《1、 引言》
1、 引言
抗病毒研究在人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）和乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）导致的病毒性疾病的药物治疗方面取得了巨大成功。然而，甲型流感病毒（influenza A virus, IAV）、严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV）以及最近的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染性疾病的暴发表明迫切需要针对呼吸道RNA病毒的有效药物。这些病毒的感染通常以流感样症状为特征，通过气溶胶传播，具有高度传染性，在无症状阶段即可传播，并且在症状出现前具有较长的潜伏期。这些病毒导致传染病的大流行，特别是在老年人和已有基础疾病的人群中死亡率较高。截至2021年4月30日，2019年新型冠状病毒肺炎（COVID-19）已在全球造成约1.51亿例感染和超过318万人死亡[1]。发现针对呼吸道RNA病毒的新型抗病毒药物是一项紧迫的工作，也是一项艰巨的任务。
虽然一些抗病毒药物是通过理性设计和化学合成而研发出来的，但其最初的发现往往受到天然产物的启发。在进化过程中，许多微生物已经演化出多种机制来对抗病毒和细菌的侵袭。微生物的次级代谢产物是潜在抗病毒候选药物的重要来源[2‒4]。据统计，在已知的16 500种活性微生物次级代谢物中，约10%表现出抗病毒活性[5]。例如，利巴韦林（ribavirin, RBV）是一种核苷类似物，用于多种抗病毒治疗，如甲型流感病毒、HCV、登革病毒和诺如病毒。利巴韦林的发现受到天然来源核苷类抗生素吡唑霉素的启发，而吡唑霉素是从纯白链霉菌（Streptomyces candidus）NRRL 3601中分离出来的[3‒4,6]。从海绵Tethya crypta中分离出的阿糖腺苷是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首个抗病毒药物，用于全身性单纯疱疹病毒感染的治疗[4,7]。1967年从桔色链霉菌（Streptomyces citricolor）中分离出广谱抗病毒化合物芒霉素[8‒9]。其他具有抗病毒活性的化合物，如间型霉素、多球壳菌素和环孢菌素A等，也均来自微生物[3‒4]。解析抗病毒抗生素的生物合成机制将有助于发现新型抗病毒药物。
链霉菌1647是20世纪70年代从中国南方土壤中分离得到的一株链霉菌，其发酵液及提取物均显示优良的抗甲型流感病毒活性，但对其抗病毒活性成分一直未能解析。本研究综合利用基因组学、转录组学和代谢组学的多组学技术，从确定链霉菌1647的活性次级代谢产物的生物合成基因簇（BGC）入手，最终确定其化学结构。相较于传统的活性微生物次级代谢产物的发现过程，基于多组学的发现策略是一种用于发现新型抗病毒活性化合物的有效方法。利用该策略，发现了一组具有优良抗甲型流感病毒和冠状病毒活性的类四肽化合物，这些天然抗病毒活性产物为研发新型抗病毒药物提供了优质的活性先导结构。
《2、 材料与方法》
2、 材料与方法
《2.1 菌株、质粒和链霉菌1647的发酵培养条件》
2.1 菌株、质粒和链霉菌1647的发酵培养条件
本研究所涉及的菌株和质粒列于附录A中的表 S1。链霉菌1647（中国药学微生物菌种保藏管理中心，CPCC 200451）及其衍生菌株于28 ℃、YMG固体培养基（酵母提取物1.0%，麦芽提取物1.0%，葡萄糖1.0%，琼脂1.5%，pH值7.2）上生长及传代。胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基（BD，美国）用于提取全基因组DNA的菌株的培养。A1、A2及A3培养基为主要的发酵培养基，成分组成详见附录A中的方法部分。大肠杆菌DH5α为克隆宿主，大肠杆菌ET12567/pUZ8002用于接合转移实验，实验步骤参考之前发表的文章[10]。
《2.2 构建基因过表达菌株及基因敲除菌株》
2.2 构建基因过表达菌株及基因敲除菌株
