癌的化学预防包含未病先防和既病防变两方面。用药物或食物成分阻断癌变的发生及癌前病变的发展, 控制、减少恶性肿瘤的发生, 分化逆转癌细胞恶性表型, 阻断或延缓肿瘤侵袭、转移, 都是癌化学预防研究的领域。迄今为止, 在众多的化合物和天然产物中研究较为成熟, 最有希望的一类癌化学预防与分化诱导剂是维生素甲酸类 (维甲类) 化合物。

对维甲类应用的探索, 国内外已有不少报道, 合成的维甲类化合物多因毒性较大, 较少能用于临床, 目前肿瘤临床应用的只有全反式维甲酸。中国医学科学院药物研究所研制的新维甲类化合物维胺酸[N- (4-carboxyphenyl) retinamide, RⅡ] [1], 经Ⅱ期临床多中心观察证明对人癌前病变口腔白斑 [2,3], 外阴白色病损, 胃粘膜不典型增生 [4], 子宫颈上皮不典型增生 [5,6]等有明显疗效, 且毒性较低, 是具有较好应用前景的癌化学预防和癌前疾病治疗药 [7]。

《1 对癌前病变和化学致癌的阻断作用》

1 对癌前病变和化学致癌的阻断作用

肿瘤可由体外或体内的多种化学及生物因子诱发, 其中绝大多数是化学致癌物。在一组由化学致癌物诱发动物不同器官癌前病变或癌变的实验中, 维胺酸显示出明显的癌化学预防作用。

小鼠二阶段皮肤乳头状瘤模型是化学致癌研究的经典模型。郭昌月等观察证明DMBA/巴豆油可诱发小鼠皮肤乳头状瘤, 对照组从实验第6周开始出现肿瘤, 以后肿瘤诱发率和每鼠荷瘤数逐渐增加;口服维胺酸可显著延迟小鼠肿瘤发生潜伏期, 减少平均荷瘤数, 降低肿瘤诱发率, 并呈明显的量效关系 [8]。

蔡海英等用N-Nitrososarcosine ethylester (NSEE) 诱发小鼠前胃上皮不典型增生后, 以50mg/kg剂量灌喂维胺酸共20次, 用药组小鼠平均前胃及瘤重较对照组减轻, 前胃癌前病变与癌变例数较对照组明显减少, 癌变抑制率达54.6% [9]。

地鼠颊囊是观察口腔癌前病变的理想部位, 采用二甲基苯蒽涂抹, 造成金黄地鼠颊囊癌前病模型后再给予维胺酸治疗, 证实该药对病变发展有明显的阻断效果 [2]。以颊囊粘膜上皮重度异常增生和癌变作为恶变指标, 对照组实验第8周时恶变率为96.2%, 停药8周时恶变率达100%, 用药组恶变率分别为32.4%和47.1%, 二组统计学比较差异显著。局部或口服给药皆有效, 以口服加局部联合用药效果更佳, 如图1所示。

《图1》

图1 RⅡ对DMBA诱发金黄地鼠颊囊肿瘤形成的抑制作用

图1 RⅡ对DMBA诱发金黄地鼠颊囊肿瘤形成的抑制作用  

Fig.1 Inhibition of buccal carcinogenesis caused by DMBA in hamsters with N-4- (carboxy phenyl) retinamide

王洪伟等利用N-butyl-N- (4hydroxybutyl) nitrosamine诱发大鼠膀胱肿瘤, 维胺酸显示显著抑制作用, 给药组发癌率比对照组明显降低, 且肿瘤数目少、体积小、浸润轻;镜下观察显示细胞分化较好, 主要为Ⅰ级, 无Ⅲ级肿瘤, 而对照组以Ⅱ级和Ⅲ级肿瘤为主;给药组肿瘤均为表浅型, 对照组浸润型占35.7%, 其中2例并已浸润至外膜 [10]。组织学分型, 两组膀胱肿瘤都以移行上皮细胞癌为主, 但对照组鳞状细胞癌较多。电镜观察证实对照组膀胱肿瘤细胞表面和细胞器的超微结构改变均重于维胺酸组。揭示维胺酸不但降低了亚硝胺类化合物对膀胱肿瘤的诱发率, 而且对于降低膀胱肿瘤的恶性程度有重要影响 [10]。

