《1 引言》

1 引言

自1986年V. H. Mathew 等首先将NPT-Ⅱ基因利用农杆菌介导法转入芥菜型油菜以来, 转基因油菜研究有了长足的发展 [1,2,3]。据E. D. Earle 和V. C. Knauf 报道 (1999) , 从1988年到1997年10年间, 有46篇文章报道了39个不同的基因对甘蓝型油菜进行了遗传转化, 并育成一些转基因油菜品种在生产上应用 (表1) [4]

据C. James (2000) 报道, 1998年全球转基因油菜种植面积为240×104 hm2, 占全球油菜种植面积的9%, 1999年增至280×104 hm2, 占全球油菜总面积2 500×104 hm2的11%, 2000年全球转基因作物面积为4 420×104 hm2, 占全球作物种植面积27 100×104 hm2的16% [5]

为了育成适于我国种植的转基因油菜品种, 我们于1995年开始进行Bt毒蛋白基因 [6]、TA29核酸酶基因 [7]、反义FAD2基因 [8]转化甘蓝型油菜的研究;浙江省农科院陈锦清博士等 [9,10]进行了利用反义PEP转化甘蓝型油菜提高种子含油量的研究。现将主要结果介绍如下 (表1) 。

由表1看出, 共有转移基因39个。其中, 抗除草剂基因4个, 抗病基因4个, 耐重金属基因1个, 改变脂肪酸组成基因11, 改变种子蛋白基因5个, 影响次生代谢物基因1个, 影响繁殖特性基因5个, 可作医药和工业产品基因5个, 启动子调节基因3个。

《2 Bt毒蛋白基因转化甘蓝型油菜育成抗虫新品系的研究》

2 Bt毒蛋白基因转化甘蓝型油菜育成抗虫新品系的研究

《2.1意 义》

2.1意 义

菜青虫 (Artogeia) 是危害油菜的重要害虫, 属鳞翅目, 在我国长江流域地区一年可发生8~9代, 且世代重叠危害, 严重影响油菜产量和品质形成, 同时还可传播软腐病, 在秋雨多的年份常导致成灾。用化学农药防治效果不佳, 且污染环境, 又增加成本。而来自苏云金杆菌的Cry I类Bt毒蛋白基因所编码的蛋白质特异地对鳞翅目昆虫有杀虫活性, 使油菜获得抗虫性, 并能在油菜中稳定遗传和表达, 为此进行本研究。

《2.2材料和方法》

2.2材料和方法

受体品种为湘油13号 (B. napus) 。 农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 菌株为LBA4404。表达载体为中国农业科学院生物技术中心范云六教授提供的pEWZ10质粒, 含有经过人工构建的Bt杀虫蛋白基因和筛选标记基因NPTII。农杆菌介导转化方法是:挑取含有pEWZ10质粒的农杆菌单菌落接种于含四环素3 mg/L的YEB液体培养基中, 28℃振荡培养过滤, 至OD600达0.5, 然后离心收集菌体, 用MS液体培养基洗两次。切取长约2 mm的4~5天的无菌苗的子叶柄, 在MS培养基 (附加6-BA4.5 mg/L) 上预培养10 h, 再放入用浓度为1/10的MS液体培养基稀释菌液中浸染4~5 min, 用灭菌纸吸干菌液, 插入共培养基 (MS+6-BA4.5/Kanmycin15 mg/L) , 在黑暗环境中培养60~72 h。转移到筛选诱导培养基 (MS+6-BA4.5 mg/L+kan 15 mg/L+Carbenicllin 500 mg/L+AgNO3 5 mg/L) 上培养 (25℃, 光照16 h/d) 3~4周, 切取再生的绿芽置生长培养基 (MS+Kan 15 mg/L+Carb 250 mg/L+Kan 15 mg/L) 中, 2~3周内即可生根, 待根系发达后移至盆钵。子房注射的方法是:对即将开放的花蕾进行人工去雄, 并套袋挂牌, 在第2天或第3天上午9:00~10:00授粉, 重新套袋。在授粉后一定时间内, 用微玻针 (针口直径10~100 μm) , 从子房不同部位注射1~3 μL质粒DNA, 然后再套袋隔离2周, 成熟后收获种子。转化成功后, 对转基因植株进行农艺性状和品质性状的选择。

