创制人工熊胆——平衡医药需求和动物福利的创新路径

李勇 ,  黄宇虹 ,  冯楠 ,  张和平 ,  屈晶 ,  马双刚 ,  刘云宝 ,  李江 ,  徐少锋 ,  王玲 ,  张咪 ,  蔡杰 ,  王伟平 ,  冯茹 ,  于航 ,  于博 ,  梁待亮 ,  秦和平 ,  罗素芗 ,  李艳芬 ,  李美凤 ,  王瑞华 ,  马辰 ,  王琰 ,  岑小波 ,  徐孝先 ,  张伯礼 ,  王晓良 ,  庾石山

工程（英文） ›› 2024, Vol. 38 ›› Issue (7) : 117 -129.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 38 ›› Issue (7) : 117 -129. DOI: 10.1016/j.eng.2023.09.017
研究论文

创制人工熊胆——平衡医药需求和动物福利的创新路径

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Artificial Bear Bile: A Novel Approach to Balancing Medical Requirements and Animal Welfare

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摘要

熊胆自古以来一直是中医药中珍贵且有效的药材，已有超过13个世纪的使用历史。然而，目前通过养熊活体取胆汁的做法因其对动物福利的不良影响而广受批评。在这里，我们提出了一种创制人工熊胆（ABB）的新方法，使ABB可以作为天然熊胆的高质量和可持续代用品。本文通过涉及资源、化学、生物学、医学、药理学和中医等多个领域的合作研究，解决了创造熊胆代用品的科学挑战。本研究建立了一套全面的功效评估系统，弥合了传统功效描述与现代医学术语的壁垒，使得系统筛选治疗成分成为可能。通过化学合成和酶工程技术的应用，我们的研究实现了熊胆药效成分的环境友好型大规模生产，并对ABB配方进行了优化和重组。由此产生的ABB不仅在成分上与天然熊胆非常接近，而且具有产品质量稳定、原料可获性高以及不依赖濒危或野生资源等优势。全面的临床前功效评估已经证明ABB的治疗效果与市售引流熊胆相当。此外，临床前毒理学评估和I期临床试验显示ABB的安全性与引流熊胆相当。这种创新的策略可以作为开发其他濒危中药代用品的新的研究范式，从而为濒危药材可持续利用提供了新的方向。

Abstract

Bear bile has been a valuable and effective medicinal material in traditional Chinese medicine (TCM) for over 13 centuries. However, the current practice of obtaining it through bear farming is under scrutiny for its adverse impact on bear welfare. Here, we present a new approach for creating artificial bear bile (ABB) as a high-quality and sustainable alternative to natural bear bile. This study addresses the scientific challenges of creating bear bile alternatives through interdisciplinary collaborations across various fields, including resources, chemistry, biology, medicine, pharmacology, and TCM. A comprehensive efficacy assessment system that bridges the gap between TCM and modern medical terminology has been established, allowing for the systematic screening of therapeutic constituents. Through the utilization of chemical synthesis and enzyme engineering technologies, our research has achieved the environmentally friendly, large-scale production of bear bile therapeutic compounds, as well as the optimization and recomposition of ABB formulations. The resulting ABB not only closely resembles natural bear bile in its composition but also offers advantages such as consistent product quality, availability of raw materials, and independence from threatened or wild resources. Comprehensive preclinical efficacy evaluations have demonstrated the equivalence of the therapeutic effects from ABB and those from commercially available drained bear bile (DBB). Furthermore, preclinical toxicological assessment and phase I clinical trials show that the safety of ABB is on par with that of the currently used DBB. This innovative strategy can serve as a new research paradigm for developing alternatives for other endangered TCMs, thereby strengthening the integrity and sustainability of TCM.

关键词

人工熊胆 / 化学成分 / 配方优化 / 药效一致性 / 临床前毒理学评估

Key words

Artificial bear bile / Chemical profile / Formula optimization / Pharmacodynamic consistency / Preclinical toxicological assessment

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李勇,黄宇虹,冯楠,张和平,屈晶,马双刚,刘云宝,李江,徐少锋,王玲,张咪,蔡杰,王伟平,冯茹,于航,于博,梁待亮,秦和平,罗素芗,李艳芬,李美凤,王瑞华,马辰,王琰,岑小波,徐孝先,张伯礼,王晓良,庾石山. 创制人工熊胆——平衡医药需求和动物福利的创新路径[J]. 工程（英文）, 2024, 38(7): 117-129 DOI:10.1016/j.eng.2023.09.017

