胞外囊泡在病原感染、传播和免疫反应中的作用

熊俊垚 ,  叶静 ,  曹胜波

Engineering ›› 2024, Vol. 43 ›› Issue (12) : 238 -252.

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Engineering ›› 2024, Vol. 43 ›› Issue (12) : 238 -252. DOI: 10.1016/j.eng.2024.06.011
研究论文

胞外囊泡在病原感染、传播和免疫反应中的作用

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Extracellular Vesicles in Pathogenic Infection, Transmission, and Immunity

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摘要

胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）由细胞分泌，广泛存在于体液中，是细胞间通讯的重要载体。近年来，EVs因具有携带宿主和病原来源的核酸、脂质和蛋白质的能力而受到了广泛的关注。在病原感染过程中，EVs的组成成分有助于介导病原在靶细胞中的感染、传播和免疫反应。因此，研究EVs在病原感染中的作用，对于理解病原-宿主相互作用和开发新的抗病原治疗方法至关重要。本文概述了EVs在病原感染、传播和免疫反应方面的研究进展，为在病原感染期间利用EVs的生物学特性缓解疾病发生发展提供参考。

Abstract

Extracellular vesicles (EVs) are secreted by cells and widely exist in body fluids, serving as an essential vehicle of intercellular communication. In recent years, EVs have gained significant attention owing to their ability to carry nucleic acids, lipids, and proteins of host and pathogen origins. A distinct composition of EVs during pathogenic infection contributes to mediating pathogenic infection, transmission, and immunity to target cells. Therefore, studying the role of EVs in pathogenic infection is crucial for understanding pathogen-host interactions and developing new anti-pathogenic therapies. This review offers an overview of current knowledge of EVs in the context of infection, transmission, and immunity to pathogens. Harnessing EVs’ biology during pathogenic infection may lay a foundation for the mitigation of pathogenic infection and associated disease outcomes.

关键词

胞外囊泡 / 病原 / 感染 / 传播 / 免疫

Key words

Extracellular vesicles / Pathogen / Infection / Transmission / Immunity

引用本文

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熊俊垚,叶静,曹胜波. 胞外囊泡在病原感染、传播和免疫反应中的作用[J]. 工程（英文）, 2024, 43(12): 238-252 DOI:10.1016/j.eng.2024.06.011

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1 引言

胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是由细胞分泌的具有双层膜的囊泡状小体[1‒4]。在真核生物中，EVs主要包括外泌体和微囊泡。外泌体是由多囊泡体（multivesicular bodies, MVBs）与细胞膜融合并释放其内部的腔内囊泡（intraluminal vesicles, ILVs）到胞外而成的，直径通常在30~150 nm之间。微囊泡直径范围为100~1000 nm之间，它是由细胞膜以出芽方式直接释放到胞外形成的[1,5‒6]。一小部分微囊泡与外泌体具有相似的直径，因此当微囊泡与外泌体同时释放时，它们各自的作用难以区分。在原核生物中，革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌都具有分泌囊泡的能力，这些囊泡来源于细菌增殖过程中的细菌外膜。其中，来自革兰氏阴性细菌的囊泡被称为外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs），来自革兰氏阳性细菌的囊泡被称为胞质膜囊泡（cytoplasmic membrane vesicles, CMVs），两者也被统称为胞外囊泡[7‒8]。

大多数关于EVs的研究都集中在真核生物上，所以我们主要概述了EVs在真核生物中的生物发生过程。外泌体主要是通过转运必需内体分选复合体（endosomal sorting complex required for transport, ESCRT）途径产生的[9]，但它们的生物发生也可以不依赖ESCRT [10]。在ESCRT依赖的机制中，ESCRT 0复合物识别早期内吞体上的泛素化蛋白，将蛋白分解成微结构域，并与ESCRT I复合物结合。随后此复合物招募ESCRT II亚基，从而启动新生ILVs的反向出芽，与此同时细胞质核酸、蛋白质和脂质可以直接进入ILVs中。接着，ESCRT II复合物在ILVs的颈部招募ESCRT III亚基，导致它们分裂为成熟的晚期内吞体，也被称为MVBs。基于不同的途径，一部分MVBs被运输到溶酶体处进行蛋白质降解，而另外一部分MVBs被运输到细胞膜处并与细胞膜发生融合，其内部的ILVs被释放到细胞外空间，这些胞外的ILVs被称为外泌体[4,9]。研究表明，即使ESCRT被敲除，含有分化簇63（cluster of differentiation 63, CD63）标记物的外泌体仍然可以被释放，这表明外泌体的发生也可以不依赖ESCRT [10]。最近的研究发现了一种新的非ESCRT依赖的外泌体形成机制，即通过中性鞘磷脂酶产生神经酰胺，进而改变膜的曲率以形成膜亚结构域，最后导致独立囊泡的形成[10‒11]。

目前关于微囊泡形成机制的研究较少，已知的是微囊泡直接来源于质膜（plasma membrane, PM），是由细胞膜向外出芽形成的囊泡[1,6,12]。一般来说，EVs的特征是杯状外观形态、特异膜蛋白（CD9、CD63和CD81）和胞内蛋白（Alix和TSG101）[1,9,12]。EVs生物发生的示意图如图1所示。

