基于同一健康策略探究老挝人、动物和环境中多黏菌素耐药性的传播特征

周宇晴 ,  Refath Farzana ,  Somsavanh Sihalath ,  Sayaphet Rattanavong ,  Manivanh Vongsouvath ,  Mayfong Mayxay ,  Kirsty Sands ,  Paul N. Newton ,  David A.B. Dance ,  Brekhna Hassan ,  Timothy R. Walsh

工程（英文） ›› 2022, Vol. 15 ›› Issue (8) : 45 -56.

PDF (3300KB)
工程（英文） ›› 2022, Vol. 15 ›› Issue (8) : 45 -56. DOI: 10.1016/j.eng.2022.01.013

基于同一健康策略探究老挝人、动物和环境中多黏菌素耐药性的传播特征

作者信息 +

A One-Health Sampling Strategy to Explore the Dissemination and Relationship Between Colistin Resistance in Human, Animal, and Environmental Sectors in Laos

Author information +
文章历史 +
PDF (3378K)

Abstract

This study was designed to investigate the molecular epidemiology of mobile colistin resistance (mcr) using a ″One-Health″ approach in Laos and to predict whether any dominant plasmid backbone and/or strain type influences the dissemination of mcr. We collected 673 samples from humans (rectal normal flora), poultry, and the environment (water, flies, birds, etc.) in Vientiane, Lao People's Democratic Republic (Laos), from May to September 2018. A total of 238 Escherichia coli (E. coli) isolated from nonduplicative samples, consisting of 98 MCR-positive E. coli (MCRPEC) (″mcr″ denotes the gene encoding mobile colistin resistance, and ″MCR″ denotes the subsequent protein encoded by mcr) and 140 MCRnegative E. coli (MCRNEC), were characterized by phenotype and Illumina sequencing. A subset of MCRPEC was selected for MinION sequencing, conjugation assay, plasmid stability, and growth kinetics in vitro. The prevalence of MCRPEC was found to be 14.6% (98/673), with the highest prevalence in human rectal swabs (45.9% (45/98), p < 0.0001, odds ratio (OR): 0.125, 95% confidence interval (CI): 0.077–0.202). The percentages of MCRPEC from other samples were 14.3% (2/14) in dog feces, 12.0% (24/200) in flies, 11.0% (11/100) in chicken meat, 8.9% (8/90) in chicken cloacal, 8.0% (4/50) in chicken caeca, and 7.5% (4/53) in wastewater. MCRPEC was significantly more resistant to co-amoxiclav, sulfamethoxazoletrimethoprim, levofloxacin, ciprofloxacin, and gentamicin than MCRNEC (p < 0.05). Genomic analysis revealed the distribution of MCRPEC among diverse clonal types. The putative plasmid Inc types associated with mcr-1 were IncX4, IncHI2, IncP1, IncI2, and IncFIA, and those associated with mcr-3 were IncFII, IncFIA, IncFIB, IncP1, and IncR. Recovery of highly similar plasmids from both flies and other sampling sectors implied the role of flies in the dissemination of mcr-1. mcr-positive plasmids were shown to be conjugative, and a significantly high transfer rate into a hypervirulent clone ST1193 was observed. Plasmids containing mcr irrespective of Inc type were highly stable and invariably did not exert a fitness effect upon introduction into a new host. These findings signify the urgent need for a standard infection control program to radically decontaminate the source of resistance.

关键词

多黏菌素耐药性 / mcr / 大肠杆菌 / 老挝 / 水平传播

Key words

Colistin resistance / mcr / Escherichia coli Laos / Horizontal transmission

引用本文

引用格式 ▾
周宇晴,Refath Farzana,Somsavanh Sihalath,Sayaphet Rattanavong,Manivanh Vongsouvath,Mayfong Mayxay,Kirsty Sands,Paul N. Newton,David A.B. Dance,Brekhna Hassan,Timothy R. Walsh. 基于同一健康策略探究老挝人、动物和环境中多黏菌素耐药性的传播特征[J]. 工程（英文）, 2022, 15(8): 45-56 DOI:10.1016/j.eng.2022.01.013

登录浏览全文

4963

注册一个新账户 忘记密码

1、 引言

抗生素耐药性（AMR）现在被认为是对健康和经济最严重的全球威胁之一[1]。表达肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC-1）或新德里金属β-内酰胺酶（NDM）[2‒3]的耐碳青霉烯类肠杆菌（CRE）的迅速增加，已威胁到碳青霉烯类药物的临床应用，这加剧了全球的关注。到目前为止，最近重新引入临床医学的黏菌素（多黏菌素E）已被认为是治疗由多药耐药（MDR）革兰氏阴性病原体（如CRE）引起的危及生命的感染的最后手段之一[4]。

自从2015年11月中国在食用动物和人源的肠杆菌中发现了可转移多黏菌素耐药性（mcr）机制mcr-1以来，从东南亚（SEA）、欧洲、非洲、北美洲、南美洲和大洋洲等六大洲45个国家的食用动物、动物产品、人和环境中分离出产生mcr的肠杆菌的报道越来越多[5‒6]。人、动物和环境来源的多个mcr基因（mcr-1至mcr-10）已被描述。质粒被认为是mcr基因在全球传播的关键驱动因素。IncI2、IncH12和IncX4是已报道的与mcr相关的主要不相容组[6‒8]。

在东南亚，在越南和泰国观察到肠杆菌属中mcr基因的流行率增加，多黏菌素的使用被认为是这种耐药性增加的驱动力[6,9‒12]。老挝最近的一份报告显示，mcr在该国普遍流行，但没有分析mcr传播的驱动因素，如环境的作用或质粒载体传播mcr的潜力[13]。本研究旨在使用“同一健康”方法调查老挝mcr的分子流行病学，并通过评估遗传和功能特性来预测是否有任何优势质粒或菌株类型可能影响mcr的传播。