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1 引言

熊胆作为中医药实践中的一种宝贵而重要的药材，其在中国的使用历史已超过13个世纪。在中医中，熊胆被认为具有“清热”和“泻肝火”的功效，传统上用于治疗肝胆疾病以及眼部和喉咙感染等[1‒2]。熊胆主要由胆酸（BA）组成，包括熊去氧胆酸（UDCA）、鹅去氧胆酸（CDCA）及其牛磺酸结合物。最近的研究揭示了胆酸的作用比仅仅作为“消化系统表面活性剂”重要得多[3]。事实上，它们还被确认为能与多种受体相互作用的信号分子，如法尼醇X受体（FXR）[4]、G蛋白偶联胆酸受体（Gpbar1，即TGR5）[5‒6]、维生素D受体（VDR）[7]和鞘氨醇-1-磷酸受体2（S1PR2）[8]，因此在调节宿主代谢和炎症、介导肠道和肝脏之间的通信中发挥着重要作用。胆酸及其衍生物在治疗多种疾病方面展现出巨大的潜力，如肝脏疾病[9]、代谢紊乱[10‒12]、炎症性肠病[13‒17]和神经退行性疾病[18]。此外，UDCA可能通过降低FXR信号、下调血管紧张素转化酶2（ACE2）表达和减少对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染的敏感性，在预防新型冠状病毒肺炎（COVID-19）方面发挥重要作用[19]。

临床上，熊胆已被用于治疗多种不同的疾病，包括糖尿病、肾炎、百日咳、痔疮和慢性乙型肝炎引起的黄疸[20]。目前，中国有267家制药企业生产的87种中成药，每年需要消耗40 t熊胆。我国历史上曾以猎杀野生熊类的形式获取熊胆。随着野生熊的数量急剧下降，中国的两种主要熊种——亚洲黑熊（Ursus thibetanus）和棕熊（Ursus arctos）——被列为二级保护动物，国际范围内的跨境贸易也被《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）禁止。在熊胆供应严重不足的情况下，20世纪80年代，为解决熊胆供应，我国引进了熊胆汁引流技术，获得熊胆粉（黑熊经胆囊手术引流胆汁而得的干燥品）。现在，引流熊胆（DBB）成为中国市场上唯一合法的熊胆来源[21]。但是，这一做法因其残忍性和有悖动物伦理一直广受质疑与诟病[22]。

因此，迫切需要创造一种熊胆代用品，以调和医疗需求和熊保护之间的矛盾。已有研究探索了使用其他家畜或家禽的胆汁、单一胆酸如熊去氧胆酸以及中草药作为熊胆的代用品[23‒24]。然而，由于熊胆复杂的化学成分和多样的药理作用，尚无足够的实验证据支持其代用品的使用[25‒26]。理想情况下，代用品应与熊胆的化学和药理性质高度一致，同时提供更稳定和均一的质量和更高的安全性[27]。人工熊胆（ABB）的创制面临着几个障碍。首先，现代医学术语与熊胆的传统适应证的描述之间存在鸿沟，这对阐明熊胆医学用途的科学基础提出了重大挑战。其次，尽管关于熊胆及其成分的研究越来越多[28‒30]，但其功能和化学成分之间的关系仍不清楚。最后，由于熊胆成分的化学和药理多样性，以及成分之间的协同作用，如何优化代用品的组成比例同样具有挑战性。

为了应对这些挑战，我们提出了一种开发ABB的新方法（图1），该方法基于对熊胆传统功效的科学基础的系统研究。本策略包括几个关键步骤：

（1）对熊胆中化学成分的结构、类型、含量和比例的全面表征；

（2）开发多维药理学模型系统，该系统可以阐明熊胆的传统适应症，并反映中医的临床经验；

（3）建立传统适应症、生物效应和化学成分之间的联系；

（4）确定各组成部分对功效的贡献；

（5）整合化学、酶工程和其他相关领域的技术，实现熊胆有效成分的绿色制备；

（6）基于实验和统计证据优化和重组ABB配方。

在此，我们提出了一种新的方法，用于绿色生产与天然熊胆的化学和药理学特性相匹配的人工熊胆。通过利用新的研究策略和整合多学科技术，我们成功开发了一种不依赖于任何野生或濒危资源的熊胆代用品。我们的解决方案具有几个优点，包括环境可持续性和一致、可靠的质量控制。

2 材料与方法

2.1 材料和试剂

中山百灵生物技术股份有限公司提供3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-HSDH）、乳酸脱氢酶（LDH）、7α-羟基类固醇脱氢酶（7α-HSDH）、7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）、鸡、鸭、鹅、牛胆膏。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）购自邦泰生物工程（深圳）有限公司；D101大孔吸附树脂购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司。ICR小鼠、Sprague-Dawley（SD）大鼠和C57小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；Wistar Kyoto（WKY）大鼠、自发性高血压（SHR）大鼠，KKAy小鼠和昆明小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司。病毒株和细胞从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获得。小鼠流感病毒感染实验在动物生物安全2级（ABSL-2）实验室进行，遵循国际动物伦理委员会标准操作程序和中国医学科学院医药生物技术研究所和药物研究所动物伦理委员会指南。中国中药有限公司提供了引流熊胆粉样品，而完整的天然熊胆样品由汪晓郓先生捐赠，并由中国医学科学院药物研究所马林教授通过目视检查、物理特征和高效液相色谱（HPLC）分析等方法鉴定。本项目使用的天然熊胆样品已获得北京市园林绿化局的批准。

