随着科技进步, 蜜蜂育种的方法已从传统的杂交育种、纯系选育、工程育种和集团闭锁繁殖育种四种育种范畴向分子生物学、生物化学、统计遗传学等新领域渗透、扩增, 甚至结合, 从微观领域里寻找新的育种手段和指标。本研究期待在分子水平上测定意蜂主要品种间MDH同工酶基因型、基因型频率、基因频率、基因型杂合度等参数, 为不同的意蜂品种或同一品种不同生产性能的蜂群鉴别、选育提供基础数据或指标。

同工酶是一组结构各异功能相同的酶, 它的产生由基因位点上的基因控制, 分为发育同工酶和分类同工酶。某些分类同工酶的蛋白质多态性的稳定存在, 为研究蜜蜂种性成为可能。李举怀等1986年对蜜蜂属 (Apis) 6个种的脂酶 (EST) 同工酶进行测定从生化角度证明了这个种存在着种间特异性, 并明确提出我国西双版纳长期共存的排蜂 (黄色大蜜蜂) 和岩蜂 (黑色大蜜蜂) 的同工酶不同, 属两个不同的种, 解决了这两种蜂是两个种还是同一个种长期争论不休的问题。李绍文等在1988年利用IEF-PAGE研究了意蜂EST (脂酶) 、IDH (异柠檬酸酶) 、Me (苹果酸酶) 、MDH (苹果酸脱氢酶) 同工酶。肯定了ESTIV和MDH的多态性[1]。李举怀、李绍文1990年又利用IEF-PAGE测定了意蜂不同级型和同一级型不同发育阶段虫态的MDH, 把MDH在pH2～10区间内的酶谱分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个区带, 其中Ⅱ区带的同工酶是由3个等位基因编码的。除卵和幼虫不易测出活性外, 其余虫态均能测出, 无组织和发育日龄的特异性[2], 进一步肯定了MDHⅡ是稳定的分类同工酶这为蜜蜂属种亚种品种含地理宗鉴别及种性研究, 提供了一个可鉴别的指标。关迎辉等1994年用IEF-PAGE分析了Eb和Ea的MDHⅡ同工酶, 发现它们间基因型、基因型频率、基因频率、杂合度都存在显著差异。为Ea品种确定提供了遗传和生化依据[3]。同样, 我们也运用这个方法, 于1997年2～6月对主要的世界著名的5个意蜂品种的MDHⅡ区的同工酶基因型、基因型频率、基因频率、杂合度、纯合度进行了测定, 为创立现代蜜蜂育种新方法及种质研究, 亚种、品种、杂种鉴别提供新的数据。

《1 材料和方法》

1 材料和方法

《1.1 材料》

1.1 材料

1.1.1 意蜂品种

Ea来源于浙农大实验蜂场共30群;Ee、Eo、Em引自吉林省养蜂研究所, 隔离扩群后分别为11群、6群、30群;Eb引自云南西双版纳景洪药植研究所何远通定地蜂场, 共21群。

1.1.2 主要仪器和试剂

LKB电泳系统 (瑞典) :LKB2197型电泳仪;LKB2117型电泳槽;LKB2219冷却水循环仪。DV-120-02紫外分光光度计 (日本) 。

安福林 (Ampholine) pH4～6、pH6～8、pH7～9, 购自华美生物工程公司上海分公司;辅酶Ⅰ (NAD) ;硝基四氮唑兰 (NBT) ;硫酸甲脂酚嗪 (PMS) ;苹果酸 (malic acid) ;三羟甲基氨基甲烷 (Tris) ;丙烯酰胺 (Acr) ;N, N′-甲叉双丙烯酰胺;N, N, N′, N′-四甲基乙二胺 (TEMED) 。

《1.2 方法》

1.2 方法

1.2.1 样品处理

每群蜂剪下35个试飞前幼龄工蜂头部, -20℃保存。任取30个用于实验。每个工蜂头置于0.5 mL Eppendorf管中, 加100μL提取液, 用玻棒研磨1 min, 自然沉淀, 取上清液用于实验。

1.2.2 Folin-酚法测定蛋白含量

样品中的蛋白含量直接影响到试验结果, 样液中蛋白含量少, 染色后图谱条带很淡, 看不清楚;蛋白含量高, 条带分不清楚。为保证较好的试验重复性, 先测定样液中的蛋白含量, 再决定加样量很有必要。利用Folin-酚法测定蛋白含量 ([Pro.]) 快速 (40min) 、简便。它是由两组试剂作用于蛋白质而产生有色物质, 通过比色测知蛋白含量 (Daniel&Stuart, 1991) [4], 本试验加样液量为20μL。

