克罗诺杆菌的食品安全风险及危害因子

凌娜 ,  蒋秀婷 ,  Stephen Forsythe ,  张丹凤 ,  沈益忠 ,  丁郁 ,  王涓 ,  张菊梅 ,  吴清平 ,  叶应旺

工程（英文） ›› 2022, Vol. 12 ›› Issue (5) : 129 -139.

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工程（英文） ›› 2022, Vol. 12 ›› Issue (5) : 129 -139. DOI: 10.1016/j.eng.2021.03.021

克罗诺杆菌的食品安全风险及危害因子

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Food Safety Risks and Contributing Factors of Cronobacter spp.

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摘要

克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）是一种革兰氏阴性条件致病菌，可导致新生儿与婴幼儿患脑膜炎、败血症以及坏死性小肠结肠炎等疾病，严重者留下神经系统后遗症。目前，Cronobacter spp. 对婴幼儿的高毒力已经引起了全世界的关注。本文分析了Cronobacter spp. 在重要食品中的流行情况，回顾了该菌在胁迫环境下的应答机制及其致病机制等，并强调了Cronobacter spp. 对食品安全的重要性，以及相关控制手段、临床治疗方案制定的意义。

Abstract

Cronobacter species are a group of Gram-negative opportunistic pathogens, which cause meningitis, septicemia, and necrotizing enterocolitis in neonates and infants, with neurological sequelae in severe cases. Interest in Cronobacter has increased significantly in recent years due to its high virulence in children. In this review, we summarize the current understanding of the prevalence of Cronobacter species in several important food types. We discuss the response mechanisms enabling persistence in adverse growth conditions, as well as its pathogenicity. We emphasize the food safety concerns caused by Cronobacter and subsequent control methods, and clinical treatments.

关键词

克罗诺杆菌 / 食品污染 / 致病机理 / 毒力因子 / 胁迫应答

Key words

Cronobacter / Food contamination / Pathogenesis / Virulence factors / Stress response

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凌娜,蒋秀婷,Stephen Forsythe,张丹凤,沈益忠,丁郁,王涓,张菊梅,吴清平,叶应旺. 克罗诺杆菌的食品安全风险及危害因子[J]. 工程（英文）, 2022, 12(5): 129-139 DOI:10.1016/j.eng.2021.03.021

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1、 引言

克罗诺杆菌原名阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii），隶属于肠杆菌科，是一种寄生于动物体和人体肠道内的革兰氏阴性无芽孢杆菌[1]。2008年，Iversen等[2]利用生物学手段，对E. sakazakii进行多样性分析及DNA杂交分析，建议将E. sakazakii定义为Cronobacter spp.。目前，Cronobacter spp.包括7个种：阪崎克罗诺杆菌（C. sakazakii）、丙二酸盐克罗诺杆菌（C. malonaticus），二者是引起公共卫生关注的主要致病菌；莫金斯克罗诺杆菌（C. muytjensi）、都柏林克罗诺杆菌（C. dublinensis）和康帝蒙提克克罗诺杆菌（C. condimenti），其临床意义较低；而苏黎世克罗诺杆菌（C. turicensis）、尤尼沃斯克罗诺杆菌（C. universalis）很少被研究报道。

新生儿感染Cronobacter事件已引起广泛关注。从1961年，英国首次报道住院婴儿中分离到Cronobacter。1979年，在佐治亚州梅肯的新生儿中报道了由Cronobacter引起的菌血症病例。继而，在荷兰（1983年、1987年）和希腊（1987年）、冰岛（1989年）和美国（1989年和2001年）也出现Cronobacter感染的报道。2001年，美国发生一系列Cronobacter感染事件，美国疾病预防控制中心对污染的婴幼儿配方奶粉（powdered infant formula, PIF）进行了溯源调查[3]。

尽管人们更多地关注于Cronobacter感染婴儿的病例，但是Cronobacter可以感染所有年龄组。Cronobacter感染可导致成人患轻微的胃肠道炎症、腹泻和尿路感染，其中，老年和免疫功能低下的成人最易感染Cronobacter [4]。

出生两个月内的新生儿，尤其是体重不足的早产儿[5]，由于其胃酸pH值较成年人高、免疫屏障不健全等因素，感染致病菌风险较高，致死率高达50%~80% [6]。2002年，国际食品微生物规范委员会[7]将Cronobacter定义为“严重危害特定人群生命、引起长期慢性实质性后遗症的一种致病菌”。据美国疾病控制与预防中心统计，美国每年有4 ~ 6名婴儿感染Cronobacter。由于政府卫生部门没有要求各部门上报Cronobacter感染，因此这个数据被严重低估。