《2 抗致突变作用与抗促癌作用》

2 抗致突变作用与抗促癌作用

癌化学预防对始发突变进行干预的主要环节是抑制致癌物的代谢活化, 或提高机体解毒酶系活性以减少致癌物的生成, 抑制致癌物到达靶器官并与DNA结合, 减少DNA加成物的形成。在抗致突变方面, 付招娣等用7种诱变剂对鼠伤寒沙门氏菌TA97、98、100、102行回复突变观察, 证明维胺酸对不同诱变物引起的突变均有一定抑制作用, 并呈现剂量-效应关系。曾毅等发现维胺酸对应用巴豆油和丁酸合并处理Raji细胞诱发EB病毒早期抗原也有较强抑制作用。交链孢酚单甲醚 (AME) 和交链孢酚 (AOH) 二种互隔交链孢霉毒素可能是河南林县食管癌重要致病原因之一, 利用V79细胞6-巯基鸟嘌呤抗性突变方法, 臧梦维等观察到维胺酸能降低AME诱发V79细胞突变频率, 随剂量加大, 抑制率增高 [11]。维胺酸对AME和AOH引起的人胚肺2BS细胞DNA单链断裂有保护作用 [12]。维胺酸并能降低广东食管癌高发区民用鱼露引起的V79细胞微核增高, 显示对染色体损伤的保护作用。动物体内实验也观察到维胺酸可拮抗环磷酰胺诱发的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成, 提前4天给药, 抑制率达60%。

佛波酯类化合物TPA是经典的促癌剂, TPA的受体是蛋白激酶C (PKC) , 而与细胞增殖和癌变有重要关系的多胺合成的限速酶是鸟胺酸脱羧酶 (ODC) 。公认佛波酯类促癌剂对ODC的诱导是细胞发生与促癌有关的早期生物化学反应之一。郭昌月等发现维胺酸能显著抑制富含佛波酯的巴豆油对小鼠表皮组织ODC的诱导, 提前2天给药即能抑制ODC活性急剧上升, 100 mg/kg用药抑制率达45.4% [8]。用巴豆油诱发小鼠耳肿胀, 维胺酸组肿胀程度与对照组相比亦明显减轻 [8]。10μmol/L的维胺酸作用于HL-60细胞12 h, PKC活性降低14%, 作用于细胞24 h, PKC活性降低49% [13]。郭昌月等报道不同浓度维胺酸对TPA刺激大鼠白细胞释放H2O2有明显抑制作用, 且呈良好量效关系 [8]。

《3 分化诱导作用》

3 分化诱导作用

恶性细胞通常具有永生性、致瘤性及生长密度依赖性, 其血清依赖性降低, 停泊依赖性丧失, 对外源凝集素的凝集能力增强, 纤维粘连蛋白合成减少以及胞质内cAMP水平降低等。

路莹等发现, 经维胺酸作用后的HL-60细胞只能在10%血清浓度下生长, 与未经药物作用的HL-60细胞相比血清依赖性提高 [13]。潘琼婧等用人食管癌Eca109细胞, 观察到维胺酸与细胞接触6天, 明显抑制细胞增殖, 随药物作用剂量增大和时间延长抑制作用加强;维胺酸并可抑制食管癌细胞的双层软琼脂及琼脂板上的集落形成率, 减少集落内的细胞层次 [14]。宁爱兰等通过电镜观察到食管癌细胞的出现退变, 线粒体肿胀、变性, 随维胺酸处理时间延长, 改变逐渐明显;电镜观察证实维胺酸有促进食管癌上皮细胞分化的作用, 用药1天后癌细胞即出现分化, 与正常上皮细胞的特点很接近 [15]。