本研究所涉及的引物列于附录A中的表S2。将目标基因分别通过双酶切和连接插入质粒pL646 [11] 中，该质粒是以质粒pSET152为基础[12] ，具有ФC31噬菌体整合位点和整合酶编码基因（attP-int）及组成型强启动子ermE*p，构建的基因过表达质粒导入链霉菌1647中进行过表达。pOJ260 [12]是链霉菌自杀型质粒，用于构建链霉菌1647基因敲除质粒。将包含目标基因上游和下游的两个同源片段（约2 kb）连接到pOJ260的多克隆位点，以接合转移的方式将重组质粒导入链霉菌1647中。利用阿泊拉霉素抗性标记于MS（黄豆粉2%，甘露醇2%，CaCO3 0.3%，水1 L）固体培养基[10]上，筛选单交换菌株，经聚合酶链反应（PCR）鉴定正确后，在不含阿泊拉霉素的MS固体培养基上传代培养，约5代后影印筛选丢失了阿泊拉霉素抗性的双交换突变菌株，并通过PCR、测序及定量逆转录PCR（qRT-PCR）进行验证，最终获得缺失目标基因的敲除菌株。
《2.3 基于活性导向的分子网络分析》
2.3 基于活性导向的分子网络分析
使用Sep-Pak C18固相萃取柱（Waters，美国）对链霉菌1647的发酵上清液及其活性组分进行浓缩和富集至原液浓度的5倍。采用Agilent 6510 Q-TOF LC/MS仪器采集质谱数据（负离子全扫描模式，扫描范围300~2000 m/z）。使用Capcell-Pak MG Ⅱ C18色谱分析柱（5 μm, 4.6 mm × 150 mm）分析上述样品，流速为1.0 mL·min-1；流动相A为乙腈，流动相B为含有0.1%甲酸的水；分段梯度洗脱：5%~30% A/B （体积分数），30 min；30%~95% A/B（体积分数），30 min；柱温：40 ℃。将获得的液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）二级质谱数据提交至全球天然产物社交分子网络（global natural products social molecular networking, GNPS）数据库，建立分子网络（http://gnps.ucsd.edu），然后运用Cytoscape软件[13]使结果可视化。
《2.4 链霉菌1647中活性成分的分离与鉴定》
2.4 链霉菌1647中活性成分的分离与鉴定
将链霉菌1647的发酵上清液进行大孔吸附树脂（Diaion HP20；日本三菱化学公司）柱层析，收集流穿液样品；使用两倍于柱体积的去离子水冲洗，收集水洗液样品；采用乙醇-水进行梯度洗脱（20%、50%和100%乙醇），每个梯度洗脱至流出液无颜色或颜色不变；收集各个梯度的洗脱液，分别称为馏分 20E、50E和100E，经过减压浓缩后，冻干备用。活性组分的进一步分离采用ODS-A-HG（日本YMC公司）的开放柱色谱。在Agilent G6500 Q-TOF系列或Waters Xevo系列的质谱仪器上进行高分辨率电喷雾离子源质谱（HR-ESI-MS）数据的采集。使用日本资生堂公司的五氟苯基色谱柱（Capcell-Pak PFP; 5 μm, 10 mm × 250 mm）进行反相高效液相色谱（RP-HPLC）半制备。化合物的一维（1D）和二维（2D）核磁共振（NMR）分析详见附录A。
《2.5 抗病毒活性检测方法》
2.5 抗病毒活性检测方法
《2.5.1. 病毒、细胞和感染》
2.5.1. 病毒、细胞和感染
流感病毒株A/Fort Monmouth/1/1947（H1N1）购于美国典型培养物保藏中心（ATCC）。临床分离株A/tianjinjinnan/15/2009（H1N1，奥司他韦耐药株）和A/wuhan/359/1995（H3N2）由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所舒跃龙教授提供。冠状病毒HCoV-229E（VR-740）购自ATCC，HCoV-OC43（VR-1558）由首都医科大学北京地坛医院赵学森博士提供。人副流感病毒3（HPIV-3，C-243株）和呼吸道合胞病毒（RSV，Long株）购于ATCC。