在许多国家，婴儿感染Cronobacter的原因经常被溯源至其食用了受Cronobacter污染的PIF。然而，目前由于我国分子溯源分析较少，我国还没有Cronobacter感染关联到PIF品牌的确切临床报告。这可能归因于中国食源性Cronobacter临床感染的追踪体系不健全，监测系统仍需不断完善[8]。

该致病菌可通过黏附于宿主细胞表面、侵入肠屏障和血脑屏障引发多种疾病（图1 [9‒11]），轻微症状表现为发热、嗜睡或精神不振[12]，严重者则患有结膜炎、胆汁性败血症、尿脓毒症、脑膜炎等[13]。虽然Cronobacter感染的患者可以在抗生素治疗后恢复，但他们往往会出现严重的神经系统后遗症和发育障碍。

图1 （a）感染Cronobacter的新生儿脑部轴位增强T1加权磁共振成像（magnetic resonance image, MRI），左侧额叶有一个大的环形增强积液病变（引用Burdette等[9]的研究）。（b）喂养含有Cronobacter奶粉的幼鼠发生新生儿坏死性小肠结肠炎（neonatal necrotizing enterocolitis, NEC）（引用Blackwood等[10]的研究）。（c）Cronobacter感染小鼠的病理组织的苏木精-伊红染色结果：（i）胶质增生（黑色箭头），标尺= 100 μm；（ii）脑膜炎（黑色箭头），标尺=50 μm；（iii）肝细胞变性（黑色箭头），标尺 = 50 μm；（iv）肝脏切片炎症（黑色箭头），标尺 = 50 μm；（v）炎症（黑色箭头），标尺 = 100 μm；（vi）盲肠切片恶化（黑色箭头）和菌落（白色箭头），标尺 = 100 μm（引用Lee等[11]的研究）。

因此，为了全面了解Cronobacter对人类健康的潜在风险和致病机制，本文将从该致病菌在食品中的污染分布、其在不同环境中的耐受性以及对食品安全造成威胁的毒力因子及其临床控制新措施的需求等方面进行综述。

2、 食品污染情况

Cronobacter在自然界中分布极为广泛，可存在于水、土壤、动物及人体排泄物中[14]。目前，研究人员对其生态位、传播途径、流行病学规律和致病机制仍处于探索阶段，因此开展Cronobacter在不同食品中的污染分布调查，对预防控制由该菌引发的食物中毒事件有很好的预警作用。

2.1 婴幼儿食品

自英国首次报道由Cronobacter引起的新生儿脑膜炎后[15]，全球范围内由该致病菌感染引起的婴幼儿食品安全事件频频暴发[16‒17]。因此，对PIF和其他婴儿食品进行Cronobacter监测是非常重要的。刘秀梅等[18]首次在87份中国安徽阜阳劣质婴幼儿配方奶粉中发现存在Cronobacter，检出率为12.6%。这些产品均未能满足良好的生产规范和质量要求。2018年，据欧盟食品和饲料类快速预警系统（Rapid Alert System for Food and Feed, RASFF）通报，一婴幼儿配方奶粉生产企业因使用了被Cronobacter污染的奶粉原料，导致多品牌多批次PIF有感染致病菌的风险，相关PIF也已出口至中国、法国等多个国家。然而，PIF并不是唯一值得关注的婴儿食品，因为Cronobacter在米粉、营养饼干和面制品等婴幼儿辅食中的污染率（1.2%~27%）与PIF（0.9%~23.1%）相似[8]。

多起新生儿Cronobacter感染事件也表明PIF是该致病菌的主要感染载体[16]，2004年，FAO和WHO将Cronobacter spp.列为PIF中A类致病菌[19]。

该致病菌主要通过未彻底灭菌的生产原料、巴氏杀菌后配方粉或添加剂干粉带入、冲泡过程来污染PIF。PIF的生产方法通常包括干混和湿混喷雾干燥。干混过程通常不需要进行大量的高温处理，因此易于导致部分数量较少的致病菌附着在食品容器和包装袋上，这往往容易在随机抽样检查中被忽视。另外，在湿混喷雾干燥过程中，进出风口的气溶胶和操作人员均可能将外源Cronobacter带入喷雾干燥塔[20]。此外，在分析PIF生产链中Cronobacter的污染情况时发现，喷雾干燥器车间、流化床车间落地粉和空气过滤车间地板等生产区域Cronobacter污染率很高[21]。因此，巴氏杀菌只能在PIF生产的早期阶段灭活Cronobacter，但无法使隐藏在配料、过滤器、喷雾干燥塔和其他加工设备中的Cronobacter失活[22‒23]。一旦生产环境被污染，就可能导致新生儿食用含该致病菌的PIF而患病[24]。