人早幼粒白血病是细胞分化缺陷的典型代表。在分化诱导剂的作用下人早幼粒白血病细胞 (HL-60) 可被分化为成熟度不同的粒细胞或巨噬细胞, 出现吞噬功能及趋化性, 呈硝基四氮唑 (NBT) 反应阳性。丧失在软琼脂培养基上形成集落及在裸鼠体内移植成瘤的能力。宋争平等观察到10-6mol/L维胺酸处理HL-60细胞6天, NBT反应显示明显的时间及剂量依赖性, 同时细胞表面出现C3补体受体等中性粒细胞的分化特征, 用药第6天, C3补体受体阳性细胞比例由HL-60细胞群体的2.5%上升到14.9%;随药物浓度增加, 处理时间延长, 见到YC3玫瑰花结率增高, 每个细胞黏附的酵母菌数量亦增多;细胞形态观察发现, HL-60细胞按粒系发育途径趋于成熟 [16]。流式细胞仪对经维胺酸处理的HL-60进行细胞周期分析显示, HL-60细胞被阻断在G1期向S期移行阶段 [17]。司静懿等用电镜组化方法证实, 维胺酸作用4天, HL-60细胞出现不同程度分化, 如细胞核形状变得不规则, 出现较多的杆状核及分叶核, 核浆比例降低, 核内异染色质增加, 胞浆中出现早幼粒细胞分化至中幼粒细胞的标志之一——特异颗粒 (随细胞成熟分化, 此颗粒数目也增多) 。但与正常白细胞分化的形态特点尚有所不同, 表现在分叶核细胞胞核内还存在一个或多个大的核仁, 同时其胞浆内细胞器的发育仍停留在较幼稚的阶段 [18]。

一般认为c-myc基因在细胞增殖中起重要作用, 其高水平表达能阻遏细胞分化, 而c-fos基因则是细胞分化的标志。路莹等研究证明, 维胺酸在10-5 mol/L浓度下可使HL-60细胞c-myc基因表达明显降低, c-fos表达明显提高 [19]。

曹鉴等在小鼠前胃癌MFC细胞同样观察到了相似的细胞周期变化 [20]。MFC细胞经维胺酸处理14天, 细胞生长受到明显抑制, 3H-TdR掺入率显著降低, 几乎丧失了在软琼脂中形成集落的能力瘤细胞中期染色体分析表明, 用药组MFC细胞较对照组超二倍体相对减少, 二倍体细胞增加, 用药前后染色体众数对比有显著差别。

细胞骨架系统是维持细胞形态和运动的物质基础, 也是与细胞生长和分化有关的信号传递系统的重要组成部分。韩立群等将人鼻咽癌细胞CNE-2Z及其亚系细胞与人胚肺成纤维细胞2BS和CV-1系非洲绿恒河猴肾上皮细胞胞质骨架比较看到, 肿瘤细胞胞质骨架系统发育不良, 骨架纤维细碎, 排列无规则, 而正常细胞胞质骨架发达, 富有应力纤维束, 排列有极向;维胺酸作用后, CNE-2Z细胞中细丝状骨架纤维增多, 并出现应力纤维束样结构, 同时细胞角蛋白有一定增加 [21], 而角蛋白表达增加是公认的上皮细胞分化标志之一。

陈俊霞等应用图象分析、聚丙烯酰胺凝胶同工酶电泳、放射免疫、刀豆球蛋白凝集反应等方法观察了维胺酸对人胃癌细胞系SGC-7901的分化诱导作用 [22]。结果发现, 维胺酸对细胞的生长、增殖有抑制作用, 使细胞内DNA平均含量下降, 核面积变小, LDH同工酶谱发生变化, H型亚基升高, M型亚基降低, 细胞癌胚抗原 (CEA) 分泌量和Con-A凝集反应均显著下降。光镜下, 细胞铺展良好, 排列较有序, 叠堆生长少见, 细胞质嗜碱性降低。显示维胺酸作用于SGC-7901细胞后无论从细胞表面、形态结构、生长特性, 还是从生物化学等方面, 均使其恶性程度降低, 并获得相对正常的表型。