阿司匹林、脂多糖（LPS）、刀豆蛋白A（Con-A）、戊四唑（PTZ）、α-异硫氰酸萘酯（ANIT）、氯化2,3,5-三苯基四唑和加巴喷丁购自Sigma-Aldrich（德国）。硝苯地平由扬子江药业集团供应，北京伊诺凯科技有限公司提供卡马西平（CBZ），北京协和制药厂供应双环醇。甘草酸二铵（GRZ）注射液购自正大天晴药业集团股份有限公司。利巴韦林由新乡制药股份有限公司供应，达菲从上海罗氏制药有限公司采购。盐酸小檗碱、左氧氟沙星和磷酸奥司他韦购自中国食品药品检定研究院。丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、葡萄糖、总胆固醇（CHO）、总胆红素和甘油三酯（TG）检测试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司。

2.2 疗效评价模型

2.2.1 酵母诱导的大鼠发热模型

体温在36.2~37.2 °C范围内的老鼠被随机分为10组。阳性对照药物阿司匹林和测试样品以4 mL∙kg-1的剂量口服给药，随后皮下注射20%酵母悬浮液（10 mL∙kg-1）。对照组接受生理盐水注射。在口服阿司匹林或样品后2 h、6 h和8 h时监测大鼠体温。

2.2.2 LPS诱导的大鼠发热模型

口服阿司匹林或样品后，大鼠腹腔注射LPS悬液（20 μg∙kg-1, 2 mL∙kg-1），正常对照组注射生理盐水。监测体温2 h后，再次口服阿司匹林和样品，并在注射后6 h和8 h测量体温，共监测8 h。

2.2.3 热板试验

第一天对ICR小鼠进行疼痛阈值筛查，热板温度设置为(55 ± 0.2) °C，选择阈值在10~30 s之间的动物，随机分为10组，称重并标记。第一天口服阿司匹林、加巴喷丁和样品（10 mL∙kg-1），第二天继续服用，1 h后进行疼痛阈值测量。

2.2.4 醋酸扭体试验

在接受腹腔注射（ip）0.6%乙酸溶液前1 h，给小鼠口服阿司匹林和样品，以观察潜伏期和15 min内的扭动事件数量。

2.2.5 体内抗流感病毒作用

经过1~2 d的适应性喂养后，将小鼠随机分组，每组10只。小鼠在麻醉状态下，通过滴鼻剂感染甲型流感病毒（H1N1）A/FM/1/47株，每天一次，每只小鼠每次0.035 mL（35TCID50），持续7 d，记录14 d内死亡情况。计算每组的存活率、平均预期寿命、死亡保护率和延长预期寿命。实验中实施了两种给药方案，第一次给药是在感染后2 h或24 h。通过口服灌胃给药，共7 d。

2.2.6 抗惊厥作用

在接受腹腔注射PTZ后，观察小鼠30 min，记录癫痫发作潜伏期和评分。每隔一天注射一次PTZ，直到所有小鼠都出现3级及以上的癫痫发作；然后连续三天注射PTZ。一个月后，给予等量的PTZ以刺激癫痫发作，使用产生3级及以上癫痫发作的小鼠进行评估，根据癫痫发作严重程度最高得分为5分。

2.2.7 保护CCl4诱导的肝损伤

每组ICR雌性小鼠（20~25 g）每12 h接受三次给药。最后一次给药后一小时，除正常对照组外，腹腔注射0.2%的CCl4。小鼠禁食过夜16 h后，抽血并在3500 r∙min-1下离心10 min。丢弃沉淀物，用生理盐水稀释上清液（10倍），用自动生化分析仪检测ALT和AST。

2.2.8 Con-A诱导的免疫性肝损伤的保护作用

ICR小鼠每12 h给药3剂，正常对照组和模型组给予等量的水。最后一次给药后1 h，尾静脉注射20 mg∙kg-1（10 mL∙kg-1）Con-A。小鼠禁食过夜16 h后，使用自动生化分析仪检测血液ALT和AST水平。

2.2.9 ANIT诱导的胆汁淤积性黄疸的保护作用

ICR小鼠连续4 d接受药物给药，在第2天给药后2 h口服ANIT（120 mg∙kg-1）。在小鼠禁食过夜16 h后，使用自动生化分析仪检测血液中的ALT、AST和总胆红素（TBIL）水平。

2.2.10 降血糖和降血脂作用

KKAy小鼠喂食高脂肪饲料，而C57小鼠喂食正常饲料。实验前，KKAy小鼠（15~17周龄）接受了空腹（2 h）血糖和血脂测量。根据血糖、血脂和体重水平对小鼠进行分组，以确保每组具有一致的平均值和标准差。连续4 d给药（0.01 mL∙g-1），禁食1 h后通过管子给予最终剂量，然后测量1 h后的空腹血糖和血脂值。