不同细胞分泌的EVs的形态和直径相似。EVs可以包裹多种病原和宿主来源的核酸、蛋白质和脂质，这些内容物可以随着EVs转移到受体细胞中发挥功能。EVs中核酸、蛋白质和脂质的类型和丰度差异较大，这取决于产生EVs的细胞类型及细胞的生理或病理状态[2‒3,5‒6,13‒15]。在EVs的特异标志物中，CD81是EVs中含量最高的蛋白，它主要定位于细胞膜上；CD63蛋白是这些蛋白中含量最低的，它主要定位在内吞体上[6,9,16]。EVs中富含RNAs并且可以转移到其他细胞和组织中。部分关于EVs RNA的研究表明，一些小的非编码RNA（ncRNAs）在囊泡中富集，如核小RNA（small nuclear RNAs, snRNAs）、微小RNA（microRNAs, miRNAs）、转运RNA（transfer RNAs, tRNAs）和Y RNAs [15,17]。此外，由细胞内膜衍生的EVs具有脂质双层膜结构，富含脂筏和膜相关成分，如鞘磷脂和磷脂酰丝氨酸[6]。

2 胞外囊泡的分离方法

目前可用的胞外囊泡分离方法如图2所示，包括超速离心法（ultracentrifugation, UC）、密度梯度离心法（density gradient centrifugation, DG）、聚合物沉淀法（polymer precipitation, PP）、尺寸排除色谱法（size exclusion chromatography, SEC）、超滤法（ultrafiltration, UF）和免疫捕获法（immunocapture, IC）[14,18‒21]。其中，分离EVs的金标准方法是超速离心法，该方法首先要去除细胞、细胞碎片和凋亡碎片，然后通过超速离心法分离EVs [20]。密度梯度离心法主要是通过特定的介质，如蔗糖或碘克沙醇，在离心管中形成不同的密度梯度。随后，通过超速离心将不同密度的粒子分散在相应的等密度区域[19‒20]。聚合物沉淀法是使用一种高度疏水的聚合物，如聚乙二醇，来改变EVs的溶解度和分散度[21]。尺寸排除色谱法是将EVs添加到一种充满多孔聚合物微球的柱子中，其中EVs由于其粒径大可以快速洗脱，而粒径小的蛋白质则需要较长的洗脱时间[22]。超滤法是将EVs通过一个固定孔径的滤膜，过滤掉小分子的同时浓缩富集大分子[23]。免疫捕获法的原理是利用含有特异膜蛋白抗体的磁珠，如CD9、CD63和CD81，选择性地富集EVs [12,24]。

在病毒感染过程中，病毒粒子与EVs一起被释放到细胞上清中。由于病毒粒子和EVs的粒径相似，因此很难用传统的方法来分离EVs和病毒粒子。虽然目前还没有EVs纯化的标准方法，但现有的技术提供了两种从病毒感染的细胞上清中纯化EVs的方法。一种常用的纯化方法是超速离心法与密度梯度离心法相结合（UC-DG）。该方法分为两步，第一步，通过多个低速离心步骤从细胞上清中去除细胞碎片和凋亡碎片，接下来，使用超速离心法富集上清中的EVs；第二步，由于EVs和病毒粒子的密度不同，在密度梯度离心中会分散在对应的密度区域，通过蔗糖或碘克沙醇密度梯度离心即可实现EVs的纯化。UC-DG方法简单，可以从不同物种的大量细胞上清中纯化EVs，但该方法也存在一些缺点，如耗时长、杂质多、易破坏EVs结构等。另一种方法是超速离心法结合免疫捕获法（UC-IC）。该方法首先通过差速离心去除细胞碎片和凋亡碎片，利用超速离心浓缩EVs。随后再通过免疫捕获法纯化EVs，即使用耦联膜蛋白CD9、CD63和CD81的磁珠来选择性地富集EVs。最后，将纯化后的EVs洗脱即可进行后续分析。以UC-IC法获得的EVs纯度较高，并保留了其原有的形态结构。然而，这种方法需要相应物种来源的特异性抗体[25‒39]。由于大多数商业可用的抗体仅适用于人类和小鼠，而某些物种（如猪、牛、羊和家禽）却缺乏相应来源的抗体，这使得从这些动物或相应种属的细胞中分离EVs具有较大的挑战性。此外，即使部分实验室自制了针对这些物种的抗体，但不能保证这类抗体质量和纯度的稳定性。因此，需要进一步探索从病毒感染细胞上清中纯化EVs的方法。

3 胞外囊泡的定量方法

目前，有几种定量EVs的方法，包括纳米颗粒跟踪分析法（nanoparticle tracking analysis, NTA）、双辛可宁酸（bicinchoninic acid, BCA）、实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）、数字PCR（digital polymerase chain reaction, dPCR）、流式细胞术（flow cytometry）和微流控技术（microfluidic technology），如图3所示。NTA是一种光散射技术，可以用来确定纳米颗粒的数量和粒径分布[40]。BCA是一种广泛应用的蛋白质定量方法，可用于测定EVs总蛋白的浓度。qRT-PCR是常用的RNA定量方法，它需要探针、标准质粒和商品化试剂。目前，EVs中尚未鉴定出标准的内参基因，因此很难直接使用qRT-PCR方法对EVs进行定量。然而，在病原感染或核酸递送的情况下，研究人员可以通过qRT-PCR测量病原基因组或核酸的丰度来间接量化EVs [31,41]。dPCR是一种绝对定量的方法，可以在单分子水平上平行进行大规模PCR分析，因此灵敏度和准确性较高，同时此方法不需要标准曲线或内参基因即可确定每微升样本中目的基因的绝对浓度[42‒44]。流式细胞术是一种成熟的技术，可基于EVs的膜蛋白（CD9、CD63和CD81）进行定量分析EVs [45]。此外，研究人员还开发出了基于荧光和高分辨率的流式细胞术方法，允许在多个参数中对EVs进行定量和定性分析[46‒47]。目前，有几种基于微流控的方法来定量检测EVs，包括表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）[48]、电化学生物传感器[49]和荧光标记[50‒51]。