表1已转移到甘蓝型油菜中的基因 (不包括标记基因)

Table 1 Genes (other than markers) transferred to B.napus plants

 

《表1》


受影响性状
基 因 来 源 参考文献
除草剂抗性:      

抗磺酰脲
乙酰乙酸合成酶
(除草剂作用位点)
拟南芥 Miki et al, 1990; Christ & Sincl, 1992; Blackshaw et al, 1994

抗草甘膦
AroA基因 农杆菌CP4菌株 Christ & Sincl, 1992
  草甘膦降解基因 无色细菌LBAA菌株 Barry et al, 1992

抗草胺膦
Bar基因 (编码使除草剂失活的酶) 链霉菌属 DeBlock et al, 1989

抗病原真菌:
     

丝核菌
几丁质酶 菜豆 Broglie et al, 1991, 1993; Benhamou et al, 1993

菌核病
黑胫病
几丁质酶 番茄+烟草 Grison et al, 1996

?通过控制白藜芦醇合成
1, 2-二苯乙烯合成酶 花生 Thomzik, 1993

抗病毒:芜菁花叶病毒
正义或反义非编码区 TYMV Zaccomer et al, 1993

耐重金属:耐镉
金属硫蛋白 Misra & Gedamu, 1989

贮藏产物
     

种子油:
     

C8:0, C10:0脂肪酸
酰基-ACP硫脂酶 Cuphea hookeriana Dehesh et al, 1995

高月桂酸 (12:0)
12:0-ACP硫脂酶 加州月桂树 Voelker et al, 1992, 1996

C12:0 (在三酰甘油sn-2位上)
溶血磷脂酸酰基转移酶 可可 Knutzon et al, 1995

高棕榈酸 (16:0)
棕榈酰-ACP硫脂酶 Cuphea hookeriana Jones et al, 1995

提高硬脂酸 (18:0)
反义硬脂酰-ACP硫脂酶 白菜型油菜 Knutzon et al, 1992

提高油酸 (18:1)
ω-6-去饱和酶 甘蓝型油菜 Reiter et al, 1994

改变C18酸比率
3-酮脂酰-ACP合成酶 大肠杆菌 Verwoert et al, 1995

增加18C以上脂肪酸 (20:1, 22:1, 24:1)
β-酮脂酰-CoA合成酶 西蒙德木 Lassner et al, 1996

三芥酸三酰甘油
溶血磷脂酸酰基转移酶 Limnanthes alba Lassner et al, 1995
  1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶 L. douglasii Brough et al, 1996

24:1脂肪酸
酮脂酰-CoA合成酶 Lunaria Lassner私人通讯

种子蛋白:
     
  napin 甘蓝型油菜 Raske et al, 1988

提高Cruciferin
反义napin基因 甘蓝型油菜 Kohno-Murase et al, 1994

提高napin
反义Cruciferin基因 甘蓝型油菜 Kohno-Murase et al, 1995

提高甲硫氨酸
2S白蛋白 巴西坚果 Guerche et al, 1990;Altenbach et al, 1992; Denis et al, 1995

提高赖氨酸
DapA (编码对赖氨酸不敏感的二羟基-吡啶甲酸合成酶) Corynebacterium Falco et al, 1995

次生代谢物:
降低吲哚类硫苷

色氨酸脱羧酶

Catharanthus roseus

Chavedej et al, 1994

繁殖特性:
     

诱导雄性不育
barnase 淀粉芽胞杆菌 Mariani et al, 1990

恢复雄性育性
barstar 淀粉芽胞杆菌 Mariani et al, 1992

自交不亲和性
S-位点基因 甘蓝、白菜型油菜 Nishio et al, 1992

对雄性育性无影响
反义绒毡层特异A9基因 甘蓝型油菜 Turgut et al, 1994

增强授粉能力
毒素A链 Corynebacterium diphtheriae Kandasamy et al, 1993

医药和工业产品:
     

医药
脑啡肽 (神经肽) 附加到拟南芥2S蛋白的编码区 Vanderkerckhove et al, 1989

塑料
PhaB, phaC Alcaligenes eutrophus Poirier et al, 1995

将蛋白导入油体
油体蛋白 (oleosin) 玉米, 拟南芥 Lee et al, 1991
  蛭素+油体蛋白 水蛭 VanRooijen & Moloney, 1995
  木聚糖酶+油体蛋白 Neocallimastix patriciarum Parmenter et al, 1996; Liu et al, 1997

