巨噬细胞分泌的U2AF1通过调控Yap1的可变剪接调控冠状动脉血管生成以促进心肌梗死修复

宫熳钰; 李浩东; 焦磊; 刘彤; 张燕伟; 刘洁; 王思钰; 王浩; 刘东萍; 礼兆悦; 都智源; 孙丽华; 宣立娜; 吕世华; 杨学文; 王艳滢; 涂应锋; 李萌萌; 吴昊迪; 李鑫; 冯雪; 徐娟; 李文志; 张勇; 张莹; 杨宝峰

doi:10.1016/j.eng.2025.06.006

Engineering ›› 2025, Vol. 50 ›› Issue (7) : 203 -219. DOI: 10.1016/j.eng.2025.06.006

研究论文

巨噬细胞分泌的U2AF1通过调控Yap1的可变剪接调控冠状动脉血管生成以促进心肌梗死修复

宫熳钰 ^a^,^b^,^c ,
李浩东 ^a^,^b ,
焦磊 ^a^,^b ,
刘彤 ^a^,^b ,
张燕伟 ^a^,^b ,
刘洁 ^a^,^b ,
王思钰 ^a^,^b ,
王浩 ^a^,^b ,
刘东萍 ^a^,^b ,
礼兆悦 ^e^,^f ,
都智源 ^a^,^b ,
孙丽华 ^a^,^b ,
宣立娜 ^a^,^b ,
吕世华 ^d ,
杨学文 ^a^,^b ,
王艳滢 ^a^,^b ,
涂应锋 ^e ,
李萌萌 ^l ,
吴昊迪 ^g ,
李鑫 ^h ,
冯雪 ^b^,ⁱ^,^j ,
徐娟 ^c ,
李文志 ^d^,^* ,
张勇 ^a^,^b^,^* ,
张莹 ^a^,^b^,^k^,^* ,
杨宝峰 ^a^,^b^,^*

作者信息 +

Macrophage-Secreted U2AF1 Orchestrates Coronary Artery Angiogenesis to Facilitate Myocardial Infarction Repair Through the Regulation of Yap1 Variable Splicing

Manyu Gong ^a^,^b^,^c^,^# ,
Haodong Li ^a^,^b^,^# ,
Lei Jiao ^a^,^b^,^# ,
Tong Liu ^a^,^b^,^# ,
Yanwei Zhang ^a^,^b ,
Jie Liu ^a^,^b ,
Siyu Wang ^a^,^b ,
Hao Wang ^a^,^b ,
Dongping Liu ^a^,^b ,
Zhaoyue Li ^e^,^f ,
Zhiyuan Du ^a^,^b ,
Lihua Sun ^a^,^b ,
Lina Xuan ^a^,^b ,
Shihua Lv ^d ,
Xuewen Yang ^a^,^b ,
Yanying Wang ^a^,^b ,
Yingfeng Tu ^e ,
Mengmeng Li ^l ,
Haodi Wu ^g ,
Xin Li ^h ,
Xue Feng ^b^,ⁱ^,^j ,
Juan Xu ^c ,
Wenzhi Li ^d^,^* ,
Yong Zhang ^a^,^b^,^* ,
Ying Zhang ^a^,^b^,^k^,^* ,
Baofeng Yang ^a^,^b^,^*

Author information +

^aDepartment of Pharmacology & Key Laboratory of Cardiovascular Medicine Research, Ministry of Education of the People's Republic of China, College of Pharmacy, Harbin Medical University, Harbin 150081, China

^bState Key Laboratory of Frigid Zone Cardiovascular Diseases (SKLFZCD), Harbin Medical University, Harbin 150081, China

^cCollege of Bioinformatics Science and Technology, Harbin Medical University, Harbin 150081, China

^dThe Heilongjiang Key Laboratory of Anesthesia and Intensive Care Research, Harbin Medical University, Harbin 150081, China

^eDepartment of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150000, China

^fDepartment of Cardiology, Affiliated Hospital of Yangzhou University, Yangzhou University, Yangzhou 225001, China

^gHeart, Lung, and Blood Vascular Medicine Institute, Division of Cardiology, Department of Medicine, School of Medicine, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA 15261, USA

^hDepartment of Cardiovascular Sciences, School of Engineering, University of Leicester, Leicester LE1 7RH, UK

ⁱDepartment of Cardiology, The 2nd Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150081, China

^jThe Key Laboratory of Myocardial Ischemia, Ministry of Education of the People's Republic of China, Harbin Medical University, Harbin 150081, China

^kUltrasound Imaging Department, The 2nd Affiliated Hospital of Harbin Medical University & State-Province Key Laboratories of Biomedicine-Pharmaceutics, College of Pharmacy, Harbin Medical University, Harbin 150081, China

^lKey Laboratory of Basic and Application Research of Beiyao, Ministry of Education of the People's Republic of China, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

liwenzhi@hrbmu.edu.cn (W. Li)

hmuzhangyong@hotmail.com (Y. Zhang)

jennying223@126.com (Y. Zhang)

yangbf@ems.hrbmu.edu.cn (B. Yang).

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摘要

心肌梗死（MI）是由于冠状动脉阻塞导致心肌长期缺血引发的心脏局灶性坏死。心肌梗死后血管重建对改善心脏功能和预防复发至关重要。本研究探讨了烟酰胺单核苷酸（NMN）诱导巨噬细胞分泌外泌体所介导的血管生成过程中，巨噬细胞与内皮细胞之间的相互作用。我们重点关注剪接因子丝氨酸和精氨酸（SR）基因家族成员——U2小核RNA辅助因子1（U2af1），在调控血管生成中的作用。通过心脏超声、马松染色、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色、微血管灌注及血小板内皮细胞黏附分子（CD31）免疫荧光染色等方法，本研究发现NMN刺激的巨噬细胞释放的外泌体对心肌梗死具有保护作用，蛋白质组学分析表明U2AF1是参与心肌梗死保护的候选蛋白。对70例心肌梗死患者血浆U2AF1水平的检测显示，冠状动脉侧支血管（CCV）较差者（Rentrop评分0~1）显著低于CCV良好者（Rentrop评分2~3）。在心肌和后肢缺血小鼠模型中，U2AF1内皮细胞特异性过表达腺病毒可促进心脏和后肢血管生成，并改善心肌梗死后的心脏功能。机制研究表明，U2AF1通过调控Yes1相关转录调节因子（Yap1）基因的可变剪接（AS），影响心肌梗死后的血管生成及心脏功能恢复。综合临床研究结果表明，U2AF1可能成为心肌梗死后冠状侧支血管生成的治疗靶点。鉴于外泌体具有低免疫原性和高生物安全性的优势，本研究为基于外泌体的心肌梗死治疗提供了理论基础和转化潜力。

