1 引言
骨关节炎（OA）是一种以软骨退变为特征的慢性退行性关节疾病，其主要病理特征为炎症反应和软骨再生能力减弱[
1]。在OA受累关节中，分解代谢和促炎介质的过量产生会破坏软骨、加剧炎症、显著减少软骨细胞数量，并抑制合成代谢生长因子的作用[
2]。OA相关软骨细胞的信号传导活性发生改变，并倾向于向肥大表型转变，这会增加软骨承受的机械应力，降低软骨维持完整性的能力[
3]。目前OA的临床治疗手段包括药物治疗、手术治疗和补充疗法，但它们均非有效的根治性方案[
4]。新兴疗法的最新进展包括基于负载药物、细胞、基因和生物活性分子的水凝胶支架的治疗策略[
5]。基于细胞的水凝胶可在很大程度上模拟组织[
6‒
8]，但植入其中的细胞难以长期存活，且因个体差异导致的高成本、免疫原性以及运输和保存成本等问题进一步限制了临床应用[
5]。因此，需要更全面的治疗策略来解决OA的根本病因。
为减轻软骨炎症、促进软骨分化并维持软骨细胞稳态，我们聚焦于两种小分子治疗药物：地塞米松（Dex）和成软骨素（KGN）。Dex是最早且最常用的糖皮质激素之一，具有抗炎特性，同时也是骨髓基质细胞（BMSC）诱导剂，可促进间充质干细胞分化，近年研究表明其还可通过调节巨噬细胞极化来调控早期免疫反应[
9‒
10]。巨噬细胞极化与软骨修复及OA进展密切相关[
11]，调控OA软骨微环境的关键在于Dex的可控释放（时间依赖性和浓度依赖性）及其细胞内转运，以控制其抗炎作用和对巨噬细胞极化的调节。KGN可剂量依赖性地促进人间充质干细胞（hMSCs）向软骨细胞分化[
12]，并刺激runt相关转录因子（RUNX）家族（主要为RUNX1）的表达。研究表明，RUNX1在软骨细胞形成、增殖和存活中起关键作用[
13‒
14]。
水凝胶的类软骨组织特性可提供具有适宜几何形状和机械参数的微环境，支持hMSCs黏附、向软骨细胞分化并增殖[
15‒
18]。此外，水凝胶可通过物理或化学方式包封小分子、功能大分子、纳米颗粒和细胞。通过精确设计交联密度和可降解性，水凝胶可在数天至数月内实现活性成分的体内可控释放[
19‒
21]。
鉴于OA的病理特征及软骨再生所需的微环境，我们选用具有良好生物相容性和可降解性的天然材料——胶原蛋白[
22]，作为水凝胶基质。胶原蛋白水凝胶支架可支持间充质干细胞的生长、黏附与分化，常用于体外软骨构建[
23‒
24]。另一种天然蛋白——丝蛋白，具有多功能性且易于加工[
25]，经有机溶剂处理后可制备丝蛋白纳米颗粒（SPNs）[
26]，其具有优异的生物相容性、可降解性和安全性。
本研究旨在通过设计双载药纳米复合水凝胶支架，解决炎症控制和软骨再生的难题。不同的负载方式使两种治疗分子（KGN和Dex）从水凝胶中释放的机制不同，分子的治疗作用与纳米复合水凝胶的支架作用通过时空机制协同促进OA缺损修复，发挥抗炎、免疫调节和促进软骨分化的作用（
图1）。本研究构建的水凝胶体系相较以往合成的药物递送系统具有三方面优势：其一，双蛋白[类人胶原蛋白（HLC）和SPNs]药物递送机制确保了体系的生物相容性、可降解性和安全性；其二，体系包封并稳定生物活性药物，通过双蛋白递送机制实现药物可控释放，即治疗早期释放Dex以调控早期免疫反应并减轻炎症，同时向细胞内持续释放KGN以促进细胞分化；其三，体系是一种集成治疗系统，可构建软骨再生微环境，通过水凝胶的支架作用与药物的治疗作用协同诱导软骨快速分化与再生。因此，本研究为开发具有双药物释放机制的先进药物递送系统，实现关节软骨组织修复提供了重要启示。
2 材料与方法
2.1 材料
类人胶原蛋白（97 000 Da；中国专利号：ZL01106757.8）购自西安巨子生物基因技术有限公司；转谷氨酰胺酶（TGase, 200 U∙g-1）购自上海源叶生物科技公司；KGN（相对分子质量：317.34 Da）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自美国Sigma-Aldrich公司；Dex购自上海麦克林生化科技有限公司。
2.2 丝蛋白提取
将蚕茧清洗后，置于5 g∙L-1碳酸钠溶液中煮沸30 min进行脱胶处理。干燥后的脱胶丝蛋白在80 ℃下溶于氯化钙/水/乙醇三元溶液（摩尔比为1∶8∶2）中1 h。随后将溶液倒入透析袋（截留分子量为8000~12 000 Da），在去离子水中透析3天以去除杂质。透析后的溶液经真空冷冻干燥，得到可溶性丝蛋白。丝蛋白提取步骤如附录A中的图S1所示。
2.3 负载KGN的SPNs的合成
将KGN（0.4 mg∙mL-1）溶于二甲基亚砜（DMSO），加入EDC和NHS（KGN/EDC/NHS摩尔比为1∶1∶1），搅拌1 h后逐滴加入丝蛋白溶液（4mg∙mL-1）。反应2~4 h后，溶液在14 000 r∙min-1下离心5 min以去除可能生成的聚合物。透析24 h去除溶液中多余杂质，真空冷冻干燥得到负载KGN的丝蛋白。将2%负载KGN的丝蛋白溶液按体积比1∶20逐滴加入丙酮中，搅拌2~4 h，合成SPNs-KGN。混合物在100 000 r∙min-1下离心30 min，用蒸馏水洗涤，悬浮液至少洗涤两次，得到均匀的SPNs-KGN悬浮液，于4 ℃保存。并制备未负载KGN的SPNs作为对照。
2.4 SPNs-KGN的表征
采用高效液相色谱法（HPLC; Alliance e2695，美国Waters公司）测定负载KGN的丝蛋白中KGN的浓度。首先建立KGN浓度与药物峰面积的线性回归方程（附录A中的图S2）。收集反应前的KGN溶液和反应后的透析液，用HPLC测定未负载的KGN浓度，并根据回归方程计算。随后计算KGN的包封率和载药量[附录A中的公式（S1）和公式（S2）]。详细步骤见附录A。
使用动态光散射分光光度计（Zetasizer Nano ZS，英国Malvern Panalytical公司）测量SPNs-KGN的粒径分布、zeta电位和多分散指数。纳米颗粒的圆二色性通过圆二色光谱仪（BRIGHTTIME Chirascan，英国Applied Photophysics公司）测定，扫描范围为190~250 nm，波长步长设为2 nm。SPNs-KGN纳米颗粒在25 ℃下干燥并镀金后，用扫描电子显微镜（SEM; JSM-IT800，日本JEOL公司）观察。采用1H核磁共振（NMR; Avance III HD 400，德国Bruker公司）光谱表征纳米颗粒的表面化学结构。
