《1、 引言》

1、 引言

大多数临床生物标志物和治疗药物都是小分子化合物[1]。因此，对干血斑（dried blood spot, DBS）[2]、血浆[3]、尿液[4]和其他体液中这些小分子化合物浓度水平进行监测具有重要意义。肌酸（creatine, CRE）代谢性疾病可能是由于缺乏肌酸转运载体，或缺乏精氨酸-甘氨酸氨基转移酶（arginine‒glycine amidinotransferase, AGAT）和重组胍酰乙酸-N-甲基转移酶（recombinant guanidinoacetate-N-methyltransferase, GAMT），这两种酶均参与CRE合成[5]。CRE代谢性疾病的实验室诊断是检测血浆和尿液中的胍基乙酸（GAA）和肌酸（CRE）[6]。免疫分析是检测常用方法之一，在临床分析中发挥着重要作用，目前仍被用于新生儿筛查[7]。但是，谱图重叠和难以避免的背景干扰限制了多种分析物的检测。

质谱（mass spectrometry, MS）以其高分辨率和特异性克服了多种物质同时检测的难题[8‒11]。线形离子阱（linear ion trap, LIT）是一种具有高效离子捕获和离子富集特点的质量分析器[12]。与三维离子阱不同，在单LIT或双LIT中，离子聚焦在一条线上，而非聚集在一个点上，有效避免了三维离子阱的固有缺陷[13‒15]。最终提高了离子捕获效率，削弱了空间电荷效应，大大提高了质谱分析的特异性和灵敏度[16]。然而，当分析复杂基质中目标物时，空间电荷效应仍然存在并影响质谱检测[17‒19]。因此，简便、高效、自动化而不损失灵敏度地进行临床样本中多种分析物的测定，仍然是LIT-MS的挑战。

四极杆质量分析器是一种动态质量过滤器，在质谱研究中具有众多优势，应用极其广泛。四极杆可单独或串联用以隔离目标离子。单四极杆质谱仪只能测量母离子或源内裂解产生的碎片离子，因此，单四极杆质谱提供的结构信息有限，特异性不如串联四极杆质谱。近年来，三重四极杆串联质谱（triple quadrupole, QqQ）广泛应用于定量分析，被称为“金标准”[5,9,20]。同时，线形四极杆具有稳定性好和使用简便等优点，为离子隔离提供了最有效的解决方案[13]。与单四极杆的局限性类似，QqQ只能提供二级质谱信息，无法区分复杂基质中的同分异构体。还有其他形式的串联质谱仪，如复合线形离子阱三重四极（QTRAP）[21]，QTRAP性能优越，但系统结构较为复杂。

本研究自主研制了一种四极杆-线形离子阱（quadrupole-linear ion trap, Q-LIT）串联质谱仪，可用于测量复杂样本中小分子疾病标志物（图1）。通过四极杆筛选功能，分离目标母离子，消除背景干扰，从而减少进入线形离子阱的离子数量，减弱了空间电荷效应，提高了灵敏度。在线形离子阱中进行母离子碎裂和子离子捕获，无需碰撞池，从而简化了仪器系统结构。同时，在线形离子阱中仍然可以实现多级碎裂（MS, n≥3，其中，n为碎裂级数），并通过精确离子操控实现高准确度定量分析。总之，Q-LIT既不依赖色谱分离，也不需复杂前处理，可显著提升复杂生物样品分析的通量和效率。

《图1》

图1 自主研制Q-LIT串联质谱仪示意图及其应用。LC：液相色谱（liquid chromatography）。

《2、 材料和方法》

2、 材料和方法

《2.1 试剂》

2.1 试剂

GAA、CRE、D2-GAA和D3-CRE标准品（纯度≥99%）购自Dr. Ehrenstorfer GmbH（德国奥格斯堡）。质谱级甲醇、乙腈和甲酸来自赛默飞世尔科技公司（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）。其他分析级化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司（中国北京）。新生儿干血斑GAA和CRE定量试剂盒（MS/MS法）由中国质谱生物科技有限公司提供。提取液为含0.05%甲酸的甲醇水（80∶20）。GAA和CRE的内标储备液是通过提取液溶解二者粉末混合物制备的，置于棕色玻璃瓶中，4 °C冰箱保存，至少可稳定保存30天。工作标准液用提取液将储备液按1∶110稀释配制，4 °C冰箱保存，最多稳定24 h。