Abstract

Myocardial infarction (MI) is characterized by focal necrosis resulting from prolonged myocardial ischemia due to coronary artery obstruction. Vascular reconstruction following MI is crucial for improving cardiac function and preventing recurrent infarction. This study investigates the interaction between macrophages and endothelial cells in angiogenesis mediated by nicotinamide mononucleotide (NMN)-induced secretion of macrophage-derived exosomes. We focus on the role of U2 small nuclear RNA auxiliary factor 1 (U2af1) gene, a member of the splicing factor serine and arginine (SR) gene family, in the regulation of angiogenesis. Through cardiac ultrasound, Masson staining, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining, Microfil vascular perfusion, and platelet and endothelial cell adhesion molecule 1 (CD31) immunofluorescence staining, extracellular vesicles from NMN-stimulated macrophages were shown to exert a protective effect in MI, with proteomic analysis identifying U2AF1 as a candidate protein involved in MI protection. Plasma U2AF1 levels were measured in 70 MI patients, revealing significantly lower levels in individuals with poor coronary collateral vessel (CCV; Rentrop scores 0–1) than in those with good CCV (Rentrop scores 2–3). In both myocardial and hindlimb ischemia mouse models, overexpression of endothelial cell-specific adenoviral overexpression U2AF1 promoted angiogenesis in the heart and hindlimbs and improved cardiac function after MI. Mechanistic studies demonstrated that U2AF1 regulates the alternative splicing (AS) of Yes1-associated transcriptional regulator (Yap1) gene, influencing post-MI angiogenesis and cardiac function recovery. Collectively, our clinical findings suggest that U2AF1 may serve as a therapeutic target for coronary collateral angiogenesis following MI. Given the low immunogenicity and high biosafety of exosomes, this study provides a foundational basis and translational potential for exosome-based therapies in MI treatment.

关键词

血管生成 / U2小核RNA辅助因子1 / 可变剪接 / 巨噬细胞外泌体 / Yes1相关转录调节因子

Key words

Angiogenesis / U2 small nuclear RNA auxiliary factor 1 / Alternative splicing / Macrophage exosomes / Yes1-associated transcriptional regulator

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宫熳钰,李浩东,焦磊,刘彤,张燕伟,刘洁,王思钰,王浩,刘东萍,礼兆悦,都智源,孙丽华,宣立娜,吕世华,杨学文,王艳滢,涂应锋,李萌萌,吴昊迪,李鑫,冯雪,徐娟,李文志,张勇,张莹,杨宝峰. 巨噬细胞分泌的U2AF1通过调控Yap1的可变剪接调控冠状动脉血管生成以促进心肌梗死修复[J]. 工程（英文）, 2025, 50(7): 203-219 DOI:10.1016/j.eng.2025.06.006

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1 引言

血管生成作为关键的生理过程，在胚胎发育和组织稳态维持中起着重要作用。研究表明，心肌梗死（MI）后立即促进血管生成可有效改善缺血心肌区域的血液供应，保护心肌细胞，并减轻心脏不良重构[1‒2]。因此，通过刺激治疗性血管生成来预防心力衰竭并加速心肌梗死后组织修复，已成为极具前景的临床策略。

心肌梗死后，缺血区域的代谢失衡和细胞死亡会激活炎症反应，引发免疫细胞浸润并释放促炎性细胞因子与趋化因子，进而招募并激活髓系细胞[3‒5]。单核细胞被动员并募集至损伤部位，继而分化为巨噬细胞。这些巨噬细胞主要呈现两种极化表型：促炎性M1型巨噬细胞分泌白细胞介素-1B（IL-1B）、白细胞介素-6（IL-6）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）；修复性M2型巨噬细胞则分泌白细胞介素-10（IL-10）、血管内皮生长因子（VEGF）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1），从而促进心肌梗死后组织修复。已有研究表明，巨噬细胞可与内皮尖端细胞相互作用，作为细胞伴侣引导血管萌芽[6‒7]。然而，巨噬细胞促进内皮血管生成的具体途径和机制仍不完全清楚。

外泌体是直径为30~100 nm的微小膜囊泡，含有DNA、RNA、脂质、代谢物及表面蛋白等多种生物分子。由于其具有低免疫原性、稳定性的特性及靶向器官的能力，外泌体作为治疗载体备受关注。研究表明，巨噬细胞来源的外泌体（尤其是M1型）会加剧心脏炎症和损伤，而M2型则具有心脏保护特性[8‒9]。Wang等[10]发现M1型外泌体富含miR-155，这种分子在心肌梗死期间会被心肌成纤维细胞摄取，从而加重炎症反应并导致心肌破裂。此外，M1型外泌体通过抑制sirtuin 1（SIRT1）/腺苷5ʹ-单磷酸激活蛋白激酶α2（AMPKα2）-内皮一氧化氮合酶（eNOS）和Rac家族小GTP酶1（RAC1）/P21激活激酶2（PAK2）信号通路，阻碍血管生成[9]。与之相反，M2型外泌体含有miR-148a，该分子通过调控硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）、Toll样受体4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）/NLR家族及含吡啶结构域3（NLRP3）信号通路，缓解心肌缺血再灌注损伤[11]。这些发现凸显了M2型巨噬细胞外泌体在心肌梗死治疗中的潜力。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是参与能量代谢和细胞稳态的重要胞内辅酶。它作为电子载体，在氧化态（NAD⁺）与还原态（NADH）之间循环，从而为三磷酸腺苷（ATP）的生成提供必要的氧化还原反应[12‒13]。除了代谢功能外，NAD⁺还是DNA修复、表观遗传调控及翻译后修饰等的关键信号分子[14‒15]。鉴于心脏对能量的高需求，NAD⁺代谢异常与心血管疾病的关系日益受到关注[13,16‒17]。我们前期的研究发现，NAD⁺通过诱导M2巨噬细胞极化促进小鼠心肌梗死心脏的血管生成[18]。作为NAD⁺前体的烟酰胺单核苷酸（NMN），能被细胞高效摄取[19‒20]。然而，NMN刺激的巨噬细胞外泌体是否具有治疗心肌梗死的潜力仍不明确。基于先前研究，本研究旨在探索NMN诱导的巨噬细胞外泌体在促进血管生成和治疗心肌梗死中的潜在作用。