2.2.11 抗高血压作用

对WKY和SHR大鼠进行体重、血压和心率监测，直至8周龄。连续14天口服硝苯地平或样品（WKY对照组和SHR模型组给予蒸馏水）。在第4 d、8 d、14 d和21 d监测体重、血压和心率。

3 结果

3.1 阐明熊胆药用的科学基础

为了开发替代熊胆的产品，明确其药用的科学基础至关重要。尽管对熊胆的化学成分和生物效应进行了广泛的研究，但仍然缺乏全面的理解。为了取得进一步进展，需要结合化学和药理学研究的综合方法。

3.1.1 系统化学表征

为了全面了解熊胆中所含物质的组成和比例，我们对大量样本进行了系统的化学分析。共分析了73批引流熊胆和三个天然熊胆样品。表1显示的结果表明，在引流或天然熊胆中存在七种含量超过0.5%的胆酸，包括牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）、牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）、牛磺胆酸（TCA）、牛磺-7-酮石胆酸（T7KLCA）、牛磺-7α-羟基-3-酮-5β-胆烷酸（T3KDCA）、UDCA和CDCA，它们合计占熊胆干重的56.2%~82.7%。此外，冷喷离子化质谱（CSI-MS）分析证实，结合型胆酸以钠盐形式存在。

值得注意的是，引流熊胆中TUDCA的平均含量为33.1%，明显低于天然熊胆中的59.9%。此外，与引流熊胆（69个样本的平均值为1.3）相比，天然熊胆（三个样本的平均值为8.3）中TUDCA与TCDCA的比例大约高出六倍，这一发现与各种研究小组的报道一致[31‒33]。目前尚不清楚引流过程是否导致这些差异。然而，由于TUDCA具有调节内质网应激、抗氧化应激、抗凋亡和抗炎等多种生物学效应，因此它是评估熊胆质量的重要指标[9,18‒19,30]。另一方面，作为FXR等受体的天然配体，TCDCA既与调节糖脂代谢有关，也与腹泻和转氨酶升高等不良后果有关[34]。因此，熊胆成分的变化无疑会影响其疗效和安全性。

除了胆酸外，熊胆还含有氨基酸、脂肪酸、灰分、水分和少量胆红素。为了比较新鲜熊胆汁与干燥熊胆粉中的蛋白质组分，进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析。与干燥引流熊胆或天然熊胆不同，新鲜熊胆汁在25 kDa、60 kDa、70 kDa和130 kDa处显示出明显的蛋白条带（附录A中图S1）。进一步的研究表明，在干燥过程中，熊胆中的蛋白质可能在室温下在一周内分解（附录A中图S2）。氨基酸分析显示，熊胆中含有超过16种氨基酸，其中牛磺酸是最丰富的氨基酸，占干燥熊胆粉重量的0.54%。

对引流和天然熊胆进行了全面的定性和定量分析，以确定其组成成分的平均值、含量范围和变异程度（表1）。这一分析为人工熊胆的制备提供了参考和基础。

3.1.2 建立熊胆的传统功效描述与现代医学术语的链接

熊胆的传统适应症和现代医学术语之间的差异可归因于中医与现代医学之间的根本差异。中医实践植根于一个独特的理论体系，该体系使用独特的诊断标准，并强调健康维护的整体方法。它们的传统适应症通常源自表型变化的观察，而不是特定疾病的诊断[35]。此外，中医中使用复方配伍的复杂性，如实践中熊胆主要与其他中药配伍使用，使得难以区分出每种成分的具体贡献。

传统适应症与药理作用之间的联系的建立（图1）主要基于中医理论、临床应用经验和对熊胆的现代药理学研究。鉴于传统适应证与现代药理学效应之间缺乏严格的一对一对应关系，熊胆临床应用在桥接这一差异方面具有重要作用。临床应用不仅反映了中医的原则，而且可以从现代药理学的角度进行解释。

“清热”是中医用来描述旨在治疗与“内热过盛”相关的症状（如发热、口干、喉咙痛和便秘）的治疗方法的术语。这些症状常常与传染病和炎症性疾病等有关。

中医中的“平肝”针对的是肝脏经络内“气”流动失衡所引起的症状，可能导致烦躁不安、情绪波动和消化系统疾病。在临床实践中，保肝、胆汁淤积、降糖、降压和抗惊厥等药理效应与此方法相关联。

“明目”是用于描述眼疾及其相关症状（如红肿、瘙痒、干燥和视力模糊）的治疗方法的术语。根据中医理论，“滋养肝肾经络”是除了众所周知的抗病毒和抗菌疗法外，可以促进眼睛健康的重要途径。因此，旨在保肝、降血压以及调节胆固醇和血糖水平的临床干预措施往往被认为是“明目”疗法的不可或缺的组成部分，以帮助改善患者的整体预后。