2、 材料和方法

研究大纲如图1所示。

图1 研究工作流程示意图。CCS：鸡泄殖腔拭子；CC：鸡盲肠；CM：鸡肉；BF：禽类粪便；DF：狗粪；FL：苍蝇；WW：废水；WC：运河、河流和水库的水；HRS：人直肠拭子；E. coli：大肠杆菌；MCRPEC：MCR阳性大肠杆菌；PCR：聚合酶链反应；MALDI-TOF：基质辅助激光解吸/电离飞行时间；UTI：尿路感染；MIC：最低抑菌浓度。

2.1 抽样策略

2018年5—9月，在老挝万象实施了基于“同一健康”方法的全面采样战略。收集的673个样本包括来自健康志愿者（n = 100）的人类直肠拭子（HRS），来自商业农场的鸡泄殖腔拭子（CCS, n = 90，包括幼雏和肉鸡）；来自屠宰场的鸡盲肠（CC, n = 50）；来自露天市场和超市的鸡肉（CM, n = 100）；鸟粪（BF, n = 16）；狗粪便（DF, n = 14）；来自露天市场和屠宰场的苍蝇（FL, n = 200）；来自农场、市场和屠宰场（WW）的废水（n = 53）；以及来自运河、河流和水库的水（WC, n = 50）。采样地点选择在家禽养殖场半径10 km的范围内[附录A中的图S1（a）]。使用苍蝇胶板（PEST-STOP, UK）捕捉苍蝇，然后在无菌条件下将其单独转移到离心管中[14]。其他样本使用运输拭子（西班牙Deltalab）收集。收集志愿者的采样细节（即样本类型、位置和采样日期）和人口统计学信息（如性别、位置、基于农产品的职业、饮食习惯、饮酒习惯、卫生状况以及是否拥有农场）（附录A中的表S1）。这个项目得到了牛津大学牛津热带研究伦理委员会（524-18）和老挝国家健康研究伦理委员会（2018.62.MC）的批准。所有样品都是用UN3373集装箱（UN3373，荷兰）从老挝转移到英国，并附有相关文件。

2.2 MCR阳性大肠杆菌的表型特征

筛选包括在含有多黏菌素（0.5 μg∙mL-1）的显色尿路感染（UTI）培养基（德国Merck Life Science）上培养标本，分离粉红色菌落，并通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱（MS；德国Bruker Daltonics）。将苍蝇捣碎并用Luria培养基（LB；德国Sigma-Aldrich）培养4 h，然后用多黏菌素选择（0.5 μg∙mL-1）涂布在显色UTI培养基上。首先，使用先前描述的引物[15]通过聚合酶链反应（PCR）筛选大肠杆菌的mcr-1和mcr-3，并测定多黏菌素的最低抑菌浓度（MIC）[16]。将多黏菌素耐药性预测值阴性的样品（即分离的大肠杆菌对多黏菌素敏感或为mcr-1或mcr-3阴性）铺在不含多黏菌素的显色UTI上，回收对多黏菌素敏感的大肠杆菌用于风险分析。在673株样本中，本研究共分析了238株从非重复样本中分离的大肠杆菌，其中包括98株MCR阳性大肠杆菌（MCRPEC）和140株MCR阴性大肠杆菌（MCRNEC）。琼脂稀释法用于确定临床相关抗菌药物（复方阿莫西林、哌拉西林-他唑巴坦、头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、庆大霉素、替加环素、磷霉素和磺胺甲????唑-甲氧苄啶）的MIC，并根据欧洲委员会抗菌药物敏感性试验（EUCAST）折点对结果进行解释[16]。

2.3 全基因组测序

E. coli使用Illumina MiSeq平台（美国Illumina公司）对从初级筛选中分离的大肠杆菌（n = 238）进行测序。基于MiSeq装配预测与mcr相关的质粒背景，并相应地选择24个具有不同质粒背景的携带mcr的大肠杆菌用于MinION测序（英国Oxford Nanopore Technologies）。简而言之，使用QIAcube（德国Qiagen）从过夜培养物中提取基因组DNA（gDNA）。使用Nextera XT制备用于配对末端测序（2 × 301个循环）的DNA文库。原始读长的质量控制包括fastqc（0.11.2），使用Trimgalore进行接头微调（0.4.3）。使用novo assembler SPAdes (3.9.0) (.fasta)将读长组装成重叠群并使用Burrows-Wheeler比对器（BWA; 0.7.15）。使用Pilon（1.22）纠正任何错误。使用Quast（2.1）评估装配度量。然后用Prokka（1.12版）对从头组装进行注释，输出（.gff）进行核心基因组比对。我们使用RA×ML-ng (v0.9.0.git-mpi)对核心序列构建了最大似然（ML）树，该树具有一般的时间可逆（GTR）进化模型和伽马校正迭代，直到引导以3%的截止值收敛（默认），随后使用交互式生命树（iTOL）（v5）进行可视化。使用Porechop (0.2.3)对从MinION测序获得的原始读长进行解复用。Unicycler (0.4.4)用于产生使用Illumina短读长和MinION长读长的杂交装配。本研究中使用的数据库是来自基因组流行病学中心（CGE）的多位点序列分型（MLST）数据库（v2.0.0）、Clermont数据库（v1.4.0）以及Resfinder和plasmid finder in ABRicate (v0.9.7)。来自该研究的所有全基因组测序数据已经以生物项目登记号PRJNA763111保存在GenBank中。

