IsPETase β片层结构的工程化改造实现PET解聚

高松枫 ,  石利霞 ,  韦泓丽 ,  刘岯 ,  赵伟 ,  龚兰玉 ,  谭子瑊 ,  翟欢欢 ,  刘卫东 ,  刘海峰 ,  朱蕾蕾

工程（英文） ›› 2025, Vol. 47 ›› Issue (4) : 192 -206.

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工程（英文） ›› 2025, Vol. 47 ›› Issue (4) : 192 -206. DOI: 10.1016/j.eng.2024.10.015
研究论文

IsPETase β片层结构的工程化改造实现PET解聚

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β-sheet Engineering of IsPETase for PET Depolymerization

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摘要

聚对苯二甲酸乙二酯（PET）酶解为废弃PET塑料的循环利用提供了一种可持续的方法。目前，大量研究致力于对PET解聚酶的底物结合裂隙及其表面环状结构/α螺旋进行工程改造。本文通过荧光高通量筛选方法，对Ideonella sakaiensis来源的PET水解酶（IsPETase）的整个β片层结构进行了系统性工程改造，共获得21个有益突变，并通过迭代重组进行优化。最佳变体DepoPETase β的熔解温度（Tm）提高了22.9 ℃，展现出优异的解聚性能，并在50 ℃下的生物反应器中，仅用4天即可实现100.5 g未处理的消费后PET（pc-PET；含0.26% Wenzyme/WPET）的完全脱聚。晶体解析和分子动力学模拟揭示，DepoPETase β的活性和热稳定性提升归因于突变后β片层区域氢键和盐桥的增强、核心片层与周围螺旋结构更紧密的排列，以及PET与活性位点结合能力的提升。本研究不仅证明了在PET水解酶的β片层区域进行分子改造的重要性，还为大规模PET回收提供了潜在的PET解聚酶。

Abstract

The enzymatic depolymerization of polyethylene terephthalate (PET) offers a sustainable approach for the recycling of PET waste. Great efforts have been devoted to engineering PET depolymerases on the substrate binding cleft and the surrounding loops/α-helices on the surface. Here, we report the systematic engineering of whole β-sheet regions in the core of IsPETase (a PETase from Ideonella sakaiensis) via a fluorescent high-throughput screening assay. Twenty-one beneficial substitutions were obtained and iteratively recombined. The best variant, DepoPETase β, with an increase in the melting temperatures (Tm) of 22.9 °C, exhibited superior depolymerization performance and enabled complete depolymerization of 100.5 g of untreated post-consumer PET (pc-PET; 0.26% Wenzyme/WPET enzyme loading) in liter-scale bioreactor at 50 °C within 4 d. Crystallization and molecular dynamics simulations revealed that the improved activity and thermostability of DepoPETase β were due to enhanced hydrogen bonds and salt bridges in the β-sheet region, a more tightly packed structure of the core sheets and the surrounding helix, and improved binding of PET to the active sites. This study not only demonstrates the importance of engineering strategy in the β-sheet region of PET hydrolases but also provides a potential PET depolymerase for large-scale PET recycling.

关键词

定向进化 / 高通量筛选 / PET酶 / PET解聚 / 热稳定性 / β片层结构工程化

Key words

Directed evolution / High-throughput screening / PETase / PET depolymerization / Thermostability / β-sheet engineering

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高松枫,石利霞,韦泓丽,刘岯,赵伟,龚兰玉,谭子瑊,翟欢欢,刘卫东,刘海峰,朱蕾蕾. IsPETase β片层结构的工程化改造实现PET解聚[J]. 工程（英文）, 2025, 47(4): 192-206 DOI:10.1016/j.eng.2024.10.015

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1 引言

聚对苯二甲酸乙二酯（PET）是由对苯二甲酸（TPA）和乙二醇（EG）合成的聚酯塑料，是目前应用最广泛的聚酯塑料之一[1‒4]。由于其优异的性能，如耐用性、轻便性和防水性，PET被广泛应用于纺织、包装、家电和医疗纤维等行业，全球每年生产PET的总量接近7000万吨[1‒4]。大量消费后PET（pc-PET）废弃物在自然环境中积聚，造成严重环境污染[5‒6]。此外，PET废弃物是微塑料的主要来源之一，通过海洋生物或哺乳动物进入食物链，对动植物及人类健康构成严重威胁[7‒10]。pc-PET废弃物的解聚与回收是实现资源可持续利用、减少对石油资源依赖的有效策略。与化学解聚方法相比，环保型PET生物解聚技术近年来备受关注[6,11‒14]。