马-达二氏犬肾细胞（MDCK）和人肝癌细胞（C3A）购自ATCC。人肝癌细胞（Huh7.5）、人宫颈癌细胞（Hela）和人上皮细胞（Hep2，HeLa衍生细胞系）由本实验室保存。MDCK细胞维持培养基中需要添加2 μg·mL-1 TPCK-胰蛋白酶（Worthington，美国）和0.08%牛血清白蛋白（BSA；北京元亨圣马生物科技公司）。如果没有特别提到，在抗流感病毒研究中均使用甲型流感病毒 H3N2病毒株（IAV H3N2）。在Huh7.5（HCoV-229E）、C3A（HCoV-OC43）、Hela（HPIV-3）和Hep2（RSV）细胞进行抗病毒活性实验中，维持培养基中需要添加2%胎牛血清。
《2.5.2. 细胞病变效应抑制分析》
2.5.2. 细胞病变效应抑制分析
化合物对甲型流感病毒、HCoV-229E、HPIV-3和RSV的抑制活性通过细胞病变效应（CPE）抑制试验检测[14]。简言之，细胞铺板在37 ℃过夜培养后，以100倍50% 组织培养感染剂量（TCID50）的病毒感染2 h，然后弃掉病毒加入待测化合物（对于HCoV-229E，待测化合物与病毒同时加入细胞），继续培养至48 h或72 h。采用Reed和Muench方法[15]计算化合物的50%抑制浓度（IC50），待测样品和阳性化合物对细胞的50%毒性浓度（TC50）也通过CPE法测定。选择指数（SI）为TC50 / IC50的比值。
《2.5.3. qRT-PCR分析》
2.5.3. qRT-PCR分析
RNeasy Mini试剂盒（Qiagen，德国）用于感染细胞总RNA的提取，根据试剂盒的说明书操作。qRT-PCR分析采用TransScript II Green One-Step qRT-PCR SuperMix试剂盒（TransGen Biotech，中国），所用仪器为ABI 7500 Fast Real-Time PCR system（Applied Biosystems，美国）[16]。所涉及的引物列于附录A中的表 S2。
《2.5.4. Western blot分析》
2.5.4. Western blot分析
哺乳动物蛋白提取试剂（M-PER; Thermo Fisher Scientific，美国）及HaltTM蛋白酶抑制剂混合物用于细胞蛋白的提取及病毒蛋白的分析。按先前研究[16]检测β-actin（抗体货号3700S；1∶5000稀释；Cell Signaling Technology，美国）及甲型流感病毒聚合酶酸性（polymerase acidic, PA）蛋白（抗体货号GTX118991；1∶1000稀释；GeneTex，美国）。
《2.5.5. 不同时间点加药实验》
2.5.5. 不同时间点加药实验
不同时间点加药（time-of-addition）实验参考文献[17]方法进行，略有修改。简言之，MDCK细胞感染甲型流感病毒2 h后更换培养基，在指定的时间点将待测化合物加入培养基。病毒感染后12 h收集细胞，蛋白质印迹法检测甲型流感病毒PA蛋白表达，细胞病变效应法检测病毒滴度。
《2.6 统计分析》
2.6 统计分析
抗病毒活性测定和qRT-PCR的实验数据以平均值±标准差（SD）表示。应用GraphPad Prism软件组间的统计分析采用双尾t检验或单因素方差分析（ANOVA），然后根据情况进行Dunnett校正。p值小于0.05表示有显著的统计学差异，误差线表示SD值。
《3、 结果》
3、 结果
《3.1 基因组序列的生物信息学分析及活性导向的比较转录组分析》
3.1 基因组序列的生物信息学分析及活性导向的比较转录组分析
链霉菌1647的发酵液上清及粗提物对不同甲型流感病毒株（H3N2、H1N1和H1N1奥司他韦抗性株）显示出抑制活性（见附录A中的表 S3）。为了探明其中抗流感病毒活性成分的化合物结构，本研究设计了一种不同于传统活性化合物发现方法的多组学指导策略，首先解析了该产生菌的基因组序列（见附录A中的方法部分）。
链霉菌1647的基因组是一个长为8.9 × 103 kb的线性染色体，GC含量为73.6%。采用antiSMASH软件（5.0.0版本）（http://antismash.secondary metabolites.org）对该基因组进行分析，提示包含38个可能的次级代谢产物生物合成基因簇。