2.4 接合转移、质粒稳定性和生长动力学

选择10个携带5种不同mcr Inc型质粒[IncX4 (n = 2)、IncI2 (n = 2)、IncHI2 (n = 2)、IncP1 (n = 2)和IncFII (n = 2)]的MCRPEC作为供体，并选择来自不同地区的4个受体[受体1（R1）：ST10来自该研究；R2：来自巴西的ST131；R3：来自中国的ST1193；R4：来自孟加拉国的ST167和大肠杆菌J53]用于接合转移试验。供体和受体的选择标准如下：①供体和受体不属于同一序列类型（STs）；②受体为mcr阴性；以及③受体属于流行病学上重要的大肠杆菌STs（例如，ST10被认为是mcr-1的最大宿主[17]，ST131是blaCTX-M-15的流行性克隆[18]，ST1193是高毒性克隆[19]，ST167是blaNDM的高风险克隆[3]）。除了来自巴西和孟加拉国的分离株含有IncFII质粒（附录A中的表S2）之外，受体不含有与供体相同的Inc组质粒。每个受体对每个供体进行接合实验。供体和受体在LB培养基中于37 °C下以170 r∙min-1的速度振荡生长，直到它们达到指数生长期[在620 nm处的光密度（OD620）为0.6]。用1∶3的供体-受体混合物在液体培养基中于37 ℃过夜培养。然后将过夜培养物的系列稀释液铺在含有多黏菌素（2 mg∙L-1）和多黏菌素加选择性抗生素（基于相关受体的敏感性模式）的显色培养基上。在适当的情况下，通过mcr的PCR，然后是Clermont分型、基于重复元件序列的PCR（rep-PCR）或MLST（附录A中的表S3）来确认成功的接合。通过相对于供体的跨接合物的集落形成单位（CFU）计数来计算转移频率。

根据之前描述的方案[20]，通过在无抗生素环境中连续传代15天，研究了获得的所有接合子（n = 41）的稳定性。将过夜培养物在不含黏菌素的新鲜LB培养基中稀释至1:1000，并在37 °C下剧烈摇动（220 r∙min-1）培养24 h。对每个菌株进行三次生物学重复。使用煮沸裂解法在第0天、第3天、第6天、第9天、第12天和第15天提取总gDNA [21]。使用StepOnePlus qPCR机器（英国Applied Biosystems）通过定量PCR（qPCR）测量15天传代中携带mcr的质粒的丰度变化，使用mcr变体的特异性引物和探针以及管家基因（HKG）rpoB（表S3）。与HKG相比，mcr的相对丰度通过delta-delta Ct方法（2-ΔΔCt）计算。实验重复进行三次。

研究了所有接合子（n = 41）和受体（n = 5）的生长动力学[20]。将细菌过夜培养物（37 ℃在新鲜LB培养基中）在新鲜LB培养基中以1:1000稀释。使用FLUOstar Omega酶标仪（英国BMG LABTECH公司）以100 r∙min-1的速度振荡24 h，每隔半小时监测OD620，记录细菌生长。对每个菌株进行三次生物学重复和两次技术性重复。

2.5 问卷和统计分析

使用SPSS (v26)进行单因素逻辑回归，以评估人类携带MCRPEC的潜在风险和社会人口学统计指标（即性别、地区、职业、饮食习惯、日常饮用水来源、厕所类型和最近三个月内抗生素的使用情况），并检查MCRPEC和其他相关变量（即MCRPEC在不同来源和地点的患病率、在不同STs中的分布、耐药性和毒力分布）之间的相关性。在GraphPad Prism (v7.04)中采用单因素方差分析（ANOVA）来研究供体、受体和质粒的细节对接合频率的影响。经统计学处理，差异有统计学意义（p < 0.05）。

3、 结果

3.1 MCRPEC的流行率

MCRPEC的总流行率为14.6% (98/673)，其中，直肠拭子中的流行率最高[45.9% (45/98), p < 0.0001, OR: 0.125, 95% CI: 0.077~0.202]。其他样品中MCRPEC的百分比为：狗粪14.3% (2/14)，苍蝇12.0% (24/200)，鸡肉11.0% (11/100)，鸡泄殖腔8.9% (8/90)，鸡盲肠8.0% (4/50)，废水7.5% (4/53)。在鸟类粪便或来自运河、河流和水库的水中没有发现MCRPEC（图S1和附录A中的表S4）。表1、图S1（b）和附录A中的表S5显示了来自万象不同地点的MCRPEC的相对流行率，这些数据显示，在Xaythany和Xaysetha，MCRPEC的流行率显著高于其他地点。mcr最常见的变体是mcr-1 (14.3%, 96/673)，其次是mcr-3 (2.4%, 16/673)。发现大多数（87.5%, 14/16）mcr-3与mcr-1相关（表2）。

表1 万象不同采样地点MCRPEC流行率的单变量逻辑回归分析

Sampling locations for different sampling sectorMCRPEC, n (%)OTHERS*, n (%)p valueOR95% CI
Sampling locations for HRS
Xaysetha20 (44.4)31 (56.4)0.2371.6150.730‒3.570
Xaythany25 (55.6)24 (43.6)0.2371.6150.730‒3.570
Sampling locations for FL
Xaysetha3 (12.5)30 (17.0)0.5751.4380.403‒5.132
Chanthabuly14 (58.3)79 (44.9)0.2190.5820.245‒1.380
Sisattanak4 (16.7)46 (26.1)0.3201.7690.574‒5.449
Sikhottabong3 (12.5)21 (11.9)0.9360.9480.260‒3.455
Sampling locations for CCS
Xaythany2 (25.0)18 (22.0)0.8430.8440.157‒4.543
Pakngum015 (18.3)———
Hadxaifong4 (50.0)16 (19.5)0.0620.2420.055‒1.075
Sikhottabong2 (25.0)23 (28.0)0.8541.1690.220‒6.220
Naxaithong010 (12.2)———
Sampling locations for CC
Chanthabuly1 (25.0)19 (41.3)0.5312.1110.204‒21.873
Sisattanak3 (75.0)17 (37.0)0.1720.1950.019‒2.031
Xaysetha010 (21.7)———
Sampling locations for CM
Chanthabuly1 (9.1%)23 (25.8)0.2463.4850.423‒28.735
Sikhottabong2 (18.2%)22 (24.7)0.6341.4780.297‒7.363
Sisattanak5 (45.5%)23 (25.8)0.1810.4180.116‒1.501
Xaysetha2 (18.2%)18 (20.2)0.8731.1410.226‒5.748
Xaythany1 (9.1%)3 (3.4)0.3810.3490.033‒3.680
Sampling locations for DF
Hadxaifong1 (50.0%)0———
Naxaithong06 (50.0)———
Pakngum04 (33.3)———
Xaythany1 (50.0%)2 (16.7)0.3180.2000.008‒4.716
Sampling locations for Water
Chanthabury1 (25.0)8 (8.1)0.2720.2640.025‒2.838
Hadxaifong08 (8.1)———
Naxaithong1 (25.0)18 (18.2)0.7320.6670.066‒6.784
Pakngum020 (20.2)———
Sikhottabong09 (9.1)———
Sisattanak2 (50.0)16 (16.2)0.1120.1930.025‒1.470
Xaysetha013 (13.1)———
Xaythany07 (7.1)———