2.5 载药纳米复合水凝胶的合成
将Dex溶于去离子水（浓度为5 mg∙mL-1），加入HLC（20 mg∙mL-1），在37 ℃水浴中加热至HLC完全溶解。充分反应后，透析去除未交联的小分子，真空冷冻干燥得到HLC(Dex)。采用C18反相柱通过HPLC测定HLC上Dex的负载量，首先建立Dex浓度与药物峰面积的线性回归方程（附录A图S2）。收集反应前的Dex溶液和反应后的透析液，用HPLC测定未负载的Dex浓度，并根据回归方程计算，包封率和载药量计算公式与KGN类似。将SPNs-KGN（1 mg∙mL-1）完全溶于去离子水，加入100 mg∙mL-1的HLC(Dex)，充分混合后加入TGase溶液（60 U∙g-1蛋白），在4 ℃下反应6~10 h，得到HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶。本研究制备的水凝胶包括：不含Dex和KGN的HLC-SPNs水凝胶；不含Dex、KGN和SPNs的HLC水凝胶；HLC与SPNs-KGN混合并通过TGase交联形成的HLC-SPNs-KGN水凝胶；HLC(Dex)与SPNs混合并通过TGase交联形成的HLC(Dex)-SPNs水凝胶。
2.6 HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶的表征
HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶在冷冻电镜[PP3000T Cryoprep转移系统（英国Quorum公司），FEI Quanta 450 环境扫描电子显微镜（美国Field Electron and Ion公司）]观察前用液氮速冻，观察内部孔隙结构。
为表征水凝胶的溶胀行为，将水凝胶浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中，每隔一定时间取出称重，直至达到恒重。水凝胶的溶胀率按附录A中的公式（S3）计算。
使用流变仪（MCR302，奥地利Anton Paar公司）在振荡模式下测试水凝胶的流变性能，参数设置为应变为5%、频率为1 rad∙s-1、温度为25 ℃。使用INSTRON 5565测试机（美国Instron公司）对水凝胶进行循环压缩测试，测试机自动计算圆柱形水凝胶（直径为1 cm，厚1 cm）的模量数据。
通过测量水凝胶形成前后的重量计算凝胶分数，以确定成胶程度。步骤如下：混合水凝胶成分以确定总质量，搅拌形成水凝胶后，取出水凝胶，用滤纸吸干表面水分，再次称重，计算凝胶分数[附录A中的公式（S4）]。
2.7 体外药物释放研究
将HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶（100 mg）和SPNs-KGN（10 mg）浸入PBS（1 mL, pH = 7.4）中，在室温下振荡（100 r∙min-1）。同时，将HLC(Dex)-SPNs-KGN 水凝胶（100 mg）和SPNs-KGN（10 mg）浸入含1 U∙mL-1胶原酶（S10053，上海基恩生物科技有限公司）的PBS（1 mL, pH = 7.4）中，室温振荡（100 r∙min-1）。在预定时间点取出0.1 mL释放液，用HPLC测定峰面积以计算总释放率，随后加入0.1 mL新鲜PBS或含1 U∙mL-1胶原酶的PBS以保持体系总体积恒定，继续透析测试。通过HPLC分析确定水凝胶释放的KGN和Dex量。
2.8 细胞相容性研究
采用3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四唑溴盐（MTT）法测定HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶的细胞毒性。将水凝胶以100 mg∙mL-1的浓度浸入培养基中，在37 ℃下孵育24 h，获得水凝胶提取物。将人关节软骨细胞（HACs）和hMSCs以每孔1 × 104个细胞的密度接种于96孔板中，加入水凝胶提取物处理。孵育24 h后，用含MTT试剂和DMSO的PBS替换提取物，在490 nm处测量各孔吸光度。细胞存活率按附录A中的公式（S5）计算。对不同水凝胶样品[HLC水凝胶、HLC-SPNs水凝胶、HLC(Dex)-SPNs水凝胶和HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶]提取物处理的HACs和hMSCs进行吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色时，将HACs和hMSCs（1 × 104 个∙mL-1）接种于96孔板，孵育24 h后加入水凝胶样品提取物，与提取物共孵育3天后，去除提取物，用PBS清洗孔板，使用AO/EB细胞活性试剂盒染色，并用荧光显微镜拍照。为评估HACs和hMSCs在HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶上的黏附情况，将水凝胶插入48孔板，在细胞培养基中浸泡24 h，每孔接种HACs和hMSCs（1 × 105 个∙mL-1），在37 ℃下孵育。2天后，用PBS清洗水凝胶，并向水凝胶中加入2.5%戊二醛固定10 h，用梯度酒精脱水后，用SEM观察水凝胶。
2.9 SPNs-KGN 的细胞内吞作用
将间充质干细胞以每孔1 × 105个细胞的浓度培养，加入HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶（100 mg）共培养。1 h和3 h后，消化并离心收集细胞，加入透射电子显微镜（TEM; Tecnai G2 Spirit，美国Thermo Fisher Scientific公司）固定液，用TEM观察细胞形态。详细步骤见附录A。