本研究基于关系映射建立了多维药理模型系统。为了评估药理模型系统在评估熊胆治疗效果方面的适用性，对来自三个地区的九批胆汁进行了测试。详细结果见附录A的表S1至表S10。通过对实验数据的分析，为每个样本在每个模型中的治疗效果进行打分。总体来说，熊胆样品在解热、镇痛、保肝、利胆、降糖和降脂模型中均表现出良好的治疗效果。因此，我们优化的多维药理评价系统在很大程度上可以代表熊胆的传统适应证，并反映中医的临床经验，适用于评估熊胆各种成分的贡献和潜在代用品的有效性。

为了更好地理解不同类型的熊胆成分对整体疗效的贡献，熊胆被分离成总氨基酸（TAAs）、总牛磺结合胆酸（TTCBAs）和总游离胆酸（TFBAs）（分离过程见附录A中图S3）。然后通过测试它们对药效的总体影响来验证其各自在功效中所起的作用（附录A中表S11至表S13）。根据其影响的显著性为每个组分打分（附录A中表S14）。结果显示，TAAs对解热模型有显著影响。TTCBAs在保肝、胆汁淤积和降脂模型中表现出显著效果，而TFBAs对解热、保肝、降糖和降脂模型有一定效果。因此，TAAs、TTCBAs和TFBAs在熊胆中都起着重要的作用，没有单一组分具有整个熊胆的全部疗效谱。

3.2 人工熊胆的创制

在熊胆的化学成分中，胆酸通过结合并激活FXR、孕酮X受体（PXR）、VDR和TGR5等受体起信号分子的作用。每种胆酸都有独特的受体选择性和亲和力，CDCA是FXR最强的天然激活剂，UDCA则是FXR的拮抗剂。TGR5对结合型胆酸高度敏感，而疏水性游离胆酸更倾向于与PXR和VDR等核受体结合[36]。我们的研究还发现熊胆TAAs具有显著的解热作用。TAAs的主成分之一牛磺酸已被报道对治疗和预防与线粒体缺陷相关的疾病有益，如衰老、代谢综合征、心血管疾病和神经系统疾病[37]。因此，为了达到与熊胆相当的效果，熊胆中所含的全部七种主要胆酸（含量0.5%以上）以及TAAs都必须包含在人工熊胆的配方中。

3.2.1 基于酶工程合成胆酸

商业上可用的胆酸，如UDCA、CDCA和CA，主要是通过从鸡、牛和猪的胆汁中提取或化学转化获得的，这个过程费时且对环境不友好。近年来，已开发出胆酸的酶法合成，其中使用NAD/NADP依赖的7β-HSDH进行UDCA生物合成已应用于商业[38‒40]。

在本研究中，开发了一个利用三种羟基类固醇脱氢酶的酶平台，以实现熊胆中所有主要胆酸（含量超过0.5%）（图2）的高效制备。鸡胆膏被用作起始材料，通过皂化、提取和结晶来制备鸡胆的主要成分CA和CDCA。在7α- HSDH和3α-HSDH的催化下，分别由CDCA制备关键中间体7-酮石胆酸（7KLCA）和7α-羟基-3-酮-5β-胆烷酸（3KDCA）。

接下来，在双酶偶联系统中，CDCA经7α-HSDH和7β-HSDH催化，转化为UDCA。CA、CDCA、7KLCA、UDCA和3KDCA等游离胆酸与牛磺酸缩合，分别生成TCA、TCDCA、T7KLCA、TUDCA和T3KDCA。最后，首次在千克规模上制备了熊胆中所有七个主要BA，为人工熊胆的大规模生产奠定了基础。数据见附录A的第S1.1节。

3.2.2 寻找熊胆TAAs的代用品

为了探索熊胆TAAs的潜在代用品，我们研究了各种家畜或家禽中TAAs的药理作用。分别从鸡、鸭、鹅和牛的胆膏中制备TAAs。疗效评价结果（附录A中表S15）表明，这些动物的胆膏制备的TAAs具有与熊胆TAAs相似的解热作用。

然而，值得注意的是，鸡胆酸主要由TCA和TCDCA组成，这两种成分也存在于熊胆中，而鸭胆和牛胆分别含有大量的别胆酸和甘氨胆酸，这两种成分在熊胆中不存在。鸡胆TAAs包含与熊胆中基本相同的氨基酸，综合考虑功效、化学相似性和质量可控性，其更适合作为熊胆TAAs的代用品。

3.2.3 ABB配方优化

根据大量样本获得的数据，发现熊胆中的总胆酸（结合型和游离型）含量相对稳定[相对标准偏差（RSD）= 7.5%]，其中TCA、T7KLCA、T3KDCA、牛磺酸和TAAs等次要成分对其波动影响较小。因此，在ABB中，总BA和次要成分的水平控制在在与高质量天然熊胆一致的范围内。