表2 不同部门样本中变体的百分率

Sampling sectorsNumber of samplesNumber of mcr variants (%)
mcr-1mcr-3mcr-1 & mcr-3
Bird feces16000
Chicken caeca504 (8.0)00
Chicken cloacal908 (8.9)00
Chicken meat10011 (11.0)2 (2.0)2 (2.0)
Dog feces142 (14.3)00
Flies20023 (11.5)6 (3.0)5 (2.5)
Human rectal10044 (44.0)8 (8.0)7 (7.0)
Water from canal, rivers, and reservoirs50000
Wastewater534 (7.5)00
Total67396 (14.3)16 (2.4)14 (2.1)

3.2 与人类粪便携带MCRPEC相关的风险因素

单因素逻辑回归分析显示，携带MCRPEC患者与非MCRPEC患者相比，并不存在性别、地区、家庭饮水和卫生设施以及抗生素摄入量方面的显著关联。与没有家养动物的参与者相比，仅在有家养动物的参与者中观察到与携带MCRPEC相关的统计学显著性（p < 0.05）（附录A中的表S6）。

3.3 MCRPEC的抗生素耐药性

MCRPEC对复方阿莫西林、复方新诺明、左氧氟沙星、环丙沙星和庆大霉素的耐药率明显高于MCRNEC（p < 0.05），耐药率分别为94.9%、85.7%、56.1%、54.1%和26.5%。然而，只有6.1%、5.1%和1.0%的MCRPEC对替环素、头孢菌素和磷霉素耐药，所有MCRPEC对阿米卡星、哌拉西林-他唑巴坦、亚胺培南和美洛培南敏感（表3）。

表3 MCRPEC和MCRNEC抗生素耐药性的单变量逻辑回归分析

AntibioticsResistant to respective antibiotics, n (%)p valueOR95% CI
MCRPEC (n = 98)*MCRNEC (n = 140)
AUG93 (94.9)109 (77.9)0.0010.1890.071‒0.506
FEP5 (5.1)2 (1.4)0.1220.2700.051‒1.419
CTX5 (5.1)2 (1.4)0.1220.2700.051‒1.419
CAZ5 (5.1)2 (1.4)0.1220.2700.051‒1.419
CRO5 (5.1)2 (1.4)0.1220.2700.051‒1.419
CIP53 (54.1)36 (25.7)<0.00010.2940.170‒0.509
LVX55 (56.1)31 (22.1)<0.00010.2220.126‒0.391
AMK0 (0)1 (0.7)———
GEN26 (26.5)8 (5.7)<0.00010.1680.072‒0.390
TGC6 (6.1)6 (4.3)0.5260.6870.215‒2.195
FOF1 (1.0)1 (0.7)0.8000.6980.043‒11.293
SXT84 (85.7)74 (52.9)<0.00010.1870.097‒0.360

氨基糖苷类耐药基因[aac(3)-IId、aadA2、aph(3´´)-Ib、aph(3´)-Ia和aph(6)-Id]、β-内酰胺酶基因blaTEM-1B、氯霉素耐药基因（floR、cmlA1和dfrA12）、大环内酯类耐药基因[mef(B)和mph(A)]、氟喹诺酮类耐药基因qnrS1、磺胺类和甲氧苄啶类耐药基因（sul2和sul3）和四环素耐药基因[tet(A)和tet(M)]与MCRPEC显著相关（p < 0.05），其中，oqxA和oqxB仅在MCRPEC中存在（附录A中的表S7）。

3.4 大肠杆菌群体的克隆分布

本研究中测序的238株大肠杆菌（n = 238）分布在134个不同的STs中。最普遍的STs是ST48 (n = 17)、ST206 (n = 10)、ST10 (n = 9)和ST58 (n = 9)（图2）。特定的STs和mcr的存在之间没有显著的关联；然而，ST5229的所有分离株都携带mcr（附录A中的表S8）。大肠杆菌ST58仅从苍蝇中发现，属于ST48和ST206的大肠杆菌分别与鸡盲肠和鸡肉有显著相关性（p < 0.05）（附录A中的表S9）。在98个MCRPEC中，大多数属于系统群A（59/98, 44.4%）和B1（30/98, 42.9%）（图2和附录A中的表S10）。

图2 本研究中大肠杆菌（n = 238）核心基因组分析生成的ML树。使用Roary（v3.12.0）进行核心基因组比对。使用GTR模型和具有自举的伽马校正，用RA×ML-ng (v0.9.0.git-mpi)构建来自核心基因组的ML树。

3.5 毒力基因与MCRPEC的关系

毒力相关基因编码肠杆菌素[entC (238/238, 100.0%)、entE (238/238, 100.0%)、entB (237/238, 99.6%)和entS (234/238, 98.3%)]和铁肠杆菌素[fepD (238/238, 100.0%)、fepB (237/238, 99.6%)、fepC (237/238, 99.6%)、fepA (233/238, 97.9%)、fes (237/238, 99.6%)]。此外，与大肠杆菌血红素摄取系统相关的毒力基因，如chuU、chuV、chuW、shuA和shuX，与MCRNEC显著相关（p < 0.05），而只有fimF和fimG（Ⅰ型菌毛）与MCRPEC相关（p < 0.05）（附录A中的表S11）。