4 胞外囊泡在病毒感染、传播和免疫反应中的作用

近年来，人们对胞外囊泡非常感兴趣，因为它们与病毒的感染、传播和宿主免疫反应密切相关。病毒可以通过建立一种分泌机制来促进其出芽过程，并产生能够将病毒内容物转移到其他细胞的载体[2‒3,14]，即病毒劫持EVs来帮助其传播。相反，宿主细胞也可以利用EVs的生物发生过程，通过刺激免疫系统来抵抗病毒感染[5,52]。鉴于EVs在病毒和宿主细胞相互作用中的关键作用，本文旨在概述EVs在调控病毒感染和传播中的作用。同时我们还描述了病毒利用EVs逃避宿主免疫的几种不同的机制。EVs在调控病毒感染、传播和免疫反应中的作用如图4所示。

4.1 胞外囊泡中的病毒成分

机体所有器官和体液中的细胞均可释放胞外囊泡。在病毒感染过程中分泌的EVs可能包含病毒和细胞成分（如核酸、脂质和蛋白质）。EVs在病毒感染中的功能目前可分为“促进作用”和“抑制作用”。前者主要通过传递病毒或细胞成分，以诱导免疫逃逸和抑制免疫应答来促进病毒感染[53]；而后者主要通过其内部包裹的miRNAs或蛋白，间接调控干扰素信号通路，从而抑制病毒感染[32,37,54]。表1 [25,55‒63]和表2 [26‒39,54,64‒86]，分别概述了EVs的分离方法、分泌来源、关键分子成分以及在DNA和RNA病毒感染中的作用。图5总结了病毒感染宿主或细胞来源的EVs中所有的分子组分。

在DNA病毒中，从非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）感染的猪的血清中分离出的EVs被发现只含有少量的病毒蛋白，但富含数百种参与凝血途径的宿主蛋白[55]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染HepAD38细胞来源的EVs中含有完整的病毒粒子，并观察到EVs表面存在HBV表面抗原[56]。来自慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）患者血清中的EVs同时含有HBV核酸和HBV蛋白[87]。此外，当成纤维细胞被人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）感染时，与未感染的细胞相比，感染细胞释放更多的囊泡且囊泡的粒径分布比例发生改变；同时来自HCMV感染细胞的EVs中还含有具有晚期结构域序列的病毒蛋白[57]。单纯疱疹病毒1（herpes simplex virus 1, HSV-1）感染细胞释放的EVs可以将病毒RNA和细胞元件[miRNAs和干扰素基因刺激蛋白（sensor protein stimulator of interferon genes, STING）]递送到未感染的细胞中[25]。JC多瘤病毒（JC polyomavirus, JCPyV）的感染与EVs的释放有关，EVs的释放驱动靶细胞的感染，有利于病毒靶向作用中枢神经系统并在其内传播；同时JCPyV病毒粒子也可以附着或被包裹入感染细胞来源的EVs [58]。

EVs的产生也与RNA病毒的感染密切相关，包括双链RNA（double-strand RNA, dsRNA）病毒、单股正链RNA [simple-strand and positive-sense RNA, (+) ssRNA]病毒以及单股负链RNA [simple-strand and negative-sense RNA, (-) ssRNA]病毒。水稻矮缩病毒（rice dwarf virus, RDV）是一种引起亚洲区域严重水稻病害的dsRNA植物虫媒病毒[88]。研究表明，RDV感染叶蝉细胞分泌的EVs富含病毒粒子[64]。在(+) ssRNA病毒中，EVs生物发生的报道主要集中在冠状病毒科、黄病毒科、小核糖核酸病毒科和逆转录病毒科的病毒中。

在冠状病毒科中，从猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）感染的细胞中分离的EVs表明，感染后EVs中miRNAs的表达水平变化较大[89]；与未感染仔猪血清样本相比，PEDV感染新生仔猪血清的EVs中补体C3、C6和补体因子B（complement factor B, CFB）的表达水平显著降低[54]。此外，从猪血凝性脑脊髓炎病毒（porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, PHEV）感染的N2a细胞中获得的EVs，包含多种内容物，包括病毒成分（PHEV N蛋白和病毒粒子）和宿主成分[模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）和干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes, ISGs）] [34]。严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）感染非洲绿猴肾细胞（Vero E6）、人肺腺癌细胞（Calu-3）和人肺泡上皮细胞（HPAEpiC）后分泌的EVs中含有大量病毒粒子[65]。

