仿生牙釉质材料的工程制造策略

张凌云 ,  张云帆 ,  余婷婷 ,  彭丽颖 ,  孙倩男 ,  韩冰

工程（英文） ›› 2022, Vol. 14 ›› Issue (7) : 113 -123.

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工程（英文） ›› 2022, Vol. 14 ›› Issue (7) : 113 -123. DOI: 10.1016/j.eng.2021.02.027

仿生牙釉质材料的工程制造策略

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Engineered Fabrication of Enamel-Mimetic Materials

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摘要

牙釉质是由有序排列的羟基磷灰石纳米晶体和交错的蛋白质基质组成的生物组织，具有优异的力学和美学特性。然而，当牙釉质受损时很难自然再生，并且随着牙釉质损伤不断发展，可能会累及牙髓，甚至牙齿脱落。牙釉质作为最硬的生物复合材料，长期以来一直被认为是一种很有前景的承重材料。因此，了解牙釉质形成过程和牙釉质结构基序，对于设计和工程制造具有高强度和高弹性的仿生复合材料非常重要。既往研究已经对牙釉质的微观结构和力学性能进行了广泛的研究，并通过模拟天然牙釉质的结构及性质开发了各种仿生牙釉质的材料合成策略。本文着眼于仿生牙釉质材料的工程制造，重点介绍仿生牙釉质材料合成策略的最新进展，并讨论其潜在应用价值。

Abstract

Tooth enamel, which is a biological tissue mainly composed of well-aligned hydroxyapatite nanocrystals and an interlaced protein matrix, has remarkable mechanical and aesthetic behaviors. Nevertheless, it is challenging to regenerate enamel naturally, and potential pulp involvement and tooth loss may occur. As the hardest biogenic composite material, enamel has long been regarded as a promising load-bearing material. Thus, understanding the enamel formation process and enamel structural motif mechanisms is important for the design and engineering of high-performance biomimetic composites with high strength and physical resilience. Extensive studies have been conducted on mimicking the microstructure and mechanical properties of tooth enamel, and various enamel-like material synthesis protocols have been developed. In light of the engineering fabrication of enamel-like materials, this review focuses on recent progress in synthetic strategies for enamel-mimetic materials and provides a discussion of the potential applications of these materials.

关键词

再生 / 再矿化 / 仿生牙釉质 / 仿生

Key words

Regeneration / Remineralization / Abiotic enamel / Biomimetic

引用本文

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张凌云,张云帆,余婷婷,彭丽颖,孙倩男,韩冰. 仿生牙釉质材料的工程制造策略[J]. 工程（英文）, 2022, 14(7): 113-123 DOI:10.1016/j.eng.2021.02.027

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1、 引言

牙釉质位于天然牙齿的最外层，是由哺乳动物体内最坚硬的生物复合材料构成，具有优异的硬度和杨氏模量（分别约为1.1~4.9 GPa和62~108 GPa，牙釉质内无机物含量为85 vol%）[1‒2]，同时具有高耐磨性和抗疲劳性[3]。这些优越的特性使牙釉质能够承受较大范围的负荷应力（约0.45~2.5 GPa），以及口腔内的其他剪切应力，从而保护内层牙本质免受损伤和破坏[4‒5]。

然而因釉质成熟过程中干细胞逐渐消失，牙釉质一旦受损无法自我再生。因此，如果没有适当的干预措施，脆弱的牙本质和牙髓很可能会在牙釉质缺损发生后，继而受到损伤，最终可能导致牙齿脱落[6]。现有的传统牙科修复材料（包括金属、陶瓷和复合树脂）由于存在美学效果不理想、修复过程损伤牙体组织和微渗漏等问题，在几十年来的临床实践中仍然无法取得令人满意的修复效果。因此，牙科修复治疗中迫切需要理想的仿生牙釉质材料。

除了牙科应用外，具有优越性能的仿生釉质材料长期以来在交通运输[7]、消费电子产品和建筑等领域也一直在被开发应用。在实际应用中，传统合成材料难以在增强韧性的同时保持高刚度和硬度，因此限制了其性能的进一步优化[8‒9]。而在自然界中，生物体内多层结构的演变为研发新型仿生材料提供了可能性[10]，如在天然牙釉质结构中强度和韧性的性能平衡[11]。因此，具有与牙釉质相似特性的材料有望在未来的医疗和其他领域应用中得到广泛应用。