近年来，研究人员鉴定并广泛研究了多种PET水解酶，包括脂肪酶[15‒16]、嗜热角质酶[17‒25]和中温IsPETase [26]等[6,27‒32]。大量研究致力于从数据库中筛选角质酶样或类IsPETase，以增加PET水解酶的数量和多样性[33‒52]。这些酶可催化PET水解为单（2-羟乙基）对苯二甲酸（MHET）、TPA和EG [49,53-55]。其中，叶堆肥角质酶变体LCCICCG [23]和最近开发的PET水解酶PES-H1L92F/Q94Y [33]在60~72 ℃的温度范围内表现出优异的解聚性能[49]。此外，IsPETase可在常温下特异性地水解PET [56‒58]。然而，IsPETase活性不足及稳定性欠佳限制了其在温和条件下实现工业规模酶促PET解聚工艺的发展。自2017年首次解析PETase晶体结构以来，对IsPETase的（半）理性设计已得到广泛开展[57,59]，并获得多个高度改进的变体，如ThermoPETase [60]、DuraPETase [61]、FAST-PETase [62]和DepoPETase [50,59,63‒70]（图1）。此外，IsPETase定向进化研究也取得了重大进展。研究人员采用超高效液相色谱（UPLC）进行IsPETase定向进化过程中的突变库筛选，成功获得了热稳定变体HotPETase [熔解温度（Tm） = 82.5 ℃]，该变体可在60 ℃下以0.29 mg∙g-1的酶量在24 h内实现PET/PE复合薄膜中半结晶PET 48.1%的解聚[71]。然而，直到最近，IsPETase的工程化区域主要集中在底物结合裂隙及其周围区域，这些区域由表面上的环结构和α螺旋组成（图1）[60‒63,71‒74]。IsPETase结构中埋藏的β片层区域及其周边区域鲜少被研究，仅有四个位点被报道：F229Y [65]、S282C [73]、M154G [71]和F201I [72]。考虑到IsPETase的折叠模式为由9个β片层组成的核心结构，两侧各由7个螺旋结构包围，IsPETase核心骨架的稳定性主要由核心片层与周围螺旋结构之间的相互作用强度决定[56]。此外，IsPETase的整体结构稳定性会影响蛋白质表面催化三联体的完整性[75]。因此，对β片层区域进行工程改造可能有助于提升IsPETase的稳定性和活性。此外，已有研究通过改造其他酶的β片层区域成功提升了其活性或稳定性[76‒78]。

本研究筛选了整个β片层区域的58个位点饱和突变（SSM）文库。通过采用序贯重组策略以及基于K均值聚类算法的组合策略，重组了有益的氨基酸突变。所得变体在温和条件下对不同pc-PET材料表现出显著提高的熔融温度和优异的解聚性能。此外，最佳变体在反应器中实现了对未处理pc-PET废料的完全解聚。

2 材料与方法

2.1 化学试剂与材料

本研究中所用的所有化学试剂均为分析纯或更高纯度，除非另有说明，均购自国药集团（上海）、阿拉丁公司（上海）或源叶生物公司（上海）。无定形PET薄膜（ES301445）购自Goodfellow GmbH（英国伦敦）。鸡腿包装盒购自当地超市（天津），汽水瓶盖购自肯德基（KFC）（天津）。通过将PETase基因（含信号肽pelB）插入pET22b（+）质粒的EcoRI和XhoI限制性位点构建质粒。TransStart FastPfu DNA聚合酶由TransGen Biotech（北京）提供，QuickCut Dpn I由Takara公司（北京）提供。寡核苷酸合成由Genewiz公司（天津）或Tsingke Biotechnology公司（北京）完成。DNA测序由Genewiz公司（天津）进行。

2.2 3-羟基-4-[（2-羟乙基）羰基]苯甲酸（MHET-OH）的合成与表征

首先，将1.82 g 2-羟基对苯二甲酸（TPA-OH）、0.5 mL硫酸和15 mL EG加入三口圆底烧瓶中。将烧瓶中的混合物在20 ℃下搅拌回流48 h。随后通过减压除去上清液，并通过柱色谱从残留物中分离出MHET-OH。合成的MHET-OH通过质子核磁共振（1H-NMR）进行表征。

2.3 高通量筛选实验的构建

按照先前报道的方法[63]测定MHET-OH和TPA-OH的荧光光谱。在320 nm的激发波长下，测定了2.5 mmol·L-1 MHET-OH和TPA-OH在350~850 nm发射波长范围内的荧光发射强度。选择TPA-OH产物显示显著荧光而MHET-OH底物产生最低背景荧光的波长作为最佳发射波长。随后，在最佳发射波长下，使用230~400 nm范围内的不同激发波长诱导激发，以确定最佳激发波长。随后，以MHET-OH作为底物检测粗酶pET22b-PETase的水解活性。向96孔黑色多层板（MTP）中加入15~50 μL的pET22b-PETase，并用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（0.1 mol∙L-1, pH = 8.0）补充至150 μL。然后，加入50 μL 10 mmol∙L-1 MHET-OH以启动反应。对照反应通过用表达载体pET22b的上清液替换粗酶制备。在30 ℃下，于320 nm（激发波长）和400 nm（发射波长）监测荧光强度，持续240 min [63]。

2.4 IsPETase β片层-SSM文库的构建

SSM文库采用标准聚合酶链反应（PCR）方法构建，以质粒pET22b-PETase野生型（WT）基因[53]作为模板。正向和反向引物分别采用退化密码子NNK和MNN（5'→3'）进行设计。PCR系统和操作流程按照说明书指示准备。PCR产物DNA模板经QuickCut Dpn I（Takara Bio，北京）消化后，将产物转化至大肠杆菌BL21-Gold（DE3）感受态细胞。筛选阳性克隆进行进一步研究。

2.5 IsPETase β片层-SSM文库在96孔板中的培养与表达

IsPETase β片层-SSM文库的培养与表达在96孔MTP中进行，具体方法参见先前报道[53]，但粗酶通过4 ℃离心20 min收集。

2.6 采用MHET-OH试剂盒对IsPETase β片层-SSM文库进行筛选

IsPETase β片层-SSM文库的筛选使用了新底物MHET-OH。检测水解活性的筛选按照先前描述的方法进行[63]，但将双（2-羟乙基）2-羟基对苯二甲酸（BHET-OH）替换为MHET-OH（2.5 mmol·L-1）。PETase的活性通过每分钟荧光强度（Flu∙min-1）的线性增加来表示。变体与WT的活性比值代表相对活性。对于热稳定性筛选，将120 μL的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（0.1 mol∙L-1, pH = 8.0）与30 μL的表达上清液混合于96孔黑色MTP中，随后在47/50 ℃下加热10 min。室温冷却10 min后，加入2.5 mmol∙L-1 MHET-OH启动反应[53,63]。残留活性（%）以热处理后活性与未热处理后活性的比值表示。