在黄病毒科中，完整的猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）病毒粒子包裹在CSFV感染的猪肾细胞（PK-15）分泌的EVs中，且EVs中的病毒粒子可以通过EVs转移到未感染的细胞中[66]。从登革病毒（dengue virus, DENV）感染的蚊子细胞，如白纹伊蚊细胞（C6/36）和埃及伊蚊细胞中纯化的EVs含有DENV-2感染性RNA和蛋白质[67]；来自DENV-2感染C6/36细胞的EVs比未感染细胞分泌的EVs粒径更大，且病毒样颗粒被包装在EVs中，它还可以感染阴性的C6/36细胞[30]。此外，DENV-2感染埃及伊蚊增强了分泌到蚊子唾液中的EVs中前体病毒蛋白的积累，且此EVs能够促进病毒的传播[68]。从丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）感染的人肝癌细胞中分离的EVs被发现含有全长病毒RNA、病毒核心蛋白和病毒粒子，这些EVs可以传播HCV并在阴性细胞中建立感染[69]。日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）感染小鼠小胶质细胞（N9）会分泌包裹miRNA let-7a/b的EVs，此EVs与培养的小鼠神经细胞或初级皮质神经元共孵育，会引起半胱天冬酶的过度激活并导致神经细胞的损伤[70]。

蜱传Langat病毒（tick-borne Langat virus, LGTV）与蜱传脑炎病毒类似，它利用节肢动物EVs增强了病毒RNA和蛋白质（NS1和E）向人类皮肤角质形成细胞和血管内皮细胞的传播，来自受感染的血管内皮细胞的EVs可促进病毒RNA和蛋白质跨越血脑屏障并传递到神经元细胞中[71]。西尼罗河病毒（West Nile virus, WNV）的感染显著改变了EVs中宿主miRNAs、sncRNAs和mRNA的表达水平[72]。寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）感染C6/36细胞释放的EVs携带病毒RNA和E蛋白，具有感染阴性蚊子和哺乳动物细胞的能力[73,90]。此外，ZIKV感染人胶质母细胞瘤细胞（SNB-19）能够分泌独特的EVs亚群，这些亚群具有特定的病毒蛋白谱和感染性基因组，这些EVs、病毒基因组和衣壳蛋白的释放受到EVs富含的四跨膜蛋白CD63的调控[74]。

在小核糖核酸病毒科中，来自柯萨奇病毒B3（coxsackievirus B3, CVB3）感染的人结肠腺癌细胞（Caco-2）的EVs含有病毒结构蛋白（VP1和VP2）和病毒粒子，并可以在受体阴性的宿主细胞中建立有效的感染[29]。肠道病毒71（enterovirus 71, EV71）感染人结直肠细胞（HT-29）和人单核细胞（THP-1）后会促进EVs的分泌和增加EVs中病毒RNA和宿主miR-146a的包装[75]。从EV71感染横纹肌肉瘤细胞中提取的EVs含有EV71 RNA和衣壳蛋白VP1，它还可以在人神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH）中建立感染[76]。从口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus, FMDV）感染PK-15细胞分离出的EVs中，已经鉴定出FMDV全长基因组RNA和病毒蛋白，这些EVs能够将感染传播给阴性的PK-15细胞和乳鼠[31]。包裹在宿主衍生EVs中的包膜病毒粒子（eHAV）是甲型肝炎病毒（hepatitis A virus, HAV）感染细胞释放病毒的主要形式[77]；此外，HAV结构蛋白pX在HAV的膜形成中起着至关重要的作用，其结构域可以引导外源性蛋白进入EVs [78]。从塞内卡病毒（Seneca Valley virus, SVV）感染猪肾细胞（IBRS-2）中分离出的EVs含有病毒基因组以及VP1和VP3蛋白，这些EVs能够使病毒在易感细胞和非易感细胞中增殖[38]。

在逆转录病毒科中，从J亚群禽白血病病毒（subgroup J avian leukosis virus, ALV-J）感染的鸡精液中纯化的精液EVs含有病毒基因组RNA和部分病毒蛋白，这些EVs可将ALV-J感染传播给宿主细胞并建立感染[26]。人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）感染人类单核细胞（U937）分泌的EVs中富含靶向先天免疫反应的miRNAs [79]；从慢性感染HIV的U937细胞中纯化的EVs可激活潜伏感染的HIV [91]。从网状内皮组织增生症病毒（reticuloendotheliosis virus, REV）阳性精液中纯化的EVs含有病毒基因组RNA和病毒蛋白，这些EVs可以在体内和体外建立感染[36]。

此外，动脉病毒科、肝病毒科和披膜病毒科的病毒感染细胞产生的EVs具有类似的分子成分，有助于促进病毒感染传递到未感染的细胞中。例如，从猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）感染的细胞中获得的EVs含有病毒基因组RNA和部分病毒蛋白（nsp2、GP4、GP5、M和N蛋白），这些EVs能够感染PRRSV易感细胞和非易感细胞[35]。大鼠戊型肝炎病毒（hepatitis E virus, HEV）的病毒粒子存在于MVBs中，同时EVs生物发生途径也是HEV出芽所必需的[92]。来自基孔肯雅病毒（Chikungunya virus, CHIKV）感染细胞的EVs含有CHIKV基因组RNA，且EVs具有感染性[27]。

在(-) ssRNA病毒中，山羊副流感病毒3型（caprine parainfluenza virus type 3, CPIV3）的感染能增强宿主细胞EVs的释放，且分泌的EVs包裹病毒F蛋白、F和M基因以及宿主miRNAs [28]。新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）感染鸡成纤维细胞（DF-1）释放的EVs携带病毒结构蛋白NP和F，且EVs可将NP和F蛋白转移到未感染的细胞中[33]。来自水稻条纹病毒（rice stripe virus, RSV）感染的飞虱唾液的EVs包含四种病毒基因组RNA和病毒粒子，这些EVs能在水稻中复制并引起水稻疾病[80]。血小板减少综合征病毒（severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV）感染细胞产生的EVs含有感染性病毒粒子和病毒蛋白（NSs和NP），这些EVs有效地将携带的病毒粒子运输到未感染的细胞中，以帮助病毒建立感染[39]。

