《1.引言》

1.引言

1993年，Langer和Vancanti在《Science》上发表了具有历史里程碑意义的论文，正式提出了“组织工程”的概念，第一次详细描述了生物可降解性3D支架的特征和应用[1]。在理想情况下，3D支架应该是高度多孔、互连情况良好的孔隙网络，并具有稳定而充足的孔径供细胞迁移和渗透[2]。该论文发表后的十年中(1993—2002年)，人们应用了许多传统的制造技术来制造多孔3D支架，如纤维黏结、相分离、溶剂浇筑、粒子沥滤、膜材层压、模塑和发泡等技术[3]。然而，所有这些方法都具有一个共同的主要缺点：它们均无法对支架结构、孔隙网络和孔径进行足够地控制，导致3D支架不够稳定、不够理想。为了克服这个问题，研究人员提出了使用3D打印法(也称为快速原型制造、实体自由制造或增材制造)来制造具有可控孔径和孔隙结构的定制式支架[4–6]。目前正在开发的40多种不同的3D打印技术中，熔融沉积成型(FDM)、立体光刻、喷墨打印、选择性激光烧结(SLS)和Colorjet打印等由于其良好的工艺塑性能力成为最受欢迎的3D打印技术[7–8]。由此带来的结果是，在第二个十年中(2003—2012年)，组织工程学领域的3D打印研究数量成倍增长。这些研究涵盖支架设计、过程建模和优化、3D打印方法比较、3D打印支架的后期处理和特征表示、3D打印支架在体外和体内的应用、3D打印用新型支架材料、支架制造用新型3D打印方法，甚至衍生出来一个全新的领域——3D生物打印或器官打印。我们的研究团队广泛参与了这一波研究热潮。本文首先介绍了本团队在此领域的研究成果和工作进展，然后对这一领域在第三个十年(2013—2022年)的前景予以展望。

《2.支架结构设计》

2.支架结构设计

《2.1支架库》

2.1支架库

支架结构设计能够显著影响细胞的机械性能和行为[9]。我们采用自下而上的方法构建3D支架，即首先制造单胞，然后将单胞组装成3D支架。利用这种方法，我们可以根据多孔结构设计来微调支架的机械特性。我们现已在室内开发出了组织支架计算机辅助系统(CASTS)，它可以自动创建具有受控结构的高度多孔3D支架模型，并能够精确地与天然解剖结构(如骨骼)的外表面轮廓匹配[10–12]。在这个系统中，约有20种多面体形状可供选择，用来生成单胞的基本几何形状。支架库和各个单胞的参数(如孔径和支柱尺寸)可以调节，每个多面单胞能够按照空间排列顺序自动叠加，直到其在尺寸上形成一个适合支架应用目的的模块(图1)。然后在支架模块和缺陷组织的实际表面模型之间通过布尔运算就可以创建具有解剖形状的多孔支架。Naing等[13]详细描述了组织支架计算机辅助系统(CASTS)设计并制造组织工程支架所用的数学公式的详细推导过程。

《图1》

图1.CASTS支架库中的五种多面单胞及其生成的模块示例。

《2.2功能梯度支架》

2.2功能梯度支架

天然组织(如骨骼)通常具有梯度性多孔结构，因此多孔支架设计和目标组织结构之间的机械强度和刚度匹配是很重要的[14]。骨骼中存在两种刚度梯度：长骨的径向梯度，短骨和不规则骨骼的线性梯度。我们现已通过同心排列圆柱形单胞的方式实现了径向梯度设计，使得孔隙度从中心向四周呈线性降低。这种线性梯度是由于支柱直径沿着梯度方向变化而产生的结果。因此，我们可以通过调整孔隙与刚度之间的关系使刚度变化适合CASTS支架的需要[15]。修改并改进CASTS系统后，本研究团队成功制造了人类下颌网状骨骼支架和股骨片段，均具有功能梯度[16,17]。图2展示了一段具有功能梯度的股骨片段示例。这种工艺精确度高，重复性好。另一种设计梯度结构的方法是以形状函数和全六面体网格细化为基础进行设计[18]。用这种方法时，一节骨头会被进一步细分并以各种不规则的六面体单元呈现出来，然后这些六面体单元再根据形状函数转换成各种不规则的多孔元件。在这些不规则的孔隙之间进行“并运算”之后，得到整体孔隙模型，然后在轮廓模型和孔隙模型之间进行“差运算”，得到骨骼支架。采用这种方法能够以明确定义的孔径分布实现梯度骨骼–支架设计。最近，一种基于S型函数和高斯径向基函数的新方法得到了开发，能够生成功能梯度结构，并且由此生成的模型能够以STL文件形式导出，进行3D打印[19]。