血管生成的调控涉及多个层面，包括转录前、转录和转录后机制[5]。可变剪接（AS）作为关键的转录前调控机制，能从单一前体信使RNA（mRNA）转录本中生成多种mRNA异构体，从而促进组织特异性转录组和蛋白质组的多样性[21‒23]。该过程受多种剪接因子调控，包括富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子1（SRSF1）、富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子6（SRSF6）以及U2小核RNA辅助因子1（U2AF1）[24‒26]。我们前期的研究发现，NAD⁺通过调控剪接因子SRSF1和SRSF6的表达，在巨噬细胞中促进促血管生成的VEGF165异构体生成，同时抑制抗血管生成的VEGF165b异构体[27]。Yang等[28]报道circ-0001052通过调控miR-148a-3p/miR-124-3p并募集蛋白质，提升同源结构域相互作用蛋白激酶3（Hipk3）水平，最终加剧心肌肥厚。Xu等[29]发现可变剪接因子/剪接因子2（ASF/SF2）指导维持发育期心肌细胞电生理功能的关键剪接模式，而钙调蛋白依赖性蛋白激酶II δ（CaMKIIδ）的错误剪接会导致过度收缩表型出现。作为U2小核RNA的辅助因子，U2AF1通过识别并结合3ʹ剪接位点（AG二核苷酸）对剪接体组装至关重要[30‒31]。U2af1基因的体细胞突变已被证实与多种髓系恶性肿瘤相关[30,32‒33]。本研究重点探讨U2AF1在心血管疾病中的调控作用，并分析NMN诱导的巨噬细胞外泌体是否通过AS机制影响血管生成。

Yes1相关转录调节因子（YAP1）作为Hippo信号通路的关键共激活因子，在多种生理和病理过程中发挥核心作用。在肿瘤中，YAP1与缺氧诱导因子1α（HIF1α）协同作用，激活血管内皮生长因子A（VEGFA）的转录，从而促进肿瘤血管生成[34]。He等[35]发现YAP1能增强出生后视网膜和肿瘤中的血管生成。类似地，Fan等[36]证实内皮特异性敲除Yap1会损害血管生成并加重心肌梗死模型小鼠的心脏功能恶化程度。Yap1基因包含9个外显子，可产生至少8种选择性剪接异构体。其中Yap1-1和Yap1-2异构体的区别在于是否包含编码第二个WW结构域的外显子4，这一结构域是蛋白质相互作用的关键基序[37]。含有两个WW结构域的异构体表现出更高的转录活性。α、β、γ和δ异构体源于Yap1-1和Yap1-2中外显子6的缺失及内含子5中选择性剪接位点的使用，从而使异构体功能多样。先前研究表明，YAP1-2γ通过与蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型14（PTPN14）相互作用来调控YAP1的致癌活性[38]，而YAP1-2α作为ErbB-4羧基末端片段的转录共激活因子比YAP1-1β更有效[39]。然而，Yap1异构体在心肌梗死后新生血管形成中的作用仍不明确。本研究旨在探讨不同Yap1亚型对心肌梗死后新生血管形成的影响，以期提供新的治疗策略。

本研究最新发现表明，经NMN处理的巨噬细胞分泌的外泌体通过促进血管生成，在心肌梗死中发挥心脏保护作用。这些外泌体特异性包裹U2AF1蛋白，并将其递送至血管内皮细胞后，U2AF1通过调控Yap1的AS来促进血管生成，从而助力心脏修复。值得注意的是，心肌梗死患者血浆中的U2AF1水平与冠状侧支血管（CCVs）质量显著相关，这提示U2AF1可能成为心肌梗死预后的重要生物标志物。

2 材料与方法

2.1 研究人群和数据收集

本前瞻性注册研究于2022年6月至2023年8月期间开展，共纳入40例不稳定型心绞痛（UA）患者和70例急性心肌梗死（AMI）患者。受试者年龄介于18~85岁之间。UA型心肌梗死的诊断标准为：持续胸痛至少30 min且症状出现后12 h内入院。诊断依据包括12导联心电图异常（伴或不伴T波/ST段改变）及心脏标志物水平升高（肌酸激酶MB或肌钙蛋白T/I）。为避免其他因素对U2AF1血浆蛋白水平的潜在影响，研究排除了恶性肿瘤及严重肝肾功能障碍患者。本研究遵循《赫尔辛基宣言》原则，并获得哈尔滨医科大学伦理委员会批准（编号：IRB5016723）。

2.2 冠状动脉血管造影术

冠状动脉造影术通过股动脉或桡动脉入路完成。我们采用离线定量冠状动脉造影分析程序（CAAS 5.10；荷兰Pie Medical Imaging公司）对介入治疗前、血栓切除术后及手术结束时的冠状动脉造影图像进行分析。两位经验丰富的研究人员将冠状动脉造影（CAG）图像数字化存档至数据库，且全程与患者信息隔离。当观察者意见不一时，将通过协商达成共识。针对70例急性心肌梗死患者，采用Rentrop评分标准评估侧支循环的存在与范围：0分表示线性不透亮的侧支血管，1分表示远端血管微弱充盈，2分表示间接通道中度充盈，3分表示远端血管内可见直径大于10 mm的大而明亮的侧支通道。根据Rentrop评分结果，患者被分为两组：侧支循环差（0级或1级）和侧支循环良好（2级或3级）。

2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）

实验采用ELISA试剂盒（货号为MM-62596H1，江苏酶免实业有限公司），按说明书操作流程进行检测。具体步骤如下：将根据Rentrop评分标准分为0级、1级、2级、3级的患者血清样本分装至微孔板中，室温孵育2 h。洗涤后加入检测抗体，继续室温孵育2 h。随后向各孔加入适当稀释的链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）溶液，室温孵育20 min。接着加入显色底物，室温避光孵育20 min。最后加入终止液，并在30 min内使用酶标仪（ABP 00380型，美国SpectraMax公司）测定吸光度。通过标准曲线计算确定U2AF1含量。小鼠血清样本的检测流程与上述方法相同。

2.4 细胞培养

RAW264.7细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购自上海中乔新舟生物科技有限公司。细胞培养采用Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM; Gibco，货号为C11965500BT；美国赛默飞世尔科技公司）作为基础培养基。此培养基添加了10%胎牛血清（美国赛默飞世尔科技公司）、1%青霉素（美国海克隆公司）和1%链霉素（美国海克隆公司）的混合液。细胞在37 °C、5%二氧化碳的恒温培养箱中培养。收集外泌体的巨噬细胞基础培养基需使用无外泌体血清配制。具体操作为将胎牛血清以100 000g离心2 h，收集上清液制备无外泌体血清，随后按上述基础培养基配方配制。

骨髓原代巨噬细胞取自C57BL/6小鼠胫骨和股骨。用DMEM冲洗骨髓后，以1000 r∙min^-1离心5 min，加入红细胞裂解液（货号为R1010；北京索莱宝科技有限公司）重悬2 min后离心去除红细胞。最后使用巨噬细胞集落刺激因子（MCSF; 20 ng∙mL^-1；货号为315-02-10UG；美国PeproTech公司）刺激骨髓细胞分化为巨噬细胞。