为了调查可能影响ABB总体功效的三个主要变量，研究了TUDCA与TCDCA的比例、UDCA与CDCA的比例以及结合型与游离型BA的相对丰度。设计正交实验来优化ABB的组成比例。比较了九种配方对多模型评估系统的影响（附录A中表S16至表S19）。通过充分考虑药理效果和成本，最终优化了配方。其成分类型、结构、含量和比例与天然熊胆高度一致。

3.2.4 ABB和DBB药效的一致性

制备三批ABB，每批10 kg规模，结果显示工艺重复性好、产品质量均一稳定，表明该制备工艺适合工业化生产。在此基础上对ABB和DBB的药效进行了系统比较（附录A中表S20至表S39）。

自古以来，熊胆就被用来治疗发热，这是身体防御微生物和无生命物质的一种机制。热原是引起发热反应的主要因素。其中，酵母和革兰氏阴性细菌细胞外膜中的脂多糖是发热、感染休克、全身组织损伤以及严重情况下死亡的有效诱导剂[41]。在酵母引起的发热模型中[图3（a）和（b）]，ABB（50、100和300 mg∙kg-1）与阳性对照阿司匹林（300 mg∙kg-1）具有相似的作用，并显著降低大鼠4~8 h的高热（P < 0.05）。在LPS引起的发热模型中[图3（c）和（d）]，ABB剂量为50 mg∙kg-1时，在建模后4~6 h显著抑制高热（P < 0.01），而ABB剂量为100 mg∙kg-1（P < 0.05）和阿司匹林剂量为300 mg∙kg-1（P < 0.001）时，在建模后4~8 h显示高热有显著变化。

熊胆还常用于消肿止痛。为了评估ABB和DBB的镇痛作用，建立了两种不同的模型。在热板试验中，每个剂量组的阿司匹林、加巴喷汀和ABB均在一定程度上提高了ICR小鼠的疼痛阈值。加巴喷汀（300 mg∙kg-1）和相同剂量的ABB的镇痛效果与正常对照组有统计学差异（P < 0.05），值得注意的是，ABB在提高疼痛阈值方面优于加巴喷汀（64.5%和34.5%）（附录A中表S24）。此外，在热板和醋酸扭体试验中，ABB和DBB在小鼠中镇痛效果没有显著差异[图3（e）~（g）]。

根据Brevini等[19]的报道，UDCA可能通过下调ACE2来降低SARS-CoV-2感染的敏感性，从而潜在地预防COVID-19。本研究的数据表明，在感染后2 h或24 h口服ABB或DBB对小鼠H1N1流感病毒仅表现出边际抗病毒作用，效果不如阳性对照药物达菲[图4（a）和（b）]。鉴于流感病毒和冠状病毒属于不同的病毒家族，并且在基因组结构和形态特征上存在显著差异，因此仍需要进一步研究以确定熊胆是否对冠状病毒具有类似的效果。

PTZ通过与大脑中的受体结合并增加谷氨酸能神经递质的释放，导致兴奋性神经元过度活动，最终触发癫痫发作。在单剂量实验中[图4（c）~（e）]，阳性药物CBZ明显延迟了癫痫发作的开始时间并降低了癫痫发作评分（P < 0.05）。然而，无论是ABB还是DBB都没有显示出任何显著的延迟癫痫发作开始的作用。尽管如此，接受50和100 mg∙kg-1 ABB以及DBB组的小鼠显示癫痫发作评分显著降低（P < 0.05）。在接受连续七次给药[图4（f）~（h）]后，CBZ和ABB均能够显著延迟Ⅲ级癫痫发作的开始时间（P < 0.05）[图4（g）]，ABB在100 mg∙kg-1和300 mg∙kg-1的剂量下也能延迟III级以下癫痫发作的开始时间[图4（f）]，而它们对癫痫发作评分没有显著影响，尽管显示出改善的趋势。

中医理论中，熊胆被归类为肝、胆经，“平肝”被认为是其核心功能之一。这与现代使用胆酸治疗肝脏和胆囊疾病的理解相吻合。为了评估熊胆的保肝和利胆作用，使用三种不同的肝脏损伤诱导剂（CCl4、Con-A和ANIT）来模拟由不同机制引起的肝脏损伤。

在经典的化学损伤模型CCl4诱导的肝脏损伤模型中，双环醇（作为阳性对照）显著降低了血清ALT水平，而在AST水平上没有显著差异。此外，DBB和ABB在300 mg∙kg-1剂量下，均有效降低了肝脏损伤小鼠的血清ALT水平。相同剂量的ABB也显著降低了AST水平（P < 0.05）[图5（a）和（b）]。

