2000年 第2卷 第11期
一种新型葡激酶分子的设计 基因构建 表达纯化及性质研究
上海医科大学分子遗传学研究室，上海 200032
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摘要
在葡激酶构效关系的研究过程中发现，葡激酶易形成二聚体，甚至多聚体，不利于葡激酶的临床应用。为了探究聚合体的形成机制以研制不易聚合的新型葡激酶分子，在葡激酶X射线晶体衍射结构模型的基础上，采用分子对接软件GRAMM V1.03，以高分辨率整体对接方式预测了葡激酶二聚体可能的结合区。结合区主要有两种可能的形成方式，通过强疏水相互作用及氢键结合。根据模型设计了旨在降低聚合能力的葡激酶突变体RGD-Sak,将Fill置换为D111，并且改变K109为R109，恰好使分子中形成RGD结构，使新型分子还可能具有抑制血小板聚集作用。利用定点突变及DNA重组技术，构建了RGD-Sak基因，并利用大肠杆菌原核表达系统进行了高效表达。RGD-Sak以包涵体形式存在，包涵体经洗涤，8 mol/L尿素溶解，稀释复性，离子交换色谱一步分离得到电泳纯的RGD-Sak,纯度达95%以上，分子量与理论值相符，比活性5×104 HU/mg。RGD-Sak与纤溶酶形成的复合物催化纤溶酶原的Km、Kcat值分别为12.40 μmol/L、0.81 s-1。RGD-Sak显示了很弱的聚合能力。此研究为研制防止二聚体形成的新型葡激酶分子打下了基础。
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参考文献
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