2.5 外泌体纯化、鉴定与分析

每批巨噬细胞外泌体通过连续超速离心纯化：将RAW264.7细胞接种于6孔板，在细胞融合度达70%~80%后继续培养48 h，收集上清液；NMN处理组加入0.5 mmol∙L^-1 NMN培养48 h后收集上清液。上清液经300g离心10 min、12 000g离心30 min，再次取上清液；4 ℃下用低温超速离心机以160 000g离心2 h，获得巨噬细胞外泌体。通过纳米颗粒跟踪分析、外泌体标志物检测及透射电镜对巨噬细胞外泌体进行鉴定。

2.6 外泌体体内荧光示踪

按先前报道的方法分离RAW264.7细胞来源的外泌体，用1,1ʹ-二辛基-3,3,3ʹ,3ʹ-四甲基吲哚三碳菁碘化物（DiR）标记浓度为1 μg∙μL^-1的外泌体：按500∶1的体积比加入1 mmol∙L^-1的DiR 染料，孵育30 min。为示踪体内外泌体，向小鼠尾静脉注射200 μg DiR标记的外泌体，2 h后用IVIS LuminaXRMS 活体成像系统（美国PerkinElmer公司）检测外泌体在各器官的定位。体外荧光示踪流程为活体成像后安乐死小鼠，分离肝脏、心脏、脾脏、肺、肾脏，用上述成像系统再次进行器官单独成像。

2.7 实验动物

本研究的动物使用方案获哈尔滨医科大学伦理委员会批准，遵循美国国立卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》（NIH出版物No.85-23，1996修订版）。6~8周龄C57BL/6 雄性小鼠（辽宁长生生物技术有限公司）用于构建左前降支（LAD）冠状动脉结扎模型和后肢缺血模型。全身内皮细胞特异性U2af1杂合敲除小鼠[U2af1^flox/+/钙黏蛋白 5（Cdh5）-Cre杂合转基因（Cre^+/-），简称U2af1-CKO]通过U2af1^flox/flox小鼠与Cdh5-Cre^+/-小鼠杂交获得。条件性等位基因纯合小鼠经聚肌苷酸-聚胞苷酸（pIpC）诱导后，其造血干细胞存活和功能受损，胚胎致死性限制了U2af1-CKO纯合子的构建，故本研究使用杂合子。基因型聚合酶链反应（PCR）引物：F1为5ʹ-CACTAAAAGTATCTATGGGACGGC-3ʹ，R1为5ʹ-CCACAAAGCTCTGCTCAGATACTC-3ʹ（纯合子：224 bp单条带；杂合子：224 bp和 155 bp两条带；野生型：155 bp单条带）；Cdh5-Cre-F为5ʹ-CCCAGGCTGACCAAGCTGAG-3ʹ；Cdh5-Cre-R为5ʹ-GTGAAACAGCATTGCTGTCACTT-3ʹ（Cre扩增子：583 bp）。通过腹腔注射2%阿佛丁（aftin，即三溴乙醇，10 mL∙kg^-1；货号为T48402；美国Sigma-Aldrich公司）麻醉动物。采用两步法安乐死动物，先将小鼠置于二氧化碳麻醉舱，再行颈椎脱位处理。

2.8 小鼠左前降支冠状动脉结扎模型构建

小鼠麻醉后气管插管连接小动物呼吸机，于左侧第2~3肋间开胸，打开心包，暴露心脏和左前降支，用7-0 Prolene缝线在左心耳尖端下方约1~2 mm处结扎左前降支。通过缺血区颜色改变和心电图ST段抬高确认心肌梗死模型成功构建。随后关闭胸腔，缝合皮肤伤口。外泌体处理组通过尾静脉注射对照巨噬细胞外泌体（Nor-Exo; 10 μg∙g^-1∙d^-1）或NMN诱导的巨噬细胞外泌体（NMN-Exo; 10 μg∙g^-1∙d^-1），连续7天。

2.9 心功能超声评估

心肌梗死组和假手术组小鼠于术后7天或28天麻醉，将小鼠仰卧位置于超声台，用小动物多普勒超声Vevo2100成像系统（加拿大Visualistics公司）进行M型超声心动图检查，以缩短分数（FS）和射血分数（EF）作为心功能评估主要指标。

2.10 小鼠股动脉结扎后肢缺血模型构建

6~8周龄C57BL/6雄性小鼠于术前3周注射U2af1过表达病毒（Tie启动子），手术时用2%阿佛丁（10 mL∙kg^-1）麻醉，结扎左股动脉和静脉。术后0天、3天、7天测量血流，评估U2AF1对动脉生成、血管生成及预后的影响。

2.11 激光多普勒成像

股动脉结扎术前及术后第3天、第7天，采用基于激光散斑对比分析技术（LASCA）的实时微循环成像仪（PeriCam PSI HR系统；瑞典Perimed公司）评估模型小鼠后肢血流，以任意灌注单位（PU）量化血流灌注。每个时间点采集3张图像，计算平均值，结果以缺血后肢与非缺血后肢的血流灌注比表示。

2.12 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色

为评估梗死面积，安乐死心肌梗死模型小鼠，分离心脏，用生理盐水洗涤3次，置于载玻片上，立即于-80 ℃冷冻5 min，将其切成1 mm厚的横截面切片，放入2% TTC溶液（货号为G3005；北京索莱宝科技有限公司）中37 ℃孵育20 min。梗死区呈白色，非梗死区呈红色。用Image J软件处理图像，计算梗死面积比=白色区域/心肌总面积× 100%。

2.13 马松（Masson）染色

按实验设计，在建立MI模型并对小鼠进行处理后对小鼠进行安乐死，完整分离心脏，用4%多聚甲醛固定48 h，脱水后石蜡包埋，将样品切成5 μm厚的切片。用马松三色染色试剂盒（货号为G1340；索莱宝公司）按说明书染色，脱水封片（二甲苯中取出切片，稍干后用中性树脂封片）。用Aperio VERSA扫描系统进行全景扫描，借助ImageScope软件分析图像。

2.14 Microfil灌注与三维显微计算机断层扫描（micro-CT）

按实验方案安乐死小鼠并完整分离心脏，将心脏置于含生理盐水的培养皿中，仔细分离主动脉，插管并用结扎线固定；插管另一端连接装有4%多聚甲醛的注射器，缓慢灌注心脏，排出血管内残留血液；随后将插管连接装有造影剂（Microfil MV 122；Microfil 缓释溶液= 1∶1.25，含5% Microfil硬化剂）的注射器，充盈心脏血管后，在插管接口处结扎主动脉。用体视显微镜观察并记录左前降支周围血管分布，并用小动物micro-CT（Quantum GX II；Perkinelmer公司）成像系统可视化心脏血管。