启动子调节
启动子来源:    
  油体蛋白基因 拟南芥 Plant et al, 1994
  低温反应基因 甘蓝型油菜 White et al, 1994
  S-位点糖蛋白基因 芸薹属植物 Sato et al, 1991

 

 

《2.3研究结果》

2.3研究结果

《2.3.1 转化结果》

2.3.1 转化结果

以子叶柄作转化受体进行农杆菌转化, 最佳浸染时间为3~5 min, 最佳共培养时间为60~72 h, 在最佳转化条件下, 共培养350个外植体, 获得小植株14株, 卡那霉素抗性植株频率为8.3%。经Dot blotting和Southern blotting检测, 转化频率为1.18%。采取子房注射法转化:在授粉后20~30 h从子房中部注射0.5~1.5 μg外源DNA, 从实验的25个子房中获种子674粒, 其中卡那霉素植株率为12.8%。

《2.3.2 表达检测》

2.3.2 表达检测

对转基因植株进行GUS基因表达检测, 结果呈阳性, 表明Bt毒蛋白基因在转基因植株中得到表达。分别收获转基因植株的自交种子 (第2代) , 在MS培养基上进行卡那霉素抗性筛选, 结果卡那霉素抗性植株和卡那霉素敏感植株的比例约为3∶1, 表明Bt毒蛋白基因是以单拷贝、杂合地整合到油菜基因组中。此外, 分别提取形态及产量性状表现优异的转基因植株的基因组DNA, 进行PCR扩增目的基因的分子检测, 绝大多数植株具有目的基因的扩增带, 表明目的基因在转基因植株中能稳定遗传。

《2.3.3 抗虫试验》

2.3.3 抗虫试验

转Bt基因油菜苗期对菜青虫有明显抗虫性。经3次田间接虫试验, 菜青虫取食转基因油菜叶片后, 存活率明显下降, 在4龄后存活率显著降低, 平均死亡率比对照增加60.7%。

《2.3.4 转Bt基因抗虫油菜品系表现》

2.3.4 转Bt基因抗虫油菜品系表现

对转Bt基因油菜进行农艺性状和品质性状选择, 获得性状稳定新品系。新品系株高160.5 cm, 一次有效分枝7.6个, 单株角果数368.2个, 每果22.7粒, 千粒重3.94 g, 无芥酸, 硫苷含量20 μmol/g以下, 种子含油量39.3%, 与对照湘油13号不相上下。目前正进行安全性研究。

《3 油菜基因工程雄性不育系和恢复系选育以及杂种优势利用的研究》

3 油菜基因工程雄性不育系和恢复系选育以及杂种优势利用的研究

《3.1意 义》

3.1意 义

油菜杂种优势显著, 一般可增产20%~30%, 甚至更高。再加上油菜花期长, 花龄长, 花器外露, 繁殖系数高, 有利于杂交制种。以往选育质不育杂种和核不育杂种, 育种周期长, 组合选配局限性大。用基因工程方法育成雄性不育系和恢复系, 利用杂种优势, 组合选配自由, 育种周期短, 有很好的应用前景。

《3.2材料和方法》

3.2材料和方法

受体品种为湘油15号 (B.napus) 和与之能形成强优势组合的品种742 (B.napus) 。雄性不育的表达载体为PTABNBAR55 (即NOS-barnase-TA29-bar) , 育性恢复的表达载体为PTABSBAR23 (即NOS-barstar-TA29-bar) , 分别由中国科学院遗传研究所李文彬教授构建。农杆菌转化甘蓝型油菜方法是:甘蓝型油菜子叶柄预培养20 h, OD600为0.5, 农杆菌菌液感染后共培养3天, 在MS+AgNO3 2 mg/L+6-BA 4.5 mg/L+Km 10 mg/L+Carb 300 mg/L培养基上进行前期选择, 转化率为8.8%, 在MS+AgNO3 2 mg/L+Km 15 mg/L+Carb 200 mg/L培养基上进行延迟选择, 净转化率为19.1%;在MS+AgNO3 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+Km 20 mg/L+Carb 200 mg/L培养基上进行后期选择, 净转化率为20.8%, 采用PCR检测外源基因是否进入甘蓝型油菜基因组。再生小植株经驯化后定植在盆钵中。