2.7 采用MHET-OH试剂盒在摇瓶中对IsPETase变体进行重新筛选

摇瓶培养和表达按照先前报道的方法进行[53]。相对活性和残留活性采用MHET-OH试剂盒按照上述程序进行测定。

2.8 IsPETase WT及变体的纯化

PETase WT及变体的表达、粗酶的收集与浓缩以及纯化均按先前描述的方法进行[63]。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胺电泳（SDS-PAGE）确定目标蛋白的纯度。使用BCA蛋白测定试剂盒（Genstar公司，北京）定量目标酶溶液的浓度。

2.9 表观Tm的测定

PETase WT及其变体的表观Tm使用Protein Thermal Shift染料试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行测定。反应体系按照制造商的说明进行制备。使用ABI 7500 FAST实时聚合酶链反应系统（Applied Biosystems，美国）。通过电荷耦合器件（CCD）监测蛋白质热变性引起的荧光信号变化。采用一阶导数曲线确定Tm值。

2.10 Geodfellow无定形-PET的长期解聚

将一块0.8 cm × 0.8 cm的商用 Goodfellow 无定形（gf）-PET薄膜浸泡在2940 µL的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（0.1 mol∙L-1, pH = 8.0）中，加入60 µL的纯化酶（0.5 mg∙mL-1）[63]。随后，在37 ℃和50 ℃下进行7天的解聚反应。在1天、5天和7天时移除反应溶液，并煮沸10 min以终止反应。每个样品被稀释至TPA和MHET的线性检测范围，然后通过0.22 µm滤膜过滤，进行HPLC分析[63]。每个实验均使用三份重复样品计算平均值。

2.11 扫描电子显微镜（SEM）分析gf-PET薄膜的表面形态和厚度

经WT和突变体PETase处理10天后，gf-PET薄膜依次用1% SDS溶液、乙醇和蒸馏水洗涤20 min。干燥后，使用日立公司（日本）的SU8010扫描电子显微镜在高真空条件下，以5 kV的束流加速电压观察样品表面形态和厚度。

2.12 使用gf-PET和未处理的pc-PET进行完全解聚实验

制备尺寸为0.8 cm× 0.8 cm的正方形gf-PET和两种类型pc-PET薄膜，将其浸泡在36 μL的0.5 mg∙mL-1 PETase WT或其变体中，溶于2964 μL的甘氨酸-NaOH缓冲液（0.1 mol∙L-1, pH = 9.0）。解聚反应在50 ℃下进行。每天添加新鲜酶和缓冲液。每天的反应混合物被稀释至TPA和MHET的线性检测范围以进行定量分析。所有实验均重复三次。

2.13 DepoPETase β（V20）、FAST-PETase和DepoPETase对gf-PET薄膜在50~60 ℃下的解聚性能比较

制备直径为0.6 cm的圆形gf-PET薄膜，并将其与DepoPETase β（V20）、FAST-PETase和DepoPETase（60 μL, 0.5 mg∙mL-1）一同在甘氨酸-NaOH缓冲液（2940 μL, 0.1 mol∙L-1, pH = 9.0）中浸泡。反应在50 ℃、55 ℃和60 ℃下进行。新鲜酶和缓冲液在24 h和72 h后补充，每天收集样品。收集的溶液在定量分析前稀释至TPA和MHET的线性检测范围。所有实验均重复三次。

2.14 3 L生物反应器中pc-PET废料的完全解聚

将100.5 g pc-PET（来自当地超市的包装材料）制成矩形片状（约为0.5 cm× 1 cm），然后加入到含有甘氨酸-NaOH的缓冲液（2 L, 0.1 mol∙L-1, pH = 9.0）中[63]。在解聚过程中，分批加入总计260 mg的纯化DepoPETase β（0.26% Wenzyme/WPET）。温度控制在50 ℃，通过水浴浸泡实现，并以500 r∙min-1的恒定搅拌速度由单级离心叶轮搅拌器控制。反应溶液的pH值通过蠕动泵添加2 mol∙L-1 NaOH溶液调整至8.6 ± 0.2。反应溶液在不同时间点收集，并稀释至TPA和MHET的线性检测范围以进行HPLC分析。

2.15 高效液相色谱分析

PET样品释放产物的定量分析按照先前报道的方法进行[63]。流动相由缓冲液A（Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，20 mmol∙L-1, pH = 7.0; 70%）和缓冲液B（乙腈；30%）组成。洗脱条件为缓冲液B从30%线性梯度升至70%。TPA和MHET在260 nm波长下检测[63]。通过测定各产物（TPA和MHET）标准溶液浓度与对应峰面积的关系，构建校准曲线，其R²值均不低于0.998。若产物浓度超出校准曲线范围，则对样品进行稀释。

2.16 通过差示扫描量热法（DSC）测定PET样品的结晶度

PET材料的结晶度采用差示扫描量热仪（DSC 250, TA Instruments，美国）测定，结晶度计算方法如前所述[63]。结果见附录A中表S1。

2.17 序列一致性分析

通过ClustalW对与IsPETase具有40%~100%同源性的序列进行氨基酸序列比对，这些序列来自NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）[61]。随后，使用WebLogo网页（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）[79]将序列比对结果可视化为logo图。通过在线工具ConSurf（https://consurf.tau.ac.il/）[81‒83]，利用PETase WT的晶体结构（PDB ID: 5XJH）[80]及多序列比对结果，构建PET水解酶β片层区域的进化保守性轮廓。结构映射由PyMOL程序[84]完成。