2.15 免疫荧光

心脏组织冷冻切片后，用4%多聚甲醛固定1 h，再用0.1% Triton X-100室温处理 15 min，随后用10%山羊血清+ 1%牛血清白蛋白（BSA）于37 ℃封闭1 h，加入CD31抗体（1∶500；货号为ab28346；英国Abcam公司）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（1∶500；货号为AF1032；美国Affinity Biosciences公司），4 ℃避光孵育过夜；磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次去除未结合的一抗，加入荧光二抗，37 ℃孵育1 h；用4ʹ,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色后封片。用共聚焦激光显微镜（货号为0972818；日本Olympus公司）获取梗死边缘区图像。

2.16 细胞计数试剂盒-8（CCK8）分析

将HUVECs接种于96孔板，按实验设计处理后弃去培养基，每孔加入100 μL培养液和10 μL CCK8试剂，在37 ℃培养箱孵育2~4 h后，用酶标仪检测450 nm处吸光度。

2.17 管形成实验

本研究通过基质胶（Matrigel）检测HUVECs的体外血管生成能力。将显微镜培养皿包被基质胶（150 μL∙孔^-1；货号为356234；美国Corning公司），基质胶凝固后，接种经U2af1小干扰RNA（siRNA）或阴性对照（NC）预处理的HUVECs细胞（密度为5 × 10⁴ 个∙孔^-1），37 ℃、5%二氧化碳条件下孵育4~6 h。用倒置显微镜拍摄各孔血管图像，用Image J软件计算管长并分析小管分支节点。

2.18 划痕实验

HUVECs融合至100%后，用无菌白色移液枪头沿细胞培养板中轴线划直线，加入无血清ECM，立即在倒置显微镜拍摄划痕（记录0 h划痕面积）；细胞在37 ℃细胞培养箱中继续培养12 h，用倒置显微镜拍摄划痕（记录12 h划痕面积），并用Image J软件定量评估伤口愈合率。

2.19 粒径分析

巨噬细胞源外泌体样本用双蒸水稀释，并用Zetasizer Nano ZS90（英国Malvern Instruments公司）于25 ℃测定样品粒径和多分散指数（PDI）。

2.20 流式细胞术

用胰酶消化HUVECs 获得单细胞悬液，PBS洗涤样品后，将样品置于70%乙醇中在4 ℃环境下固定过夜；用缓冲液重悬细胞，加入25 μL 碘化丙啶和10 μL核糖核酸酶（RNase）A，37 ℃避光孵育30 min。使用流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）以488 nm激发波长检测样品，并用ModFit软件分析DNA倍体和细胞周期分布。

2.21 RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）

使用Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒（货号为RIP-12RXN；美国Sigma-Aldrich公司），按说明书操作：将HUVECs裂解于含蛋白酶和RNase抑制剂的缓冲液中，细胞裂解液与结合抗U2AF1抗体（货号为ab172614；Abcam公司）的磁珠4 ℃孵育过夜；提取RNA，逆转录为互补DNA（cDNA）；通过实时定量PCR（qRT-PCR）分析样品，富集度以相对于输入的百分比计算。

2.22 琼脂糖凝胶电泳

称取1 g琼脂糖粉末，倒入250 mL锥形瓶，加入100 mL 1 × tris-乙酸-乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（TAE），微波加热至完全溶解，室温冷却至60 ℃，加入10 μL含溴化乙锭的上样缓冲液（LEB），倒入电泳槽胶板，冷却后制备1%琼脂糖凝胶。将琼脂糖凝胶放入电泳槽，倒入1× TAE后，加入DNA标志物和DNA样本进行电泳。电泳后，在紫外灯下观察凝胶条带，记录并拍照。

2.23 数据分析

使用SPSS v26.0和GraphPad Prism 9.0.1（美国GraphPad Software公司）进行统计分析。分类变量以计数和百分比表示；连续变量正态性用Kolmogorov-Smirnov检验评估，正态分布数据以均数±标准差（SD）表示，非正态分布数据以中位数（四分位数范围）表示。组间比较采用适当的统计检验，包括Student t检验、Mann-Whitney U检验、单因素方差分析（ANOVA）及Tukey检验、双因素方差分析及Tukey 检验、Log-rank（Mantel-Cox）检验、Kruskal-Wallis检验、χ²检验或Fisher精确检验。用二元logistic回归分析评估血清U2AF1水平与良好侧支循环的关系（调整临床相关协变量），计算比值比（OR）及95% 置信区间（CI）。P < 0.05（双侧）为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 NMN诱导的巨噬细胞外泌体通过促进血管生成改善心肌梗死小鼠的心功能

我们先前的研究表明，NAD⁺可促进巨噬细胞向M2型极化[18]，而M2型巨噬细胞源外泌体在心肌梗死中具有保护作用[11]。由于NAD⁺分子量较大，本研究采用其前体NMN进行实验。如附录A图S1（a）所示，NMN以剂量依赖性方式增加巨噬细胞中的NAD⁺水平。为探讨NMN对巨噬细胞极化的影响，我们采用Luminex液相悬浮芯片技术检测NMN处理的巨噬细胞分泌因子的表达水平[附录A图S1（b）]。与对照组相比，NMN（1 mmol∙L^-1）处理的巨噬细胞促炎细胞因子（CXCL1、IL-1B和TNF）水平降低，抗炎因子（VEGF、IL-10和CXCL12）水平升高[附录A图S1（c）和（d）]。此外，NMN通过下调M1相关标志物（Nos2、Tnf和Ccl3）和上调M2相关标志物（Il10、Vegf）促进M2型巨噬细胞极化[附录A图S1（e）~（i）]。在脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞中，NMN也降低了促炎细胞因子（Il1b、Il6、Tnf和Ccl3）的表达，同时增强了抗炎细胞因子（Il10）的表达[附录A图S1（j）~（n）]。这些结果表明，NMN可促进巨噬细胞向M2型极化。

为进一步探讨NMN刺激的巨噬细胞源外泌体是否具有功能，我们首先通过差速离心法分离外泌体并进行形态学分析。为清晰起见，我们将这些外泌体称为NMN-Exo。纳米颗粒跟踪分析显示其粒径分布均匀，中心粒径约为100 nm [附录A图S2（a）]；透射电镜显示外泌体具有透明的双层膜结构，直径范围为30~150 nm [附录A图S2（b）]。与细胞裂解物相比，NMN-Exo中外泌体标志物CD63和CD81的表达显著升高[附录A图S2（c）]。免疫荧光分析进一步证实，NMN处理的巨噬细胞中外泌体特异性标志物CD63水平升高[附录A图S2（d）]。这些结果表明，NMN可促进巨噬细胞源外泌体的产生并提高其装载效率。