2.10 体外抗炎活性研究
本研究采用小鼠单核/巨噬细胞样细胞（RAW264.7细胞）进行体外抗炎活性实验。首先，将RAW264.7细胞接种于无菌盖玻片上孵育24 h，小心去除上清液，向各组细胞中加入处理液，孵育24 h。细胞用PBS清洗，用4%多聚甲醛固定后，进行免疫荧光染色[白细胞介素（IL）-10（20850-1-AP）和肿瘤坏死因子（TNF）-α（ab1793），英国Abcam公司]，并用激光共聚焦显微镜（A1，日本尼康公司）观察。实验分组如下：正常RAW264.7细胞（对照组）；脂多糖（LPS）组（阳性对照，10 ng∙mL-1 LPS 溶液）；HLC-SPNs、HLC(Dex)-SPNs和HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组（用50 mg∙mL-1水凝胶提取物处理）；LPS + HLC-SPNs、LPS + HLC(Dex)-SPNs和LPS + HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组（用10 ng∙mL-1 LPS 溶液和 50 mg∙mL-1水凝胶提取物处理）。
2.11 hMSCs软骨分化的体外实验
将灭菌水凝胶[HLC-SPNs水凝胶、HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶、HLC-SPNs-KGN水凝胶和HLC(Dex)-SPNs水凝胶]浸入诱导培养基中，与hMSCs共孵育10天。实验分组如下：仅诱导培养基的空白对照组；含600 nmol∙L-1 KGN的诱导培养基阳性对照组；含100 mg∙mL-1 HLC-SPNs水凝胶的诱导培养基HLC-SPNs水凝胶组；含100 mg∙mL-1 HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶的诱导培养基HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组；含100 mg∙mL-1 HLC-SPNs-KGN水凝胶的诱导培养基HLC-SPNs-KGN水凝胶组；含100 mg∙mL-1 HLC(Dex)-SPNs水凝胶的诱导培养基HLC(Dex)-SPNs水凝胶组。将hMSCs在37 ℃下用4%多聚甲醛固定30 min，用甲苯胺蓝（索莱宝公司）染色，并用显微镜观察。hMSCs固定后进行免疫荧光染色，一抗为II型胶原（Col II）、软骨寡聚基质蛋白（COMP）、聚集蛋白聚糖和SOX-9抗体，用共聚焦荧光显微镜（尼康A1）观察hMSCs。
将经Co-60辐照灭菌的水凝胶[直径为10 mm，高2 mm；HLC-SPNs水凝胶、HLC(Dex)-SPNs水凝胶、HLC-SPNs-KGN水凝胶和HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶]浸入软骨分化培养基中6 h，然后在每个水凝胶中接种2 × 104个hMSCs。将含细胞的水凝胶在软骨分化培养基中培养5天和10天，消化并收集细胞，分别进行酶联免疫吸附试验（ELISA）和实时定量聚合酶链反应（qPCR）检测软骨分化相关蛋白和基因。详细步骤见附录A。
2.12 三维培养细胞中基因表达的qPCR检测
按照第2.11节所述方法培养细胞，用TRIzol试剂（日本Takara公司）按制造商说明提取细胞总RNA，用Prime Script RT 试剂盒（Takara）合成第一链互补DNA（cDNA）。使用Bio-Rad qPCR系统（美国Bio-Rad公司）对COMP、COL2A1、ACAN和SOX9进行qPCR，所得值以阴性对照为基准归一化为倍数变化。实验方法细节见附录A。
2.13 水凝胶的体外降解与抗炎作用
所有动物实验均经西北大学实验动物管理与伦理委员会审查，符合动物伦理相关法律和机构指南，并经伦理委员会批准（NWU-AWC-20210810R）。将水凝胶样品植入兔子背部皮下，在第1周、第5周和第10周研究水凝胶样品的降解情况。收集皮肤组织，用4%中性多聚甲醛固定。将降解的水凝胶样品真空冷冻干燥，用SEM观察样品结构，同时对冷冻干燥的降解水凝胶样品称重以计算降解率。对皮肤组织进行苏木精-伊红（H&E）染色和TNF-α免疫组织化学染色。实验方法细节见附录A。
2.14 兔膝关节炎症性软骨缺损模型的建立及水凝胶植入
首先，在第1天、第4天和第7天，向每只兔子的髋关节注射0.3 mL 4%木瓜蛋白酶生理盐水溶液。7天后，麻醉兔子，用手术钻在兔子后肢建立炎症性软骨缺损（直径为5.0 mm，厚2.5mm）。将27只兔子分为对照组、HLC-SPNs水凝胶组和HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组。对照组兔子膝关节的软骨缺损不予处理，水凝胶组兔子膝关节的软骨缺损用相应的水凝胶样品填充至与天然软骨表面齐平，随后进行韧带复位和伤口闭合（缝合骨膜和皮肤，附录A中的图S3）。详细步骤见附录A。
2.15 软骨修复评估
收集兔膝关节进行样品观察和分析。采用国际软骨修复协会（ICRS）分类系统，通过评估手术部位缺损的外观及缺损与周围区域的连接情况，确定膝关节手术部位的修复状态（附录A中的表S2）。使用微型计算机断层扫描（micro-CT）仪（SKYSCAN 1172，德国Bruker公司）对手术部位的组织再生进行定性和定量分析，测量参数包括骨密度（BMD）、骨体积/总体积比（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁间距（Tb.Sp）。组织学评估方面，用H&E染色评估膝关节细胞和纤维组织的分布，用番红O染色检测膝关节组织中糖胺聚糖的存在情况。使用H&E和番红O染色图像进行ICRS视觉组织学评分（附录A中的表S3）。对TNF-α、含血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶5（ADAMTS5）和IL-6进行免疫组织化学染色，对骨形态发生蛋白（BMP）2、转化生长因子（TGF）-β1、巨噬细胞标记物[分化群68（CD68）、CD86、CD206]，以及RUNX1、SOX-9、Col II、COMP、CD90和CD73进行免疫荧光染色。通过纳米压痕仪（Step 500-NHT3/NHT2，奥地利Anton Paar公司）检测软骨损伤部位的位移-力曲线、弹性模量和硬度。详细步骤见附录A。