2.2 即食生鲜食品

除婴幼儿食品外，日本料理[25]、熟肉制品、奶酪、牛肉末、香肠末[26]中均检测出Cronobacter阳性株。据报道，植物可能是Cronobacter的自然来源[27]，30.27%的即食蔬菜食品中含有Cronobacter [28]，且凉拌菜中Cronobacter阳性率为8.2% [29]。通过分析Cronobacter在即食生鲜食品中的流行情况发现，由于凉拌菜、鲜榨果汁或生鲜水果售卖季节通常为春、夏等温度较高的季节，可能为致病菌繁殖提供了有利条件。

在食品制备过程中需要良好的卫生规范，如果没有遵循适当的清洗程序，用于存放熟食的砧板、刀具和器皿及原材料中的Cronobacter可能会导致即食食品中的交叉污染。

2.3 即食干制食品

与其他肠杆菌科菌株相比，Cronobacter具有显著的抗干燥特性，Cronobacter感染与奶粉污染的流行病学相关性研究也证明了这种优势特性。在中国14家工厂收集的1012份脱水米粉中发现7.5％的样本呈Cronobacter阳性，其中一家工厂的Cronobacter检出率更是高达28.8% [30]。一项与荷兰生产或销售的食品中Cronobacter污染有关的五年调查报告也表明，干谷物和香辛料中的Cronobacter检出率分别约为4%和3% [31]，而中国香辛料Cronobacter总检出率高达57% [32]，调味料中Cronobacter的检出率为6.3% [33]。因此，添加香辛料的干制食品不经烹调直接与食品共食，容易将外源性Cronobacter转移到菜肴中，对消费者带来潜在危害。

鉴于Cronobacter的广泛分布，食品工业，特别是婴儿食品制造商，需要控制这种病原体，必须对原料和加工环境进行有效的分离和定期清洗。

3、 环境胁迫

食源性致病菌在经历食品生产—餐桌—人体感染的过程中，往往会经历不同的不利环境（图2）。Cronobacter具有极强的逆境耐受力，在干燥、热休克、酸冲击等特殊条件下可代谢生成特殊物质，如海藻糖、脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱、葡萄糖、N-酰基高丝氨酸内酯、色素以及特定蛋白来缓解外界压力[34]。同时，该致病菌抵御逆境和抗生素的能力使得病原体难以被根除。由于该菌顽强的生存能力及对婴幼儿极高的致死率，其在婴幼儿食品领域得到广泛关注。

图2 微生物面临来自食物和人类宿主的不同胁迫环境。酸：常见的食物防腐剂和胃的天然抑菌剂；盐：常见的食物防腐剂，也是宿主形成渗透胁迫的天然防御系统；谷物副产品或粉状食品的低水分活度和食品加热过程不利于食源性病原体的生长；口腔黏膜是细菌通过进食方式接触到的第一道机体保护屏障，口腔和胃产生的酶也可以抑制细菌的生长；胃肠道中的有机酸、药物、氧化物和免疫因子是细菌面临的不可避免的胁迫环境；氧化物和一氧化氮：免疫细胞释放的物质；免疫因子：由免疫细胞引起的宿主防御反应；CSF：脑脊液。

3.1 干燥抗性

Cronobacter比大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌和其他肠杆菌科菌株的耐干燥能力更强[35]。106 CFU∙mL-1的Cronobacter在脱水PIF中室温条件下放置5个月活菌数降低2.4个对数周期，而随后的19个月存活菌量仅下降了1个对数周期，且该菌可在PIF中存活长达两年之久[36]。

Breeuwer等[37]认为，Cronobacter能通过K+等金属离子积累以及海藻糖、脯氨酸和甜菜碱等相溶性物质的分泌增加细胞间的渗透压，维持大分子周围的水膜以减少细胞间的脱水作用。在C. sakazakii SP291干燥过程中，opuCABCD操纵子和proP基因编码的运输脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱的OpuC系统和ProP系统，以及proVWX操纵子编码的膜结合蛋白ProU系统高度上调，可以运输渗透保护剂进入胞内抵御干燥胁迫[38]。研究发现，Cronobacter在正常培养条件下静止期时细胞内海藻糖的含量为0.04 μmol∙mg-1；而干燥后，海藻糖浓度则上升至0.23 μmol∙mg-1，其含量增加了5倍以上。然而，其他肠杆科菌株在干燥胁迫条件下，均未检测到海藻糖的聚积。随后，通过iTRAQ分析了C. sakazakii ATCC 29544潜在干燥抗性因子，发现Cronobacter海藻糖合成相关基因ostAB、海藻糖转运基因treABCF [38]等上调表达，其产物在干燥条件下能保护磷脂膜和蛋白质[39]。