为探讨NMN-Exo对心功能的影响，我们向心肌梗死模型小鼠静脉注射NMN-Exo或Nor-Exo（即对照组外泌体）[图1（a）]。DiR标记的外泌体荧光成像显示，外泌体主要在肝脏和脾脏中积累，少量到达心脏[图1（b）]。与Nor-Exo相比，NMN-Exo显著改善心功能，表现为心肌梗死后7天EF和FS增加、梗死面积缩小以及胶原沉积减少[图1（c）~（e）]。这些心功能的改善在心肌梗死后28天仍然存在（附录A图S3）。我们进一步比较了NMN直接给药（50 mg∙kg^-1和500 mg∙kg^-1）与NMN-Exo处理的治疗效果。所有治疗组均显示心功能增强和梗死面积缩小，但NMN-Exo的治疗效果最为显著（附录A图S4）。此外，我们通过Microfil灌注观察到，NMN-Exo增加了梗死边缘区的新血管生成[图1（f）]，并上调了心脏组织中CD31的表达[图1（g）]。Nor-Exo组未观察到这些效果，表明NMN-Exo在心肌梗死小鼠中具有特异性的促血管生成作用。为观察巨噬细胞源外泌体在体内的行为，我们量化了其在冠状动脉血管中的滞留情况。通过尾静脉注射Dil标记的巨噬细胞外泌体，我们观察到其与CD31阳性血管内皮细胞共定位[图1（h）]，表明这些外泌体可被内皮细胞内化并参与心肌梗死后的血管生成。

为阐明NMN-Exo促进心肌梗死小鼠血管生成的潜在机制，我们探讨了NMN-Exo被内皮细胞摄取的情况[附录A图S5（a）]。PKH26标记的NMN-Exo被HUVECs内化并定位于细胞核附近[附录A图S5（b）]。浓度为25 μg∙mL^-1和125 μg∙mL^-1的NMN-Exo显著促进HUVECs增殖，而Nor-Exo无明显作用[附录A图S5（c）]。NMN-Exo还促进HUVECs进入S期，进一步支持其具有增强增殖的能力[附录A图S5（d）]。划痕实验和管形成实验证实，NMN-Exo（而非Nor-Exo）显著促进内皮细胞迁移和血管生成[图1（i）和（j）]。综上，这些结果表明NMN-Exo通过促进血管生成改善心肌梗死小鼠的心功能。

3.2 NMN诱导的巨噬细胞外泌体的特征性蛋白表达谱

定量蛋白质组学分析显示NMN-Exo和Nor-Exo之间存在差异表达蛋白[图2（a）]。基因本体（GO）分析鉴定出16种上调蛋白（参与囊泡合成、囊泡运输和可变剪接等过程，如SEC22B、U2AF1、SLC7A5）和8种下调蛋白（如AOC3、VNN1、ITIH3、KNG1、TALOD1、MFAP4、TUBGCP3和SERPING1）[图2（b）~（d）]。实时定量PCR（qRT-PCR）分析证实，16种上调基因中的大多数在NMN处理的巨噬细胞中也表达升高，其中U2af1的上调最为显著（附录A图S6）。在上调蛋白中，SEC22B和SLC7A5已知参与囊泡运输和氨基酸运输，均与血管生成有关。因此，我们进一步评估了这些蛋白的水平，蛋白质印迹最终证实NMN-Exo样本中SEC22B和U2AF1水平升高，与定量蛋白质组学结果一致[图2（e）]。在NMN处理的巨噬细胞中也观察到这些蛋白的水平有类似升高[图2（f）]。SEC22B因其在囊泡运输中的作用而被熟知，而U2AF1参与mRNA剪接。这些发现表明，SEC22B和U2AF1可能在NMN-Exo介导的血管生成中发挥关键作用。

3.3 U2AF1通过促进血管生成介导心肌梗死的心脏修复

为比较U2AF1和SEC22B在心脏疾病中的作用，我们重新分析了健康志愿者（HVOLs）和心力衰竭（HF）患者的血清转录组测序（RNA-seq）数据（GSE208194）。心力衰竭患者的血清中U2AF1水平显著低于健康志愿者组[图3（a）]，而SEC22B未观察到显著变化。U2AF1的蛋白质序列在小鼠和人类之间高度保守（附录A图S7）。利用小鼠心肌梗死模型进一步验证发现，心肌梗死后3天、7天和28天，血清和心脏组织中U2AF1的表达均下调[图3（b）和（c）]，表明U2AF1可能在心肌梗死病理过程中发挥作用。为探讨U2AF1的功能，我们在心肌梗死小鼠中采用腺相关病毒血清型9（AAV9）介导的内皮细胞特异性过表达系统（U2AF1-v）和对照病毒（Vector-v）分别感染小鼠（附录A图S8）。U2AF1过表达显著改善心功能并上调血管生成标志物CD31的表达[图3（d）和（e）]，表明U2AF1可增强血管生成。为进一步验证，我们在U2AF1-v和Vector-v小鼠中建立后肢缺血模型。激光多普勒成像显示，与对照组相比，U2AF1过表达组在缺血后3天和7天的血流恢复速度显著加快。此外，U2AF1过表达小鼠缺血后肢的毛细血管密度（CD31标记）和小动脉数量（α-SMA标记）增加[图3（f）和（g）]。

在体外实验中，缺氧和H₂O₂处理（模拟心肌梗死的缺血和氧化应激环境）的HUVECs中U2AF1表达降低[图4（a）和（b）]。转染U2AF1表达载体显著提高HUVECs中U2af1 mRNA和蛋白的水平[图4（c）和（d）]。此外，U2AF1过表达增加了缺氧或H₂O₂处理的HUVECs中S期和G2/M 期细胞的比例[图4（e）和（f）]，并增强了H₂O₂处理的HUVECs的迁移能力[图4（g）]。我们还探讨了U2AF1对心肌细胞的影响。蛋白质印迹分析显示，缺氧诱导损伤12 h和24 h后，原代新生小鼠心肌细胞中U2AF1蛋白水平显著降低[附录A图S9（a）]。我们还成功构建并验证了U2AF1过表达质粒的转染效率[附录A图S9（b）]。流式细胞术检测结果表明，U2AF1过表达显著减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡[附录A图S9（c）和（d）]。这些结果表明，U2AF1通过增强缺血和氧化应激条件下HUVECs的增殖和迁移来促进血管生成，并且对心肌细胞凋亡具有保护作用。