《2.2 仪器设备》

2.2 仪器设备

Q-LIT V2串联质谱仪，由中国计量科学研究院前沿计量科学中心，国家市场监管技术创新中心（质谱）研制。

Q-LIT外观图和内部剖视图如图2（a）所示。仪器整机的长、宽、高分别为65 cm、55 cm、54 cm。关键部件包括四极杆和线形离子阱，如图2（b）所示。四极杆由四个圆柱电极组成，为不锈钢加工而成，场半径（r）为6 mm。每根杆分为三段，长度分别为20 mm、130 mm、20 mm。四极杆阵列的场半径均为5.31 mm。本研究中采用的线形离子阱的几何形状与已报道的相近[22‒23]。线形离子阱的长度为100 mm，x和y两对射频（RF）电极之间的半距离均为6.76 mm。在每个x电极的中心位置有一个宽0.28 mm、长70.0 mm的狭缝。

《图2》

图2 Q-LIT串联质谱仪外观和剖视图（a）关键部件（四极杆，线形离子阱）（b）的示意图。x电极间半距离为6.76 mm, y电极间半距离为6.76 mm，z轴长度为100.0 mm，狭缝长70.0 mm，宽0.28 mm。RF：射频（radio frequency）。

Q-LIT原理如图3（a）所示。利用两个电子倍增器，检测从线形离子阱发射出的离子。在x和y两对电极上分别使用了一个RF线圈，使用平衡的两相射频电压。采用自主开发的独立控制软件（TinyTrap，中国计量科学研究院）来控制Q-LIT系统。本仪器使用的氦气通过聚碳酸酯支架上的孔直接引入线形离子阱，以实现阱内高压。所有实验中，线形离子阱外的压力为2.67×10-3 Pa。四极射频频率为922 kHz，而LIT射频频率为1149 kHz。四极杆RF/直流电（direct current, DC）用于筛选母离子。交流电（alternating current, AC）辅助波形耦合到线形离子阱射频，并应用到x电极进行离子隔离、激发和共振激发。本实验中碰撞诱导解离（CID）的无量纲马修方程参数（q）值为0.40。根据已报道研究[24]，隔离和共振激发均选择q值0.83。Q-LIT串联质谱系统的扫描功能示意图如图3（b）所示，通过增加四极射频电压，母离子首先被分离，然后被捕获在LIT中，施加单频交流波形打碎母离子，最后，通过扫描LIT射频电压对子离子进行分析。

《图3》

图3 （a）Q-LIT原理图：（i）毛细管，（ii）管透镜，（iii）离子提取透镜，（iv）短方四极，（v）长方四极，（vi）三段四极杆，（vii）线形离子阱，（viii）电子倍增器，（ix）气体入口，（x）涡轮分子泵，（xi）机械泵。（b）Q-LIT扫描功能。CID：碰撞诱导解离；AC：交流电。

在性能测试实验中，将校正液以10 μL·min-1的流速通过注射泵注入Q-LIT以验证质量范围。将利血平溶液以10 μL·min-1的流速注入Q-LIT，改变扫描速度测试分辨率。通过共振激发进行碰撞诱导解离，观察利血平（m/z 609.30）子离子（m/z 448.05和397.19）质谱图并进行优化。通过改变离子富集时间，观察到利血平离子峰的质量位移和峰宽变化，表明Q-LIT可以有效地降低空间电荷效应。