2.18 能量计算

使用FoldX [85]对IsPETase的晶体结构（PDB ID: 5XJH）进行了能量计算。PETase β片层区域上的所有58个残基均在体外被突变为19种其他蛋白质氨基酸[61]。相对折叠自由能变化（ΔΔGFold）基于以下方程计算[61]：

ΔΔGFold = ΔGsubstitutionFold - ΔGWTFold

折叠结构与展开结构之间的自由能差异即为折叠自由能（ΔGFold）[61]，该值由FoldX算法[85]预测。除温度设置为50 ℃外，其他标准参数均保持默认值，并采用五次计算的平均值。

2.19 结晶、数据采集、结构确定与精修

所有PETase变体的结晶均采用蒸气扩散法（25 ℃）进行。取1 μL PETase V16（IsPETaseD283R/V84L/N233K/F229Y/R280E/F201I/E204Q）或PETase V20（IsPETaseD283R/V84L/N233K/F229Y/R280E/F201I/R53Q/D186H）溶液（30 mg∙mL-1，溶于25 mmol∙L-1 Tris-HCl, pH = 7.5, 150 mmol∙L-1 NaCl，其中Tris-HCl为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）与等体积的储液在坐滴结晶板中混合，并平衡至储液（100 μL）。PETase V16的结晶条件如下：0.1 mol∙L-1N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES），pH = 7.5，8%（V/V）乙二醇，10%（w/V）PEG 8000， 0.2 mol∙L-1 (NH4)2SO4。对于PETase V20，采用以下条件：0.2 mol·L-1 KF，pH = 7.2，以及20%（w/V）PEG 3350。最佳晶体在5天内达到适合X射线衍射数据收集的合适尺寸。X射线衍射数据集在上海同步辐射光源（SSRF）的国家蛋白质科学研究设施（NFPS）的BL02U1（BL17U）、BL10U2、BL17B、BL17UM、BL18U1和BL19U1光束线进行测试和采集。蛋白质晶体在数据采集前浸泡于冷冻保护剂溶液中并固定于冷冻环，采集温度为100 K。所有衍射图像均通过HKL2000 [86]进行处理，结构通过Phenix [88]软件包中的Phaser [87]进行分子置换法解析。Ideonella sakaiensis 201-F6来源的IsPETase（PDB ID: 5XG0）[57]的结构被用作搜索模型。模型构建和进一步的结构精修使用程序phenix.refine [89]和Coot [90]完成。随机选取5%的反射用于Rfree计算[91]。附录A中表S5显示了衍射数据收集和结构精修的统计数据。所有图均使用PyMOL软件制作[84]。

2.20 分子对接

分子对接使用Schrödinger 2018软件进行。PETase WT的晶体结构（PDB ID: 5XJH）[80]被用作受体蛋白。4-聚PET（4PET）被对接至三个系统：WT在结合位点1（WTB1），WT在结合位点2（WTB2）以及R53Q在结合位点2（Q53B2）。结合位点1为催化位点（以S160为中心）。结合位点2为结合区域，其中残基R53位于该区域，以残基F55为中心。结合盒的长度设置为35 × 35 × 35（Å）。在Schrodinger中使用诱导契合对接方法对接4PET、受体和配体，范德华力缩放因子设置为0.30，并对距离配体构象约5.0 Å的残基侧链进行精修。最多进行20次对接构象。

2.21 分子动力学（MD）模拟

所有突变体均使用Schrodinger软件的mutate模块构建。分子动力学模拟使用Amber20软件进行。模拟系统采用Protein.ff19SB和Gaff2力场构建。对于4PET结合能计算，对三个系统（WTB1、WTB2和Q53B2）在310 K下进行了50 ns的MD模拟。通过MM-GBSA计算评估结合能。

对于结构稳定性分析，对所有八个系统（R53Q、V84L、F201I、F229Y、N233K、R280E、D283R 和 DepoPETase β）进行了 1000 ns的分子动力学模拟。模拟的前100 ns设置为310 K，以使变体有足够时间实现由氨基酸突变引起的构象变化，随后900 ns的模拟设置为370 K。采用4 fs积分时间的氢质量重新分配（HMR）模拟，以考察高温下结构稳定性的变化。我们启动能量最小化步骤以消除初始结构中的不利相互作用。在此步骤中，蛋白质主链通过20 kcal∙mol-1的谐振力常数进行约束。且最小化步骤包含1500步最速下降法最小化和1500步共轭梯度法最小化。能量最小化后，系统在500 ps的分子动力学模拟中逐步加热至310 K，约束条件为5 kcal∙mol-1，积分时间步长为2 fs。加热阶段结束后，结构在无约束条件下于恒定的颗粒数、压力和温度（NPT）条件下平衡500 ps。整个系统采用TIP3P水模型[92]设置周期性边界条件。对于静电相互作用的长程成分，我们结合AMBER软件包[93]使用粒子网格Ewald（PME）方法。在分子动力学模拟中，涉及氢的键通过SHAKE算法[94]进行约束。温度控制通过朗之万热浴实现，其碰撞频率为2 ps-1，而压力则由各向异性蒙特卡洛气压计[95]调节。模拟通过在NVIDIA GeForce RTX 30系列显卡上运行的GPU加速版PMEMD [96]加速完成。