病毒的特征与其是否存在于EVs中，两者的关系是一个有趣的研究方向。病毒粒子的大小被认为是影响EVs包裹病毒粒子的一个潜在因素。然而，由于不同研究中使用的各种分离和检测方法的局限性，目前尚不清楚病毒被包裹进EVs是否取决于病毒粒子的大小。由于EVs的粒径在30~1000 nm之间[1,6,12]，通过平行比较小病毒和大病毒相关的研究，发现小病毒粒子可能更容易被包裹在EVs中。例如，在EVs中可以检测到小粒径（CVB3、EMCV、HAV和RSV，0~35 nm）和中等粒径（CSFV、HBV、HCV、JcPyV和RDV，35~80 nm）的病毒粒子。然而，EVs中存在大粒径病毒粒子（大于80 nm）的相关报道却很少[39,65]。此外，病毒的其它特征，如是DNA还是RNA病毒、是否存在囊膜，可能与它们被包裹进EVs有关。研究表明，无论是DNA病毒（HBV和JcPyV）还是RNA病毒（RDV、CVB3、CSFV、EMCV、HAV、HCV和RSV），或囊膜病毒（CSFV、HBV和HCV）和无囊膜病毒（CVB3、EMCV、HAV和JcPyV），都可以被包裹进EVs中。因此，为了得出更准确的结论，需要进一步开展更多病毒相关EVs的研究。

以上研究表明，病毒感染细胞分泌的EVs可以包裹病毒成分（如病毒粒子、病毒蛋白和病毒基因组）或宿主成分（宿主蛋白和miRNAs等）。然而，大多数EVs分离方法如UC、UF和SEC过于简单，可能不能有效地将EVs与病毒粒子分离开，最终导致EVs成分的复杂性。虽然一些研究已经通过密度梯度离心法和免疫捕获法纯化了EVs，并通过电子显微镜鉴定出EVs中存在病毒样颗粒，但仍需要通过免疫电镜进一步验证这些病毒样颗粒是否为病毒粒子。

4.2 胞外囊泡在病毒感染中的作用

在病毒感染过程中，EVs中的病毒成分通常有利于病毒建立有效感染。CPIV3感染牛肾细胞的结果表明，含有病毒元件和宿主miRNAs的EVs释放增强，其中miR-126-3p的富集能抑制细胞自噬反应，促进病毒复制[28]。携带CVB3病毒粒子的EVs通过不同的进入途径表现出对受体阴性细胞的高感染效率，而抑制EVs与病毒粒子的偶联可以减轻CVB3诱导的免疫系统功能障碍和体内的致病性[29]。脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus, EMCV）感染诱导几种不同亚群EVs的释放，它们具有不同的分子组成和释放时间，转移病毒感染的能力也不同[81]，这些EVs的释放被发现是由EMCV Leader蛋白通过刺激分泌性自噬来控制的[93]。EV71感染细胞分泌的EVs含有EV71 RNA和miR-146a，这些病毒RNA具有复制潜能并且可以被转移到新的靶细胞，而miR-146a可以通过抑制I型干扰素反应而促进病毒复制[75]。从NDV感染鸡成纤维细胞（DF-1）中提取的EVs包裹NDV的NP蛋白，NP蛋白可以通过EVs转移到未感染的细胞中，从而抑制细胞因子的表达[33]。RDV可劫持宿主EVs的释放途径，使其跨越顶端质膜进入叶蝉唾液腺，从而介导病毒实现从昆虫到植物韧皮部的水平传播，在叶蝉进食时建立初始感染[64]。REV阳性鸡血清EVs中包裹的病毒粒子在鸡细胞中表现出较高的传播效率和复制能力，这些EVs可导致宿主先天免疫应答减弱[36]。

有研究表明，含有血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2, ACE2）的EVs能增强Vero E6细胞中的SARS-CoV-2的感染，而抑制EVs摄取可以降低SARS-CoV-2的感染效率[94]。相反，另一项研究则表明，含有ACE2的EVs，无论是单独还是与TMPRSS2联合，在抑制SARS-CoV-2 S蛋白依赖性感染方面都比可溶性ACE2更有效[95]。因此，需要进一步的研究来探索含有ACE2的EVs在SARS-CoV-2感染中的作用。SVV感染猪肾细胞和ZIKV感染人星形胶质细胞能诱导富含病毒成分的EVs的大量释放，而用EVs抑制剂GW4869治疗SVV和ZIKV感染的细胞则会导致病毒复制能力的显著下降[38,96]。

EVs内的宿主成分通常有助于抑制病毒感染，而不是增强病毒感染。DENV感染细胞释放的EVs通过限制膜融合来限制蚊子细胞早期的DENV感染，但相应EVs并不限制对细胞的黏附或入侵[82]。FMDV感染导致EVs中miRNA-136的丰度显著增加，进而抑制了受感染细胞中FMDV的增殖[32]。从HBV感染的肝细胞中获得的EVs增加了THP-1巨噬细胞或肝脏F4/80+细胞中NKG2D配体[即诱导自然杀伤（nature killer, NK）细胞产生IFN-γ] mRNA的表达，进而促进了肝细胞中病毒RNA的降解[59]。HSV-1感染细胞释放含有STING的EVs，该EVs在维持细胞活力的同时发挥抗病毒活性[25,60,61]。狂犬病毒（rabies virus, RV）感染人胚胎肺成纤维细胞（MRC-5）会诱导EVs包裹miR-423-5p，此miR-423-5p通过靶向作用SOCS3增强I型IFN反应，从而抑制RV复制[37]。