采用比较转录组分析（见附录A中的方法部分）初步定位抗病毒活性化合物的生物合成基因簇。依据筛选14个发酵培养基的结果，选择A3和B7培养基分别作为链霉菌1647的高活性和无活性的发酵培养基，并在发酵初期24 h、48 h和72 h分别收集菌体，进行转录组测序（RNA-seq）[图1（a）]。结合antiSMASH预测的38个生物合成基因簇信息，找到了三个在A3培养基中显著高表达的生物合成基因簇，分别是cluster 27、cluster 28和cluster 36 [图1（b）~（d）]。转录组测序结果得到了qRT-PCR实验的进一步验证[见附录A中的图S1（a）~（c）]。
《图1》
图1 不同的发酵条件下链霉菌的比较转录组。
生物信息学分析显示，cluster 27和cluster 28为铁载体类化合物的生物合成基因簇，均含有多个铁阻遏蛋白的结合位点（iron box sequence），提示其表达可能受到铁离子浓度的调控[18‒19]。进一步的转录组测序结果表明，在A3培养基中加入过量铁离子（终浓度为0.05%）后，cluster 27和cluster 28的转录被沉默了，但cluster 36仍高表达[图1（e）~（g）]，该结果也得到qRT-PCR实验的验证[见附录A中的图S1（d）~（f）]。活性检测结果表明，加入过量铁离子的发酵液仍然具有很高的抗病毒活性（见附录A中的表S3）。因此，推测cluster 36可能负责合成链霉菌1647中主要的抗流感病毒活性物质。
《3.2 确证抗病毒活性化合物的生物合成基因簇》
3.2 确证抗病毒活性化合物的生物合成基因簇
antiSMASH 5.0.0分析预测cluster 36中共含有50个开放阅读框（ORF），其中一些是非核糖体肽合成酶（NRPS）基因[图2（a）]。
《图2》
图2 链霉菌1647过表达和敲除突变株的分析。
为了初步评估cluster 36在链霉菌1647抗流感病毒活性成分的生物合成中的作用，首先选择该基因簇内NRPS基因附近的5个调节基因分别进行过表达分析，包括基因7081（TetR家族）、基因7082（SARP家族）、基因7083（ArsR家族）、基因7089（LysR家族）和基因7102（TetR家族），结果提示只有在过表达调节基因7102时，发酵液样品的抗流感病毒活性才呈现出一定程度的提高[见图2（b）及附录A中的图 S2（a）~（d）]。转录组测序结果表明，调节基因7102过表达后，cluster 36的NRPS核心区（基因7092~7102）转录水平显著上调[图2（c）]，该结果得到qRT-PCR实验的验证[见附录A的图S2（e）]。基因7092~7102的功能预测详见附录A中的表 S4。
随后，通过同框缺失策略对cluster 36核心区域中的NRPS基因7098进行敲除，获得阻断株7098-KO。为避免敲除引起的极性效应，将基因7098重新引入7098-KO突变株中获得遗传回补株7098-KOC，通过qRT-PCR检测了cluster 36核心区域的基因表达水平[图2（d）]。抗病毒活性测试[图2（e）]结果显示，基因7098的敲除导致其发酵液的抗流感病毒活性消失，而该基因的回补可以恢复抗病毒活性。对这些菌株的发酵提取物进行LC-MS分析[图2（f）]，结果表明在敲除株7098-KO中，一系列保留时间在14~23 min和31~42 min的组分消失，而这些组分在回补菌株7098-KOC的发酵液中重新出现。
以上结果表明，cluster 36的核心NRPS区域负责链霉菌1647中抗流感病毒活性成分的生物合成。在本研究开展的过程中，Maxson等[20]报道了基于化学反应的筛选方法发现的去亚胺基抗痛素（deimino-antipain）的生物合成基因簇，通过比对发现其与cluster 36的核心区域序列高度同源。这些数据提示链霉菌1647中抗流感病毒的活性成分可能是一些与去亚胺基抗痛素具有不同后修饰的寡肽。
《3.3 活性导向的比较代谢组分析》
3.3 活性导向的比较代谢组分析