2.22 均方根波动计算

使用每个系统900 ns（370 K）的HMR MD轨迹计算均方根波动（RMSF）值，每个系统包含225 000帧。为确定用于比较的主链参考结构，每个系统的初始结构被用作平均坐标数据集计算的参考结构。初始结构是使用Amber进行最小化步骤后获得的构象。

3 结果与讨论

3.1 基于MHET-OH的新型高通量筛选系统的建立

我们此前已证明，基于BHET-OH水解的BHET-OH检测方法可用于PET酶的工程改造[63]。遵循类似原理，我们设计并合成了另一种新化合物——MHET-OH，其芳香环上相较于MHET多了一个羟基（附录A中图S1），用于PETase β片层区域饱和突变库的筛选。PETase将MHET-OH的酯键水解，释放荧光TPA-OH，通过定量测定此荧光产物可评估PETase的活性[图2（a）]。与BHET-OH检测相比，MHET-OH检测的优势在于，仅需水解MHET-OH的一个酯键即可释放荧光TPA-OH，而使用BHET-OH作为底物时则需要双水解裂解。因此，MHET-OH检测可实现对PETase水解过程的更快速监测。

我们首先研究了MHET-OH底物和TPA-OH产物的激发和发射光谱。如图2（b）所示，当以320 nm激发时，MHET-OH的最大发射波长相对于TPA-OH向右偏移了30 nm。由于TPA-OH的荧光强度在400 nm处可与MHET-OH明显区分，因此检测TPA-OH时采用的激发和发射波长分别为320 nm和400 nm。荧光信号响应与TPA-OH和MHET-OH浓度呈线性相关（R2 = 0.98），浓度范围为0~2.5 mmol∙L-1，激发波长为320 nm，发射波长为400 nm（图S2）。随后，我们通过监测荧光信号的持续增加来检测野生型PETase对MHET-OH的活性。如图S3所示，随着水解反应的进行，荧光强度逐渐增加，证实了所开发的MHET-OH检测方法的适用性。我们进一步测量了PETase WT在45 ℃、47 ℃和50 ℃热处理后的残留活性。WT在45 ℃、47 ℃和50 ℃下孵育10 min后，分别保留了63.3%、38.2%和5.95%的残留活性（图S4）。47 ℃的热处理较为适宜，因为它为热稳定性的提升提供了合适的空间，而45 ℃稍显温和，50 ℃则对PETase WT过于严苛。因此，选择47 ℃进行热稳定性筛选。

3.2 PETase β片层区域的工程改造以提升水解活性和热稳定性

我们构建了包含58个氨基酸残基的SSM文库，这些残基构成了PETase的β片层区域及其周边区域。每个SSM文库通过MHET-OH测定法筛选了200个克隆（图S5）。经过对约12 000个克隆的首次筛选及对157个克隆的重新筛选后，共鉴定出10个位置的21个氨基酸突变，这些氨基酸突变可改善水解活性或热稳定性，如图3（a）所示。其中，14个氨基酸突变（R53A/Q/H、S54T、T56E、E204Q、N233S/M/F/G/L和R280Y/E/F）在30 ℃下对MHET-OH的活性显著增强，较PETase WT提高了1.1~1.7倍。此外，19个热稳定性氨基酸突变，包括R53A/Q/H、S54T、T56E、V84L、F201I、E204Q、F229Y、N233K/S/M/G/F/L、R280S/A/E和D283R，与WT（46.7 ℃）相比，其Tm值提高了1.3~10.0 ℃ [图3（b）]。其中，S54T、T56E、F201I和R280S/A突变体在47 ℃下热处理10 min后保持了38.1%~64.5%的活性，而野生型仅保持28.5%的活性。R280E、V84L、E204Q、F229Y、N233K/S/M/G/F/L和D283R突变体在50 ℃下热处理10 min后保持了12.4%~85.2%的活性，而野生型几乎完全丧失活性（图S6）。随后，我们分析了每个SSM文库的致死率，以评估β片层区域这58个位置对PETase活性和热稳定性的影响。如图3（c）所示，根据SSM文库的致死率，将58个氨基酸位置分为三组。第一组（红色三角形）包含热处理前后致死率均低于50%的氨基酸位置。这些位置在热处理前后显示出相似的致死率水平，但E204、E231和A152除外。第一组的致死率相较于第二组和第三组相对较低，表明第一组中的大多数残基对氨基酸突变具有较高的灵活性，且不太可能对酶活性或热稳定性产生负面影响。此外，60%的已识别有益位置（包括R53、T56、E204、F229、N233和R280）属于第一组。第二组（黄色圆圈）中的大多数残基在热处理前致死率低于50%，但在热处理后致死率远高于50%，这表明这些残基在热稳定性方面更为保守，而在活性方面则较不保守。值得注意的是，两个具有改善热稳定性的突变位点（S54T和D283R）属于第二组。第三组（绿色方块）包括热处理前致死率高于60%且热处理后致死率相似或更高的位点，这表明第三组中的大多数残基在活性方面高度保守，而在热稳定性方面保守性较低。已识别的突变F201I和V84L属于第三组，其活性分别比WT低8.6%和29.8%，而其Tm值分别比WT高4.3 ℃和3.8 ℃。序列一致性分析[图3（d）和图S7]显示了β片层区域残基的多样性，这与致死率分析结果一致。此外，对β片层区域这58个位置的FoldX分析显示，我们识别出的57%的氨基酸突变导致ΔGFold降低，而43%导致ΔGFold增加，这表明实验数据与FoldX分析之间存在部分一致性（图S8）。总体而言，这些结果为PETase β片层区域氨基酸残基的可变性和贡献提供了全面见解，这对扩展PETase工程领域具有重要价值。