《图2》

图2.股骨片段功能梯度多孔支架的虚拟原型和实体原型。

《2.3血管设计》

2.3血管设计

除机械性能之外，组织工程学的另一个主要限制是如何形成血管，尤其是进行大厚度、大体积组织工程设计时。研究人员现已提出多种策略来提高或加快血管形成，其中支架设计发挥了至关重要的作用[20]。研究结果表明，250μm或以上的孔径设计比更小的孔径更有利于血管的生长[21]。另外，高孔隙率并不一定促成更多的血管形成，因为如果孔隙之间的连通性很低，那么细胞迁移和血管形成过程可能会受到抑制[22]。最近，研究人员开发了一个工具箱，用于评估3D多孔支架[23]，这个工具箱基于模块化支架设计，能够对支架孔径和孔隙率进行微调以便进行血管形成研究。本研究团队正在探索混合支架设计新理念，以解决血管形成问题。这种新方法涉及采用多孔薄膜和细丝网格代替分层材料来形成3D支架(图3)[24]。

《图3》

图3.一种推荐的便于血管形成的混合支架设计。

《3.直接3D打印》

3.直接3D打印

《3.1具体的材料形式》

3.1具体的材料形式

在室温下，3D打印使用的主要材料形式是可固化流体、非脆性长丝、层叠薄片和精细粉末[25]。每种形式的材料只针对特定的3D打印工艺。如果认为某种材料适合特定应用，但所要采用的3D打印工艺需要的特定材料形式很难制备，那么要打印这种材料就会很有挑战性。即使某种材料可以制备成特定的形式，但这也不能保证这种材料可以进行3D打印，因为要在垂向维度上成功进行打印，还依赖层与层之间的黏结强度。因此，在探讨某种材料是否适合3D支架应用时，很重要的一点是从一开始就考虑这种材料可以采用的形式。此外，为了扩大3D打印生物材料的范围，未来的开发应包括发明新的方法，以将现有的生物材料转换成适合3D打印的形式。例如，明胶凝胶的固化需要在低温下进行，但是这种低温环境与有利于细胞存活的环境相冲突。因此，未来的研究可能涉及明胶凝固新机制的开发，比如通过酶化交联进行固化[26]，或者开发一种新的混合机制用于水凝胶和系统的低温沉积[27]。

《表1》

表1.具体的材料形式和适合的3D打印工艺

《3.2工艺参数和限制》

3.2工艺参数和限制

本研究团队调查了大量的材料以便利用选择性激光烧结工艺来制造组织工程支架。表2总结了选择性激光烧结技术的主要工艺参数，即部件基床的温度、激光功率和扫描速度。特别值得一提的是，在聚醚醚酮/羟基磷灰石(PEEK/HA)系统中，结果表明羟基磷灰石含量应保持在40%(质量比)或以下才能保证结构的完整性。在聚乙烯醇/羟基磷灰石(PVA/HA)和聚己内酯/羟基磷灰石(PCL/HA)系统中，羟基磷灰石含量应保持在30%(质量比)或以下才能成功生成具有明确定义的孔隙连通性和良好的结构完整性的支架样品。开发复合材料系统时，虽然添加羟基磷灰石最初能够提高机械性能和生物活性，但它在水解降解过程中会损害材料的性能[45]。除支架外，我们还研究了药物输送装置的激光烧结应用及其微观特征[46–48]。

《表2》

表2.不同类型聚合物的选择性激光烧结工艺参数

选择性激光烧结工艺的一个局限性是制造小型设计原型(如组织工程支架)时材料浪费严重。不过这个问题可通过在选择性激光烧结部件床中纳入紧凑型适配系统来解决，这样适配器就可以将选择性激光烧结部件床的运动转换为自带的小部件床的运动[56]。利用这个装置，可以节约高达6.5倍的粉末消耗量。用选择性激光烧结技术制造支架的第二个局限性是：在细胞接种过程中支架保持细胞的能力很低。原因之一是，选择性激光烧结所用的材料是合成的，不利于初始细胞附着。另一个原因是，选择性激光烧结技术的分辨率问题导致孔径比细胞大很多，因而在接种过程中细胞会从孔隙中掉落。然而，采用由替代性的静电纺纳米纤维和3D打印支架层组成的混合3D支架后，由于纳米纤维的孔径很小，因而能够防止细胞掉落[57,58]。还有一种替代的解决方案，就是将载有细胞的胶原水凝胶注入到多孔结构中[59]。选择性激光烧结支架确实还存在尚未解决的缺陷，如多孔支架内部区域的粉末截留问题。截留的粉末很难手工去除，特别是当孔径<500μm时。研究人员探讨了利用超声波清洗截留粉末的方法，但收效甚微[60]。