迄今为止，大量研究已经提出了许多仿生牙釉质的方法来模拟牙釉质的性能。在本文中，我们讨论了牙釉质形成过程和仿生策略关注的结构基序，并对比了这些设计概念和合成方法的优势、局限性以及未来前景。本文的组织结构如图1所示。

图1 仿生牙釉质合成策略示意图。（a）模拟牙釉质的结构；（b）模拟牙釉质的功能。

2、 牙釉质——结构与功能

天然牙釉质的形成包括分泌阶段和成熟阶段[6]，跨越从微观到宏观的多个维度。在分泌阶段，成釉细胞伸长，远端伸展为托姆斯突（Tomes’ process）。一旦细胞相互对齐，成熟的成釉细胞就开始通过托姆斯突分泌蛋白质，尤其是釉原蛋白[12]。这些蛋白质基质能够诱导磷酸钙的成核、羟基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2, hydroxyapatite, HAP]晶体的组装以及引导其自身被矿物质替代[13]。每个成釉细胞最终会形成一个釉柱（直径约5 µm），从釉牙本质界（dentino-enamel junction, DEJ）延伸到牙釉质表面[14‒15]。在成熟阶段，大部分的有机基质被矿物质所替代，无机物的体积占比急剧增加（从10%~20%到80%~90%）[16]。牙釉质的层次结构如图2 [3,17]所示。

图2 牙釉质结构示意图。（a）人类牙齿结构的示意图；（b）釉牙本质界（DEJ）到牙釉质表面的方向示意图[17]；（c）钥匙孔结构示意图[3]；（d）人类牙齿的光学照片影像[3]；（e）釉柱在反射圆偏振光中的方向；（f）钥匙孔结构的扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）图像[3]。

在微观尺度上，牙釉质主要由包含数千个纳米晶体的釉柱和柱间质构成，它们平行于磷灰石晶体c轴排列[18]。釉柱和柱间质之间被富含蛋白质的有机层占据，称为“釉柱鞘”（rod sheath）。釉柱的排列和方向从牙釉质表面到釉牙本质界（DEJ）处有所不同[图2（b）、（e）] [19]。在釉质的约外三分之一，釉柱的排列方向大部分是平行的，该区域的横截面显示出直径约为3~5 µm的“钥匙孔”排列结构[图2（c）、（f）]。在釉质的较深层部分，釉柱交叉缠绕在一起，成为绞釉。在远离釉质表面的绞釉处，釉柱以更垂直的排列方式朝向DEJ排列。除了釉柱外，在釉质表面还有一层薄薄的无釉柱釉质层，其中含有无序的HAP微晶。

总之，牙釉质优异的力学性能主要归功于无机矿物质成分、晶体结构和生物有机成分[20]。研究普遍认为，主要矿物相（95 wt%~96 wt%）对牙釉质的强度至关重要。实验证实脱矿牙釉质的硬度（约1 GPa）和弹性模量（约70 GPa）都较低[21]。针对釉质晶体结构的研究显示，牙釉质的硬度和弹性模量从DEJ（硬度小于3 GPa和弹性模量小于70 GPa）到牙釉质表面都不断增加（硬度大于6 GPa和弹性模量大于115 GPa）[20]。此外，研究发现，牙釉质的晶体排列通常从DEJ到牙尖逐渐更加有序，这使得釉质最外层的咬合面能够承受最大的咀嚼力[22]。此外，研究观察到牙齿功能尖的晶体结构更紧密、晶体排列更有序垂直于表面，因此具有更高的承受负荷能力。同时，晶体结构的各向异性和釉质内的有机成分是釉质高韧性的主要成因。结构各向异性能够将应力传导至牙本质，从而抵抗裂缝造成的釉质损伤[23]，HAP微晶之间的黏弹性蛋白膜则分散负荷以避免釉质的断裂[6]。

一般来说，牙釉质分层结构基序融合了多尺度下的硬质和相对软质的成分，这对于牙釉质的力学性能和功能行为至关重要。受这些结构基序原则和功能基础的启发，近年来越来越多的研究报道了各种仿生牙釉质材料的合成策略。

3、 仿生牙釉质材料的合成策略

目前研究可以通过两种主要策略来合成与牙釉质性能匹配的材料。通过模仿复杂的釉质结构可以使复合材料实现类似牙釉质的性能，包括全牙再生工程、物理化学合成方法和生物化学牙釉质工程等方法。此外，还可以通过调整不同合成复合材料的性质来间接实现与牙釉质匹配的性能，如珍珠层状复合材料和类表皮样结构材料。在本节中，我们综述了近年来用于仿生牙釉质材料的合成方法、成分、技术、优势和局限性。