1.2.3 MDHⅡ基因型的测定

采用IEF-PAGE法, 先后通过模具准备, 凝胶配制, 灌胶、铺胶片、加电极条和加样纸、加样、电泳、取胶、染色、烘干等步骤。[5～7]

《1.3 数据统计与分析》

1.3 数据统计与分析

根据30只工蜂头部MDHⅡ的图谱, 参照6种基因型图谱 (见图1) , 确定基因型, 然后统计三项指标。

《图1》图1 蜜蜂MDHⅡ6种基因型图谱Fig.1 Map of six genotypes of MDHⅡin honeybee

图1 蜜蜂MDHⅡ6种基因型图谱

Fig.1 Map of six genotypes of MDHⅡin honeybee

 

基因型频率=基因型数目/样本总数。

基因频率由基因型频率求得,

 

杂合度、纯合度也由基因型频率求得,

杂合度%=ab%+ac%+bc%;

纯合度%=aa%+bb%+cc%。

独立性检验采用c×r联列表卡方分析, 对5个品种的基因型频率、基因频率及杂合度、纯合度三项指标作独立性检验[3]。

《2 结果》

2 结果

《2.1 蛋白含量》

2.1 蛋白含量

Folin-酚法测得的6支标准蛋白含量管和2支样品管在500 nm处吸光值 (OD500) 见表1, 蛋白含量与OD500关系的标准曲线见图2。测得样品管在500 nm处吸光值 (OD500) 为0.276, 由标准曲线求得样品管中的蛋白含量为194μg, 样品管中的样液为20μL, 因此每微升样液的蛋白含量为9.7μg;100μL提取液 (一只工蜂头部) 中的蛋白含量为970μg。IEF-PAGE电泳时加样5μL, 蛋白含量为48.5μg。

  

表1[Pro.]与OD500对应表

Table 1 List of[Pro.]and OD500

《表1》
表1[Pro.]与OD500对应表Table 1 List of[Pro.]and OD500

《图2》图2 蛋白含量标准曲线图Fig.2 The standard curve diagram of protein content

图2 蛋白含量标准曲线图

Fig.2 The standard curve diagram of protein content

 

《2.2 基因型》

2.2 基因型

本研究测定了5种类型意蜂2940个工蜂个体, 确实存在6种基因型, 其中以cc型最多, bb型和aa型最少, 其中Em和Eo都未发现bb、aa型, 具体见表2。

《2.3 基因型频率、基因频率、杂合度和纯合度》

2.3 基因型频率、基因频率、杂合度和纯合度

根据测得的数据统计基因型频率cc型最高, 不仅5种意蜂平均数最高, 而且每个意蜂类型本身也最高, 最高值Eo达81.1%, 最低值Ee为26.7%;aa、bb型最低, Em、Eo都是0。基因频率c最高, 最高的Eo达90.3%, 最低的Ee为50.5%, 也在50%以上。杂合度Ee最高为67.9%, Eo最低为18.9%, 相反, 纯合度Eo最高, Ee最低。具体见表3。

  

表2 5种类型意蜂工蜂MDHⅡ基因型数目表

Table 2 List of the MDHⅡgenotype numbers in 5 races of Italian honey bees

《表2》表2 5种类型意蜂工蜂MDHⅡ基因型数目表Table 2 List of the MDHⅡgenotype numbers in 5 races of Italian honey bees

  

表3 不同类型蜜蜂基因型频率、基因频率、杂合度和纯合度表

Table 3 List of genotype frequency, allele frequency, heterozygosity and homozygosity of MDHⅡin the different Italian honey bees

《表3》

 

表3 不同类型蜜蜂基因型频率、基因频率、杂合度和纯合度表Table 3 List of genotype frequency, allele frequency, heterozygosity and homozygosity of MDHⅡin the different Italian honey bees

《2.4 MDHⅡ三项指标显著性检验》

2.4 MDHⅡ三项指标显著性检验

联列表独立性检验结果表明, 5种意蜂类型, MDHⅡ基因型频率、基因频率和杂合度/纯合度存在显著差异, 见表4。

  