2.16 统计分析
数据以平均值±标准差表示，使用SPSS软件进行统计分析。采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）确认不同阈值下的显著差异，*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。
3 结果
3.1 SPNs-KGN的表征
KGN分子结构中的羧基通过EDC和NHS活化，与丝蛋白的氨基偶联[
图2（a）]，得到负载KGN的丝蛋白。通过控制KGN和丝蛋白的浓度可调节KGN的载药量和包封率（附录A表S4）。本文选定的丝蛋白和KGN浓度分别为4 mg∙mL
-1和0.4 mg∙mL
-1，相应负载KGN的丝蛋白载药量和包封率分别为2.05% ± 0.32%和20.30% ± 4.76%。丙酮等有机溶剂可使丝蛋白分子链发生构象转变，形成β-折叠结构并组装成纳米级颗粒[
图2（b）]。SPNs-KGN的圆二色光谱[
图2（c）]在217 nm处显示负椭圆度，表明丝蛋白从无规构象转变为β-折叠结构。
图2（c）插图显示SPNs-KGN的胶体特性（丁达尔效应）。KGN的
1H NMR谱显示芳香质子特征峰，位于7.3~7.9 ppm之间[
图2（d-i），峰1~13]；丝蛋白的
1H NMR谱显示酪氨酸‒CH
2特征峰[2.74~2.89 ppm，
图2（d-ii）]、甘氨酸/丝氨酸‒CH
2特征峰[3.41~3.54 ppm，
图2（d-iii）]及R‒NH
2特征峰[2.36 ppm，
图2（d-iv）]。负载KGN的丝蛋白
1H NMR谱同时显示KGN和丝蛋白的主要峰，且KGN的羧基与丝蛋白的氨基共轭形成酰胺键，因此其谱图中出现ArCONHR的主要峰[6.22~6.35 ppm，
图2（d-v）]。SPNs-KGN的平均粒径和zeta电位分别为(211.80 ± 8.23) nm和(6.25 ± 0.36) mV [
图2（e）和附录A表S5）。用SEM观察显示纳米颗粒呈不规则球形[
图2（f）]。
3.2 HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶的表征
3.2.1 形态与基础性能
Dex与HLC混合后，通过氢键与HLC网络交联。将HLC(Dex)复合物与SPNs-KGN混合，利用TGase交联形成HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶。Dex的磷酸基团与HLC网络中的‒OH基团发生反应[
图3（a）]。如
图3（b）所示，与HLC的傅里叶变换红外光谱（FTIR）相比，HLC(Dex)的FTIR光谱显示‒OH伸缩振动峰（3200~3700 cm
-1）减弱、羧基‒OH伸缩振动峰（2915 cm
-1）衰减，并出现P‒O伸缩振动峰（1090 cm
-1）。P‒O弯曲振动峰（1777 cm
-1）和对称P‒O伸缩振动峰表明，HLC中丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、精氨酸的羟基或天冬氨酸、谷氨酸的羧基与Dex的磷酸基团通过氢键结合。
HLC(Dex)的
1H核磁共振谱显示Dex不同位置H的特征峰，表明形成了HLC(Dex)复合物（附录A图S4）。Dex的包封率和载药量分别为4.12% ± 0.18%和1.15% ± 0.21%，即每1 g HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶中约含1 mg Dex。将HLC、Dex和SPNs-KGN混合，加入TGase并在4 ℃孵育12 h，形成HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶，其呈乳白色半透明状，具有不规则多孔结构[
图3（c）]。冷冻电镜观察显示，湿态水凝胶内部孔隙结构主要分布在10~30 μm之间[
图3（d）]，这有利于维持适宜的氧张力和营养供应；放大图显示，HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶结构中嵌入大量SPNs-KGN颗粒。
3.2.2 KGN和Dex的释放行为
如
图3（e）所示，HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶表现出Dex的即时释放和KGN的持续释放，这由两种药物的负载机制调控。第1天，水凝胶表面HLC与Dex之间不稳定的氢键断裂，导致Dex释放；溶胀过程中内部少量Dex随氢键断裂快速释放，突发释放直至溶胀平衡后结束。相比之下，由HLC网络和SPNs-KGN控制的KGN突发释放不显著。随着水凝胶中HLC骨架降解，约80%的Dex在40天内释放，而KGN仅释放40%。纳米复合水凝胶的凝胶分数为95.15% ± 0.39%，成胶过程中会残留少量液体，这导致药物释放率低于100%。在I型胶原酶存在下，KGN和Dex的释放趋势与PBS中相似，但随着水凝胶降解加速，药物从载体中的释放速率随时间增加[