此外，一些研究表明，体液分泌的EVs可以帮助宿主抵抗病毒感染，维持机体稳态。例如，从山羊奶中提取的EVs能够显著减少DENV-2的复制和成熟病毒粒子的分泌[97]；从未感染的新生仔猪中分离出的血清EVs富含补体蛋白C3、C6和CFB，此EVs对PEDV感染呈现较强的抗病毒作用[54]；猪乳EVs中的宿主miRNAs（miR-let-7e和miR-27b），通过靶向作用PEDV N和宿主HMGB1蛋白，在体内和体外抑制PEDV复制[98]。精液中的EVs通过损伤病毒囊膜的完整性和阻止其附着在细胞表面来抑制生殖细胞中的ZIKV感染；进一步研究发现这与EVs的脂质而不是蛋白质或RNA成分有关[83]。人类唾液中的EVs通过阻止病毒附着在猴子和人类细胞的细胞膜上而呈现抗ZIKV活性，而这种病毒抑制作用与EVs中的蛋白成分无关[99]。

值得注意的是，大多数研究主要集中于EVs功能的探究，而不是阐明EVs发挥作用的分子机制。因此，在未来的研究中仍需对EVs介导病毒感染的分子机制进行进一步探索。

4.3 胞外囊泡在病毒传播中的作用

研究表明，EVs是多种病毒的传播源，一些病毒利用EVs创造有利于其传播的环境。ALV-J感染的鸡的精液EVs可将ALV-J传播给无特定病原体（specific pathogen-free, SPF）鸡，还可以介导ALV-J从SPF母鸡向其子代雏鸡的垂直传播[26]。来自CHIKV感染细胞的EVs具有感染性，感染性病毒成分可通过EVs传播到邻近的阴性细胞[27]。DENV2感染细胞释放的EVs通过与含四跨膜蛋白结构域的糖蛋白Tsp29Fb相互作用，介导病毒由节肢动物向哺乳动物细胞的传播；进一步研究表明，抑制Tsp29Fb蛋白的表达或EVs释放都是阻断DENV2传播的潜在方法[67]。

与游离的HBV病毒相比，EVs可以同样高效地将HBV传播给未感染的肝癌细胞[87]。HCMV能通过上调人类成纤维细胞中ESCRT水平来增强EVs分泌，这些EVs又进一步增强了病毒感染阴性细胞的能力。这表明HMCV可以利用EVs途径将促病毒传播信号转移到邻近未感染细胞，以增强病毒的传播效率[57]。LGTV利用蜱虫来源的EVs作为媒介，将病毒传播到脊椎动物细胞；同时利用脊椎动物来源的EVs在脊椎动物体内传播，以诱导神经侵袭[71]。此外，这种EVs作为载体介导病毒成分在宿主之间和体内的传播受到盐、pH和温度的变化调控[100]。来自PRRSV感染细胞的EVs通过影响宿主应答，有利于PRRSV在允许性细胞和非允许性细胞中的原发性感染；而抑制EVs的释放则会减弱EVs介导的PRRSV复制和传播[35]。对昆虫EVs发生途径各阶段的干扰都会影响RSV从昆虫载体向水稻的传播[80]。SARS-CoV-2感染过程中产生的EVs能介导病毒在不需要识别受体的情况下进入宿主细胞，因此EVs可以介导SARS-CoV-2的胞间传播[65]。

迄今为止，关于EVs在病毒传播中作用的研究较少。大多数已发表的研究都集中于阐明EVs在胞间传播中的作用，缺乏EVs在跨物种传播中功能的研究。

4.4 胞外囊泡在免疫反应中的作用

HAV可以通过劫持宿主细胞膜获得包膜，通过赋予病毒EVs样形态从而使病毒逃避中和抗体的清除，以促进病毒在肝脏中的传播[77]。HBV感染肝细胞释放的EVs含有病毒核酸，能通过刺激巨噬细胞分化初级反应蛋白88（myeloid differentiation primary response protein 88, MyD88）、toll/IL-1受体结构域适配分子1 [toll/IL-1 receptor (TIR) domain-containing adaptor molecule 1, TICAM-1]和线粒体抗病毒信号（mitochondrial antiviral signaling, MAVS）蛋白依赖的通路，增加自然杀伤细胞2族成员D（natural killer group 2 member D, NKG2D）配体的表达[59]。相反，肝细胞中HBV的感染增加了EVs中免疫调节相关miRNA的丰度，其转移到巨噬细胞后，通过抑制IL-12p35 mRNA的表达，来抑制宿主先天免疫应答[59]。此外，这些肝细胞来源的HBV-EVs也可以被单核细胞内吞，通过刺激单核细胞PD-L1的表达，引起免疫抑制[101]。来自慢性乙型肝炎患者血清的EVs直接以视黄酸诱导基因I（retinoic acid-inducible gene I, RIG-I）依赖的方式干扰NK细胞的功能，从而抑制核因子κB（nuclear factor κB, NF-κB）和p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）通路的激活[87]。HCV感染细胞产生的EVs已经被证明可以在不含有病毒结构蛋白的情况下，将病毒传播给阴性细胞，而且这种传播途径对中和抗体具有部分抗性[69]。携带HCV-RNA的EVs传递到浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells, pDCs）后可引起IFN-α上调，且在复制非允许性旁观者细胞中诱导无对抗的先天免疫反应[84]。