《3.3研究结果》

3.3研究结果

《3.3.1 转化结果》

3.3.1 转化结果

不育基因经农杆菌介导法转入湘油15号后, 获得98株转基因植株, 植株主要性状与供体亲本无明显差异, 但其育性可分为完全不育、半不育和可育三种类型。其中, 完全不育转基因植株约占4%, 但雄蕊发育不良, 花丝变短, 花药小而干瘪, 药室中无花粉, 或仅有极少量畸形花粉, 套袋自交不能结实, 授予对照花粉能结实;半不育转基因植株约占40%, 其雄蕊明显短于雌蕊, 部分花药有少量可育花粉;可育的转基因植株约占56%, 其雄蕊与对照无明显差异, 花粉量多, 可被kI-I2染色。育性恢复基因经农杆菌介导法转入742品种后, 共获15株转基因植株, 其表现型与供体亲本无明显差异。

《3.3.2 喷药试验》

3.3.2 喷药试验

对转基因植株喷洒PPT除草剂600 mg/L后, 有45%的不育基因转化植株和33%的恢复基因转化植株表现出不同程度的抗性。

《3.3.3 效果》

3.3.3 效果

按以下制种方式生产的杂种, 与常规品种进行产量比较, 一般增产30%左右。

A系 雄性不育系 (转不育基因的湘油15号, 具有S显性不育基因, 且与抗除草剂基因H紧密连锁)

A′系 保持系 (未转不育基因的湘油15号, 且无抗除草剂基因, 表现可育)

B系 恢复系 (具有显性基因R+H, 雄性可育)

《图1》

 

 

《4 反义FAD2基因转化甘蓝型油菜双低品种提高油酸含量的研究》

4 反义FAD2基因转化甘蓝型油菜双低品种提高油酸含量的研究

《4.1意义》

4.1意义

油酸脱氢酶FAD2 (EC1.3.1.35, 1-酰基-2-油酰基-sn-甘油-磷酸胆碱脱氢酶) 是植物产生多聚不饱和脂肪酸的关键酶, 它存于内质网膜上, 以1-酰基-2-油酰基-sn-甘油-磷酸胆碱为底物, 需氧条件下NADH为还原剂。NADH:tyb5氧化还原酶和Cytb5生成多聚不饱和脂肪酸、亚油酸 (Cis 9, 12-18:2) 和α-亚麻酸 (Cis 9, 12, 15-18:3) , 它们在植物的膜系统中主要以酯化的形式存在。本研究拟从甘蓝型油菜中克隆FAD2基因cDNA片段, 并构建种子特异型表达载体, 利用反义抑制技术, 将FAD2反义基因转化双低油菜品种, 使种子中油酸含量提高到80%以上。

《4.2材料和方法》

4.2材料和方法

受体油菜材料为双低油菜品种湘油15号 (油酸含量为60%) 。克隆载体为pGEM-T Easy, 受体菌为DH10B。mRNA及cDNA的合成采用试验盒。参照GenBank中甘蓝型油菜FAD2基因序列设计引物, 将FAD2基因克隆于pBluescript SK+的EcoRV位点, 并测序。油菜特异表达基因napin启动子的克隆:用SDS法从油菜种子中提取总DNA, 根据已知napin基因序列设计引物扩增其1.15 kb的启动区, 将napin启动子克隆于SK+载体的HindⅢ、EcoRI位点, 测序。种子特异性FAD2反义基因表达载体的构建;将pBI 101的HindⅢ、SacI区置换成pUC119的多克隆位点区, 再用HindⅢ、SalI切开, 回收大片段。用EcoRI、SalI将FAD2基因切下。用HindⅢ将napin启动子切下。一起连接, 即完成载体构建。表达载体转入农杆菌LBA4404。然后按已建立的再生体系转化双低油菜品种湘油15号。最后采用PCR扩增法进行检测。

