《1. 综述》

1. 综述

弯曲菌是一种嗜热型的革兰氏阴性菌，是全球引起弯曲菌病这一食源性疾病的主要病原[1,2]。空肠弯曲菌和结肠弯曲菌是弯曲菌属中引起人类胃肠炎最主要的种[3]。此外，空肠弯曲菌还是引起格林巴利综合征（GBS）与米勒费雪症候群（MFS）的主要诱因[2]。家禽、被污染的水、生牛奶都是其常见的感染源[4]，由于鸡的肠道是弯曲菌最适宜生存的环境，因此，鸡是弯曲菌最主要的宿主，并在其感染人类的过程中扮演非常重要的角色[5]。

通常，弯曲菌感染具有自限性，不需要临床治疗，只需补充营养物质保证水和电解质的平衡即可[6]。而对于有获得性免疫缺陷综合征（AIDS）、症状严重或者发生肠道外感染的病患则需进行抗菌药物治疗[6]。氟喹诺酮类药物和大环内酯类药物是治疗弯曲菌感染的首选药物[7]，四环素和庆大霉素则通常治疗弯曲菌引起的全身性感染[7]。然而，由于抗菌药物的广泛使用，弯曲菌的耐药性问题（如环丙沙星和阿奇霉素耐药性）已成为人医和兽医临床上的重要挑战。2017年欧盟细菌耐药性与人畜共患病报告结果显示，57.7%的空肠弯曲菌与63.5%的结肠弯曲菌已对环丙沙星产生耐药[8]。美国国家肠道细菌耐药性监测系统（NARMS）结果显示，人源结肠弯曲菌对环丙沙星的耐药率由2012年的34%上升至2015年的40%，鸡源空肠弯曲菌对环丙沙星的耐药率也维持在22%~28%（2012—2015年）[9]。因此，2013年美国疾病预防控制中心已将耐药弯曲菌列为危害公共卫生安全的重要威胁[10]。世界卫生组织也将氟喹诺酮耐药弯曲菌列为病原优先级2级（高度威胁）[11]。

与美国和欧洲不同的是，我国仍旧缺乏一个完善的弯曲菌耐药性监测网络。研究表明，部分地区分离的弯曲菌对环丙沙星的耐药率已达到较高水平，如江苏（85.2%）[12]、北京（87.5%）[13]、深圳（89.7%）[14]以及上海（97.4%）[15]。此外，一项对2008—2014年五个省市的弯曲菌耐药性调查研究表明，肉鸡与生猪中分离的弯曲菌对环丙沙星的耐药率已达到100%，表明环丙沙星在这些地区已无法用于弯曲菌的治疗[16]。

弯曲菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制主要包括DNA促旋酶A亚基GyrA中氟喹诺酮耐药决定区的位点突变以及由三部分组成的多重耐药外排泵CmeABC [17,18]。CmeABC属于耐药结节化细胞分化家族（RND），包括一个胞质融合蛋白（CmeA）、一个内膜药物转运蛋白（CmeB）以及一个外膜蛋白（CmeC）[19]。作为弯曲菌的一种重要的外排泵，CmeABC可以泵出对细菌有害的各种物质，其中包括多种类型的抗生素，如氟喹诺酮类、酰胺醇类、大环内酯类、四环素类等[20]。近期，有研究发现了一种新型的CmeABC变异体，命名为RE-CmeABC [21]，通过基于局部比对算法的搜索工具（BLAST）发现，该变异体中的CmeB与野生型的CmeB只有80.5%~81.2%的氨基酸同源性，功能性研究发现其可以提高多种药物的耐药水平。尤为重要的是，RE-CmeABC不仅可以在药物压力下提高弯曲菌中GyrA中氟喹诺酮耐药决定区位点的突变频率，还可与gyrA 突变协同介导对环丙沙星的高水平耐药[最小抑菌浓度（MIC）≥ 128 mg·L–1 ] [21]。

自2014年首次发现RE-cmeABC 以来，尚未有对其大范围的流行病学调查报道。因此本研究调查了2014—2016年连续三年间我国的山东、上海和广东等三个重点养殖区养殖场与屠宰场分离的RE-cmeABC 阳性弯曲菌的流行与耐药性现状。