为了更加快速有效地确定链霉菌1647抗流感病毒活性成分的结构特征，指导目标产物的分离，本研究对该菌株的野生株、基因7098敲除株（7098-KO）和回补株（7098-KOC）的发酵液通过HPLC进行初步分离，接着对各段样品进行HR-ESI-MS/MS数据的采集，并将质谱数据提交至GNPS数据库[21‒22] [图3（a）]进行聚类分析，构建LC-MS/MS数据分子网络；通过比较不同活性发酵液中分子及碎片离子的组成差异，找出活性分子的结构特点。不同菌株的发酵液数据分别归入G1（来源于链霉菌1647野生型菌株）、G2（来源于基因7098的阻断株）和G3（来源于基因7098的遗传互补菌株）三组，将其LC-MS/MS数据提交至GNPS数据库，建立分子网络。在此分子网络中，共有22 850个质谱数据经过聚类分析形成了1076个节点，每一个节点代表一类结构相似的化合物。通过分析上述可视化的分子网络图，可以发现具有抗病毒活性的G1组和G3组拥有同一簇化合物，是无活性的G2组所不具有的[图3（b）]，提示这一簇化合物极有可能属于链霉菌1647的抗流感病毒活性成分。进一步分析这簇化合物在总离子流图中的分布、分子量、紫外吸收以及二级碎片离子信息等特征，为后续活性化合物的分离纯化和结构鉴定工作提供指导。
《图3》
图3 基于发酵粗提物MS/MS片段数据的GNPS分子网络。
《3.4 抗病毒活性成分的分离与结构鉴定》
3.4 抗病毒活性成分的分离与结构鉴定
为了获得足够量的活性成分，对链霉菌1647野生株进行了放大发酵，以基因7098的阻断株作为阴性对照。基于分子网络质谱数据分析以及活性导向进行分离纯化，从链霉菌1647野生株发酵液中发现了18个含有脲基的类四肽化合物，命名为奥米克欣A1~A6、B1~B6和C1~C6，这三个系列化合物的区别在于C末端单元分别为苯丙氨醇（phenylalaninol, Pheol）、精氨醛（arginal, Argal）和苯丙氨醛（phenylalaninal, Pheal）单元，其中奥米克欣A1、A2、A6、B1~B3、B5、B6、C1、C2和C6为新化合物[图4（a）]。
《图4》
图4 奥米克欣的结构信息。
奥米克欣A1是白色无定形粉末，HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 628.2903 [M+H]+，提示其分子组成为C30H41N7O6S（计算分子量为628.2912），通过详细分析NMR数据，得出该化合物的氨基酸连接顺序为苯丙氨酸基（Phe）‒CO‒capreomycidine（Cap）‒甲硫氨酸基（Met）‒苯丙氨醇[见图4（b）及附录A中的图S3和表S5]，其C末端为苯丙氨醇结构。依据HR-ESI-MS数据，奥米克欣A2的分子式被推断为C30H43N7O6S，比A1多两个氢原子。同样，经详细的NMR数据分析，得出A2为苯丙氨酸基‒CO‒精氨酸基（Arg）‒甲硫氨酸基‒苯丙氨醇[见图4（b）及附录A中的图S4和表S5]。采用高级Marfey方法[23‒24]对奥米克欣A1和A2中氨基酸的绝对构型进行了确定（见附录A中的表S6）。通过NMR分析和与文献报道的数据[25‒26]进行对比，确定奥米克欣A3和A4为已知化合物。比较奥米克欣A3~A6的HR-ESI-MS/MS数据（见附录A中的图S5），发现A3和A4中的缬氨酸残基在A5和A6中，被一个亮氨酸或异亮氨酸残基替代了，从而确定了奥米克欣A5和A6的化学结构。
基于1H-NMR和HR-ESI-MS/MS数据分析可知，化合物奥米克欣B1~B6的C末端单元为醛基，即精氨醛（由精氨酸的羧基转变）。利用奥米克欣B4和已知肽醛蛋白酶抑制剂抗痛素（见附录A中的图S5）的共进样HPLC分析，推断奥米克欣B4为已知的蛋白酶抑制剂抗痛素。有研究报道抗痛素在水溶液中以两种水合物形式、四种六元环半胺缩醛形式和两种游离醛形式的动态平衡混合物存在[27]。由于末端精氨醛单元的不稳定性，导致奥米克欣B系列化合物在色谱分析中难以获得较好的分离度，无法得到高质量的2D NMR图谱。从HR-ESI-MS数据来看，奥米克欣C1~C6的分子量均比奥米克欣A1~A6相对应地少了2 Da。进一步通过HR-ESI-MS/MS数据（见附录A中的图S5）分析以及与已知化合物糜蛋白酶抑素的比较，从而推断出奥米克欣C1~C6的C末端由A组的苯丙氨醇单元变成了C组的苯丙氨醛单元（Pheal）。