高渗条件和干燥环境引起的生理变化往往是相似的，这常常导致渗透胁迫和干燥胁迫的研究相混淆。Riedel等[40]利用双向凝胶电泳法（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）观察Cronobacter处于物理干燥和1 mol∙L-1 NaCl高渗透压生长条件的不同应激反应，研究表明，在高渗培养条件下，观察到周质蛋白OsmY的上调，而γ-谷氨酰转肽酶等相关的氨基酸生物合成酶和转运蛋白显著下调，表明致病菌在该条件下生长缓慢，代谢下降。为了应对干燥环境压力，致病菌热休克蛋白、DNA结合蛋白Hns、伴侣蛋白GroES、OmpA等相关蛋白持续上调，有助于在干燥条件下保护细胞不受损伤。此外，含有荚膜的Cronobacter菌株可在干燥环境中存活2.5年以上[36]。荚膜多糖作为Cronobacter生物膜的主要成分，有助于其在不锈钢和玻璃管上附着和形成由三维细胞群组成的Cronobacter生物膜，从而促使该病原体对外界环境压力的抗性更强[41‒42]。本团队发现一株Cronobacter糖基水解酶缺陷突变株，由于无法及时裂解生物膜形成堆积，在一定程度上提高了菌株在干燥条件下的适应性[43]。

3.2 耐热性

高温冲泡PIF并冷却至70 ℃是避免奶粉食用过程中引入的Cronobacter进入人体的一项重要保障[44]。Cronobacter的生长温度范围为5.5 ~ 47 ℃，在54 ~ 64 ℃的范围内具有耐热性[45]。Breeuwer等[37]测定了Cronobacter在58 ℃条件下时D值为0.39 ~ 0.60 min，且来源于婴幼儿食品中的Cronobacter在65 ℃下依旧有少数菌株存活[46]。因此，应该用大于70 ℃的水而不是温水冲泡奶粉。

Riedel等[40]和Asakura等[47]分别提议将Mfla-1165和翻译起始因子infB作为耐热菌株的分子标记物，与热敏菌株相比，其在耐热菌株表达量特异性上调。此外，具有完整的thrB-Q基因组岛能增强Cronobacter在58 ℃中的存活力[48]，而编码应激反应σ因子rpoS基因表达水平不同也可能是造成Cronobacter耐热性差异的原因之一。同时发现沙门氏菌在暴露于低水分亚致死条件下，通过生理遗传调节产生交叉保护，提高了其对高热杀菌的抵抗力[49]，而Cronobacter的干燥抗性也可以提高该致病菌对高热条件的耐受力[50‒51]。尽管用热水冲泡PIF后Cronobacter的持续污染具有重要意义，但Cronobacter干燥性和耐热性之间的交互关系仍需深入研究。

3.3 耐酸性

通常成年人胃液pH约低于2，而以PIF喂养为主的婴幼儿胃液pH约为3.6。而C. sakazakii在pH 3.0条件下处理后，菌体仍可存活90 min [52]。因此，一旦婴幼儿食用了被Cronobacter污染的PIF或其他辅助食品，Cronobacter可以突破胃酸屏障，引起坏死性小肠结肠炎等肠道炎症。

此外，在酸处理过程中细胞内阴离子的积累导致DNA和蛋白质的损伤，Cronobacter出现生长滞后现象，该致病菌可能通过细胞形态由初始变形到适应酸环境后恢复正常生长来缓解酸胁迫[53]。同时，Cronobacter在酸性条件下也会产生一系列的分子策略来应对环境压力，cpxR、ompR [54]、rpoS、分子伴侣基因hfq [55]、grxB [53]和phoP/phoQ [56]参与C. sakazakii的耐酸过程。这些蛋白质通过参与细菌感知逆境并应答、修复受损的蛋白质和核酸、调节氧化应激等过程抵御酸胁迫。

细菌对于不同胁迫条件具有共有应激机制，而对多种环境胁迫的耐受性之间也易存在交叉效应，致使其抗逆调控途径复杂且多样。因此，未来对Cronobacter的胁迫应答研究除了关注该菌在特定环境下相关蛋白质、基因的调控途径和代谢途径，更应对胁迫中枢调控系统及交叉保护机制进行深入研究。