《2. 材料与方法》

2. 材料与方法

《2.1. RE-cmeABC 阳性弯曲菌的分离鉴定、基因与耐药突变筛选》

2.1. RE-cmeABC 阳性弯曲菌的分离鉴定、基因与耐药突变筛选

本研究调查了2014—2016年连续三年间我国山东、上海和广东等三个重点养殖区食品动物源RE-cmeABC 阳性弯曲菌的流行趋势。我们复苏了1088株弯曲菌（931 株结肠弯曲菌与157株空肠弯曲菌），其中，2014年的部分菌株先前已经报道[21]。这些菌株由本实验室年度的动物源细菌耐药性监测计划采集，主要来源于猪和鸡的肠内容物、粪便和肉。首先，所有菌株划线接种于MH（Sigma-Aldrich, Inc., USA）平板上，置于42 ℃微需氧条件下（5% O2 , 10% CO2 , 85% N2 ）生长18~24 h。随后使用RE-cmeBF  (5′-CGTATTGCACGAT-TATTTG GAC-3′)和RE-cmeBR  (5′-ATCGTTATCAAAC-CCTCTAT GTGCC-3′)引物检测RE-cmeB 基因的存在。为了验证环丙沙星高水平耐药是否与DNA解旋酶基因gyrA 点突变和RE-cmeABC 相关，运用多重错配扩增突变试验聚合酶链反应（multiplexmismatch amplification mutation assay-polymerase chain reaction, MAMA-PCR）以检测gyrA 单位点突变的流行情况（C-257 to T）[22]。

《2.2. 药物敏感性测试》

2.2. 药物敏感性测试

对所有弯曲菌按照临床试验标准研究所（CLSI）M45 (2016)推荐的琼脂稀释法测定其对临床常用抗菌药物的敏感性，受试药物如下：庆大霉素、红霉素、环丙沙星、四环素和克林霉素[23]。CLSI未设定弯曲菌在琼脂稀释法测定中氟苯尼考的耐药折点，因此在本研究中选择参照NARMS推荐的标准展开试验[24]。空肠弯曲菌ATCC 33560作为质控菌株。

《2.3. 分子分型》

2.3. 分子分型

97株携带RE-cmeABC的代表性菌株用于脉冲场凝胶电泳分型（PFGE），仪器型号为CHEF-DR III，试验方法参考弯曲菌PFGE标准方法进行[25]。弯曲菌的总DNA经SmaI 酶切，沙门菌H9812作为Marker，经Xba I酶切。凝胶电泳结果分析软件为InfoQuest FP 4.5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)。

《2.4. 数据收集与统计学分析》

2.4. 数据收集与统计学分析

流行病学数据整理与分析（包括95%置信区间计算）由Excel 2016 (Microsoft, USA)完成。RE-cmeABC、弯曲菌及MIC耐药水平的单变量分析由Prism 7.0 (GraphPad Software, USA)完成，以P ≤ 0.05为差异显著。用比值比（OR）检验RE-cmeABC 阳性菌株数与各变量之间的相关性。用X2 或Fisher精确检验以判定上述比率之间的差异。

《3. 结果与讨论》

3. 结果与讨论

《3.1. 弯曲菌中 RE-cmeABC 的流行》

3.1. 弯曲菌中 RE-cmeABC 的流行

1088株弯曲菌中共筛选到122株（11.2%, 95% CI: 9.4~13.2）RE-cmeABC阳性菌株，所有菌株均分离自鸡。122株阳性菌株包括111株（111/157, 70.7%, 95% CI: 62.9~77.7）空肠弯曲菌与11株（11/931, 1.2%, 95% CI: 0.6~2.1）结肠弯曲菌。RE-cmeABC 阳性空肠弯曲菌的流行率显著高于RE-cmeABC 阳性结肠弯曲菌（70.7% vs. 1.2%, P < 0.0001）[图1（a）]，与2012—2014年报道的趋势相似[21]。另外，RE-cmeABC 在空肠弯曲菌中的阳性率由2012—2014年的34.7% (189/544) 上升至2014—2016年的70.7% (111/157) (P < 0.0001)，而结肠弯曲菌中的阳性率则由3.2% (47/1458)降至1.2% (11/931) (P <0.0001)。上述结果表明RE-cmeABC 的主要宿主已逐渐集中于空肠弯曲菌，空肠弯曲菌已成为RE-cmeABC 的最主要携带种属。由于家禽是空肠弯曲菌的主要宿主，这也在一定程度上解释了RE-cmeABC 为何均分离自鸡[26]。由于RE-cmeABC 阳性结肠弯曲菌数量较少，无法得到较为可信的统计学结果，因此我们重点比较不同年份间三地区RE-cmeABC 阳性空肠弯曲菌的流行与耐药特征。