在识别出β片层区域的单氨基酸突变后，通过迭代重组21个氨基酸突变位点（共10个位置）的序列，采用序列重组策略[图4（a）]和K均值聚类算法指导的组合策略（补充文本和图S9）并行进行，以获得进一步优化的变体。随着重组步骤中热稳定性的进一步提高，通过在热失活步骤中逐步提高热处理温度（47~60 ℃）或时间（10~25 min）来增加筛选压力，以评估组合变体。顺序重组产生了多个优秀的变体供进一步表征，重组过程如图4（b）所示。首先选取四个最稳定的突变位点（N233K、D283R、F229Y和V84L）进行系统性重组研究，生成所有11种可能的组合变体（V1~V11）（表S1）。V11（V84L/F229Y/N233K/D283R）的水解活性降低了约50%，但其Tm提高了17.1 ℃，并在47 ℃下热失活15 min（或更严苛条件：55 ℃下15 min）后仍保留约94%的活性（表S2）。建议选择热稳定性更高的变体作为后续积累的模板，以避免酶变性[61]。因此，V11被视为第二轮重组的模板。剩余的10个氨基酸突变（R53A/H、S54T、T56E、F201I、E204Q和R280F/A/S/E）与V11结合，产生了最佳变体V12（V11 + R280E），其热稳定性略有下降，但与V11相比，活性恢复率达到100%。随后，V12被选为第三轮重组的新模板，与剩余5个位置的突变结合，即R53A/H/Q、S54T、T56E、F201I和E204Q。在第三轮中，变体V13（V12 + F201I）表现出最高的热稳定性（在60 ℃下加热10 min后残留活性为95.0%），但与V12相比活性降低了50%以上，而变体V14（V12 + S54T）和V15 （V12 + R53H）与V12相比，热稳定性提高了9.1%，水解活性提高了18.8%。综合考虑热稳定性和活性，V13、V14和V15被用作下一阶段的模板。在第四轮中，将突变位点E204Q、R53Q/A/H、T56E和S54T引入V13，产生了六个V13衍生变体，这些变体在热处理（60 ℃, 20 min）后残留活性略有下降（1.6%~14.8%），但与V13相比，活性最高可提高34.3%。本研究中，选取了两个变体进行进一步表征：V16（V13 + E204Q），其热稳定性和活性略有下降；V17（V13 + R53Q），其活性比V13高出34.3%。然而，对V14引入突变（R53A/Q、T56E和E204Q）显著降低了其热稳定性（经60 ℃热处理20 min后，热稳定性降低12.5%~39.4%）。将T56E、S54T和E204Q引入V15后，其残留活性提高了1.8~2.3倍。特别是，变体V18（V15 + T56E）和V19（V15 + S54T）显示出100%的活性恢复。此外，代表性组合变体（V11、V13、V14、V16~V19）在重组关键阶段的Tm值与WT相比增加了16.9~18.6 ℃ [图4（c）]，这与图4（b）中热失活实验的结果基本一致。随后，Tm值增幅最大的V17（ΔTm = 18.6 ℃）与先前报道可提高热稳定性和水解活性的D186H突变相结合[60‒61,72‒73]，MHET-OH测定表明，所得变体V20在30 ℃时与WT均具有100%的恢复活性，且在60 ℃下热处理25 min后，其残留活性比V17高30.7%。V20的Tm值较V17提高了4.3 ℃ [图4（b）和（c）]。

为了尽可能覆盖更多的重组组合，我们同时进行了基于K均值聚类算法指导的重组[86]和顺序重组（图S9）。如图S9（a）所示，21个单点突变被分为三个聚类（聚类1：D283R，N233K/S/L/M/G/F，E204Q；聚类2：V84L，F201I，R53A，R280A/Y/F/S/E；聚类3：R53Q/H，S54T，T56E，F229Y），通过一组参数进行分组，包括实验验证的相对活性、残留活性、突变的表达水平、突变之间的相互作用（如氢键和盐桥相互作用）、突变的位置（由突变的Cα原子与催化三联体之间的距离确定）、是否靠近PET结合口袋以及对结构的潜在影响（表S3）。然而，经过五轮重组后，所有产生的变体与通过并行进行的顺序重组策略获得的V11相比，热稳定性显著降低（残留活性降低17.9%~81.5%）。因此，基于K均值算法的重组策略被终止[图S9（c）]。通过序列重组策略获得的变体进一步进行了特性分析。

3.3 PETase变体对gf-PET的解聚性能

在获得具有显著改善性能的变体后，我们进一步研究了关键变体（包括V11、V13、V16、V17和V20）对商业级无定形PET薄膜（供应商为Goodfellow）的解聚性能，实验在3 mL反应体系中进行，未控制pH值，反应温度为37 ℃和50 ℃。尽管V17的Tm比V16高0.4 ℃ [图4（c）]，但其解聚性能低于V16。如图5（a）所示，与PETase WT相比，PETase变体介导的总释放产物浓度在37 ℃时增加了5.9~12.5倍，在50 ℃时增加了139.2~179.4倍（经过7天的孵育）。值得注意的是，在50 ℃时，五个变体与37 ℃时的活性相比增加了3.5~6.9倍，而野生型仅为37 ℃时活性的26%。总体而言，V20表现出最高的PET解聚性能。这些结果进一步验证了所识别变体显著增强的热稳定性。此外，即使在视觉水平上，也观察到用PETase变体和WT处理的gf-PET薄膜表面存在明显差异。经V16和V20变体处理的gf-PET薄膜表面形态在37 ℃和50 ℃下均比经WT处理的薄膜更粗糙且透明度更低（图S10）。通过SEM对表面形态进行了详细分析，如图5（b）所示，在37 ℃和50 ℃下，V16/V20处理的gf-PET薄膜表面均出现严重侵蚀，且孔洞显著增大并具有可扩张性；而WT处理的gf-PET薄膜表面在37 ℃下观察到少量微小孔洞，在50 ℃下未见此现象。此外，通过SEM测量了酶处理的gf-PET薄膜的厚度，与仅用缓冲液处理的对照组相比，V16和V20处理的gf-PET薄膜厚度在37 ℃时减少了30.6%，在50 ℃时减少了25.6%~57.5%，而WT在37 ℃时仅观察到4.3%的厚度减少（表S4）。