3.1 模拟牙釉质的结构

3.1.1. 全牙再生工程

基于组织特异的干细胞、适当的支架材料以及诱导细胞生长和分化的细胞因子的组织工程技术已实现多种器官的再生，从而推进了其临床应用[24]。针对牙釉质的再生，成釉细胞作为分泌矿化相关蛋白以调控上述牙釉质矿化过程的关键细胞，被认为是最有潜力的干细胞之一。因此，研究曾一度集中于探索可获得的、操作简便的成釉细胞样干细胞系以直接诱导釉质样晶体的成核和生长。尽管这些研究已经实现了一部分成釉细胞的特性，但尚无研究实现在体外形成釉质样结构。因此，研究转向由牙胚中干细胞启动的环境诱导作用。

自然牙齿形成过程是从早期的上皮与间充质诱导相互作用开始的，干细胞在随后的阶段继续生长和分化[25]。因此，全牙组织再生研究致力于通过模仿天然釉质发生初期的环境诱导过程来模仿天然牙胚的发育过程。经过几十年努力，一种无血清、化学成分明确的培养基被广泛用于帽状期体外小鼠牙胚的培养，但依然难以获得哪怕是薄层的牙釉质[26]。Nakao等[27]在2007年报道，将分离后的小鼠牙胚的上皮细胞和间充质细胞重组，在体外和体内实验中都获得了完整的再生全牙。他们的文章证实了全牙再生工程的研究基础，并提供了可选的干细胞来源。

研究表明利用牙齿形成早期阶段的自然信号级联，成年的上皮和间充质细胞也可以响应牙源性诱导信号并形成牙齿[28‒29]。2004年，Ohazama等[28]首次将诱导期牙源上皮和成人骨髓基质细胞重组以刺激成牙反应。在被转移到成年环境（成年小鼠的肾囊和上颌骨）后，这些重组牙胚发育成了与第一磨牙相似的异位牙冠。而在成人体内，人牙龈上皮细胞已显示出体外扩增和对小鼠牙胚间充质细胞刺激反应的能力[29]。人造牙胚在转移到肾包膜后形成了多个类似牙齿的结构。尽管全牙再生策略可以再生发育良好的牙根和包含釉质在内的牙冠，但从釉柱到牙周韧带纤维的整个牙齿的特征性复杂微观结构仍然难以实现。

考虑到这些研究中的大多数都使用了小鼠模型，医学应用的进一步证据需要大型动物模型的实验数据。2017年，One等[30]报道了将重组的生物工程牙胚自体移植犬模型后成功再生全牙的过程，如图3所示。生物工程重组牙齿显示出正确的超微结构，以釉柱为例，其成分（Ca/P = 2.05）与天然牙齿（Ca/P = 1.95）相似。在正畸力的作用下，生物工程重组全牙的牙周韧带可以引导牙齿移动而不发生根骨粘连，这类似于天然牙齿的生理功能。

图3 生物工程重组再生牙齿的形态和生成过程。（a）全牙再生示意图；（b）无牙胚移植组、天然牙胚移植组和重组牙胚移植组的影像；（c）无牙胚移植组、天然牙胚移植组和重组牙胚移植组的显微计算机断层扫描（micro-CT）图像和组织学分析。E：牙釉质；D：牙本质；C：牙骨质；PDL：牙周韧带；AB：牙槽骨；HE：苏木精-伊红[30]。

从理论上讲，全牙再生工程是仿生牙釉质的最终目标，并且对牙齿缺失的修复具有很大的应用前景；然而该策略距离真正的医学实现尚远。除了尚不清楚牙胚发育的调节机制外，全牙再生低成功率以及有限的再生牙数和再生牙形态都限制了其在医学方面的应用。此外，牙胚中的干细胞在体外扩增后即失去了成牙潜力[31]。根据细胞密度促进分化的理论[32]，基于牙胚内干细胞的“群落效应”[33]，三维（3D）培养系统的进一步发展可能揭示其分化调控机制[34]。

3.1.2. 物理化学仿生策略

使用HAP纳米晶体修复和再矿化牙釉质已成功合成类牙釉质样结构，但仍然难以获得可实际应用的有序矿化HAP晶体结构。受釉质结构启发，采用其他不同包含有机相和无机相的材料可以制造柱状分层结构，被称为“非生物釉质”，具有与天然釉质匹配的特性。