3.4 耐药性

近年来对多株食品来源的Cronobacter进行药敏检测，认为该致病菌的耐药能力并未达到大肠杆菌、沙门氏菌等肠杆菌科细菌所呈现的显著性，但该菌对青霉素、克林霉素、万古霉素、头孢菌素、四环素等医院常用抗生素耐受性较高[57]。同时，由于诱导型AmpC β-内酰胺酶的产生和耐药基因水平传播，发现多重耐药菌数量日益增加。

Caubilla-Barron等[58]从新生儿重症监护室分离到3株β-内酰胺酶阳性的Cronobacter，发现强力霉素对所有菌株均无效，其中3株分离自死者气管分泌物和血液的致病菌株还对氨苄西林、头孢呋辛钠、头孢噻肟和阿莫西林/克拉维酸耐药。此外，一例Cronobacter感染新生儿脑膜炎的调查报告显示，pGW1质粒中编码AmpC β-内酰胺酶的耐药基因blaDHA-1与头孢菌素耐药性有关，且发现了5个新的耐药基因，分别为mph(A)、sul1、aadA2、dfrA12和aac-IId [59]。

近年来，中国等一些国家已用黏菌素作为牲畜饲料中的生长促进剂。近期在Cronobacter中也检测到质粒携带的黏菌素耐药基因mcr-1和mcr-10 [60‒61]。这些耐药质粒的传播和耐药性的加重可能是抗菌药物使用和滥用的后遗症[62‒64]。因此，耐药性是一个日益严重的全球公共卫生威胁，为了克服在广谱抗生素治疗过程中正常肠道菌群的扰乱并减少Cronobacter耐药性的传播，研究重点已经慢慢集中在新治疗方法的建立及联合治疗方法等。研究发现，双歧杆菌已被证实能减缓C. sakazakii引起的小鼠的肠道炎症现象[65]，而鼠李糖乳杆菌可通过改变细胞膜通透性来逐渐抑制C. sakazakii生长[66]。此外，亚抑制浓度的柠檬醛[67]能够增加C. sakazakii对氨苄西林和头孢西丁的敏感性，硫辛酸[68]也可以在体外抑制该菌的感染能力。益生菌制剂及提取物的研发，将为Cronobacter的有效治疗提供新策略。

图3 Cronobacter的胁迫应答。OM和CM分别代表外膜和细胞质膜；HSP：热休克蛋白；Hns：热稳定的核结构蛋白。

Cronobacter在体内脱水过程中特异性地从细胞外基质中获得K+、海藻糖、脯氨酸和甘氨酸，并同时增强海藻糖、脯氨酸和甘氨酸的合成。此外，热休克蛋白HSPs、DNA结合蛋白Hns、伴蛋白GroES和外膜蛋白OmpA也有利于抗干燥；Mfla-1165、翻译起始因子infB、sigma因子rpoS和thrB-Q基因组岛参与了热耐受性；Cronobacter通过增加应激反应调节因子、伴侣分子、氧化应激相关基因的表达来抵抗酸胁迫；Cronobacter β-内酰胺酶的分泌和pGW1质粒介导的耐药基因水平转移有助于其在药物处理下存活；海藻糖是生物膜中胞外多糖的重要组成部分，对Cronobacter在各种逆境下的生存至关重要。

4、 危害机制

通常，细菌进入机体并引发疾病，需穿越宿主机械物理屏障、化学屏障、微生物屏障、免疫屏障。目前，研究发现Cronobacter能够编码多个与致病过程密切相关的毒力因子，对黏附入侵以及破坏肠屏障、血脑屏障具有重要作用（图4）。研究者认为，新生儿尤其是早产儿Cronobacter的高感染率是由于其未成熟的肠道屏障导致肠道黏膜易受Cronobacter损伤，致使细菌发生易位进入机体组织[69]，引起肠道免疫功能紊乱，同时激活一系列细胞因子，引起炎症级联反应，导致肠道的进一步损伤及最终的肠坏死。此外，Cronobacter也可侵入血液形成菌血症，继而细菌黏附、侵入人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cell, HBMEC），并穿过血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）之后存活，引发脑膜炎[69]。

图4 Cronobacter入侵宿主细胞的毒力因子。HBMEC：人脑微血管内皮细胞。

4.1 黏附

Cronobacter对宿主细胞的黏附作用是多数感染性疾病的起因，可使病原体粘连于肠道上皮细胞表面，避免被宿主清除[70]。Cronobacter依靠菌毛吸附于受体细胞表面，并定向侵入及作用于宿主细胞[71]。其中，编码菌毛的基因簇sfp与其黏附作用密切相关[72]，P菌毛则能够提高新生儿感染脑膜炎的发生率[73]。此外，研究发现C. sakazakii ES5菌株中假定蛋白ESA_00281、ESA_00282与该菌黏附过程有关，鞭毛蛋白FlhA、FliG和FliC参与介导C. sakazakii的自凝集[74]。致病菌穿越肠道屏障后侵入宿主循环系统，引发宿主严重的系统性感染，进而穿透血脑屏障[75]。然而，亚抑制浓度的硫辛酸可以在C. sakazakii感染初期抑制该菌的泳动及群集，从而降低致病菌对宿主细胞的侵袭能力[68]。