图3（f）]：SPNs-KGN中90%以上的KGN在4天内释放；HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶中Dex在10天内近乎完全释放，80%以上的KGN在30天内释放。KGN的释放需先通过HLC骨架降解使SPNs-KGN脱离，再经SPNs降解实现，因此其释放速率显著慢于Dex。HLC骨架保护SPNs-KGN，后者随HLC降解而释放，继而进一步降解并释放KGN分子[
图3（g）]。由于共价键比范德华力和静电作用等物理相互作用更耐水解，故HLC(Dex)-SPNs-KGN中KGN的释放呈现缓释特性。
3.2.3 水凝胶的溶胀与力学性能
图3（h）显示，HLC、HLC-SPNs和HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶在PBS中的溶胀过程均经历三个阶段后达到平衡，溶胀率无显著差异（可能因交联方式相同），三者均在120 min内达到溶胀平衡，平衡溶胀率低于400%。鉴于软骨持续承受机械应力，本研究通过动态流变和循环压缩实验分别评估HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶的黏弹性和抗疲劳性。循环压缩测试显示，卸载后水凝胶恢复初始形状，但压缩曲线为非线性闭合曲线，表明存在滞后现象[
图3（i）插图]。20次压缩循环后，水凝胶的压缩模量[(102.52 ± 8.42) kPa]与初始值无显著差异，表明其具有良好的抗疲劳性，可承受日常活动的循环机械应力。
图3（j）显示，HLC-SPNs水凝胶[(146.45 ± 2.34) Pa]和HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶[(147.57 ± 2.37) Pa]的储能模量高于HLC水凝胶[(104.29 ± 3.64) Pa]，说明SPNs与HLC分子的共价交联增强了水凝胶的力学性能。
3.3 体外细胞相容性与抗炎特性
图4（a）显示，HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶显著促进HACs和hMSCs的增殖。AO/EB染色结果[
图4（b）]表明，该水凝胶组的细胞密度显著高于对照组，且细胞形态与对照组相似，证实其具有良好的细胞相容性。细胞植入实验是评估软骨支架细胞相容性的重要方法，
图4（c）显示HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶内部结构支持hMSCs和HACs的三维生长：扫描电镜下细胞在水凝胶中均匀分布，黏附于水凝胶表面和孔隙并维持正常形态，表明该水凝胶作为软骨支架具有良好的细胞黏附性。本研究通过透射电镜观察SPNs-KGN的细胞内吞过程[
图4（d）和（e）]：1 h时SPNs-KGN分布于细胞膜周围；3 h时内吞小泡包裹纳米颗粒进入细胞质，证实SPNs-KGN可通过内吞作用进入细胞溶胶。
为验证HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶的抗炎活性，我们将水凝胶提取物加入激活抗炎反应的RAW264.7巨噬细胞中。LPS作为内毒素可引发细胞免疫反应，诱导RAW264.7巨噬细胞向促炎表型分化。LPS组巨噬细胞中炎症因子TNF-α的表达显著高于正常对照组[
图4（f）~（g）；单通道图像见附录A图S5]。研究发现，负载Dex的HLC(Dex)-SPNs和HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶提取物可显著诱导RAW264.7巨噬细胞产生抗炎因子IL-10，并减少促炎因子TNF-α的表达。
3.4 促进hMSCs向软骨细胞分化
为确认HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶能否诱导hMSCs向软骨细胞分化[
图5（a）]，本研究对经水凝胶提取物诱导的hMSCs进行甲苯胺蓝染色。甲苯胺蓝染色液中的阳离子与软骨细胞内酸性物质结合呈紫褐色。如
图5（b）所示，对照组hMSCs在第10天未观察到紫褐色酸性黏多糖，而HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶提取物处理的hMSCs在第5天部分细胞出现紫褐色（箭头示酸性黏多糖生成），至第10天紫褐色覆盖区域扩大。相比之下，对照组hMSCs软骨分化诱导周期为21天，表明该水凝胶可加速hMSCs向软骨细胞分化。我们通过对COMP、Col II、聚集蛋白聚糖和SOX-9蛋白进行免疫荧光染色实验，进一步验证水凝胶提取物诱导hMSCs向软骨细胞的分化。
图5（c）~（f）显示，对照组和HLC-SPNs水凝胶提取物处理的hMSCs中上述蛋白表达量极低，而KGN处理组及HLC(Dex)-SPNs、HLC-SPNs-KGN和HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶提取物处理的hMSCs中蛋白显著表达，其中HLC-SPNs-KGN和HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶提取物处理的hMSCs中蛋白表达量显著高于KGN处理组[
图5（g）]。此外，我们还将hMSCs直接接种于水凝胶上培养[
图5（h）]，分别在第5天和第10天消化收集细胞，通过ELISA和qPCR检测细胞分化情况。qPCR结果显示[
图5（i）]，与免疫荧光结果一致，负载KGN的水凝胶[HLC(Dex)-SPNs-KGN和HLC-SPNs-KGN]显著上调
COMP、
COL2A1、
ACAN和
SOX9基因表达。HLC(Dex)-SPNs水凝胶的促分化作用与HLC-SPNs水凝胶相似，表明Dex与KGN协同诱导hMSCs向软骨细胞分化。ELISA结果（附录A图S6）显示相同趋势。
3.5 HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶的体内软骨修复研究
我们建立了骨关节炎模型（炎症性软骨缺损）并在兔膝关节植入水凝胶。