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3.1.2.1. 釉质状结构的原位生长

（1）磷酸钙离子簇诱导合成。早期的研究采用传统的物理方法合成HAP，如表面活性剂辅助矿化、螯合剂水热法矿化、模拟体液浸泡矿化等方法，以合成牙釉质样结构。然而，受限于极端的合成条件、有毒的添加剂、合成的晶体呈片状以及对牙釉质的附着力较差[35]，这些方法通常被改良为其他合成方法中的部分基础步骤。

HAP和无定形磷酸钙[Ca3(PO4)2·nH2O, ACP]的主要生长单元之一是磷酸钙离子簇（calcium phosphate ion cluster, CPIC）[36]。得益于CPIC的分离，Yamagishi等[37]和Onuma等[38]开发了一种白色氟化结晶糊剂，可在釉质受损部位无缝生长HAP纳米晶体，形成一层薄的釉质状层（15 min内可合成20~30 μm厚）。然而，该酸性的糊剂和高浓度的过氧化氢可能会导致牙龈发炎。此外，众所周知生物矿化的矿化前沿依赖于结晶与非晶界面，Shao等[39]受此启发采用一种新型的CPIC，模仿矿化边界，通过外延生长修复受损的牙釉质[图4（a）]。修复层的力学性能与天然牙釉质相似，甚至稍高[硬度为(3.84 ± 0.20) GPa，弹性模量为(87.26 ± 3.73) GPa]。仿生牙釉质的摩擦系数（0.18±0.008）表明其耐磨性与天然牙釉质相近。然而，修复层的厚度被限制在2.8 μm。

图4 使用CPIC（a）[39]和无定形ZrO2（b）[17]合成的釉质样结构的原位再生过程和形态表征。TEM：透射电子显微镜；R：釉柱；IR：柱间质；HA：羟基磷灰石。

（2）非晶陶瓷的湿化学合成。目前大多数原位釉质再矿化技术研究面临的挑战是合成足够厚的仿生牙釉质，以用于实际材料生产，同时它们的界面连接通常较弱。因此，有研究转向HAP纳米柱之间的非晶相[40]。通过原位湿化学合成策略，Wei等[17]实现了在牙釉质上合成非晶相容的ZrO2陶瓷修复层（厚度约为400 nm）[图4（b）]，其力学性能与天然牙釉质相当（杨氏模量约为82.5 GPa，硬度约为5.2 GPa）。修复层对表面的细菌黏附和增殖具有很高的抵抗力，并通过强化学连接修复层和基底釉质之间的界面增强了对咀嚼力损伤的抵抗能力。然而，ZrO2陶瓷层仅模拟了HAP纳米柱之间的晶间相，而不是模拟了釉质的整体分层结构，同时修复层的厚度仍然有限。

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3.1.2.2. 从头合成类牙釉质结构

（1）HAP晶体组装。在天然牙釉质的自然形成过程中，HAP晶体受到蛋白质基质和细胞的诱导自组装，形成多尺度排列有序的结构。受此过程的启发，研究成功开发了多种促进HAP晶体成核和沉积的方法。Zou等[41]报道了一种直接从三斜磷钙石（CaHPO4）转化为釉质状HAP的合成方法。在微波加热辅助的碱溶液中，水解的CaHPO4晶格作为HAP成核的模板。合成的HAP晶体束（直径约250 nm，长度大于1 µm）类似牙釉质晶体方向平行排列。然而，合成晶体的大小和仿生釉状层的厚度仍与天然釉质内的磷灰石不同。

为了合成有一定厚度、高度有序排列的HAP纳米晶体，研究人员最近开发了具有高纵横比（大于10 000）的自组装超长纳米线状HAP [42]。经过可控的注射过程，这些高度定向的HAP纳米线在油酸钠的辅助下构建了三维棱柱状结构[43]。然而，合成的HAP结构表现出的力学性能（以杨氏模量为例，约为13.6 GPa）与牙釉质相差甚远，即使通过牙科树脂的渗透增强也是如此。尽管这种方法证实了合成HAP的自组装能力及其在3D打印技术中的潜力，但迄今为止的结果表明合成产物性能并不理想，因此合成HAP晶体组装并不是从头合成非生物牙釉质的最佳选择。