在Con-A诱导的小鼠免疫性肝损伤模型中，给予DBB的不同剂量导致血清ALT和AST水平有显著改善（P < 0.05）。然而，由于大量的组内变异，在不同剂量组之间未观察到明显的剂量-反应关系。值得注意的是，在300 mg∙kg-1剂量下，ABB显著改善了肝脏损伤小鼠的血清ALT和AST水平（P < 0.01）。阳性药双环醇在200 mg∙kg-1的剂量下能够有效地降低血清ALT水平，但对AST水平没有显著影响[图5（c）和（d）]。

ANIT可以干扰胆汁排泄的生理过程，导致胆汁淤积和胆酸合成受损。这些病理变化可导致肝细胞损伤。在ANIT诱导的肝脏损伤模型中，GRZ（阳性药物）显著降低了梗阻性黄疸小鼠血清中的ALT、AST和TBIL水平。ABB（50~300 mg∙kg-1）和DBB（100~300 mg∙kg-1）显著改善模型小鼠血清ALT水平（P < 0.01）。另外，ABB（50~100 mg∙kg-1）和DBB（100~300 mg∙kg-1）在模型小鼠血清AST和TBIL水平上同样有显著改善（P < 0.05）[图5（e）~（g）]。

在中医理论中，高血糖和血脂水平可以归因于体内“热”盛。而熊胆被认为具有清热的效果。为了评估熊胆的降糖和降脂作用，使用了KKAy小鼠——临床前研究中常用的2型糖尿病模型。结果表明，连续4 d给予ABB导致100 mg∙kg-1和300 mg∙kg-1剂量组TG水平显著降低，只有300 mg∙kg-1剂量组显示空腹血糖（FBG）显著降低。虽然所有组都显示出CHO下降的趋势，但没有观察到统计学差异。在给予DBB后，100和300 mg∙kg-1剂量组均显示FBG、TG和CHO水平显著降低[图5（h）~（j）]。

熊胆在中医中还被用于治疗高血压及其相关疾病。采用SHR大鼠自发性高血压模型评价样品的降压作用。从7周龄开始，SHR大鼠的平均血压已经达到(160.0 ± 1.9) mmHg（1 mmHg = 133.3224 Pa）。与同龄WKY对照大鼠相比，SHR大鼠的血压显著增加（P < 0.05）。从8周龄开始，阳性药物硝苯地平、DBB和不同剂量的ABB每天口服给药，连续21 d。在服药第0、4、8、14和21天，监测所有组动物的体重、血压和心率。硝苯地平有效降低了模型大鼠从服药第4天起的血压（P < 0.05）。DBB 300 mg∙kg-1剂量和ABB 50~300 mg∙kg-1剂量组对模型大鼠血压升高均表现出显著且持续的抑制作用（P < 0.05），其中ABB的疗效与DBB基本相当[图5（k）]。

为了进一步阐述ABB和DBB的药效一致性，我们基于实验数据进行了分析和比较研究。表2提供了分级结果的概述，表明ABB和DBB在包括解热、镇痛、保肝、利胆、降糖、降脂和血压调节在内的多个模型上都具有显著效果。此外，尽管没有对抗菌和脑缺血模型表现出任何显著的药理学效果，但ABB和DBB都显示出一定的抗惊厥和抗病毒活性趋势。这些发现进一步支持了熊胆在中医药中的传统应用，并为其临床使用提供了科学证据。此外，这些发现有助于更好地理解熊胆的活性成分及其作用机制，从而增强对其药理性质的理解。

我们在体外和体内对ABB和DBB的药理一致性进行了全面评估。结果提供了有力的证据，证明在测试的多种药理模型中，ABB与DBB相当。总体而言，ABB可以被认为是DBB的理想代用品。我们将进行更多的临床比较研究来确认ABB和DBB之间的等效性。

3.2.5 ABB的药代动力学研究

在SD大鼠和比格犬中进行了ABB的口服给药，并通过高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）确定了UDCA、CDCA、TUDCA和TCDCA的血浆水平。图6分别展示了SD大鼠中CDCA、TCDCA、UDCA和TUDCA的时间-浓度曲线，其药动学参数见附录A。在雄性SD大鼠中，CDCA和UDCA的0~12 h曲线下面积（AUC）随剂量增加而线性增加，而TCDCA和TUDCA的AUC随剂量增加而非线性增加。CDCA的吸收迅速，峰浓度时间（T max）范围为(5.00 ± 0.00) ~ (9.00 ± 2.24) min，最大浓度（C max）为(7.97 ± 2.33) ~ (12.40 ± 6.20) μg∙mL-1。相比之下，UDCA的T max范围为(128.00 ± 162.97) ~ (170.00 ± 159.50) min，C max为(2.86 ± 1.59) ~ (5.49 ± 2.14) μg∙mL-1。与游离胆酸相比，TCDCA和TUDCA表现出更平滑的曲线、较小的C max以及多次峰值，表明存在肝肠循环。