3.6 携带-1基因的质粒的特点

在这项研究中获得了携带mcr-1.1的完整环状质粒，属于33~34 kb的IncX4 (n = 8)、195~280 kb的IncHI2 (n = 4)、47~56 kb的IncP1 (n = 4)、59~87 kb的IncI2 (n = 4)和209 kb的IncFIA (n = 1)。在核苷酸水平上的基因组比较表明，IncX4质粒在99%的覆盖率下有99%的相似性，IncHI2在85%的覆盖率下有99%的相似性，IncP1在98%的覆盖率有99%的相似性，而IncI2在91%覆盖率下有99%的相似性。IncX4、IncHI2、IncP1和IncI2质粒的宿主来源见附录A中的图S2。对mcr-1附近遗传环境的分析显示，所有质粒都有一个2300~2400 bp的保守片段，包含mcr-1.1和pap2（mcr-1.1的上游）。仅在IncFIA (n = 1)和IncP1 (n = 1)两个质粒中，保守区被两个完整的ISApl1括起来。质粒IncI2 (n = 2)和IncFIA (n = 1)在mcr-1.1下游有一个完整的ISApl1。在本研究中其他质粒序列中发现mcr-1.1周围的ISApl1完全缺失[图3（a）和图S2]。所有属于IncX4的质粒、属于IncP1的三个质粒和属于IncI2的两个质粒仅携带mcr作为耐药基因；然而，所有的IncHI2质粒都显示为MDR（附录A中的图S3）。

图3 不同Inc型质粒上mcr遗传背景的线性比较。箭头代表开放阅读框的位置和转录方向。序列之间的灰色交联显示序列同源性区域（大于77%同一性）。通过Easyfig（v2.2.5）进行基因组比较。（a）IncFIA、IncHI2、IncI2、IncP1和IncX4质粒上mcr-1的遗传环境。（b）IncFIB、IncFII、IncR、IncP1和IncFIA质粒上mcr-3的遗传环境。NADPH：还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；DEAD：Asp‒Glu‒Ala‒Asp氨基酸序列；DEAH：Asp‒Glu‒Ala‒His氨基酸序列；SMC：染色体家族蛋白的结构维持；NTPase：核苷三磷酸酶。

3.7 携带-3的质粒的鉴定

IncFII的质粒大小范围为71~87 kb (n = 3)，IncP1的质粒大小为53 kb (n = 1)，IncR的质粒大小为64 kb (n = 1)，IncFIA的质粒大小为112 kb (n = 1)，IncFIB的质粒大小为103 kb (n = 1)，可以通过短读和长读序列数据的混合组装来闭合。表征的mcr-3变体是IncFII (n = 2)、IncFIA和IncP1上的mcr-3.5，IncR上的mcr-3.1，IncFIB上的mcr-3.19，IncFII上的mcr-3.21 (n = 1)，以及未测定质粒上的mcr-3.1和mcr-3.4。携带mcr-3的IncFII质粒核苷酸水平的基因组比较显示，在69%~86%的覆盖率下，有97%的一致性。IncFII质粒的宿主来源如附录A中的图S4所示。在除IncFIA以外的所有质粒中都发现了核心片段ΔTnAs2‒mcr-3‒dgkA，其中，TnAs2在mcr-3下游丢失。发现ISKpn40和IS26与mcr-3的保守区域相关，分布在不同Inc类型的质粒中。IncFIB、IncFII (n = 1)和IncR质粒中，dgkA的上游有ISKpn40，在IncP1中，dgkA的上游为IS26。有趣的是，在IncFIA质粒中发现了IS26存在于（两端方向相同）mcr-3-dgkA两侧。IS15DI也与mcr-3的保守片段相关，但IS15DI的分布仅限于IncFII (n = 2)和IncFIB质粒[图3（b）]。携带mcr-3的质粒除一个IncFII和一个IncP1（仅编码mcr-3）外均为MDR，且耐药表型多样（图S3）。

3.8 质粒的可转移性、稳定性和适应性代价

所有结合转移实验产生的接合频率范围从低（1×10‒8）到高（1×10‒1）（附录A中的表S12）；然而，在某些情况下接合不成功（IncHI2到ST10，ST131和ST167；IncI2到ST131；IncP1到ST167；以及IncX4到ST131）（图4和表S12）。ST1193受体的平均接合频率显著高于其他STs受体（p < 0.05）。在供体STs、供体来源和质粒Inc类型方面，未观察到转移率的显著差异（附录A中的表S13）。

图4 图表显示携带mcr的质粒在10个供体和4个STs受体中的不同转移率。大肠杆菌J53用作每个供体的对照，J53的结合率未在该图中显示。

在无抗生素培养基中连续传代的转接合子显示，与第0天相比，mcr的拷贝数直到第15天都是稳定的。仅在携带IncP1的CX-17（ST1193）的转接合子中观察到第9天后mcr-1的相对丰度下降。在经过15天传代后，具有IncHI2的转接合子中mcr-1的拷贝数显著低于具有其他Inc类型的转接合子（图5）。

图5 无抗生素条件下mcr质粒的丰度。通过传代15天的方法，研究了所有转接合子（n = 41）中mcr质粒拷贝数的动态变化。检测了携带5种Inc型质粒[IncFII（含有mcr-3）、IncHI2（含有mcr-1）、IncI2（含有mcr-1）、IncP1（含有mcr-1）和IncX4（含有mcr-1）]的5个受体（R1、R2、R3、R4、大肠杆菌J53）的转接合子。delta-delta Ct方法（2‒ΔΔCt方法）用于模拟mcr拷贝数随时间的变化。ΔCt指的是mcr和染色体编码基因之间的阈值循环差异。每个菌株包括三个独立的重复，数值代表三个独立分析的平均值。误差线代表标准偏差（n = 3）。