（2）逐层沉积技术。逐层沉积（layer by layer, LBL）技术是一种重复的沉积技术。首先在底板材料上形成带电单层，吸引带相反电荷的材料在其表面上沉积为第一层，以此类推，不断吸引相反电荷沉积为新层，最终形成多层结构[44]。通过LBL技术，利用丰富且廉价的原料可以制备出黏土/聚合物多层纳米复合材料。该类纳米复合材料表现出非凡的特性，因此研究人员一直对这项技术感兴趣。Yeom等[2]报道了通过水热法，利用ZnO纳米线和聚电解质基质LBL沉积成功制备出(ZnO/LBL)非生物牙釉质。这种复合材料表现出与天然釉质匹配的黏弹性指数（viscoelastic figures of merit, VFOM）（0.7~0.9）和重量调整VFOM（大于0.8），超出了传统材料的性能限制。此外，该技术所利用的材料丰富且廉价，具有显著可实际应用的优势。

（3）3D打印技术。梯度陶瓷聚合物复合材料（graded ceramic-polymer composite）的3D打印为平行柱状排列的陶瓷应用奠定了基础，该平行柱状排列方式与牙釉质中的釉柱结构相似[45]。Feilden等[46]通过计算机控制喷嘴挤出材料过程中氧化铝薄片（直径约5 µm）的排列方向，以构建由软相渗透的分层陶瓷支架结构（图5）。尽管这项研究并非受到天然牙釉质的启发，但复合材料中纳米片的排列与牙釉质的结构设计基序基本一致。材料的力学性能也根据氧化铝纳米片的排列而变化。纤维横断面取向显示出最高的抗弯强度[(202±10) MPa]、抗压强度（452 MPa）和断裂韧性[(3.0±0.3) MPa·m1/2]。仿生的Bouligand型结构，类似于绞釉，通过提高韧性和抗性（阻力曲线）为裂纹扩展提供了引导。所得复合材料还显示出高杨氏模量[(99.1±0.6) GPa]。这些韧性增强的复合材料同时拥有高强度，成为各种应用的潜在候选材料[47]，如在航空航天和汽车领域。对于牙科应用而言，更高分辨率的材料微结构与牙釉质的匹配至关重要，而目前技术精度尚无法满足这一要求。

图5 通过3D打印合成的梯度陶瓷聚合物复合材料的形貌。（a）~（c）三种结构的示意图（分别为垂直于纤维方向结构、平行于纤维方向结构和Bouligand结构）；（d）~（f）三种结构相应断裂面方向的SEM图像[46]。

3.1.3. 生物化学工程仿生策略

蛋白质在牙釉质矿化的无机相沉淀过程中起关键作用[13]。釉质蛋白主要由釉原蛋白、釉蛋白和成釉蛋白组成，对磷酸钙的自然成核和HAP晶体的有序组装至关重要。作为主要蛋白质（体积分数大于90%），釉原蛋白可起到引导磷灰石晶体和稳定无定形磷酸钙的重要作用[48]。因此，许多由釉原蛋白或其类似物辅助来控制生物矿化过程的方法已被用于仿生牙釉质样结构。

凝胶状富含釉原蛋白的基质在牙釉质形成初始阶段提供独特的有机无机相互作用。为了模拟牙釉质的凝胶状基质，研究已经开发和改良了各种水凝胶矿化模型。然而如果没有釉原蛋白及其类似物，所得晶体层与天然牙釉质非常不同。研究报道了一种含釉原蛋白的壳聚糖（amelogenin-containing chitosan, CS-AMEL）水凝胶系统，其中，Ca-P簇由釉原蛋白稳定和引导，复合链融合并演变成对齐的磷灰石纳米晶体（厚度约为15~30 μm）直接连接在牙釉质表面[49]。随着基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase-20, MMP-20）的掺入，釉原蛋白逐渐降解，从而防止蛋白质阻塞遮挡无机相，仿生牙釉质层表现出更均匀的取向、更高的模量和硬度（与不含MMP-20的水凝胶相比，弹性模量增加1.8倍，弹性模量增加2.4倍）。

考虑到釉原蛋白的表达和纯化较为困难，有研究开始探索可以替代这种昂贵蛋白质的替代分子。全长釉原蛋白的C端结构域已被认为是牙釉质矿物质正常形成所必需的，其类似物，如富含亮氨酸的选择性剪接釉原蛋白肽（leucine-rich alternative splicing amelogenin peptide, LRAP）[50]和含有釉原蛋白C端的合成寡肽两亲物[51]，都可以促进牙釉质的再矿化。据2017年的研究报道，LRAP选择性地促进针状晶体沿c轴排列。然而无论是这种方法还是其他使用含有釉原蛋白C端的替代分子的方法仍然受到合成晶体束厚度（约2 µm）的限制[50]。