图1（a）显示了RE-cmeABC 阳性弯曲菌每年在三地区的整体流行情况。RE-cmeABC阳性菌株维持了一个较高的流行率，且在三年中并无显著性变化（P > 0.05）。广东与上海地区的RE-cmeABC 阳性菌株在三年间有略微上升[图1（b）]；山东地区在2014年与2015年一直维持在较低的流行水平，2016年却突然增加至76.1%(35/46, 95% CI: 61.2~87.4) [图1（b）]。上述结果表明RE-cmeABC 阳性菌株已在这些地区的畜禽中出现了较高的流行率，对公共卫生带来了潜在威胁。

《图1》

图1. 不同年份间三地区RE-cmeABC 阳性菌株的流行率。（a）不同年份间三地区结肠弯曲菌与空肠弯曲菌中RE-cmeABC 的流行率比较； （b）不同年份间三地区RE-cmeABC 阳性空肠弯曲菌的流行率。误差条代表95%置信区间（95% CI）。

《3.2. 耐药表型》

3.2. 耐药表型

药物敏感性测试结果表明所有RE-cmeABC 阳性空肠弯曲菌均对环丙沙星耐药，其次为四环素（99.1%）、氟苯尼考（74.8%）、 庆大霉素（45.9%）、 克林霉素（13.5%）和红霉素（11.7%）（表1）。为进一步验证RE-cmeABC 在空肠弯曲菌中的耐药功能，我们补充了RE-cmeABC 阴性弯曲菌的MIC结果以整合分析。RE-cmeABC 阳性空肠弯曲菌与RE-cmeABC 阴性空肠弯曲菌对氟苯尼考、克林霉素和红霉素的耐药率有显著差异（P < 0.05），而对环丙沙星、四环素和庆大霉素的耐药率无显著差异（表1）。RE-cmeABC 阳性菌株对氟苯尼考的耐药率显著高于RE-cmeABC 阴性菌株（74.8% vs. 39.1%, P < 0.0001）。RE-cmeABC阳性菌株对氟苯尼考的相关性（OR = 4.61）显著高于RE-cmeABC 阴性菌株（表1）。酰胺醇类的氟苯尼考未被批准用于临床，而在兽医临床则被广泛用于治疗食品动物疾病[27]。因此，在畜禽养殖过程中，氟苯尼考对RE-cmeABC 阳性菌株的筛选可能具有重要作用。与氟苯尼考耐药情况不同的是，RE-cmeABC 阳性菌对克林霉素和红霉素耐药率的相关性则显著低于RE-cmeABC 阴性菌性（OR = 0.32和0.34）（表1）。尽管RE-cmeABC 可以将菌株对红霉素的耐药水平提高四倍，但若没有23S rRNA点突变存在的情况，仍不足以达到耐药水平[28]。这表明RE-cmeABC 不是空肠弯曲菌中对克林霉素和红霉素的主要耐药机制。