《3.5 奥米克欣的抗病毒活性检测》
3.5 奥米克欣的抗病毒活性检测
采用细胞病变效应抑制法测定奥米克欣A1~A4和B1~B4以及商品化的蛋白酶抑制剂抗痛素和糜蛋白酶抑素对甲型流感病毒和冠状病毒HCoV-229E的活性（表1）。奥米克欣B1~B4对甲型流感病毒具有显著的抑制作用，其IC50值在微摩尔浓度范围内（0.89 ~ 3.34 μmol·L-1），明显低于磷酸奥司他韦（IC50 为4.24 μmol·L-1）和利巴韦林（IC50为13.16 μmol·L-1）。同样，奥米克欣B1~B4具有显著的抗HCoV-229E作用，IC50值约为1 μmol·L-1，药效优于阳性对照药利巴韦林（IC50为25.14 μmol·L-1）约20倍。奥米克欣A1~A3具有中等的抗甲型流感病毒（IC50为80 ~ 320 μmol·L-1）和抗冠状病毒HCoV-229E（IC50为40 ~ 180 μmol·L-1）活性；糜蛋白酶抑素对冠状病毒HCoV-229E也有一定的抑制活性（IC50为23.74 μmol·L-1）)，优于其抗甲型流感病毒活性（IC50为329.33 μmol·L-1）的10倍以上。这些结果表明，奥米克欣C末端单元还原形式（即醛基或醇羟基）和C末端单元氨基酸（即精氨酸或苯丙氨酸）结构对化合物抗病毒活性至关重要，这为未来的化学结构优化提供了有益信息。
《表1》
表1 链霉菌1647活性化合物的抗甲型流感病毒和HCoV-229E活性
| Sample information | IAV (H3N2a) | HCoV-229E | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| TC50 (µmol·L‒1) | IC50 (µmol·L‒1) | SI | TC50 (µmol·L‒1) | IC50 (µmol·L‒1) | SI | ||
| Omicsynin A1 | > 318.83 | 318.83 ± 0 | > 1.00 | > 159.41 | 45.04 ± 7.03 | > 3.54 | |
| Omicsynin A2 | > 794.53 | 207.77 ± 56.00 | > 3.82 | > 397.27 | 171.85 ± 2.10 | > 0.92 | |
| Omicsynin A3 | > 335.97 | 87.85 ± 23.68 | > 3.82 | > 167.98 | 57.41 ± 15.62 | > 2.93 | |
| Omicsynin A4 | > 83.71 | > 83.71 | ‒ | > 41.86 | > 41.86 | ‒ | |
| Omicsynin B1 | > 315.31 | 0.89 ± 0.20 | > 352.94 | > 157.65 | 1.35 ± 0.28 | > 117.19 | |
| Omicsynin B2 | > 314.32 | 1.00 ± 0.22 | > 312.78 | > 157.16 | 1.53 ± 0.32 | > 102.90 | |
| Omicsynin B3 | > 332.06 | 3.34 ± 0.13 | > 99.34 | > 166.03 | 1.19 ± 0.51 | > 139.53 | |
| Omicsynin B4 | > 330.96 | 2.43 ± 0.71 | > 136.05 | > 165.48 | 0.89 ± 0.22 | > 186.34 | |
| Antipain | > 330.96 | 3.16 ± 0.94 | > 104.90 | > 165.48 | 1.57 ± 0.46 | > 105.63 | |
| Chymostatin | > 329.33 | 329.33 ± 0 | > 1.00 | > 164.66 | 23.74 ± 5.66 | > 6.93 | |
| OP | > 487.33 | 4.24 ± 1.66 | > 114.94 | NT | NT | NT | |