图6（a）显示了HLC-SPNs和HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶促进实验性骨关节炎兔软骨再生的效果。术后第1个月，对照组关节可见大面积凹陷，再生组织极少；相比之下，HLC-SPNs和HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组的水凝胶支架与宿主软骨组织融合。术后第2个月，对照组缺损仍明显可见，缺损边界清晰；HLC-SPNs水凝胶组缺损边界消失，可见大量新生肉芽组织，而HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组缺损完全被新生软骨组织填充。术后第3个月，对照组缺损仍部分空置，相邻软骨组织间存在明显间隙；HLC-SPNs水凝胶组新生软骨与天然软骨组织缺乏连续性，表面略粗糙；植入的HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶与周围组织边界消失，完全融入天然软骨组织，修复的软骨表面光滑。根据ICRS软骨修复评估标准对膝关节软骨组织进行评估，结果如
图6（a）所示，对照组和HLC-SPNs水凝胶组软骨修复为III级（异常），而HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组为II级（接近正常）。
对兔膝关节进行显微CT分析，通过断层扫描获得的二维投影图像和三维重建图像评估软骨修复情况，结果如
图6（c）所示。术后第1个月，对照组缺损处未见新生软骨组织，而HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组已出现初步软骨修复。术后第3个月，HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组缺损完全填充，与周围组织整合良好，新生软骨组织结构与天然软骨相似。此外，如
图6（d）~（h）所示，HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组的BMD、骨小梁数量（Tb.N）、Tb.Th和BV/TV显著高于HLC-SPNs水凝胶组和对照组，Tb.Sp显著低于对照组。这些结果表明，HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶诱导的软骨形成程度和软骨代谢水平显著高于HLC-SPNs水凝胶和对照组。
3.6 组织学与免疫组织化学研究
为进一步探究HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶促进骨关节炎修复的效果，我们进行了H&E和番红O染色，并基于O’Driscoll系统组织学评分的11项参数评估以下组织学特征：新生软骨组织形成、水凝胶样品降解及软骨下骨生成。术后第1个月，对照组仅见少量纤维组织，HLC-SPNs水凝胶组可见纤维组织与类软骨组织混合[
图7（a）]，而HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组观察到大量类软骨细胞外基质，软骨下方出现新生骨组织。术后第3个月，对照组纤维组织较第一个月增多，HLC-SPNs水凝胶组和HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组缺损处均可见纤维组织与类软骨组织混合（附录A图S9），但HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组的软骨组织密度显著高于HLC-SPNs水凝胶组。
番红O可用于区分软骨组织与骨组织，评估软骨基质关节面的完整性及软骨细胞与糖胺聚糖的聚集情况。结果显示，对照组未见明显软骨形成，HLC-SPNs和HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组软骨组织相对完整[
图7（a）]。HLC(Dex)-SPNs-KGN组红色标记的阴离子多糖含量显著高于HLC-SPNs组，表明该水凝胶促进了软骨修复。对缺损关节的H&E和番红O染色图像进行组织学评分，缺损的整体填充情况反映了缺损内新生组织的生成[
图7（b）]，软骨评分[
图7（c）]评估软骨基质关节面完整性及软骨细胞与糖胺聚糖的聚集程度。HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组的整体填充评分和软骨评分均高于对照组和HLC-SPNs水凝胶组，表明此水凝胶支持软骨形成。
本研究还对软骨损伤部位的三种促炎因子（IL-6、TNF-α和ADAMTS5）进行免疫组织化学分析[
图7（d）]。对照组中IL-6、TNF-α和ADAMTS5呈明显阳性反应，且阳性区域随时间增加，表明缺损关节内炎症反应持续加剧，提示软骨炎症需临床干预。有趣的是，HLC-SPNs水凝胶组炎症反应较低，这表明不含抗炎药物的水凝胶本身可能为组织修复提供了有利条件。如
图7（e）所示，HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组的IL-6、TNF-α和ADAMTS5水平显著低于对照组和HLC-SPNs水凝胶组，表明此水凝胶有效控制了炎症。
3.7 HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶对体内巨噬细胞极化的影响
图8（a）显示了CD68标记的巨噬细胞、CD86标记的M1型巨噬细胞和CD206标记的M2型巨噬细胞的免疫荧光染色结果。术后第1个月，HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组和HLC-SPNs水凝胶组的巨噬细胞（M1和M2）数量是对照组的两倍。
如