4.2 入侵

细菌入侵会扰乱宿主的免疫平衡，宿主往往通过免疫细胞的吞噬、清除及免疫因子、细胞黏液蛋白分泌等方式抑制宿主细胞异常凋亡、提高细胞间紧密连接蛋白表达来维持屏障的完整性[76]。Cronobacter菌株可以入侵肠道上皮细胞，进入血液，进而转移到肝脏、脾脏等器官，并穿越血脑屏障进入大脑[77]。

Cronobacter产生的外膜蛋白、脂多糖、肠毒素、入侵和纤溶酶原激活物是入侵宿主的主要毒力因子。Cronobacter通过铁获取系统、阳离子外排系统、群体感应系统以及唾液酸的催化和利用等途径在宿主体内生存和繁殖，以加重其感染。

4.2.1. 外膜蛋白

研究表明，Cronobacter的侵袭过程与其外膜蛋白（outer membrane protein, OMP）密切相关，OMP是仅存在于革兰氏阴性菌中的一组镶嵌在细菌外层磷脂双分子层中，能够维持细菌外膜结构完整以及形态正常的蛋白质。Cronobacter的外膜蛋白A（OmpA）是噬菌体的结合位点，也是F菌毛介导的接合反应的中间体。Mittal等[78]发现Cronobacter感染新生小鼠后，在所有死亡小鼠中均检测到OmpA，并且伴有嗜中粒细胞渗漏、出血和神经胶质增生现象，表明携带OmpA的Cronobacter菌株可以成功穿越新生小鼠小肠屏障在血液中增殖，该蛋白可以结合纤连蛋白侵入HBMEC，随后穿过血脑屏障诱导细胞凋亡，而侵入血脑屏障是细菌性脑膜炎的关键致病机制[79]。此外，Inv和OmpA在体内外具有协同效应，Inv能够介导C. sakazakii从基底外侧侵入宿主的内脏器官，增加OmpA的致病能力[80]。

外膜蛋白X（OmpX）是一种小分子的毒力蛋白，可以和OmpA协同参与C. sakazakii肠道组织的侵袭过程，ompX缺失后菌株对Caco-2和INT-407细胞的侵袭黏附能力明显降低[81]。近期，微阵列分析表明，Cronobacter分泌的外膜囊泡（outer membrane vesicle, OMV）中包裹的具有毒性的OMP可能参与被肠道细胞吸收、增加细胞增殖并刺激宿主的先天促炎反应[82]。

4.2.2. 脂多糖

脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）也被称为O-抗原或内毒素，是嵌入革兰氏阴性细胞壁的外膜，当死亡或遭受到物理化学攻击时才会释放的一种多糖物质。有研究表明，当体内含有适量的LPS时，可以激发机体的免疫反应提高免疫力，而高浓度或长期接触低浓度LPS则会破坏机体平衡，诱发糖尿病、脂肪肝等一系列炎症反应。摄入LPS可增加婴儿肠壁的通透性，导致细菌入侵继而全身感染。LPS是Cronobacter一种非常重要的毒力因子，被细胞受体识别后会引起一系列级联反应及相关促炎性因子的表达，如Toll样受体TLR2或TLR4，并往往伴随着细胞完整性的破坏[69]。本课题组将提取的C. sakazakii LPS腹腔注射小鼠，发现C. sakazakii LPS会引发肠道菌群紊乱，且影响了肠道紧密连接蛋白（Claudin-4, Occludin）、TLR4以及一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）的含量表达，使肠道组织受到不同程度的损伤（数据未发表）。值得注意的是，在PIF的加工过程中，具有一定耐热性的LPS难以被完全消除[69]。然而，目前并没有针对PIF中Cronobacter LPS量级检测及限量的相关安全标准。新生婴幼儿在先天免疫系统未成熟时，如果摄入含高水平LPS的奶粉，则会增加患菌血症或内毒素血症的风险。