表4 5种类型意蜂MDHⅡ基因型频率, 基因频率, 杂合度、纯合度显著性检验表

Table 4 List of the testing significance for genotype frequency, allele frequency and heterozygous and homozygous degrees of MDHⅡin 5 races of Italian honey bees

 

《表4》表4 5种类型意蜂MDHⅡ基因型频率, 基因频率, 杂合度、纯合度显著性检验表Table 4 List of the testing significance for genotype frequency, allele frequency and heterozygous and homozygous degrees of MDHⅡin 5 races of Italian honey bees

《3 讨论》

3 讨论

《3.1 基因型频率和种群特征》

3.1 基因型频率和种群特征

群体遗传学的哈代-温伯格定律指出, 自然交配的大群体, 在没有自然选择、没有新基因加入和遗传漂变的条件下, 上下代之间基因频率和基因型频率是不变的[8]。然而在人工饲养情况下, 上述哈代-温伯格定律的条件要求是达不到的。关迎辉等指出, 若有几十个蜂群组成的小群体从一个大群体迁出与原来大群体及其他任何群体隔离, 自行繁衍后代, 则基因频率会偏离大群体频率, 种群越小, 偏离越大。蜜蜂引种, 往往只引进几个种王, 在人为的干预下, 繁殖的种群与原来大群体基因型频率会有差异。通过数个世代, 该群体会形成比较固定的基因型频率, 因此, 这种基因型频率可以成为鉴别这一小群体的指标。如果这个小群体的蜂群具有某种优良性能, 该基因型频率就有较大的应用价值。

《3.2 意大利蜜蜂亚种的等位基因频率》

3.2 意大利蜜蜂亚种的等位基因频率

李举怀等 (1996) 许多学者报道西方蜜蜂各亚种在MDHⅡ位点上存在有a、b、c三个等位基因。而且众多的研究结果指出, 欧洲黑蜂 (Apis mellifera mellifera) 中b的频率最高[9], 非洲蜜蜂 (Apis mellifera scutellata) 和非洲化蜜蜂中a的频率最高[10], 意大利蜜蜂 (Apis mellifera ligustica) 中等位基因c最高[11]。本试验结果表明, 各种意蜂 (Apis mellifera liguistica) 的3个等位基因中, c基因亦占有优势, Eo最高达90.3%, 最低的Ee也占50.5%。根据以上的研究结果, 是否可以把c基因频率大于50%作为意蜂c基因频率的标准, 如果该标准得到确认, c基因不到半数的蜂种可以认为不是意蜂亚种, 至少是属于混杂十分严重的意蜂, 在生化方面为意蜂亚种鉴别找到了比较可靠的基因频率指标。

《3.3 图谱条带的分辨率》

3.3 图谱条带的分辨率

根据MDHⅡ区的pH在6.5～7.5之间, 把凝胶pH调至6～8区间, 由于整个电泳胶板被较小范围的pH占据, 使pH梯度表现距离增大, 结果明显拉开了条带间距, 甚至使原为重叠部分重叠的一条条带重新分开变成两条可以明显分辨的独立的条带, 从而提高了条带清析度和基因型分辨率。

《3.4 同工酶多态性应用》

3.4 同工酶多态性应用

同工酶及蛋白多态性是生化变异的主要组成部分。它具有较大的应用前景。

3.4.1 种、亚种、品种分类

Sylvester利用MDH-1, ADH-1、P-3R的资料及Ayala和Powall的方法, 论证了一个用于区分巴西的非洲化蜜蜂和巴西的欧洲蜜蜂的方法[12]。这个方法联合地分析了5个位点, 可使单只蜜蜂鉴定的准确率大于99%, 而单独地利用3个位点鉴定的准确率分别为93、87和85%。

3.4.2 分子标记

当蜜蜂在形态上几乎没有或只有微小差异时, 等位基因具有作为遗传标记的希望。对于那些特定地区稀少或缺乏的等位基因酶有希望成为最有用处的等位基因酶。

3.4.3 发育分化

蜜蜂中不同性别, 不同级型的个体及同一个体在不同发育阶段表现有不同的生化变异, 这可作为研究基因在发育分化过程中表达调控的一个很好的模型。

3.4.4 选育指标

许多敏感品系与抗药品系在同工酶条带及强弱上是存在差异的 (张大羽, 1996) 。那么会不会不同生产性能的不同类型意蜂间也存在着不同的一组酶或同一组酶中条带强弱差异呢?在这方面有待进一步进行基础研究。另外对非特异蛋白和基因组多态性的研究也应予以重视。