《表1》

表1 RE-cmeABC阳性与阴性空肠弯曲菌的MIC特征

与野生型cmeABC 相比，RE-cmeABC 已被证明具有更强的泵出功能，可将氟喹诺酮类、酰胺醇类、大环内酯类、四环素类等药物泵出细胞[21]。尽管有无RE-cmeABC对环丙沙星、四环素和庆大霉素的耐药率无显著差异，然而，携带RE-cmeABC的菌株可以使环丙沙星与四环素对弯曲菌的MIC值分布趋于更高水平范围（图2），这与此前的研究结果一致[21]。有趣的是，对环丙沙星与四环素高水平耐药（≥16倍MIC折点）的RE-cmeABC 阳性菌株数显著高于RE-cmeABC 阴性菌株数（P < 0.0001和P = 0.0004）。上述结果同样表明RE-cmeABC 可以提高弯曲菌对抗生素的整体耐药水平[21]。为了验证对环丙沙星的高水平耐药机制，我们检测了gyrA 基因的单位点核苷酸突变（C-257 to T）。然而，所有的RE-cmeABC 阳性菌株均存在C257T突变，佐证了RE-cmeABC 可以促进gyrA 的突变频率。目前尚未阐明的是药物MIC水平是否与RE-cmeABC 的表达水平有关，RE-cmeABC 受其上游调控基因cmeR 的负反馈调控，而cmeR 则位于RE-cmeABC 的启动子区域，是一种转录抑制因子[29]，RE-cmeABC 引起菌株对抗生素高水平耐药的机制仍需进一步研究。

《图2》

图2. RE-cmeABC 阳性菌株与阴性菌株对环丙沙星与四环素的MIC分布比较。（a）空肠弯曲菌对环丙沙星的MIC分布； （b） 空肠弯曲菌对四环素的MIC分布。

《3.3. 分子分型》

3.3. 分子分型

本研究选取了97株RE-cmeABC 阳性空肠弯曲菌代表株（上海37株、广东25株和山东35株）用于PFGE分型分析。以80%的相似度划分PFGE克隆亚型，RE-cmeABC 阳性空肠弯曲菌共分为30个PFGE克隆型，包括13个独特型和17个克隆簇（图3）。上海地区克隆型最多，包括8个克隆簇和7个独特型；其次为广东地区，包括11 个克隆簇和6个独特型；最后为山东，包括5个克隆簇。上海和广东地区菌株除了A型（27.0%, 10/37）和W型（20%, 5/25）外无其他流行克隆，表明上海及广东地区的RE-cmeABC 阳性空肠弯曲菌仍以水平扩散为主。相反，B型（65.7%, 23/35）是山东地区流行的最主要克隆，表明该地区主要以B型的克隆扩散为主。另外，有三株R型菌株同时在上海和广东被分离到，有3株U型菌株同时在广东和山东被分离到。同时，分离自上海和广东的3株菌表现出100%的同源性；而分离自上海和山东的4株L型菌株也表现出100%的同源性。上述结果表明，某些具有相同PFGE谱型的RE-cmeABC 阳性空肠弯曲菌已在不同地区开始流行，且具有稳定的水平传播与适应能力。

《图3》

图3. 2014—2016年97株RE-cmeABC阳性空肠弯曲菌代表株的PFGE分型。菌株经由酶切。地区包括山东（SD）、上海（SH）与广东（GD）。

《4. 结论》

4. 结论

本研究调查了2014—2016年连续三年间我国山东、上海和广东等三个重点养殖区食品动物源RE-cmeABC 阳性弯曲菌的流行与耐药性现状。与2012—2014年的数据相比，鸡源的RE-cmeABC 阳性空肠弯曲菌逐渐超过结肠弯曲菌成为主要菌种。RE-cmeABC 阳性菌株对氟苯尼考的耐药率显著高于RE-cmeABC 阴性菌株，对环丙沙星与四环素的耐药率则无显著性差异。然而，携带RE-cmeABC 的菌株可以使环丙沙星和四环素对弯曲菌的MIC值分布趋于更高水平范围。另外，在上海与广东及广东与山东还分离到了相同PFGE谱型的RE-cmeABC 阳性空肠弯曲菌。这些发现表明RE-cmeABC 已在我国食品动物源弯曲菌中广泛流行，对公共卫生安全具有重要威胁。

《致谢》

致谢

本研究得到国家重点研发计划（2017YFC1601501）、中国博士后科学基金（2018M631638）与国家自然科学基金项目（31802247）资助。

《Compliance with ethics guidelines》

Compliance with ethics guidelines

Dejun Liu, Weiwen Liu, Xing Li, Hong Yao, Zhangqi Shen, Yang Wang, and Jianzhong Shen declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.