4.2.3. 肠毒素

Pagotto等[83]首次发现在测定的18株Cronobacter中，有4株菌产生类似肠毒素样化合物，其能与LPS协同作用引起炎症反应，同时可导致肠上皮细胞内cAMP水平升高，肠细胞内的水、钠离子、氯离子和碳酸氢钾连续分泌到管腔，导致腹泻。Raghav等[84]用硫酸铵盐析处理后测得该肠毒素类似物的分子质量为66 kDa，并且其在90 ℃条件下处理30 min仍具有活性，该肠毒素类似物的强稳定性可能会加重Cronobacter污染PIF的致病风险。有研究证明，将104 ~ 105 CFU∙mL-1 Cronobacter注射到小鼠体内时，72 h后小鼠存活率仅为33%，而当致病菌含量达到107 CFU∙mL-1时，所有小鼠均死亡[85]。然而，编码该毒素的基因尚未确定，Cronobacter肠毒素的性质和形成机制有待进一步研究。

4.2.4. 铁捕获系统

铁作为Cronobacter中一种重要的辅酶因子，参与了电子转移、细胞呼吸等一系列基本的新陈代谢活动。在缺铁环境中，Cronobacter可产生具有高亲和力的铁载体来吸收环境中的Fe3+，一旦通过特殊的铁捕获系统进入细胞质，Fe3+铁载体复合物会被还原成Fe2+以供致病菌的生长，因此铁捕获机制在Cronobacter入侵感染宿主细胞过程中至关重要。Grim等[86]对231株不同来源的Cronobacter菌株的铁捕获系统进行鉴定，发现为了获取Fe3+，所有Cronobacter spp.基因组都具有编码气杆菌素样铁载体和肠杆菌素样铁载体的同源基因。其中气杆菌素样铁载体基因簇定位在类似pESA3和pCTU1质粒上，其基因簇由合成基因iucABCD和受体基因iutA同源的基因组成；而编码肠杆菌素样铁载体基因则定位在染色体上的三个不同位点上，分别为entD、fepA、fes、ybdZ、entF, entCEBAH、fepB、entS、fepDGC和fepE，用于肠杆菌素铁载体的合成、转运以及在细胞内裂解释放主链中的铁。此外，为了从环境中获取Fe2+，Cronobacter spp.基因组含有feoABC编码的Feo和efeUOB编码的Efe亚铁转运系统。然而，通常当铁摄取充足时，铁摄取调节蛋白（ferric uptake regulator, Fur）则结合至大多数铁转运系统的启动子区抑制铁转运系统的表达。Fur是细菌参与调节金属离子摄取和细胞金属稳态的蛋白家族并负责控制细胞内铁的浓度。尽管铁是必需的，由于高浓度的铁会形成活性氧产生细胞毒性，因此在正常环境条件下铁的浓度范围必须加以控制。

4.2.5. 其他毒力因子

随着蛋白质组学和转录组学的进步发展，Cronobacter的测序基因组揭示了一系列潜在的毒力因子，如表1所示。其中研究发现，只有C. sakazakii和部分C. turicensis含有可催化、利用唾液酸的基因nanAKTR和yhcH [87]，可将存在于母乳、PIF、脑神经节苷脂等中的外源唾液酸转运到细胞质中并进行代谢，该过程会加重坏死性小肠结肠炎病症和新生儿脑膜炎期间的严重脑损伤。研究表明，在E.coil K1中可利用唾液酸在细胞表面形成荚膜来抵抗宿主免疫反应，而在C. sakazakii暂未发现该机制[88]。此外，Cronobacter可产生大量由可拉酸（colonic acid, CA）和K抗原组成的胞外多糖，其中，K2:CA2型荚膜可能是导致新生儿感染C. sakazakii CC4 (clonal complex 4)引发脑膜炎的重要因素之一[88]。然而，没有实验数据支持Cronobacter荚膜成分与脑膜炎之间的关系，K2:CA2型荚膜是否参与该菌穿越血脑屏障尚不明确。因此，进一步了解Cronobacter的发病机制对预防和控制Cronobacter的感染至关重要。

表1 spp.已知毒力因子及作用

Virulence factorRelated genesFunctions
OMPsompA, ompXPromoting adherence and invasion to host cells
FimbriaesfpPromoting adherence to host cells
FlagellumflhA, fliG, fliCParticipating in the automatic aggregation of pathogenic bacteria and chemotaxis
Sialic acid utilizationnanAKRT, yhcHContributing to colonization of intestinal tract by pathogenic bacteria and digestion of gangliosides
Efflux systemcusCEncoding cation efflux operon, mediating invasion of brain microvascular endothelial cells
Iron acquisition systemsFur, iucABCD/ iutA, entD, fepA, fes, ybdZ, entF, entCEBAH, fepB, entS, fepDGC, fepE, feoABC, efeUOB, eitCBADEncoding iron acquisition systems and participating in pathogenic process together with plasminogen activator, iucABCD/iutA and eitCBAD are on a RepFIB plasmid
Plasminogen activatorcpaRelated to the resistance of serum and the spread and invasion of pathogenic bacteria
Diffusible signal factor (DSF) quorum-sensingrpfFRegulating c-di-GMP in cells and increasing the lethal rate