生长动力学分析显示，在具有不同Inc类型的mcr阳性质粒的转接合子中，适应性代价的程度是不一样的。与受体相比，在获得IncFII (FMM.1860:J, FMM.1860:R1, FMM.1860:R2, HRS.1827:R1, HRS.1827:R2和HRS.1827:R3)、IncHI2 (CMS.1847:J, CMS.1847:R3, HCS.1819:J和CMS)的mcr阳性质粒的转接合子中观察到生长率的显著降低，然而，41个接合子中的26个（63.4%）表现出低适应性代价（图6）。

图6 含和不含mcr质粒菌株的生长动力学。检查了5个受体（R1、R2、R3、R4、大肠杆菌J53）及其相应的转接合子（n = 41）。对5种Inc类型的质粒进行生长适应性测试：IncFII（含有mcr-3）、IncHI2（含有mcr-1）、IncI2（含有mcr-1）、IncP1（含有mcr-1）和IncX4（含有mcr-1）。对每个菌株进行三次生物重复和两次技术重复。OD620 nm表示在620 nm波长下测量的样品的光密度。数据点代表独立分析的平均值。误差线代表标准偏差（n = 6）。通过不成对t检验（GraphPad v7.04）检验适合度的差异。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。

4、 讨论

这项研究已经证实了mcr基因在老挝的人类、动物和环境水库中广泛存在，对人类健康构成潜在风险。mcr-1是最常见的变体，其次是mcr-3，如先前的研究[13,22‒26]中所发现的。关于多黏菌素在老挝的使用情况，可用数据非常少，对科学文献的审查也没有提供其在老挝用于人医临床的证据[27‒28]。然而，多黏菌素在泰国和越南等邻国的家畜中已被广泛用于预防疾病[9,12]。农业养殖动物已被证明是最常见的mcr来源，如最近在中国和老挝所描述的[6,13]；然而，在我们的研究中，mcr在人类中的患病率最高，来自万象Xaythany和Xaysetha的人类样本表明这两个地区产生最高的mcr率（表1、图S1和表S5）。这一结果不太可能是由多黏菌素在人类中的临床使用引起的，这在老挝非常罕见，但可能与食物链和环境的污染有关，苍蝇可能参与了mcr基因的传播[表2、图S1（b）]。有趣的是，我们发现MCRPEC的存在与拥有家畜的参与者之间存在显著的相关性（p < 0.05）（表S6），这表明动物与人类之间存在传播联系[40]。

大肠杆菌是一种机会致病菌，有利于包括人类在内的各种动物的肠道菌群，也可以在土壤和水生环境中持续存在[29]。这项研究中大肠杆菌耐药性的表型和基因组筛选为了解老挝MDR细菌的普遍性提供了依据。尤其令人担忧的是，14.6%的受试大肠杆菌（MCRPEC, n = 98）对临床上重要的抗菌药物类别（β-内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类）表现出高耐药率，此外还有世界卫生组织上市的“储备”抗生素多黏菌素（表3、图1和表S7）[30]。

如其他地方所述，包括在老挝[6,13]，mcr的水平传播在各种环境传播中发挥了关键作用。我们还发现mcr在大肠杆菌STs中广泛存在（图2）。此外，通过短读和长读数据的杂交装配，我们分析了24个携带mcr的质粒，这证明了在老挝mcr在不同遗传背景和不同质粒背景方面复杂的水平传播（图3、图S1和图S3）。mcr-1的原始载体被认为是Tn6330 (ISApl1-mcr-1-pap2-ISApl1) [31,39]。本研究中鉴定的两个质粒（IncFIA和IncP1）具有mcr-1的经典特征（Tn6330）。IncI2上mcr-1.1下游ISApl1的存在也预测了插入序列（IS）衍生的mcr-1的移动，而IncX4、IncHI2、一个IncI2和一些IncP1上mcr-1附近ISApl1的缺失表明mcr-1在各种质粒背景中的稳定性[图3（a）和图S2] [32]。基于核苷酸位置和不同IS元件在不同质粒骨干中的分布，我们构建了老挝mcr-3移动的假设。我们假设mcr-3被ISKpn40、TnAs2或IS26捕获，随后分散到不同背景的质粒中[图3（b）和图S4]。虽然移动元件，如TnAs2和ISKpn40，通常被发现与mcr-3相关，但也有人描述了IS26介导的mcr-3的移动性[7,33]。其中，从老挝[25]分离株中分离到ISKpn40复合转座子（ISKpn40-mcr-3-dgka-ISKpn40）。高度相似的mcr携带质粒在不同采样区域的分布[例如，从人类和鸡的分离株中发现的IncHI2] [图S2（a）]；从人类、水、苍蝇和鸡中分离出的IncI2 [图S2（b）]；从人类、鸡和苍蝇分离的IncP1 [图S2（c）]；人、狗、鸡和苍蝇分离株中的IncX4 [图S2（d）]；人和蝇类分离株中的IncFII（图S4），表明可能存在质粒介导的宿主间传播以及苍蝇在老挝mcr传播中的潜在作用。值得注意的是，在老挝最近的一项研究[13]中携带IncX4的mcr-1.1（序列号：CP063335）和携带IncFII的mcr-3.5（序列号：CP063484）与本研究中发现的mcr阳性IncX4和IncFII质粒非常相似（覆盖率≥97%，同一性≥99%），这突出了质粒在老挝mcr传播中的主导作用。接合试验证实了本研究中检测的所有mcr阳性质粒的可转移性；然而，观察到了可转移性的变化（图4）。不成功的接合结果可以通过受体基因型和质粒背景的不同来解释[34]。我们选择的受体不具有与供体相似Inc类型的质粒，这潜在地排除了复制控制机制导致的接合失败（表S2和表S13）[41]。我们的研究结果表明，与大肠杆菌ST10、ST131或ST167相比，ST1193更倾向于获得mcr（图4、表S12）。还可能的是，含有mcr的IncHI2不能转移到大肠杆菌ST10、ST131或ST167中，因为其分子量大于250 kb（表S2和表S12）[37]。此外，ST1193的高接合率应作为高致病性克隆中出现mcr的警告（表S13）[19]。