据报道，釉原蛋白和其他酸性牙釉质蛋白在与无定形磷酸钙（ACP）相互作用后，会从无序的结构卷曲折叠成有序的β折叠结构[52]。因此，有研究尝试通过替代分子模仿牙釉质形成过程中蛋白质的无序-有序相互作用来合成类牙釉质，其中包含自组装β折叠肽[53]、类弹性蛋白[54]和固有无序蛋白（intrinsically disordered protein, IDP）[55]。这些研究中的合成产物大多数都受到类牙釉质层厚度（约1 µm）的限制。然而，随着在近生理条件下对IDP的探索，Elsharkawy和Al-Jawad [55]合成了可调的分级有序氟磷灰石[Ca5(PO4)3F, FAP]晶体结构（长度和高度为数十微米），其表现出与牙釉质匹配的耐酸性和耐酶解性（图6）。但是该人造晶体的硬度[硬度值为(1.1±0.8) GPa，弹性模量为(33.0±20.1) GPa]仅为天然牙釉质的一半。

图6 应用IDP合成的分级有序FAP晶体结构的制造过程和形态。（a）形成机制的示意图；（b）分级有序的FAP晶体结构的SEM图像。ELR：弹性蛋白样重组体；CaP：磷酸钙[55]。

为了追求更厚的HAP修复层，树枝状聚合物作为釉原蛋白的另一种类似物，可以引导晶体成核并为HAP的矿化提供模板[56]。特别是，类似于釉原蛋白的超分子组装的聚酰胺-胺型树枝状大分子（PAMAM）能够调节HAP的大小和形状。通过不同官能团的修饰和几代树枝状大分子的改良，Li等[57]合成了以磷酸为末端的PAMAM（PAMAM-PO3H2），实现再生釉柱状HAP层（三周内厚度达到11.23 μm），其显微硬度达天然釉质的97%，黏附力达到50 N。此外，与其他体外生物化学方法相比，体内再生（厚6.63 μm）实验证明PAMAM-PO3H2在人牙釉质修复方面具有巨大潜力。

除了釉原蛋白之外，还有一些研究开发了一些其他矿化相关分子的类似物来促进牙釉质再矿化，如天冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸肽[58]和聚多巴胺[59]，然而这些方法均受到类牙釉质层的厚度限制。

3.2 模拟牙釉质的性能

3.2.1. 冷冻铸造技术

在力学性能方面，理想的釉质替代材料应该具有足够的硬度、刚度和强度以实现抵抗损伤和良好耐久性。在各种材料中，陶瓷和陶瓷基复合材料都是有潜力的候选材料[60‒64]。然而，它们比天然牙釉质和牙本质更硬[例如，氧化钇稳定的四方氧化锆多晶（Y-TZP）的硬度约为12 GPa，比天然牙釉质硬约4倍]，同时损伤耐受性较差，很容易破损[1,65]。冷冻铸造是一种用于制造类珍珠层状复合材料的技术。Tan等[66]研究通过双向冷冻铸造技术制造出多孔支架，配合牙科树脂浸润（图7）得到类珍珠层结构复合材料，显示出与人类牙釉质类似的杨氏模量[(42 ± 4) GPa）]、硬度、刚度和强度，此外，该材料还表现出高水平的韧性（J积分断裂韧性约为1.7 kJ·m-2和ASTM有效的裂纹扩展韧性约为9.6 MPa·m1/2），这对牙科应用具有重要意义。

图7 具有与天然牙釉质匹配性能的复合材料的合成示意图（a）、微观结构示意图[（b）、（c）]和硬度和刚度（d）[66]。

如前所述，冷冻铸造技术还可以作为其他技术的基础，例如，磁辅助粉浆铸造以生成类似珍珠层的复合材料[67]。然而到目前为止，以这种方式制造的复合材料的力学性能与牙釉质的性能仍然有很大不同。