| RBV | > 819.00 | 13.16 ± 3.11 | > 62.24 | > 409.50 | 25.14 ± 6.10 | > 16.29 | |
为了进一步研究奥米克欣的抗病毒谱，检测了其对其他呼吸道相关RNA病毒的抗病毒活性，包括HCoV-OC43、RSV和HPIV。细胞病变效应抑制分析显示，奥米克欣对RSV和HPIV无抗病毒活性（数据未显示）。由于HCoV-OC43感染C3A细胞未诱导细胞病变效应，因此通过qRT-PCR分析C3A细胞中HCoV-OC43 N蛋白的mRNA水平来检测奥米克欣对HCoV-OC43的抑制活性。结果表明，奥米克欣B4对冠状病毒HCoV-OC43具有抑制活性，IC50为28.67 μmol·L-1 [图5（a）]。
《图5》
图5 奥米克欣对HCoV-OC43和甲型流感病毒 H3N2的抑制。
以利巴韦林为阳性对照，通过检测甲型流感病毒M2 mRNA和PA蛋白水平确定奥米克欣B4、链霉菌1647野生株的发酵液提取物（WT-50E）和基因7098敲除株的发酵液提取物（KO-50E）的抗病毒活性。结果如图5（b）、（c）所示，奥米克欣B4和WT-50E可以剂量依赖地降低MDCK细胞中甲型流感病毒M2 mRNA和PA蛋白的水平。然而，KO-50E对甲型流感病毒的复制无影响。
如图5（d）、（e）所示，采用不同时间点加药实验[17]研究奥米克欣靶向甲型流感病毒复制周期的具体阶段。通过检测病毒滴度发现，在病毒感染后（2~12 h）加入奥米克欣B4和WT-50E可以抑制甲型流感病毒的复制，但在感染前（-2~0 h）和感染期间（0~2 h）加入无作用[图5（d）]。而且研究还发现，在病毒感染后0 h、1 h、2 h、4 h或6 h加入奥米克欣B4和WT-50E可以抑制甲型流感病毒复制，但在感染后8 h和10 h加入则无抑制作用[图5（e）]。与此同时，研究发现KO-50E对病毒复制各阶段均无明显抗病毒作用，这与预期一致。综上所述，研究表明奥米克欣B4和WT-50E通过抑制病毒进入后早期复制阶段发挥抗病毒作用。
《4、 讨论》
4、 讨论
自然界中微生物往往暴露于病毒（对于细菌等原核生物，称为噬菌体），因此微生物可能通过产生代谢产物而形成对抗病毒感染的微环境。在过去几十年中，在本研究所筛选的20 000多个微生物发酵样品中，发现链霉菌1647可产生对包括奥司他韦耐药株在内的不同甲型流感病毒具有优良且可重复的抗病毒活性的次级代谢产物。值得注意的是，其发酵液中的活性成分对SARS-CoV也具有活性[28]。然而，链霉菌1647产生的抗病毒化合物的有效分离和结构鉴定长期以来一直困扰着研究人员。本研究使用整合的“组学”策略，以定位负责链霉菌1647产生的抗病毒次级代谢产物的生物合成基因簇作为突破口，最终确定了链霉菌1647发酵产物中的活性抗病毒化合物，其中11种是新结构化合物。
在传统的微生物天然产物发现过程中，活性天然化合物的分离和鉴定既费时又费力。尽管最初的微生物发酵提取物可能显示出良好的生物活性，但有时活性化合物可能在一系列活性导向的分离过程中丢失或失活。不稳定的活性次级代谢产物往往缺乏清晰的核磁共振氢、碳信号，整个分子结构可能无法阐明或可能被错误确定。因此，本研究采用了一种新的策略，即通过整合基因组学、生物活性导向的转录组学和代谢组学分析，有效地推动了由链霉菌1647产生的一系列名为奥米克欣的新型抗病毒类四肽天然产物的分离鉴定。具有C端精氨醛的高活性奥米克欣B系列化合物易发生互变异构现象，在弱酸性水溶液中可能主要以四种互变的六元环半胺缩醛形式存在，同时含有少量游离醛和水合物[20]。这可能是先前在活性导向的分离和HPLC分析中遇到困难的主要原因。
在后基因组学时代，多组学分析可以有效地用于促进微生物天然产物中生物活性化合物的发现和鉴定。基于基因组序列的高效生物信息学分析，可以获得由目标菌株编码的次级代谢产物的基本结构信息。然后，基于生物活性导向的比较转录组学的应用，可以发现负责活性化合物生物合成的潜在基因簇。目标生物合成基因簇可以通过对基因簇中调节基因或生物合成基因的遗传操作进一步确定。结合从目标生物合成基因簇预测的结构信息，代谢组学数据的生物活性导向分子网络可以标示该菌株产生的活性候选物。因此，可以根据靶分子的潜在特性选择理性的分离程序，从而加速活性化合物的鉴定[29‒30]，尤其是对于那些使用传统发现程序难以确定的活性成分。