《3.3熔融沉积成型(FDM)和选择性激光烧结(SLS)建模》

3.3熔融沉积成型(FDM)和选择性激光烧结(SLS)建模

在3D打印中，理解工艺本身以及背后的科学原理很重要，只有理解之后才能进一步改善工艺(图4)。聚己内酯(PCL)是熔融沉积成型(FDM)工艺所用的一种代表性生物材料。建模和有限元分析的结果表明：熔融聚己内酯流体的压降和速度取决于流体通道参数[61]。熔融聚己内酯的温度梯度表明：聚己内酯会在通道长度的35%以内液化[61]。同样，我们在研究选择性激光烧结工艺过程中对热传递现象进行了建模。我们的模型将诸如热导率、热扩散率、表面反射率和吸收系数之类的材料性质纳入其中，从而有利于识别对烧结结果很关键的生物材料性质和激光光束性质[62]。了解在3D打印中机械性能和支架孔隙度之间的关系同样重要(图5)。根据从丙烯腈–丁二烯–苯乙烯共聚物(ABS)样品所得的实验数据，我们得到了适用于熔融沉积成型工艺的关系曲线[63,64]。此外，对于组织支架计算机辅助系统设计的聚己内酯(PCL)支架，我们发现了其可行的孔隙度和综合刚度范围[65]。此刚度范围与颌面部松质骨的刚度梯度十分吻合，从磨牙区的35.55MPa，逐渐变为犬牙和门牙区的67.48MPa[66]。

《图4》

图4.(a)激光烧结工艺的温度分布和高斯轮廓线；(b)熔融沉积成型流体通道沿线五个不同区域的融化速度曲线。

《图5》

图5.(a)熔融沉积成型支架中孔隙度和模数之间的关系；(b)选择性激光烧结工艺制造的聚己内酯支架中可行的孔隙度和压缩刚度范围（灰色部分）。

《4.间接3D打印》

4.间接3D打印

与合成聚合物相比，天然聚合物通常具有非常良好的生物相容性，并能提供有利于细胞生存的微环境。但是天然聚合物的3D可打印性普遍较差。为了利用天然聚合物(如胶原和明胶)制造3D多孔支架，间接3D打印技术应运而生。直接3D打印直接利用模型材料生产支架，而间接3D打印与此相反，它通常利用支撑材料创建一个凹模，然后用这个凹模以干燥法来铸造所需要的聚合物支架[6,67,68]。采用这种方法可以制造具有三维内部通道网络的胶原支架[69]。此外，现已发现在间接3D打印中冷冻干燥法是最合适的干燥方法，因为它产生的收缩比临界点干燥法更小，并能够精确地再现各个通道的设计形态[69]。此外，间接制造法与发泡工艺相结合可以生产出具有复杂通道结构的高孔隙度、高均匀度明胶支架[29,70]，如图6(a)~(d)所示。这种结构的有序性还可以通过在铸造过程中加入均匀分散的微球体而进一步提高[71]，如图6(e)和(f)所示。除胶原和明胶之外，本研究团队还利用蚕丝丝素蛋白成功制造出同时满足宏观和微观形态特征的多孔支架[30,72]。

《图6》

图6.间接3D打印和发泡工艺相结合制造的均匀多孔的互连网络结构。

《5.生物反应器》

5.生物反应器

在组织工程中，生物反应器是一种重要的后期处理工具，因为生物反应器可为细胞–支架复合体提供动态的环境，促进复合体的成熟。更重要的是，生物反应器是组织工程学实现工业规模生产中自动化生产线的组成部分[73]。最近的一项研究报告指出，支架结构在生物反应器中可以影响细胞分化，但在静态培养中却不能[74]，这进一步证明了生物反应器的重要作用。令人惊讶的是，利用在旋转式生物反应器中常见的空气–液体界面，可以诱导诱导多能干细胞(iPS细胞)向肺泡上皮细胞分化，这就是说生物反应器在解决细胞源问题上可发挥新的作用[75]。最新的生物反应器设计采用了双流生物反应器与机械刺激相结合的形式[76]。这种新颖的设计能够让营养物、合成代谢因素或分解代谢因素从复合体的一侧扩散，从而产生梯度。因此，这种生物反应器的设计非常适用于工程界面组织。本研究团队专门研究了间隙渗流对纤维原细胞响应能力的影响[77]。通过计算流体动力学研究，我们发现动态流体即使以低至0.002cm.s–1的速度流动，也比静态培养更有利于支持物质交换，更有利于提高细胞数量，并更有利于让细胞分布和营养分布更均匀[78]。我们还开发了双窗口双带宽分光光学相干断层扫描技术(DWDB-SOCT)来监测“成纤维细胞”在支架中的增殖。“成纤维细胞”及其在支架中的分布在分光图像上清晰可辨[79]。我们期望生物反应器将来发挥更多的生物学作用，并与各种类型的刺激技术和非侵入性监测技术相结合，形成集成度更高的设计。