3.2.2. 混合LBL组装技术

无机晶体与周围蛋白质之间具有明显的力学特性差异，天然牙釉质没有自我修复能力，一旦受损就很难愈合。为避免在合成自修复材料时降低天然牙釉质的力学性能，目标策略应实现不同的成分良好匹配，成分间无缝整合。受人类皮肤的启发，研究人员使用氧化石墨烯（graphene oxide, GO）和聚合物通过混合LBL组装技术合成复合材料。线性LBL薄膜层中高含量的GO纳米片为复合材料提供了优异的屏障和力学性能[68]。这种沉积在相对较软的LBL膜之上的较硬屏障层产生了类似表皮的分层复合材料。可控的聚合物动力学通过聚合物提供的软垫促进外界应力在层间扩散，而硬层作为密封屏障实现自我修复。这种智能涂层降低了严重破坏率和维护费用，同时还保持了接近牙釉质的高硬度[硬度值为(2.27±0.09) GPa，弹性模量为(31.4±1.8) GPa]，高于迄今为止其他任何自修复合成薄膜材料。这种材料在医疗保健和消费电子产品等多种应用中都很实用。

表1列出了以上各种策略的相关研究[2,19,30,39,43,46,50,55,57,66,68‒69]。

表1 仿生牙釉质材料合成策略的研究摘要

Synthetic strategiesMethodsMajor componentsAchievementsLimitationsRef.
Replication of enamel-like structures
Whole-tooth engineering
In situ growth of enamel-like structuresAutologous transplantation of reconstructed tooth germHAPsCorrect ultrastructure such as enamel rods; components similar to natural tooth (Ca/P 2.05 and Ca/P 1.95, respectively); enamel-matching functionality, with periodontal ligament-mediated tooth movement without ankylosis in response to orthodontic force (10 gfa for 30 days); successful in vivo experiment involving autologous transplantation in a large-animal modelUnclear regulatory mechanisms for tooth germ development; inefficient reconstructing condition; limited number and morphology of the given type of teeth; loss of odontogenic potential after in vitro expansion[30]
Physicochemical enamel replication
In situ growth of enamel-like structuresUsing CPICs to mimic the mineralization frontierHAPsSeamless repair layer; excellent mechanical properties, with a hardness of (3.84 ± 0.20) GPa, an elastic modulus of (87.26 ± 3.73) GPa, and a COF of 0.180 ± 0.008, slightly exceeding that of natural enamelLimited thickness of 2.8 μm, incubation for 48 h[39]
Using in situ wet-chemical growth techniqueZrO2 ceramicsEnamel-matching mechanical properties, with a Young’s modulus of ~82.5 GPa and a hardness of ~5.2 GPa; enhanced resilience toward mastication damage; high resistance to bacterial adhesion and proliferationLimited thickness of ~400 nm[19]
De novo synthesis of enamel-like structuresHAP assemblyHAPsSelf-assembly synthetic HAPs; potential for printing techniqueLimited mechanical properties, with a Young’s modulus of ~13.6 GPa[43]
LBL depositionZnO nanowires + a polyelectrolyte matrixInexpensive components; enamel-matching properties, with a VFOM of 0.7‒0.9, a weight-adjusted VFOM of > 0.8, and a Young’s modulus of (39.8 ± 0.9) GPaLimited hardness of (1.65 ± 0.06) GPa[2]
3D printingAlumina plateletsEnamel-matching mechanical properties, with high flexural strength ((202 ± 10) MPa), compressive strength (452 MPa), a high Young’s modulus ((99.1 ± 0.6) GPa), and high fracture toughness ((3.0 ± 0.3) MPa∙m1/2); Bouligand structures similar to the decussation enamel prisms, exhibiting R-curves behaviorLimited resolution of structure[46]
Biochemical enamel engi- neeringUtilizing CS-AMEL reinforced by MMP-20HAPsBetter uniform orientation; improved mechanical properties, with an increased modulus and hardness (a 1.8-fold increase in elastic modulus and a 2.4-fold increase in hardness compared with the same hydrogel without MMP-20); preventing protein occlusion; HAP componentLimited thickness of 15‒30 μm[69]
Adopting LRAPHAPsRemineralization promotionLimited thickness of ~2 μm[50]
Using IDPsFAPsEnamel-matching elastic modulus of (33.0 ± 20.1) GPa; a larger structure tens of micrometers in length and height; enamel-matching acid and protease resistanceLimited hardness of (1.1 ± 0.8) GPa; limited replication of structure, as it further grew into a larger circular structure; fluoride component[55]
Synthesizing PAMAM-PO3H2HAPsEnamel-matching mechanical properties with a regenerated enamel prism-like HAP layer showing 97% recovered microhardness; an adhesive force of 50 N; successful in vivo regeneration experiment with a thickness of 6.63 μmLimited thickness of 11.23 μm in 3 weeks; exact mechanical properties unknown[57]
Generation of enamel-matching mechanical properties
Freeze-casting techniqueAdopting bidirectional freeze-casting technique to synthesize nacre-inspired structure3Y-TZP + a light-curing methacrylate resinEnamel-matching mechanical properties, with an enamel-matching Young’s modulus ((42 ± 4) GPa), hardness, stiffness, and strength; high toughness (J-integral fracture toughness of ~1.7 kJ∙m-2, ASTM valid crack-growth toughness of ~9.6 MPa∙m1/2)Nacre-inspired structure[66]
Hybrid LBL assembly techniqueDepositing a hard linear-LBL film layer on top of a relatively soft exponential-LBL layer to mimic the epidermis structureGO + poly (vinyl alcohol) + tannic acidEnamel-matching hardness of (2.27 ± 0.09) GPa; self-healing potentialLimited elastic modulus of (31.4 ± 1.8) GPa; epidermis-like structure[68]