Cronobacter能产生抗血清杀菌活性的纤溶酶原激活因子[89]。RpfF介导的DSF群体感应系统则通过调节细胞内环二鸟苷酸（c-di-GMP）水平来影响生物膜的形成、菌落形态及群集运动，在该菌黏附入侵过程中发挥重要作用[90]。

4.3 诱导凋亡

Hunter等[91]首次发现Cronobacter可能通过调节小鼠肠上皮细胞胞内信号通路来诱导细胞凋亡。在Cronobacter感染宿主过程中，一氧化氮（nitric oxide, NO）合成系统被激活，诱导肠上皮细胞IEC-6释放大量的NO，引起细胞凋亡（图5）。Cronobacter引起的异常凋亡则会损害肠道屏障功能，增加肠屏障的通透性，进而导致细菌移位。而用保加利亚乳杆菌预处理Cronobacter感染的小鼠模型可以减少其NO的合成，降低肠上皮细胞IEC-6的凋亡。同样的，在Cronobacter侵袭Caco-2细胞之前增加柠檬醛预处理，可显著降低细胞iNOS的表达及Caspase-3的酶活力，从而减少NO的产生和细胞凋亡，提高肠上皮细胞抵抗C. sakazakii引起炎症反应的能力[67]。

图5 Cronobacter spp.引发的宿主细胞屏障与免疫反应。GSDMA：gasdermin A；NT：N端；ASC：凋亡相关斑点样蛋白，含有C端caspase招募结构域；NLRP3：含pyrin结构域NOD样受体家族3；BCL：B细胞淋巴瘤；BAX：BCL2同源X蛋白；IL：白介素；ZO：紧密连接蛋白；TNF：肿瘤坏死因子；IFN：干扰素。

4.4 免疫逃逸

C. sakazakii在人巨噬细胞U937中可存活96 h，在一段时期内甚至可以复制增殖[10]，引发宿主全身感染[77]。Townsend等[92]将Cronobacter注入新生小鼠脑内，发现浸润性巨噬细胞和嗜中性粒细胞形成炎症性聚集并吞噬致病菌，但大多数Cronobacter菌株仍可在小鼠巨噬细胞中生存48 h。C. sakazakii中sod基因可编码超氧化物歧化酶SOD，其活性会影响巨噬细胞的pH值，并与巨噬细胞中的活性氧发生中和反应降低宿主活性氧胁迫力，抵抗宿主免疫反应，从而提高Cronobacter的存活[93]。同时有研究表明，含有OmpA的Cronobacter可以干扰树突细胞的成熟，经其处理的树突细胞会诱导少量甚至无T细胞增殖来逃避强大的宿主免疫防御机制[94]。

Cronobacter感染主要通过5个关键过程引发病害：①降低紧密连接蛋白（occludin和ZO-1）表达；②通过NLRP3/caspase1/ASC信号通路诱导细胞凋亡；③通过caspase3信号通路诱导细胞凋亡；④激活炎症小体；⑤释放大量NO损伤细胞。

5、 展望

Cronobacter对所有年龄段人群都具有致病性，且危害大、致死率高。Cronobacter作为婴幼儿配方奶粉的“A”类致病菌，近年来因引发多起食品安全事件而备受世界卫生组织、国家政府以及消费人群的高度关注。因此，为了减少Cronobacter的传播与暴发，应进一步分析该致病菌的外源传播特征，发掘并靶向控制污染源以及提高食品安全检测标准。

目前，Cronobacter致病机制仍需深入阐明。首先，环境胁迫应答途径需要进一步研究，特别是食品加工处理可能诱发其响应机制。其次，携带K2:CA2型荚膜多糖的Cronobacter菌株被认为更易引起新生儿脑膜炎感染，然而，该现象是否存在因果关系尚不清楚。关于Cronobacter在特殊环境下相关蛋白质、基因的调控途径和代谢途径需要进一步阐明；其次，与Cronobacter致病性有关的毒力因子未完全发掘，且研究大多集中于单一的毒力因子的影响，而较少研究多种毒力因子的协同致病效应。此外，芳香性精油、多酚类化合物等抑菌物质和益生菌的应用，也可能是未来控制Cronobacter多重耐药菌株和耐药传播出现的一项新策略。

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