《6．3D生物打印与超前发展》

6．3D生物打印与超前发展

组织工程学的主要进展之一是出现了3D打印这个新领域[80]。Mironov等最初以“器官打印”为名提出了3D打印的概念，将其定义为基于计算机辅助的喷涂式活体人类器官3D组织工程[81]。这种器官打印工艺完全遵循典型的3D打印工艺链，也就是说，从计算机辅助设计(CAD)模型开始，转换为STL文件，分层，然后打印。器官打印相比基于支架的传统方法的主要优点是能够实现自动化和很高的细胞密度[82]。器官打印所用的材料是微组织，通常以球状体形式存在。这些紧密排列的球状体能够自动进行组装，融为一体[83]，为器官的3D打印奠定基础。器官打印具有即将实现的潜力，但需要解决工程组织学中的组织问题和复杂性问题[84]。器官打印还具有造就工业规模的机器人组织装配生产产业的巨大潜力[73]。然而，目前器官打印的应用仅限于体外药物测试。根据Mironov的报告，世界第一例生物打印器官移植很可能是将于2015年进行的老鼠甲状腺移植[85]。

除器官打印之外，还存在其他简便的生物打印途径和方法，如喷墨打印、微挤压和激光辅助前推转移技术等，具体情况可在参考文献[86]中查阅。这些方法的主要挑战是如何在一个确定位置以一种单独的工艺定位并培养多种类型的细胞。尽管研究人员在打印异质性组织上已获得初步成功[87,88]，但这些组织被打印在单独的小隔间内，未能复制出天然组织的微观结构。为了应对这一挑战，本研究团队计划把重点放在生物打印工艺的基础研究上，如开发时间–压力模型来精确控制挤压材料[89]。

3D生物打印现有一个令人关注的派生领域，就是微电子组件与机电组件的整合集成。例如，生物机器人就是依靠一根哺乳动物骨骼肌肉细胞条带来驱动行走的机器人[90]。3D生物打印的另一个令人关注的派生领域是4D生物打印概念。4D打印是指可编程材料的3D打印。由于所打印的部件在形状上是随着后期打印阶段的推进而逐渐变化的，因而第四维是指时间[91]。现在已有的一项4D打印物理演示涉及的是能够折纸的智能活动铰链[92]，而这个概念经过进一步的扩展，已能够让光响应窗口根据光线的强弱作出打开或关闭响应。因此，研究界认为4D打印将会成为一个新兴的领域[93]。本研究团队目前正在与Stratasys公司(www.stratasys.com)合作，开发可用于4D打印的形状记忆聚合物[94]。在4D生物打印方面，可编程生物材料的开发在实现“根据时间改变形状”上似乎是至关重要的。“4D生物打印”这个术语目前在定义上不如“4D打印”清晰，它将来如何发展定型很大程度上还是未知数，但非常值得关注。

《7.未来展望》

7.未来展望

组织工程学诞生后的第二个十年中，3D打印由于其独有的可控性和制造能力，逐渐成为这一领域的一个明确的组成部分。展望未来，即使上述技术难题有朝一日被克服，但要将学术研究的成果转换成造福社会的临床产品，仍然有很长的路要走。在此领域中，研究人员目前的任务是加速推进3D打印医疗设备的标准化和认证。标准化工作的长期拖延会让监管工作变得更为复杂，尤其是针对当前流行和转变的3D生物打印技术，因为“医疗器械”的概念可能很快会被重新定义。另一个未来趋势可能涉及法律环境[95]，因为围绕3D打印出现的侵权和知识产权保护会更为激烈地相互交织。因此，及早而明智地探索各种法律途径是应对未来变化的最好策略。

《致谢》

致谢

作者谨此感谢新加坡国家研究基金会(NRF)对新加坡3D打印中心(SC3DP)提供的资金支持，同时还要感谢曼彻斯特大学Li Lin教授盛情邀请其提交论文。

《Compliance with ethics guidelines》

Compliance with ethics guidelines

Jia An, Joanne Ee Mei Teoh, Ratima Suntornnond, and Chee Kai Chua declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.