3.4 未处理的pc-PET废料的解聚

除了文献中常用的商业PET膜外，探索变体对未处理的pc-PET废料的解聚性能至关重要。在优化反应条件下，于50 ℃的3 mL反应体系中，对无定形gf-PET薄膜及两种pc-PET样品（当地超市鸡腿包装盒，结晶度为7.6%；肯德基可乐瓶盖，结晶度为4.8%）进行了酶促解聚（表S5）。所有PET薄膜均被切割成正方形（0.8 cm× 0.8 cm）。此外，对纯化变体V16和V20的解聚性能与已报道的特性良好的FAST-PETase（图S11）进行了比较，后者显示出更优的解聚性能[62]。如图6（a）~（c）和图S12所示，变体V16、V20和FAST-PETase均在4~7天内实现了对gf-PET薄膜（6.2 g∙L-1）、鸡腿包装盒（6.9 g∙L-1）和汽水瓶盖（8.8 g∙L-1）的完全解聚，而PETase WT在相同条件下未能实现完全解聚。此外，变体V16的完全解聚时间比V20和FAST-PETase更长。V20的活性与FAST-PETase相当，且在解聚gf-PET、鸡腿包装盒和汽水瓶盖时，分别比PETase WT产生了364.1倍、305.3倍和72.3倍的产物。值得注意的是，进一步比较解聚性能显示，V20在55 ℃和60 ℃时的活性均高于FAST-PETase [62]和DepoPETase [63]，如图S13所示。经过2天的孵育，尽管V20、FAST-PETase和DepoPETase在55 ℃下释放的总解聚产物量相似，但V20的初始反应速率比FAST-PETase和DepoPETase高出1.7倍。在60 ℃下，经过4天孵育后，V20释放的产物量分别比FAST-PETase和DepoPETase多6.6倍和4.4倍。此外，V20的Tm比DepoPETase高3.5 ℃，表明V20具有更优异的热稳定性。有趣的是，当我们将底物量从5 mg/3 mL增加到150 mg/3 mL时，V20在50 ℃下的性能略优于55 ℃。可能因更高的底物量需要更长的时间进行水解，而50 ℃对DepoPETase β更为理想，尽管其在55 ℃时的初始反应速率高于50 ℃（图S14）。上述结果促使我们进一步研究变体PETase V20的应用，此变体被命名为DepoPETase β。

为了进一步证明DepoPETase β在PET废物解聚过程中的适用性，我们在3 L生物反应器中对未经处理的pc-PET（来自当地超市的零食包装，100.5 g）进行了放大解聚实验，反应温度为50 ℃，pH值自动调节控制。初始反应体积为2 L。如图6（d）~（e）所示，DepoPETase β在96 h内以0.26%的酶量（Wenzyme/WPET）实现了PET碎片的完全解聚。释放的产物量在最初72 h内呈线性增加，且获得了83%的产物。96 h后，尽管MHET和TPA的总量不再进一步增加，但TPA与MHET的比例发生了动态变化。TPA的比例从96 h的79.2%增加到144 h的96.6%，表明DepoPETase β在降解的后期阶段进一步将水解产物MHET水解为TPA，这可以简化解聚产物的后续纯化和回收，以实现实际应用。这些结果表明，DepoPETase β是PET废物酶促解聚中具有前景的催化剂。

3.5 DepoPETase β增强性能的分子机制

为阐明变体增强的PET解聚性能的分子机制，分别以1.92 Å和2.0 Å的分辨率解析了变体V16（PDB ID: 8H83）和DepoPETase β（PDB ID: 8J5N）的晶体结构（表S6）。根据晶体结构和分子动力学模拟分析，与野生型相比，DepoPETase β在环B（116~119）、环C（185~190）、环E（237~244）和环F（276~281）区域的RMSF值显著降低，其他区域也出现轻微下降[图7（b）]。显著降低的RMSF值表明，DepoPETase β的整体结构稳定性优于WT。特别是，DepoPETase β在催化残基H237所在的环E以及形成底物结合口袋的环C中表现出显著的稳定性提升。环E和环C稳定性的增强将改善催化三联体的结构完整性，从而提升PETase的解聚性能。