分离后杀伤系统在接合质粒中普遍存在，这有助于质粒在细胞分裂期间在后代中的维持，并且可能受到质粒或适应性进化引起的适应性代价的影响[35‒36]。本研究中发现的质粒IncFII、IncHI2、IncI2、InP1和IncX4表现出适应性代价；然而，并不是在所有的接合子中都观察到这些效应，并且并不局限于特定的接合子STs（图6）。与早期的发现一致，与其他Inc型质粒相比，mcr阳性的IncHI2具有较高的分子量，并携带更多的ARG，这可能造成了适应性负担[图6、图S1（a）和图S2] [37]。尽管适应性代价有所不同，但除了BCS.1847:R3外，mcr阳性质粒在所有接合子中都是稳定的，无论Inc类型如何，也没有任何抗生素选择（图5）。一些接合子可以在没有选择压力[38]的情况下保持质粒50代。同样值得注意的是，尽管有显著的适应性代价，但IncHI2的质粒在经过15天的传代后仍然保持在低拷贝数（图5和图6）。

5、 结论

我们证明了mcr相关的多黏菌素耐药的高流行率，这似乎已在老挝广泛的宿主和环境中水平传播。这一发现意味着需要紧急实施跨越单个专业领域的理论和实际干预措施，包括该国医疗保健和农业部门的抗微生物药物管理计划，以阻止抗微生物药物耐药性的蔓延。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用
[1]

Review AMR. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations [Internet]. London: Review AMR; 2016 [cited 2021 Dec 20]. Available from: https://amr-review.org/.
[2]

Pitout JDD, Nordmann P, Poirel L. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae, a key pathogen set for global nosocomial dominance. Antimicrob Agents Ch 2015;59(10):5873‒84.
[3]

Wu W, Feng Y, Tang G, Qiao F, McNally A, Zong Z. NDM metallo-b-lactamases and their bacterial producers in health care settings. Clin Microbiol Rev 2019;32(2):e00115‒8.
[4]

Loho T, Dharmayanti A. Colistin: an antibiotic and its role in multiresistant Gram-negative infections. Acta Med Indones 2015;47(2):157‒68.
[5]

Shen Z, Wang Y, Shen Y, Shen J, Wu C. Early emergence of mcr-1 in Escherichia coli from food-producing animals. Lancet Infect Dis 2016;16(3):293.
[6]

Luo Q, Wang Y, Xiao Y. Prevalence and transmission of mobilized colistin resistance (mcr) gene in bacteria common to animals and humans. Biosaf Health 2020;2(2):71‒8.
[7]

Wang Z, Fu Y, Schwarz S, Yin W, Walsh TR, Zhou Y, et al. Genetic environment of colistin resistance genes mcr-1 and mcr-3 in Escherichia coli from one pig farm in China. Vet Microbiol 2019;230:56‒61.
[8]

Wang C, Feng Y, Liu L, Wei L, Kang M, Zong Z. Identification of novel mobile colistin resistance gene mcr-10. Emerg Microbes Infect 2020;9(1):508‒16.
[9]

Nguyen NT, Nguyen HM, Nguyen CV, Nguyen TV, Nguyen MT, Thai HQ, et al. Use of colistin and other critical antimicrobials on pig and chicken farms in southern Vietnam and its association with resistance in commensal Escherichia coli bacteria. Appl Environ Microbiol 2016;82(13):3727‒35.
[10]

Nakayama T, Jinnai M, Kawahara R, Diep KT, Thang NN, Hoa TT, et al. Frequent use of colistin-based drug treatment to eliminate extended-spectrum beta- lactamase-producing Escherichia coli in backyard chicken farms in Thai Binh Province. Vietnam Trop Anim Health Prod 2017;49(1):31‒7.
[11]

Davies M, Walsh TR. A colistin crisis in India. Lancet Infect Dis 2018;18(3):256‒7.
[12]

Lekagul A, Tangcharoensathien V, Mills A, Rushton J, Yeung S. How antibiotics are used in pig farming: a mixed-methods study of pig farmers, feed mills and veterinarians in Thailand. BMJ Glob Health 2020;5(2):e001918.
[13]

Moser AI, Kuenzli E, Campos-Madueno EI, Büdel T, Rattanavong S, Vongsouvath M, et al. Antimicrobial-resistant Escherichia coli strains and their plasmids in people, poultry, and chicken meat in Laos. Front Microbiol 2021;12:708182.
[14]

Wang Y, Zhang R, Li J, Wu Z, Yin W, Schwarz S, et al. Comprehensive resistome analysis reveals the prevalence of NDM and MCR-1 in Chinese poultry production. Nat Microbiol 2017;2(4):16260.
[15]

Yang Q, Li M, Spiller OB, Andrey DO, Hinchliffe P, Li H, et al. Balancing mcr-1 expression and bacterial survival is a delicate equilibrium between essential cellular defence mechanisms. Nat Commun 2017;8(1):2054.
[16]

The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 11.0 [Internet]. Copenhagen: The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing; 2021 [cited 2020 May 20]. Available from: http://www.eucast.org.
[17]

Matamoros S, van Hattem JM, Arcilla MS, Willemse N, Melles DC, Penders J, et al. Global phylogenetic analysis of Escherichia coli and plasmids carrying the mcr-1 gene indicates bacterial diversity but plasmid restriction. Sci Rep 2017;7(1):15364.
[18]

Day MJ, Hopkins KL, Wareham DW, Toleman MA, Elviss N, Randall L, et al. Extended-spectrum b-lactamase-producing Escherichia coli in human-derived and foodchain-derived samples from England, Wales, and Scotland: an epidemiological surveillance and typing study. Lancet Infect Dis 2019;19(12):1325‒35.
[19]