《4 对癌细胞运动侵袭的影响》

4 对癌细胞运动侵袭的影响

侵袭、转移行为是恶性肿瘤最本质的特性, 是区分肿瘤良性或恶性的确切标准。阻断或控制侵袭和转移中的一个或多个关键性环节, 将可有效地控制肿瘤。

高进等报告, 维胺酸作用后小鼠前胃癌细胞球体数明显增多, 12 h到60 h球体运动计算显示, 维胺酸组比对照组向周围主动移动距离小, 说明药物使肿瘤细胞间的同质性粘附能力得到提高, 明显抑制细胞运动性 [21]。但维胺酸对不同癌细胞及其亚系与几种基底膜成分异质性粘附的影响并不一致, 可能与肿瘤细胞亚群的异质性有关。用人鼻咽癌细胞CNE-2Z母系及侵袭能力为高、中、低度的克隆株L2、H2、L4检测, 维胺酸用药15天, 4个细胞株体外侵袭力明显减弱 [23]。用MFC细胞进行抗侵袭实验发现, 对照组细胞与器官块接触培养24 h即出现Ⅰ～Ⅱ级侵袭, 维胺酸组仅1例出现Ⅰ级侵袭, 3例仍停留在0级, 继续培养3、5、7天, 用药组的侵袭程度均低于对照组。肾包膜下移植模型上观察到, MFC细胞移植后3天, 维胺酸组仅1例出现Ⅰ级侵袭, 4例为0级, 而未用药组侵袭已达Ⅰ～Ⅱ级, 第5天, 第7天时两组侵袭程度均有显著差别。维胺酸能明显地抑制小鼠前胃癌细胞MFC与人鼻咽癌细胞CNE-2Z等细胞系株的体外侵袭能力, 说明维胺酸在肿瘤细胞的侵袭环节有一定的阻断作用。维胺酸作用后细胞形态均出现明显改变, 特别是细胞表面结构变化明显。光镜下MFC细胞由多角型为主的上皮细胞型转变为成纤维细胞型, 细胞密度降低, 局部细胞出现极性。扫描电镜观察到药物处理后的细胞微绒毛较丰富, 丝状伪足较多, 且末端常见圆形膨隆状结构。而对照瘤细胞表面多为褶皱状伪足, 仅有少量微绒毛, 尚可见多量叶状伪足 [19]。人鼻咽癌CNE-2Z、L2、L4细胞在维胺酸作用15天后光镜下虽未见明显形态学改变, 但透射电镜看到, 细胞胞浆中尽管仍含有大量游离核糖体, 但髓样小体增多, 大部分细胞胞浆内可见粗大的张力纤维束 [24]。

有关维胺酸抗侵袭、抗转移作用机理, 高进等对具有不同转移潜能的细胞株用药后v-fos、ras″、nm23、Rb等癌基因、抑癌基因的表达作了观察, 发现维胺酸作用对小鼠前胃癌细胞系MFC的nm23表达明显促进, myc基因表达受到抑制, fos基因表达升高, 而在人鼻咽癌细胞母系及高转移克隆株和低转移克隆株的各细胞基因表达却不尽相似 [23]。此种现象如何解释尚待深入研究。刘玉琴等报告小鼠肺腺癌LA795母系及克隆株细胞LA1、LA5胞内游离Ca2+浓度与维胺酸作用有一定相关性 [25]。

《5 结语》

5 结语

大量药理实验表明维胺酸可通过多种途径抑制癌发生的各个阶段, 尽管对维胺酸作用机理还需深入探讨, 但维胺酸的癌化学预防作用在多种动物模型得到了证实。维胺酸与维甲酸等药物比较, 毒性小, 疗效肯定是其特点, 临床试用受到了医生和患者的好评, 其临床试用效果如表1所示。相信, 维胺酸的问世将对我国癌化学预防工作的开展起到推动作用。

《表1》

表1 维胺酸临床试用效果 [7]

Table 1 Clinical trial of N-4- (carboxyphenyl) retinamide

表1 维胺酸临床试用效果[2, 4, 5, 7]

有效率为“显效+有效”或“显效+好转”;*统计学比较P<0.05;**统计学比较P<0.01

致谢:维胺酸研究过程中承蒙全国很多医、药科研单位和临床医院大力协助, 谨表谢忱!