**3.4 内皮细胞特异性U2af1敲除抑制心肌梗死模型小鼠的心脏血管生成并损害心脏损伤修复**

内皮细胞特异性U2af1敲除小鼠（U2af1-CKO）的敲除效率优异，主动脉组织中U2af1表达显著降低[图5（a）和（b），附录A图S10]。8周龄时，与U2af1^f/+小鼠相比，U2af1-CKO小鼠的心功能显著降低[图5（c）]。与U2af1^f/+ + MI组相比，U2af1-CKO + MI小鼠的存活率降低[图5（d）]。值得注意的是，随着心肌缺血时间的延长（心肌梗死7天、14天和28天），U2af1-CKO小鼠的心功能比U2af1^f/+小鼠下降更多[图5（e）和（f）]。此外，心肌梗死28天时，U2af1-CKO小鼠的梗死面积大于U2af1^f/+小鼠[图5（g）]。心肌梗死7天时，U2af1-CKO小鼠的胶原沉积比U2af1^f/+小鼠更严重[图5（h）]。三维（3D）micro-CT和CD31免疫荧光证实，U2af1-CKO + MI组小鼠心脏血管密度和CD31标记的内皮细胞显著减少[图5（i）和（j）]。在体外，qRT-PCR验证了siRNA介导的U2af1敲低效果[图5（k）]。如图5（l）和（m）所示，与转染siRNA阴性对照（siNC）的细胞相比，敲低U2af1显著降低HUVECs的迁移和管形成能力。这些结果强调了U2AF1在内皮细胞中特异性敲低时对血管生成和心肌梗死后修复的关键作用。

**3.5 U2AF1通过调控Yap1可变剪接促进血管生成**

作为剪接辅因子，U2AF1主要调控可变剪接事件。为揭示U2AF1在血管生成中发挥作用的分子机制，我们对U2AF1过表达的HUVECs和载体转染的对照组进行了全基因组RNA测序。我们分析了5种主要的可变剪接类型，包括外显子跳跃（SE）、可变5ʹ剪接位点（A5SS）、可变3ʹ剪接位点（A3SS）、互斥外显子（MXE）和内含子滞留（RI）事件，发现U2AF1过表达细胞与对照组相比有2696个显著的可变剪接事件。其中，1294个可变剪接事件上调，1402个下调，外显子跳跃事件占比最大（53.9%）[图6（a）]。筛选|Δ剪接包含率（PSI）|大于0.1且P小于0.05的事件，我们鉴定出U2AF1相关的外显子跳跃事件。GO分析显示，这些事件富集于细胞增殖、迁移、伤口愈合、细胞周期调控、自噬和mRNA剪接等过程[图6（b）]。免疫荧光证实U2AF1主要定位于细胞核[图6（c）]，与其在前体mRNA剪接中的作用一致。鉴于U2AF1参与剪接和血管生成，我们重点关注YAP1进行基因调控网络分析[图6（d）]。Yap1由 9个外显子组成，存在两种主要的剪接异构体（Yap1-1和Yap1-2），两者被确定为核心靶标，这些异构体进一步分为α、β、γ和δ亚型[图6（e）]。测序数据显示，U2AF1过表达在染色体（ch）11:102056749-102056862处诱导Yap1的外显子跳跃，具体影响外显子4 [图6（f）]。

为证实U2AF1对Yap1可变剪接的直接调控作用，我们设计了内含子3和外显子4交界处的引物进行RNA免疫沉淀实验，证实U2AF1与Yap1的外显子4剪接位点结合[图6（g）]。本研究使用外显子3上游和外显子5下游的引物对Yap1中的外显子4跳跃事件进行分析，进一步发现与NC组相比，U2AF1过表达诱导Yap1-2相对上调和Yap1-1相对下调[图6（h）和（i）]。

**3.6 U2AF1促进Yap1-2γ剪接体的形成并增强血管生成**

Yap1-1和Yap1-2产生四种剪接异构体：α、β、γ和δ。对U2AF1过表达细胞中转录本表达的分析显示，Yap1-2β和Yap1-2γ异构体表达上调，Yap1-1δ和Yap1-2δ表达下调[图6（j）]。我们使用外显子3上游引物和外显子7下游引物，扩增出与Yap1-1和Yap1-2相关的8种剪接变体。琼脂糖凝胶电泳显示出不同的DNA条带，其中Yap1-2γ、Yap1-2α和Yap1-1δ含量最高[图6（k）]。高丰度Yap1剪接变体与全基因组测序中显著改变的转录本的Venn图比较表明，U2AF1通过抑制外显子4跳跃来调控Yap1功能，从而促进Yap1-2γ异构体的表达，同时抑制Yap1-1δ异构体表达[图6（l）]。为评估Yap1可变剪接对血管生成的影响，我们构建了Yap1-2γ和Yap1-1δ的过表达质粒。琼脂糖凝胶电泳证实转染细胞中两种剪接变体的表达均显著增加[图6（m）]。细胞划痕实验显示，Yap1-2γ过表达后伤口闭合率提高，而Yap1-1δ无类似效果[图6（n）]。在管形成实验中，Yap1-2γ过表达显著增加相对管长和管节点数量。相比之下，尽管Yap1-1δ过表达也延长了管长，但对管节点形成无显著影响[图6（o）]。为确定U2AF1是否通过调控Yap1剪接来调节血管内皮细胞迁移，我们使用可变剪接抑制剂Madrasin进行干预。划痕实验显示，与对照组相比，U2AF1过表达增强HUVECs迁移；然而，在Madrasin预处理的细胞中，这种作用被消除（附录A图S11）。这些结果表明，U2AF1通过调控Yap1的可变剪接来调节血管内皮细胞迁移。