这种新策略具有另一个固有优势，即从组学数据出发可同时发现活性次级代谢产物及其生物合成基因簇。负责奥米克欣生物合成的基因簇位于编码五个NRPS基因的cluster 36的核心NRPS区域。去亚胺基抗痛素属于肽醛蛋白酶抑制剂家族，其特征在于存在C端醛基[31‒33]，包括抗痛素、糜蛋白酶抑素、β-微生物碱性蛋白酶抑制剂（β-MAPI）、弹性酶抑制剂A和亮肽素[图6（b）]。在链霉菌1647中，代谢组学数据确定了18种以上的奥米克欣化合物，包括至少11种新化合物，以及几种已知的类似物，如抗痛素、糜蛋白酶抑素和β-MAPI。据报道，这些化合物具有多种抗病毒活性。例如，有研究报道，抗痛素对HCoV-229E [34]和脊髓灰质炎病毒2A [35]具有抑制活性，亮肽素对流感病毒[36]和HCoV-229E [34]具有抑制作用，β-MAPI对HIV-1蛋白酶具有抑制作用[26,36]。新型肽醛化合物奥米克欣B1、B2和B3对甲型流感病毒和HCoV-229E表现出显著的抑制活性，具有广谱作用。奥米克欣B4和多种存在于野生型菌株发酵液提取物50E部分（WT-50E）的奥米克欣组分，在病毒感染后0~6 h给药，可以抑制甲型流感病毒复制，提示这些组分通过干扰病毒进入细胞后的早期阶段来发挥抗病毒作用。奥米克欣针对对奥司他韦敏感及耐药的甲型流感病毒株具有相似的活性，提示奥米克欣的抗病毒机制不涉及靶向促进子代病毒从感染细胞中释放的神经氨酸酶。奥米克欣在抗甲型流感病毒中的确切作用机制值得进一步详细研究。
《图6》
图6 奥米克欣的生物合成基因簇和代表性肽醛蛋白酶抑制剂的化学结构。
本研究是第一个同时从微生物中鉴定了抗病毒活性化合物及其生物合成基因簇的研究，然而，这些化合物的生物合成机制仍有待阐明。奥米克欣的生物合成过程有许多未解之谜，如第四个NRPS的A结构域的缺乏（即类四肽的生物合成基因簇中仅存在三个A结构域）和两种独特的氧化还原酶的功能等。该类肽家族同源化合物的存在表明可能存在多样的遗传元件负责新型抗病毒化合物的生物合成。因此，确定奥米克欣生物合成的详细生化机制，基因组挖掘与奥米克欣及其结构类似物相关的新生物合成模块，将促进通过组合生物合成和合成生物学手段来获得新结构衍生物，从中可能发现用于抗击流感病毒和（或）冠状病毒引起的呼吸道感染的新型候选药物或疗法。
《5、 结论》
5、 结论
本文采用整合的多组学策略从链霉菌1647发酵产物中发现了十多个新型抗病毒类四肽化合物，取名为奥米克欣。奥米克欣，特别是奥米克欣B类化合物显示出显著的抗甲型流感病毒和冠状病毒活性。同时确定的奥米克欣生物合成基因簇为其生物合成机制的解析奠定了基础，也为发现新的抗病毒化合物以应对甲型流感病毒和冠状病毒相关疾病的暴发提供了潜力。
Authors’ contribution
Shuyi Si, Bin Hong, Jian-Dong Jiang, and Yuhuan Li contributed to the study design. Hongmin Sun, Xingxing Li, Minghua Chen, Ming Zhong, Yihua Li, Kun Wang, Yu Du, Xin Zhen, Rongmei Gao, Yexiang Wu, and Yuanyuan Shi contributed to the experiment implementation and the data collection and analysis. Shuyi Si, Bin Hong, Jian-Dong Jiang, Yuhuan Li, Hongmin Sun, Xingxing Li, Minghua Chen Liyan Yu, and Yongsheng Che contributed to the manuscript preparation. All authors have read and approved this final manuscript.
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