我们对单点突变R53Q、V84L、F201I、F229Y、N233K/F、R280E、D283R以及DepoPETase β进行了分子动力学模拟，以分析每个氨基酸突变引起的结构变化。如图7（c）所示，当β9的Asp283被Arg替换时，位于β9上的邻近单盐桥（D283-R285）转变为由β8和β9之间的E231-R283以及α5和β9之间的D220-R285组成的双盐桥。此外，α5的N212与β9的R283之间形成了一个氢键。这些变化稳定了包含催化残基H237的环E [图S15（a）]，同时消除了β8的E231与β9的D283之间的静电排斥，从而实现了三重益处。当β8的229位Phe被Tyr替换时，E231可与Y229和S282形成氢键。引入的氢键稳定了E231和S282的氢键网络。此氢键网络的构建导致了β7、β8和β9片层的相对位置发生调整，尤其在β9的起始部位（S282所在位置）。β9片段起始端与β7片段末端之间的距离从WT的9.0 Å缩短至变体DepoPETase β的7.8 Å [图7（d）]。缩短的距离有利于环E（与β8连接）和环F（与β9连接）的稳定性，这体现在它们显著降低的RMSF值上[图S15（b）]。如图7（e）所示，R280E利用水分子与N246形成桥接氢键。此外，R280E还可与T279形成氢键。这一新引入的氢键网络增强了环E与环F之间的相互作用，从而提高了环E的结构稳定性。这可从图S15（c）的RMSF分析中观察到，其中环E的RMSF值有适度降低，而环F的RMSF值仅有轻微降低。位于β7上的大型刚性疏水残基F201，连同周围主要由Leu和Ile组成的疏水残基，阻止了α6与β7的完全接触。相比之下，F201I使α6更接近β7，导致PETase有更紧密的结构堆积[图7（f）和图S15（d）]。关于V84L，WT中残基V84周围存在两个空隙，这影响了β4与α3之间的相互作用强度，导致环B的稳定性不足。通过将残基84处的Val替换为Leu，上述两个空隙消失[（图7（g）]。与WT相比，变体V84L中环B的113~119位点的RMSF降低，表明结构稳定性增强[图S15（e）]。将β8边缘附近的N233替换为K233，形成了E204与K233之间的盐桥，中和了电荷，维持了E231与S282之间氢键的稳定性，并消除了所有不利影响，如E204与E231之间的静电排斥[图7（h）]。N233K也在Lu等[62]的研究中被报道，与我们的独立研究时期重合。此外，我们观察到将233位点替换为疏水残基（如N233F/L/M）也具有稳定化作用[图3（b）]。以N233F为例，我们可以看出F233占据了S282上方的空间，将E204推开，使E204能够与N205和G234形成氢键。尽管N233F引起的相互作用增强程度不如N233K显著，但N233F仍是一种有效的突变方式，可减少静电排斥。

从DepoPETase β的晶体结构中观察到，D283R形成新的盐桥，而V84L填补了允许水分子渗透的空隙。F229Y和R280E均建立了氢键网络。这些结果与单点突变的分子动力学模拟结果相似。然而，DepoPETase β晶体结构中的N233K和F201I与分子动力学模拟结果存在差异[图S16]。在N233K单点突变的模拟体系中，N233K可直接与E204形成盐桥，或通过水分子介导间接形成盐桥；而在DepoPETase β中，K233与附近带负电的残基E204、E280均无相互作用，这与突变体稳定性提升的结果似乎矛盾。对DepoPETase β进行MD模拟后发现，N233K可与T279的主链羰基形成氢键，进而强化由K233、N246、T279、E280及一个水分子共同构成的氢键网络。此外，F201I突变未导致DepoPETase β晶体结构的主链构象发生可见变化。

PETase的底物结合表面整体带正电，正电荷主要分布在两个凹槽区域：一个是底物的催化位点；另一个位于β1侧，且两个区域均包含强正电区域。对于位于β1上的R53Q突变，MD模拟显示，野生型中R53与PETase其他部分无潜在氢键或盐桥相互作用。将4PET底物对接至PETase WT的两个凹槽区域后发现，4PET在催化位点的MM-GBSA结合能为(-36.15 ± 3.17) kcal∙mol-1，在β1结合位点的结合能为(-32.79 ± 3.16) kcal∙mol-1。两个位点的结合能相近，导致它们之间存在潜在的底物结合竞争。R53Q突变破坏了R53与4PET羧基间的盐桥相互作用，这一点体现在4PET与β1位点的结合能降低[(-32.79 ± 3.48) kcal∙mol-1]，如图7（i）所示。结合能的变化减少了β1位点对底物的竞争性结合，从而提高了底物与催化位点结合的概率，最终增强酶活性。对比单突变位点的模拟结果与DepoPETase β的晶体结构可见，D283R、V84L、F229Y、R280E这四种突变引起的模拟结构变化，与DepoPETase β晶体结构的实际变化一致。

总体而言，在PET酶的9个β片层区域中，β1~2和β8~9位于酶的表面，其残基部分暴露，这两个区域的稳定性依赖于强氢键和盐桥的构建，D283R、F229Y、R280E、N233K四种突变均有助于增加该区域的氢键和盐桥数量；而β3~7位于酶的核心区域，因此通过D186H突变增强疏水相互作用，以及通过F201I、V84L突变形成更紧密的堆积结构，均有利于稳定β3~7区域。

4 结论

综上所述，本研究首次通过高通量荧光检测方法对IsPETase的整个β片层区域进行了系统性分子改造。通过对有益突变的迭代重组，获得了组合变体DepoPETase β，其在温和温度下的解聚性能较野生型显著提升。此外，DepoPETase β在生物反应器中实现了未处理PET塑料的完全解聚，展现了其在PET生物解聚过程中的潜在应用价值。对DepoPETase β的进一步机制分析表明，外层β片层区中的有益突变形成了强烈的氢键和盐桥，而内层β片层区中的有益突变则支持了更紧密的结构排列，这为PET水解酶的研究提供了新见解。针对β片层区域的工程化策略，可能适用于其他与PETase具有相似支架结构的PETase水解酶。

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