3.7 U2AF1作为心肌梗死预后的循环生物标志物

上述发现凸显了U2AF1通过促进血管生成在心肌梗死修复中的作用。先前的研究表明，及时形成侧支循环是心肌损伤修复的关键步骤。基于此，我们探讨了循环U2AF1水平与心肌梗死的关联。在一项涉及110例患者（40例UA和70例AMI）的研究中，急性心肌梗死患者的U2AF1蛋白水平显著低于对照组。U2AF1水平与侧支循环呈正相关，侧支循环是心肌缺血损伤修复的重要组成部分（图7）。两组患者的临床基线特征存在差异（表1）。具体而言，急性心肌梗死组男性患者比例更高（75.7% vs 37.5%, P < 0.001），肌酸激酶同工酶[CK-MB; 110.65 (47.85, 225.05) μ∙L^-1 vs 0.55 (0.40, 0.80) μ∙L^-1, P < 0.001]、N末端脑钠肽前体[NT-pro BNP; 1404.50 (676.03,2608.75) pg∙mL^-1 vs 47.61 (19.06, 90.22) pg∙mL^-1, P < 0.001）和左心室射血分数[LVEF; 53.0% (42.0%, 59.0%) vs 62.5% (60.0%, 69.0%), P < 0.001]以及其他心肌梗死和心力衰竭指标显著升高。值得注意的是，与对照组相比，急性心肌梗死患者的U2AF1蛋白水平显著降低[(2.51 ± 1.87) ng∙mL^-1 vs (4.35 ± 1.48) ng∙mL^-1, P < 0.001]，如表1和图7（a）所示。在其他测量参数中，不稳定型心绞痛和急性心肌梗死组之间未发现显著差异。我们还通过对造影图像进行Rentrop评分评估急性心肌梗死患者的侧支循环。Rentrop评分0分、1分、2分和3分的患者分别为7例、19例、30例和14例。共有26例患者（37%）侧支循环不良（Rentrop评分0分或1分），44例患者（63%）侧支循环良好（评分2分或3分）[图7（b）]。进一步分析证实，U2AF1蛋白水平与侧支循环呈正相关[图7（c）和（d）]。这些结果支持U2AF1具有作为心肌梗死预后循环生物标志物的潜力。

4 讨论

冠状动脉侧支微循环障碍增加心肌梗死风险，并促成不良心脏重构。然而，心肌梗死期间恢复冠状动脉微循环的具体靶点和机制仍不清楚。本研究结果证明了NMN作为心脏血管生成的促进剂，在心肌梗死进展过程中调控巨噬细胞-内皮细胞相互作用。NMN作用于巨噬细胞，刺激其释放具有独特蛋白谱的外泌体，从而增强血管生成并改善心功能。重要的是，U2AF1通过其在Yap1可变剪接中的作用被确定为心肌梗死后血管生成的关键调控因子。特异性调控血管内皮细胞中U2AF1的表达可促进或抑制血管生成。来自不稳定型心绞痛和急性心肌梗死患者的临床样本显示，急性心肌梗死组血清U2AF1水平显著降低，且与侧支循环程度明显相关。

传统的心肌梗死治疗方法，如旁路手术、支架植入或溶栓治疗等血运重建术，主要针对大血管阻塞。这些方法虽能快速恢复主要血流，但往往无法完全解决心肌细胞水平的缺血缺氧问题。因此，及时形成冠状动脉侧支循环已成为一种有前景的治疗策略[40‒41]。研究表明，提高NAD⁺水平可通过防止心肌细胞凋亡并改善代谢、线粒体、溶酶体功能，保护心脏免受心力衰竭、心肌梗死、扩张型心肌病和缺血再灌注损伤[20,42‒48]。然而，大多数先前的研究采用全身给药，且NAD⁺改善心肌梗死后侧支循环的具体机制仍不清楚。我们先前的研究表明，NAD⁺通过促进M2型巨噬细胞极化增强心肌梗死小鼠心脏的血管生成[18]。本研究选择NMN（一种具有更好细胞摄取能力的NAD⁺前体[19‒20]）作为切入点，探讨心肌梗死后侧支血管形成的分子机制，同时发掘与冠状动脉侧支循环相关的循环生物标志物和治疗靶点。

血管生成是一个涉及多种细胞类型的复杂过程，其中巨噬细胞发挥核心作用[49]。本研究结果证实NMN抑制巨噬细胞向促炎性M1表型极化，并促进M2型巨噬细胞极化。由于外泌体的内源性来源和异质性，其在诊断和治疗中具有独特优势[50‒52]。在心肌梗死小鼠模型中，NMN源外泌体显著改善心功能、缩小梗死面积并抑制胶原过度沉积。NMN-Exo处理的HUVECs显示出增殖、迁移和管形成能力增强的特征。对NMN-Exo的蛋白质组学分析揭示了16种与囊泡运输和可变剪接相关的上调蛋白。基于心力衰竭患者的血液样本分析，U2AF1被进一步确定为心肌修复的关键因子。U2AF1是一种参与多种髓系恶性肿瘤发生的剪接辅因子，本研究发现其在心肌梗死小鼠心脏组织中表达降低。在体内实验中，U2AF1过表达改善心功能并促进血管生成。全基因组测序进一步证实其在调控可变剪接事件（尤其是外显子跳跃事件）中的作用。转录共激活因子YAP1是器官大小和血管发育的关键调控因子，随后被确定为U2AF1的下游靶标。Yap1具有多种异构体，U2AF1过表达导致Yap1-2γ表达增强，同时抑制Yap1-1δ表达。这些剪接变化调节内皮细胞迁移和管形成。

作为一种非侵入性诊断工具，血清标志物在评估心脏侧支循环和预测疾病进展方面显示出巨大潜力。然而，研究表明某些血清标志物，如VEGF和成纤维细胞生长因子（FGF），会促进病理性血管生成并增加血管渗漏风险[53‒55]。因此，需要发掘新的生理性血管生成因子。本研究通过分析110例临床患者（40例不稳定型心绞痛和70例急性心肌梗死）的血清U2AF1水平变化，发现急性心肌梗死患者的U2AF1蛋白水平显著低于对照组。此外，我们使用Rentrop评分评估急性心肌梗死患者的侧支循环，发现U2AF1水平与侧支循环密切相关，表明U2AF1有望成为心肌梗死预后的潜在外周血标志物。与我们的发现一致，Bao等[56]研究了血管生成素-2对糖尿病心肌缺血小鼠血管生成的影响，并评估了血清血管抑制素-2水平与糖尿病慢性完全闭塞（CTO）患者CCVs的关系。然而，目前将循环U2AF1水平作为心肌梗死预后外周血标志物的应用仍有限。血清U2AF1水平可能随疾病进展和治疗干预而波动，难以准确捕捉其动态变化。为获得更可靠的结果，必须仔细考虑这些因素，并采取适当措施控制或消除潜在的混杂因素。此外，未来的研究应使用更大的样本量、更长的随访时间、更广泛的蛋白质组学分析和更严格的研究设计，进一步探讨血清蛋白水平与疾病的关联。尽管本研究为NMN和U2AF1在促进心肌梗死期间血管生成中的作用提供了重要见解，但也存在一些局限性。针对U2AF1的靶向治疗药物筛选仍有待进行，这些发现需要临床验证才能转化为治疗干预措施。总体而言，本研究强调了针对心肌梗死期间微循环功能障碍的治疗策略的重要性，并强调了U2AF1在调控血管生成中的关键作用，为与微循环障碍相关的心肌梗死提供了一种有前景的临床标志物。

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Received	Accepted	Published
2024-10-11	2025-05-26	2025-07-01
Issue Date
2025-06-25

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