来自HIV感染细胞的含有Nef的EVs可以通过扰乱胆固醇代谢和重组旁观者细胞中的脂筏来增强免疫反应。HIV-Nef-EVs被巨噬细胞吸收，导致ATP结合转运体A1型（ATP binding cassette transporter type A1, ABCA1）表达下调和胆固醇外排减少，并通过减少小GTPase Cdc42的激活而提高脂筏的丰度。此外，脂筏的改变与toll样受体4（toll-like receptor 4, TLR4）的重新定位、TREM1（triggering receptor expressed on myeloid cells 1）靶向脂筏、ERK1/2磷酸化、NLRP3炎症小体激活和炎症因子分泌有关[85]。另一项研究表明，在CD4+ T细胞感染过程中释放的EVs可以有效抑制体外的HIV感染[86]。同时有研究表明从HIV感染者血浆中分离出的EVs与HIV患者的免疫激活和氧化应激有关。此外，这些血浆EVs的蛋白质组学检测发现了免疫激活标志物（CD14、CRP、HLA-A和HLA-B）、氧化应激标志物（CAT、PRDX1、PRDX2和TXN）和Notch4分子的存在[102]。

来自Kaposi肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus, KSHV）感染淋巴瘤细胞的EVs激活了典型的MEK/ERK通路，而不影响其他先天免疫调节因子，这使得病毒可以不依赖病原识别来引起这些变化[62]。此外，表面含有线粒体DNA的KSHV-EVs能通过刺激cGAS-STING信号通路来触发抗病毒反应[63]。ZIKV-EVs可以通过靶向作用两种主要细胞群（单核细胞和内皮血管细胞群）来调节免疫反应；ZIKV感染C6/36细胞产生的EVs，由于携带ZIKV RNA和蛋白质，可以通过增加肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）的产生，诱导宿主幼稚单核细胞分化为促炎状态。此外，这些EVs通过诱导凝血受体（TF）和炎症受体（PAR-1）的表达来促进血管内皮细胞损伤，从而导致内皮细胞通透性的增加[73]。DENV感染细胞产生的EVs能介导免疫调节。DENV通过CLEC2激活和启动中性粒细胞和巨噬细胞上CLEC5A和TLR2的表达，增强血小板EVs的释放，进一步导致中性粒细胞胞外陷阱（NET）的形成和促炎细胞因子的释放[103]。此外，同时阻断CLEC5A和TLR2的表达可以有效降低DENV诱导的炎症反应，从而对感染小鼠提供保护作用[103]。

其他几种病毒感染过程中产生的EVs，包括CSFV [66]、FMDV [31‒32]、JCPyV [58]、PRRSV [35]、REV [36]、SARS-CoV-2 [65]和SVV [38]，也可以通过阻止中和抗体识别病毒，为病毒提供免疫保护。EVs介导的宿主免疫逃逸是否发生在其他病毒感染期间尚不清楚，这需要未来的进一步探究。

除上述功能外，EVs在病毒感染过程中还发挥着其他作用。一些研究表明，RNA和蛋白质可以作为癌症诊断的生物标志物[104‒105]。EVs中的RNA和蛋白质水平受到病原感染的影响，有可能作为诊断感染的生物标志物。例如，慢性丙型肝炎患者血清EVs中的CD81水平与炎症活性和纤维化严重程度密切相关，这有助于阐明CD81在HCV感染中的作用[106]。此外，一些证据表明，EVs有潜力成为疾病治疗的分子递送载体。例如，包裹干扰素诱导的跨膜蛋白3（interferon-induced transmembrane protein 3, IFITM3）的EVs可以有效地递送IFITM3蛋白跨越胎盘屏障，抑制胎儿中的ZIKV感染[107]。EVs介导的mRNA体内递送安全性符合要求，可用于诱导SARS-CoV-2的免疫反应[108]。然而，许多研究都集中在EVs的成分及其在感染中的功能上，对于EVs在诊断和治疗病原感染中作用的研究却很少。因此，未来需要深入探究EVs在疾病诊断和治疗病原感染中的潜能。