Wu J, Lan F, Lu Y, He Q, Li B. Molecular characteristics of ST1193 clone among phylogenetic group B2 non-ST131 fluoroquinolone-resistant Escherichia coli. Front Microbiol 2017;8:2294.
[20]

Yang QE, MacLean C, Papkou A, Pritchard M, Powell L, Thomas D, et al. Compensatory mutations modulate the competitiveness and dynamics of plasmid-mediated colistin resistance in Escherichia coli clones. ISME J 2020;14(3):861‒5.
[21]

Queipo-Ortuño MI, De Dios CJ, Macias M, Bravo MJ, Morata P. Preparation of bacterial DNA template by boiling and effect of immunoglobulin G as an inhibitor in real-time PCR for serum samples from patients with brucellosis. Clin Vaccine Immunol 2008;15(2):293‒6.
[22]

Rolain JM, Kempf M, Leangapichart T, Chabou S, Olaitan AO, Le Page S, et al. Plasmid-mediated mcr-1 gene in colistin-resistant clinical isolates of Klebsiella pneumoniae in France and Laos. Antimicrob Agents Chemother 2016;60(11):6994‒5.
[23]

Olaitan AO, Chabou S, Okdah L, Morand S, Rolain JM. Dissemination of the mcr-1 colistin resistance gene. Lancet Infect Dis 2016;16(2):147.
[24]

Okdah L, Le Page S, Olaitan AO, Dubourg G, Hadjadj L, Rolain JM. New therapy from old drugs: synergistic bactericidal activity of sulfadiazine with colistin against colistin-resistant bacteria, including plasmid-mediated colistin- resistant mcr-1 isolates. Int J Antimicrob Agents 2018;51(5):775‒83.
[25]

Hadjadj L, Baron SA, Olaitan AO, Morand S, Rolain JM. Co-occurrence of variants of mcr-3 and mcr-8 genes in a Klebsiella pneumoniae isolate from Laos. Front Microbiol 2019;10:2720.
[26]

Hernando-Amado S, Coque TM, Baquero F, Martínez JL. Defining and combating antibiotic resistance from One Health and Global Health perspectives. Nat Microbiol 2019;4(9):1432‒42.
[27]

Chansamouth V, Mayxay M, Dance DA, Roberts T, Phetsouvanh R, Vannachone B, et al. Antimicrobial use and resistance data in human and animal sectors in the Lao PDR: evidence to inform policy. BMJ Glob Health 2021;6(12):e007009.
[28]

Poupaud M, Putthana V, Patriarchi A, Caro D, Agunos A, Tansakul N, et al. Understanding the veterinary antibiotics supply chain to address antimicrobial resistance in Lao PDR: roles and interactions of involved stakeholders. Acta Trop 2021;220:105943.
[29]

van Elsas JD, Semenov AV, Costa R, Trevors JT. Survival of Escherichia coli in the environment: fundamental and public health aspects. ISME J 2011;5(2):173‒83.
[30]

World Health Organisation. WHO releases the 2019 AWaRe Classification Antibiotics [Internet]. Geneva: World Health Organisation; 2019 [cited 2020 Dec 20]. Available from: https://www.‍who.‍int/news/item/01-10-2019-who-releases-the-2019-aware-classification-antibiotics/.
[31]

Snesrud E, McGann P, Chandler M, Novick RP, Olaz F, Partridge S, et al. The birth and demise of the ISApl1‍‒‍mcr-1‍‒‍ISApl1 composite transposon: the vehicle for transferable colistin resistance. MBio 2018;9(1).
[32]

Wang R, van Dorp L, Shaw LP, Bradley P, Wang Q, Wang X, et al. The global distribution and spread of the mobilized colistin resistance gene mcr-1. Nat Commun 2018;9:1179.
[33]

Wang Z, Fu Y, Du XD, Jiang H, Wang Y. Potential transferability of mcr-3 via IS26-mediated homologous recombination in Escherichia coli. Emerg Microbes Infect 2018;7(1):1‒4.
[34]

Alderliesten JB, Duxbury SJN, Zwart MP, de Visser JAGM, Stegeman A, Fischer EAJ. Effect of donor-recipient relatedness on the plasmid conjugation frequency: a meta-analysis. BMC Microbiol 2020;20(1):135.
[35]

Yang QE, Walsh TR. Toxin-antitoxin systems and their role in disseminating and maintaining antimicrobial resistance. FEMS Microbiol Rev 2017;‍41(3):343‒53.
[36]

San MA. Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context. Trends Microbiol 2018;26(12):978‒85.
[37]

Ma K, Feng Y, Zong Z, Koraimann G. Fitness cost of a mcr-1-carrying IncHI2 plasmid. PLoS ONE 2018;13(12):e0209706.
[38]

Liu X, Lin J, Zhang Z, Bian J, Zhao Q, Liu Y, et al. Construction of conjugative gene transfer system between E. coli and moderately thermophilic, extremely acidophilic Acidithiobacillus caldus MTH-04. J Microbiol Biotechnol 2007;17(1):162‒7.
[39]

Li R, Xie M, Zhang J, Yang Z, Liu L, Liu X, et al. Genetic characterization of mcr-1-bearing plasmids to depict molecular mechanisms underlying dissemination of the colistin resistance determinant. J Antimicrob Chemother 2017;72(2):393‒401.
[40]

Lei L, Wang Y, He J, Cai C, Liu Q, Yang D, et al. Prevalence and risk analysis of mobile colistin resistance and extended-spectrum b-lactamase genes carriage in pet dogs and their owners: a popula- tion based cross-sectional study. Emerg Microbes Infect 2021;10(1): 242‒51.
[41]

Virolle C, Goldlust K, Djermoun S, Bigot S, Lesterlin C. Plasmid transfer by conjugation in Gram-negative bacteria: from the cellular to the community level. Genes 2020;11(11):1239.

基金资助

()

AI Summary AI Mindmap
PDF (3300KB)

Supplementary files

Supplementary Material

6943

访问

0

被引

详细
导航
相关文章

AI思维导图

/

〈 〉