4、 应用前景展望

理论上HAP生物矿化策略是合成仿生釉质材料的一种有效的方法[70]，但实际上合成类釉质磷灰石（包括HAP和FAP）结构目前仍然不适合实际应用。尽管全牙再生已被证明是成功的，但如上所述，其机制仍然极其模糊、复杂，再生过程难以控制。此外，合成仿生牙釉质的物理化学和生物化学方法仍然存在如下问题：①类牙釉质层的厚度有限，除修复早期龋外，无法应用于实际。②尽管研究已开发多种方法合成相对较厚的类牙釉质层，但大多数方法都表现出有限的结构精度，与具有多尺度的独特有序分层结构的天然牙釉质相差甚远。③目前仍没有合成产物的性能可以达到匹配牙釉质完整的力学性能和增强的多功能性。④修复层类牙釉质通常只生长在经处理的天然牙釉质表面，这似乎是口腔内牙釉质修复的一个实用优势。然而，这些方法中的大多数涉及缓慢的生物矿化过程，降低了它们在原位修复应用中的潜力。同时它们修复的厚度有限，因此这些方法无法用于体外工程制造仿生材料。⑤最后，牙釉质结构的有限模拟是所有方法普遍存在的问题，大多数方法不是模拟牙釉质的整个层次结构，而是仅模仿牙釉质的一小部分，如仿生平行釉柱或者绞釉。尽管这些方法已被用于合成高度有序的纳米颗粒、纳米胶囊、薄膜和碳纳米结构，但这些方法在多大程度上可以模拟牙釉质仍不清楚[71]。因此，通过这些方法生产的材料还无法替代传统材料。

采用其他多样成分的牙釉质仿生策略通常利用不同的高度有序排列的结构设计（类似于或不同于天然牙釉质）来实现牙釉质匹配特性。由此产生的非生物复合材料为各个领域开发理想材料开辟了一条新途径。对于牙科材料应用而言，必须考虑此类复合材料的生物相容性、化学稳定性和表面性能等。因此，应用生物相容性陶瓷和陶瓷基复合材料较为便捷。随着计算机辅助设计和制造技术（computer-aided design and manufacturing, CAD/CAM）的发展，这些材料可能成为牙科修复的候选材料。这些方法普遍被认为具有令人满意的工业应用潜力，如在电子、交通和建筑领域等。首先，这些方法解决了仿生牙釉质材料厚度有限的问题，可以批量工程制造，这是工程材料实际应用的先决条件。其次，大多数非HAP成分合成方法在不影响高韧性的情况下实现了更高的硬度、刚度、杨氏模量和强度，因此具有与天然牙釉质相似的性能，明显超过传统材料的性能。此外，它们的独特特性（如高VFOM性、裂纹扩展引导性和自愈能力）使其在多个特定领域具有实用性。第三，经济成本因素被认为与力学性能一样重要，因此采用成分丰富且廉价的方法更受青睐。

未来的研究发展可能集中在合成具有超过天然牙釉质特性的仿生牙釉质材料。例如，耐高温材料可以在极端环境下应用[72]。从更广义的角度来看，仿生牙釉质材料的最终目标是实现结构复杂性、多功能性、可持续性和自我修复能力。尽管牙釉质的矿化和相关的机械过程仍不清楚，目前提出的理论仍存在争议，但对天然牙釉质的探索和模仿将在仿生牙釉质材料领域不断产生新的进展。

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