图8（b）和（c）所示，术后第1个月，HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组的M1型巨噬细胞比例（6.25%）显著低于对照组（31.25%），而M2型巨噬细胞比例（46%）显著高于对照组（6.23%）。此外，该组M1型巨噬细胞比例较HLC-SPNs水凝胶组降低85.6%，M2型巨噬细胞比例升高91.6%。HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组的M2/M1比值显著高于对照组和HLC-SPNs水凝胶组，这归因于水凝胶中Dex的释放。术后第3个月，HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组的M2/M1比值仍显著高于其他组[
图8（c）]，表明M2型巨噬细胞在软骨修复后期起关键作用。
图8（d）和（e）显示，HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组的BMP2和TGF-β1分泌量显著高于对照组和HLC-SPNs水凝胶组。这些结果表明，HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶介导的M1型向M2型巨噬细胞极化过程，显著促进了软骨分化和修复。
3.8 HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶对软骨分化的作用
本研究通过关节软骨损伤体内模型，研究HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶对hMSCs向软骨细胞分化的影响。软骨细胞特异性蛋白（COMP、Col II、聚集蛋白聚糖和SOX-9）的免疫荧光染色图像[
图9（a）和（b）]显示，此水凝胶显著诱导hMSCs向软骨细胞分化，其COMP、Col II、聚集蛋白聚糖和SOX-9水平显著高于对照组和HLC-SPNs水凝胶组，且RUNX1表达量在该组最高。
图9（c）总结了该水凝胶在软骨修复不同阶段的调控作用：修复早期，大量释放的Dex下调促炎因子表达，促进M1型巨噬细胞向M2型极化；修复中晚期，水凝胶持续释放的KGN诱导hMSCs向软骨细胞分化并维持软骨细胞稳定性。因此，KGN与Dex协同作用推动了软骨修复。
4 讨论与结论
软骨修复主要经历三个连续且部分重叠的阶段：炎症期、软骨分化期和软骨内骨化（或重塑）期。为针对这三个阶段进行靶向治疗，本研究设计了一种纳米复合水凝胶，实现Dex和KGN的可控释放与局部递送，以诱导软骨再生。KGN通过共价接枝到丝蛋白上[
图2（d）]，负载KGN的丝蛋白经丙酮处理形成丝蛋白纳米颗粒-成软骨素复合物[SPNs-KGN，
图2（f）]。HLC与Dex混合后，Dex的磷酸基团与HLC中的酪氨酸（Tyr）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和精氨酸（Arg）残基通过氢键交联，形成HLC(Dex)复合物[
图3（b）]。该复合物与SPNs-KGN混合后，通过TGase酶促交联形成工程化纳米复合水凝胶。TGase催化谷氨酰胺与赖氨酸等碱性氨基酸之间的肽键形成，从而构建水凝胶网络[
16,
27]。在本文所述体系中，TGase不仅催化HLC分子间的交联，还将SPNs-KGN与HLC网络共价连接[
图3（d）]。SPNs通过空间屏障控制KGN的释放[
图3（e）和（f）]，并将疏水性KGN分子转运至亲水环境。此外，需注意本研究中丝蛋白未经过高效纯化，临床应用前需进一步去污和纯化。HLC水凝胶的多孔结构（10~30 μm孔径）促进细胞增殖与分化[
图4（a）~（c）]，增加氧张力和营养供应，为软骨组织向内生长创造有利微环境[
28]。
数十年来，Dex一直被用于关节内糖皮质激素注射以治疗炎症和疼痛，但其临床应用存在局限性：低剂量重复注射可能加剧疼痛，高剂量则可能抑制骨细胞生长并带来全身吸收风险。研究表明，1 nmol∙L
-1的Dex可保护软骨免受TNF-α诱导的损伤[
29]，而100 nmol∙L
-1~10 μmol∙L
-1浓度的Dex可抑制软骨中糖胺聚糖的流失。这一浓度范围显著低于临床注射用Dex的浓度（7.7 mmol∙L
-1）[
30]。HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶中Dex的添加量基于其释放速率和有效浓度精心设计：水凝胶中Dex浓度约为1.9 mmol∙L
-1，在PBS中每日平均释放量约为38 nmol∙L
-1，该剂量既能实现对软骨和关节的满意抗炎效果，又能促进软骨修复[
图3（e）和（f）]。Dex的日均释放量按40天周期计算。
在软骨修复早期，降解的水凝胶以可控剂量和速率释放Dex，以缓解炎症。炎症是涉及一系列免疫细胞向炎症部位迁移的复杂过程，Dex通过调控M1型巨噬细胞向M2型极化，推动炎症期向再生期过渡[
9]。Dex的有效释放发挥了抗炎作用[
图4（f）和（g）]，有望减轻软骨修复早期的过度炎症反应。值得注意的是，即使不含KGN和Dex，HLC-SPNs水凝胶仍因HLC的抗炎特性显著降低TNF-α水平[
31‒
32]，如
图4（g）所示。
文献报道KGN的中位有效浓度为100 nmol∙L
-1 [
14]，本研究中HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶在PBS中按40天释放40%的速率计算，KGN日均释放量为630 nmol∙L
-1 [
图3（e）和（f）]，高于促进软骨分化的中位有效浓度。KGN通过水凝胶和SPNs-KGN的逐步降解实现释放[
图3（g）]，这表明HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶通过两种不同机制延迟并控制Dex和KGN的释放。
KGN作为疏水分子，在培养基中分散性差，导致其细胞摄取率低。相比之下，SPNs-KGN中的KGN分子由亲水性SPNs携带，显著改善了其分散性、溶解性和细胞摄取率[