《4.3研究结果》

4.3研究结果

4.3.1 油菜FAD2基因cDNA片段的克隆和序列分析 经1%的琼脂糖凝胶电泳分析表明PCR产物的大小为650个, 特异性很强, 与引物所对应的片段大小相符。我们提取的油菜叶片总DNA用同样引物进行PCR扩增, 同样扩增出650 bp产物, 说明FAD2基因cDNA片段无插入序列。重组克隆质粒经NotI酶切消化后有一长约650 bp的DNA片段出现。酶切结果表明:PCR产物已插入载体pGEM-TEasy中。FAD2基因cDNA片段的序列分析结果表明, PCR产物为654 bp, 经与GenBank序列 (AF243045) 进行同源性比较, 序列在比较区的同源性达100%。

4.3.2 油菜种子特异表达基因napin启动子的克隆 经1%琼脂糖凝胶电泳分析表明, PCR产物大小约1.1 kb, 特异性很强, 与引物所对应的片段大小相符。PCR产物回收后, 与pBluescriptⅡ SK+连接, 酶切分析确认其正确性。napin启动子序列分析表明, 序列长1 147个碱基, 富含AT、TATA盒出现的-70位置, 与napA只有1个碱基差别, 即462位少1个G, 这正好与napB的启动子序列一致, 它与napB有7个碱基差别, 即79位多了7个碱基, 这正好与napA启动子系列一致。因此我们认为, 新的启动子是napAnapB在86位与462位之间发生交换产生的。现已将这一启动子登录到GenBank, 登录号为Bank 1t 422796 AF 420598。

4.3.3 新的种子贮藏蛋白启动子napin已与反义FAD2基因连接, 构建了种子特异表达载体, 现正通过农杆菌介导法导入湘油15号油菜中。

《5 利用反义PEP基因转化甘蓝型油菜提高种子含油量》

5 利用反义PEP基因转化甘蓝型油菜提高种子含油量

《5.1意义》

5.1意义

油菜是油料作物, 提高种子含油量是油菜育种的重要目标。现有油菜品种种子含油量一般为40%左右。但高含油量种质资源种子含油量可达50%左右。利用基因工程技术提高油料作物种子含油量已有研究。据V.Katavic等报道 (2000) , 在油菜中表达外源ACC基因, 正向提高脂肪酸限速酶ACCase (乙酰-CoA羧化酶) 的表达;或在油菜中导入酵母溶血磷脂酸酰基转移酶 (LPAAT) 基因, 提高脂肪酸合成酯类的速度, 消除脂肪酸合成中的反馈抑制。上述两条途径所获得的转基因油菜含油量分别仅较受体品种提高5%~13.5% (相对值) 。为此, 浙江省农科院陈锦清博士提出了反义PEP技术途径。

在油脂、蛋白质生物合成途径中, 糖酵解产物——磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 可作为油脂、蛋白质生物合成的共同底物, PEPCase (磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶) 是油脂合成途径中一个潜在关键调控点 (即所谓“底物竞争说”) 。如果运用反义基因技术, 抑制油菜种子PEP基因表达, 以降低种子PEPCase量, 减少进入蛋白质合成途径的PEP量, 使更多PEP流向脂肪酸的合成途径 (图1) , 从而为油脂合成提供更多底物, 提高种子含油量。

《5.2材料与方法》

5.2材料与方法

PEP基因系根据Yanai等 (1989) 公布的油菜籽粒PEPCase同功酶基因序列, 经PCR扩增获得。将PEP基因片段插入超级双元载体pIG121的XbaI位点, 使PEP基因片段连接于CaMV35S启动子下、GUS报告基因上游, 并与35S启动子反向连接构建成反义PEP植物表达载体pPEPAS, 并用电击法导入根癌农杆菌EHA101, 然后与浙油758下胚轴共培养, 将反义PEP转化到油菜基因组中, 从而获得转基因油菜植株。

《5.3研究结果》

5.3研究结果

获得高油量转基因油菜品系超油1号, 生育期和种皮颜色等均与原品种浙油758相当, 芥酸含量 (0.82%) 亦与浙油758 (0.78%) 相当, 硫苷含量 (25.67 μmol/g) 稍低。最大差别是超油1号种子含油量比浙油758 (38%) 高9.4个百分点, 达47.4%。

《图2》

图1反义PEP基因提高油菜种子含油量原理

图1反义PEP基因提高油菜种子含油量原理  

Fig.1 Principle of anti-PEP gene to raise the oil content in sead of rapeseed