5 胞外囊泡在其他病原感染中的作用

表3概述了EVs的分离方法、分泌来源、关键分子组成，以及在细菌、真菌和寄生虫感染中的生物学作用[109‒123]。

5.1 胞外囊泡在细菌感染中的作用

汉赛巴尔通体（Bartonella henselae, B. henselae）是一种血源性传播的革兰氏阴性细菌性病原体，其自然宿主是家猫。B. henselae来源的EVs含有血红素结合蛋白C（hemin-binding protein C, HbpC），这增加了细菌对血红素毒性的抗性[109]。革兰氏阴性菌[包括大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginos）]释放的EVs，可通过内吞作用被细胞内化，这些EVs将脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）传递到细胞质中，触发半胱天冬酶依赖的效应应答[110]。卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis, M. catarrhalis）分泌的EVs含有莫拉菌免疫球蛋白[Moraxella immunoglobulin (Ig) D, MID]结合蛋白，这些含MID的EVs可作为诱饵，通过重新定向适应性体液免疫反应，避免卡他莫拉菌与宿主B细胞的直接相互作用[111]。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）是一种革兰氏阳性细菌，其常见的毒力策略是产生成孔毒素，破坏宿主细胞的细胞膜。MRSA细菌DNA诱导人类细胞和小鼠组织中分泌一种携带去整合素金属蛋白酶10（a disintegrin and metalloprotease 10, ADAM10）的EVs，这些EVs通过充当结合多种毒素的清道夫来保护宿主细胞，以提高受感染小鼠的存活率[112]。淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae, N. gonorrhoeae）通过EVs分泌细菌外膜孔蛋白PorB而引起泌尿生殖系统化脓性感染，这些PorB以巨噬细胞的线粒体膜为靶点，可导致线粒体膜电位的丧失、细胞色素的释放和凋亡级联反应的激活[113]。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis）是一种牙周革兰氏阴性厌氧菌，其分泌的EVs表面含有牙龈蛋白酶，其增加了血管通透性，导致体内和体外疾病的发生[114]。肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, S. pneumoniae）产生的EVs被内化到宿主细胞中，通过触发招募免疫细胞和细胞因子反应来促进宿主的防御。另一方面，这些EVs也为细菌的生存提供了抗炎环境[115]。

5.2 胞外囊泡在真菌和寄生虫感染中的作用

新生隐球菌（Cryptococcus gattii, C. gattii）是健康人类宿主中最主要的危及生命的真菌性感染病原。C. gattii强毒菌株释放的EVs可作为真菌胞内增殖和毒力的加速器，这些真菌EVs被受感染的宿主巨噬细胞吸收并运输到吞噬小体，导致真菌在细胞内的快速增殖[116]。利什曼原虫（Leishmania）是一类被称为利什曼病的热带和亚热带感染的罪魁祸首。利什曼原虫在高温和低pH条件下释放的EVs可以被胞外环境中的幼稚细胞吸收，这促进了病原体-宿主间的通信[117]。布鲁氏锥虫是一种流行于非洲的血液疾病的病原，会导致动物精神沉郁和食欲下降，对牲畜的生产和生活有重大影响。布鲁氏锥虫（Trypanosoma brucei rhodesiense, T. b. rhodesiense）来源的EVs包含了血清耐药性相关蛋白（serum resistance-associated protein, SRA），这对在人类中的传染性至关重要。此外，这些EVs可以将SRA转移到非人类感染性锥虫中，以逃避人类先天免疫反应。锥虫EVs也可以靶向作用哺乳动物的红细胞，导致红细胞被迅速清除和机体贫血[118]。

5.3 植物来源胞外囊泡对病原感染的影响

拟南芥分泌的EVs可以将sRNAs传递给灰孢霉菌，这些含有sRNA的囊泡会在感染部位聚集，并被真菌吸收，导致对致病性至关重要的真菌基因的沉默[119]。另一项研究表明，拟南芥释放的含mRNA的EVs被转运到真菌细胞中，递送的宿主mRNA在真菌中翻译，进而减少了灰孢霉菌的感染[120]。牙龈卟啉单胞菌是一种牙周病原体，其与姜外泌体样纳米颗粒（ginger exosome-like nanoparticles, GELNs）表面的血红结合蛋白35（hemin-binding protein 35, HBP35）相互作用，以磷脂酸（phosphatidic acid, PA）依赖的方式选择性吸收GELNs，导致牙龈卟啉单胞菌致病性的显著降低[121]。此外，GELNs来源miRNA（miRNA aly-miR396a-5p）可以通过抑制病毒S和Nsp12蛋白的表达，抑制SRAS-cov-2诱导的Vero E6细胞上的病变和小鼠的肺部炎症[122]。从向日葵幼苗胞外液中分离出的EVs可以与核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum, S. sclerotiorum）结合，表现出抑制生长、引起形态改变和诱导细胞死亡的功能[123]。来自葡萄柚、葡萄、生姜和胡萝卜的可食用植物来源的外泌体样纳米颗粒（edible plant-derived exosome-like nanoparticles, EPDENs）含有蛋白质、脂质和microRNA，它们通过诱导抗炎基因和抗氧化基因的表达而表现出不同的生物学效应[124]。

6 胞外囊泡的示踪

尽管从疾病病理生理学到治疗性药物传递相关EVs的研究发展迅速，但仍需要先进的分子工具来对EVs示踪。目前，EVs主要通过亲脂性染料（PKH67、DiO或DiR）、渗透性染料（CFSE或CFDA）、物理标记物（99mTc-HMPAO）和量子点进行标记[125]。然而，一些研究也已经开发了新的示踪方法来在体内和体外使EVs成像。例如，通过利用不同荧光素酶与CD63相连来标记EVs，可以在体外和体内对EVs进行高灵敏度的示踪[51]；CD63与NanoLuc或ThermoLuc的融合也允许以经济高效的方式实现EVs的体内定量或实时成像[51]；用NanoLuc-CD63标记物来标记EVs有助于小鼠模型中心脏EVs的时空跟踪[126]。

7 总结

总之，EVs在病原感染过程中，既可以导致疾病病情的恶化也可以改善病情，这取决于病原的类型和EVs中包裹的信号成分。鉴于EVs的生物发生和几种细胞应答在病原感染中是相似的，可以将一种病原的研究应用于其他病原，从而找到具有广谱抗病原感染的分子。目前大多数研究缺乏对EVs成分的深入分析，因此使用高通量技术平台深入分析EVs，可能为个性化医疗和疾病的防控奠定科学基础。

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