图4（d）和（e）]。KGN的释放受HLC网络和SPNs双重调控：KGN与SPNs通过酰胺键交联，体内谷氨酰胺酶、脲酶等酰胺酶可裂解酰胺键，胰蛋白酶、糜蛋白酶和木瓜蛋白酶等蛋白酶也可水解氨基酸的酰胺键，促使SPNs-KGN降解并释放KGN。HLC网络的渐进性降解释放SPNs-KGN，后者将KGN转运至细胞膜内侧并进一步降解，实现KGN分子的逐步释放。KGN主要在软骨修复中晚期调控hMSCs的软骨向分化，本文通过软骨标记蛋白分析细胞分化程度证实了HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶的这一功能（
图5）。软骨COMP是表达于软骨细胞周围基质的特异性蛋白，聚集蛋白聚糖和Col II是软骨细胞的主要功能蛋白，而SOX-9作为hMSCs软骨向分化的关键因子，可调控软骨分化的多个阶段[
33]。负载KGN的水凝胶[HLC(Dex)-SPNs-KGN和HLC-SPNs-KGN]显著上调
COMP、
Col II、聚集蛋白聚糖和
SOX-9的基因表达水平[
图5（c）~（g）]，HLC(Dex)-SPNs水凝胶也能促进hMSCs中软骨细胞相关蛋白的表达。研究表明，Dex可有效诱导hMSCs向软骨细胞分化[
34]，而HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组hMSCs中软骨细胞相关蛋白的表达显著高于HLC(Dex)-SPNs水凝胶组和HLC-SPNs-KGN水凝胶组，证实了Dex与KGN协同诱导hMSCs的软骨分化[
图5（g）]，HCL(Dex)-SPNs-KGN组hMSCs的软骨分化程度显著高于其他组。
在软骨损伤动物模型中，HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶通过抗炎[
图7（d）和（e）]、免疫调节机制，以及促进前软骨细胞分化和维持软骨稳态，展现出最佳修复效果（
图6）。生物材料介导的软骨修复需要宿主免疫细胞、成骨细胞和适配的生物材料协同参与[
28]。植入的生物材料被宿主免疫系统识别为异物，会触发间充质干细胞、软骨细胞和成骨细胞的免疫应答介导生物学行为[
35]。在免疫细胞中，巨噬细胞在炎症反应和宿主防御中起核心作用，其M1和M2两种表型及表型转换对软骨修复具有不同影响[
36‒
37]。HLC(Dex)-SPNs-KGN和HLC-SPNs水凝胶通过促进纤连蛋白、纤维蛋白原和补体成分等免疫细胞识别蛋白的吸附来募集巨噬细胞。HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶由HLC合成，其多种氨基酸可与组织中的蛋白结合，HLC结合蛋白被巨噬细胞识别并促进其募集。
Dex不仅是有效的抗炎剂，还能诱导软骨组织中巨噬细胞极化，提高M2/M1的比值，从而减轻炎症反应，促进促炎状态向促再生状态转变[
图8（a）~（c）]。结合促炎因子的免疫组化分析，本研究进一步证实HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶介导的巨噬细胞极化对软骨修复的作用。在软骨修复早期，M1型巨噬细胞通过促进组织纤维化放大炎症反应[
28]，可能加剧炎症并破坏天然软骨组织（这是骨关节炎的部分病因），或抑制炎症并启动组织修复。因此，调控早期免疫反应及M1型向M2型巨噬细胞极化可促进软骨再生。HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶通过调控巨噬细胞极化，减少M1型巨噬细胞的持续性存在，避免纤维囊形成（附录A图S10）。M1型向M2型巨噬细胞极化，降低了组织中促炎因子水平，此时M2型巨噬细胞高表达BMP2和TGF-β1 [
图9（d）和（e）]，促进骨膜间充质细胞增殖分化，进而影响软骨重塑中的趋化作用[
37]。
由于软骨缺乏神经和血管组织，其再生极为困难。本研究通过免疫荧光染色（CD90和CD73）标记损伤区域的干细胞，结果显示存在大量干细胞（附录A图S11），表明HLC-SPNs和HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶作为支架，促进了BMSC、滑膜间充质干细胞和周围健康软骨来源的软骨细胞等的增殖与黏附。除KGN在软骨修复中晚期调控软骨分化和稳态外，M2型巨噬细胞分泌的转录因子与HLC网络的支架效应协同诱导软骨再生[
图9（a）和（b）]。
既往研究表明，RUNX1可促进软骨细胞增殖和软骨生成[
38]，稳定软骨分化程度；抑制RUNX1表达则促进骨生成和软骨细胞终末分化（软骨细胞肥大、软骨钙化），这提示RUNX1是KGN的下游效应因子[
39]。HLC(Dex)-SPNs-KGN水凝胶组中RUNX1表达量最高[
图9（a）和（b）]，表明该水凝胶不仅调控软骨细胞分化，还能稳定软骨细胞。此外，该组水凝胶的力学性能较对照组和HLC-SPNs水凝胶组更接近正常组织（附录A图S12），证实其损伤修复效果优于其他处理组。
本研究合成了一种基于双蛋白的纳米复合水凝胶，通过双重药物递送机制原位释放Dex和KGN，以减轻炎症并促进软骨再生。此水凝胶通过两种释放机制实现Dex和KGN的可控释放，在软骨修复不同阶段发挥相应调控作用：其一，作为支架提供适宜微环境，促进巨噬细胞和hMSCs的黏附与增殖；其二，在治疗早期控制Dex释放，通过下调TNF-α、IL-6和ADAMTS5等促炎因子表达，以及诱导M1型向M2型巨噬细胞极化，上调M2型巨噬细胞中BMP2和TGF-β1表达，发挥抗炎和免疫调节作用，促进软骨分化；其三，KGN释放主要在修复中晚期调控软骨分化，通过上调Col II、SOX-9、COMP和聚集蛋白聚糖表达实现，并通过上调RUNX1表达维持软骨稳态、避免肥大化[
图9（c）]。综上，这种双载药纳米复合水凝胶为促进软骨形成和修复骨关节炎缺损提供了极具潜力的治疗方案。
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