与游离形式CDCA相比，TCDCA的T max要长得多，范围为(127.50 ± 131.98) ~ (260.00 ± 217.14) min，C max为(204.65 ± 136.62) ~ (631.57 ± 373.86) ng∙mL-1，这表明结合型胆酸的转运速度比游离胆酸慢。对雌性大鼠口服给药ABB（100 mg∙kg-1）后，TCDCA和TUDCA的AUC（0~12 h）与雄性大鼠相似。然而，CDCA和UDCA的AUC（0~12 h）显著低于雄性大鼠，这表明可能存在性别代谢差异。

3.2.6 ABB的临床前毒理学评估

为了给临床试验提供参考，我们评估了SD大鼠和比格犬中ABB的急性毒性（单次口服给药），观察可能的毒性反应，并与市售DBB进行比较。给药后连续14 d观察各组的日常状况，在体重、食物摄取、血压、心电图、血液学、生化和尿常规检查方面未观察到各组明显的异常。

在长期毒性评估中，SD大鼠和比格犬连续28 d给予不同剂量的ABB和市售DBB。ABB的无毒反应剂量（NOAEL）为1 g∙kg-1，在观察期间未观察到明显的异常变化。然而，市售DBB 1000 mg∙kg-1组的雄性大鼠表现出体重减轻、肾脏器官重量和肾脑比率降低。还观察到比格犬高剂量组（1000 mg∙kg-1）市售DBB的ALT水平升高。在用ABB和DBB处理的所有比格犬组中均发现总胆酸（TBA）升高，这主要是由于药物相关的改变所致。

生殖毒性研究的结果表明，对于雌性大鼠的生殖功能和早期胚胎发育，其NOAEL是1 g∙kg-1。此外，Ames、微核和染色体畸变试验结果均为阴性，表明ABB和DBB在突变性和遗传毒性方面的安全性令人满意。

3.2.7 健康志愿者I期临床耐受性试验

本研究进行了随机、双盲、单中心试验，以评估健康志愿者对ABB的耐受性。该研究包括单剂量和连续剂量实验，以及阳性对照药物（DBB）和安慰剂对照。生命体征、体格检查、临床症状和物理化学检查用于评估药物的临床安全性。

本试验进行了包括循环、呼吸、消化、泌尿和血液系统在内的各种身体系统的检查，以评估药物对健康志愿者的影响。共有134名健康志愿者参加了耐受性研究，其中86名接受了单剂量治疗，48名接受了连续剂量治疗。每个小组中的志愿者分配和完成情况详细列于表3。在0.2~2.0 g∙d-1的给药范围内，未观察到ABB和DBB出现严重的不良事件（SAEs）或意外的不良反应（SUSARs）。

ABB和DBB两药的主要不良反应包括胃肠道系统反应，如腹痛和恶心，以及肝生化异常，如ALT、AST或γ-谷氨酰转移酶（GGT）升高，这些大多发生在超过临床给药范围（1.2~2.0 g∙d-1）的剂量下。在临床推荐剂量（0.2~0.8 g∙d-1）内，测试药物组发生了一例腹痛形式的不良反应，在排便后无需干预即可解决；阳性对照药物组发生了一例痔疮出血形式的不良反应，也无需干预即可解决。

在ABB和DBB组之间，不良反应的类型和程度没有显著差异。然而，由于研究人群由样本量有限的健康受试者组成，因此需要进行更大数量患者的后续临床试验来进一步评估ABB的安全性和有效性，并为其大规模临床应用提供坚实的基础。包括Ⅱ期临床试验综合发现在内的附加数据将在后续文章中详细记录并发表。

4 结论

因为熊胆具有复杂的机制和多样的化学成分，研究熊胆代用品涉及资源、化学、生物学、医学、药理学和中医等多个领域的科学挑战。为了应对这些挑战，我们需要采用新的研究方法并进行跨学科合作。

在本研究中，我们通过全面揭示熊胆的科学基础，并整合不同学科的多种技术，为创制ABB提供了一种新的方法，并开发了一个全面的有效性评估系统。该系统以反映中医临床经验的方式描述了熊胆的治疗效果，建立了传统和现代医学术语和哲学之间的沟通桥梁。我们利用化学合成和酶工程技术，以高效、环保的方式实现了熊胆中的药效成分的大规模制备，并在此基础上，对人工熊胆配方进行了科学的系统筛选。

最终得到的人工熊胆不仅在组成上与天然熊胆高度一致，还具有产品质量稳定均一、价格合理、原材料可及等优点。综合的临床前药效评估已经证明了人工熊胆的治疗效果与市场上可用的引流熊胆相当。此外，临床前药理学评估和健康志愿者的临床试验表明，人工熊胆具有良好的安全性，与引流熊胆相当。

人工熊胆的成功创制将彻底解决熊胆供应问题，促进熊类动物保护及其福利，具有重要的经济价值、生态价值和社会价值。该突破性研究成果有望成为开发其他濒危药材代用品的新的研究范式，为濒危药材可持续利用提供了新的方向。

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