《2.3 应用》

2.3 应用

Q-LIT在选择反应监测模式（single reaction monitoring, SRM）下，采用正离子电喷雾电离模式对干血斑中的GAA和CRE进行分析。离子源条件：离子源温度为120 °C，吹扫气（氮气）压力为3.45×103 Pa，大气接口温度为305 °C，辅助气（氮气）压力为1.38×103 Pa；鞘气（氮气）压力为6.89×104 Pa，毛细管电压为4.9 kV。GAA和D2-GAA离子富集时间为1800 ms，CRE和D3-CRE离子富集时间为150 ms。优化四极杆射频和离子阱射频，从而尽可能提高灵敏度。母离子、子离子和SRM参数，包括四极杆射频和离子阱射频，如附录A中的表S1所示。使用流动注射分析（FIA）检测GAA和CRE，无色谱柱分离，通过流速改变（附录A中的表S2）形成面包峰，流动相为甲醇/水（80:20, V/V，含0.05%甲酸），进样量为5.0 μL，进样室温度为4 °C。

样品前处理：质控样品和干血斑样品进行打孔，每个样品的直径约为3.2 mm。将每个打孔得到的样品转移到一个干净的96孔板上。每孔加入100 μL工作液，45 °C振荡45 min，转速为750 r∙min-1。收集提取液75 μL，采用FIA-Q-LIT串联质谱检测，进样量为5.0 μL。

采用上述方法对质控品和77个实际样品进行分析。

《3、 结果和讨论》

3、 结果和讨论

《3.1 性能测试》

3.1 性能测试

采用Q-LIT测试质荷比（m/z）已知化合物，验证质量范围。该校正溶液中含有质量范围为m/z 195~2022的化合物。在射频扫描过程中，偶极辅助交流电压（405.9 kHz）的幅值从0.21 V提高到8.20 V，促进离子的有效逐出，质量范围在m/z 48~2000之间。图4（a）为扫描速度12 180 amu·s-1的质谱图，在m/z 2000以内，半峰宽小于0.8 amu。

《图4》

图4 （a）Q-LIT扫描校正液的质谱图，扫描范围达m/z 2000；（b）利血平（m/z 609.30）半峰宽，Q-LIT扫描速度与半峰宽的变化关系；（c）Q-LIT获得的利血平二级子离子质谱图，碎裂效率为64%。FWHM：半峰宽（full-width peaks at half-maximum）。

提高Q-LIT质量分辨率的常用方法是降低扫描速度。考虑到在固定质量范围内，基于射频电压的增量数量增加，分离相邻质荷比离子所需时间增加，这些离子在其稳定阈值处会被一起逐出。研究了扫描速度对分辨率的影响，在400~12 000 amu·s-1的不同扫描速度下，采集利血平的质谱图，绘制峰宽与扫描速率关系的函数，如图4（b）所示。质量分辨率随着扫描速度降低而增加，当扫描速度为1218 amu·s-1，利血平半峰宽可达0.28 amu。

研究了离子筛选和碎裂效率。四极杆选择母离子，优化了q值0.25、0.30、0.35、0.40、0.45和0.50，q值为0.30时解离效率最高。因此，在q = 0.30时，CID被共振激发，在碎裂离子的低质量截止点和径向赝势阱深之间提供了良好的平衡。利血平（m/z 609.30）子离子质谱图如图4（c）所示。激活时间为50 ms，CID效率为64%。

《3.2 空间效应》

3.2 空间效应

与相同截面积的三维离子阱相比，二维离子阱的z向延伸使捕获的离子体积增大[8]。当离子从二维离子阱（如线形离子阱）中被逐出时，离子云沿着z轴扩散[22,25]，离子不会像在三维离子阱中聚集成直径约为1 mm的球体[26]。本研究使用利血平测试Q-LIT降低空间电荷效应的效果。如图5所示，隔离或碎裂前的离子（红线，未隔离）受空间电荷影响较大。空间电荷通常是通过隔离目标母离子来解决的。为了表征空间电荷对自研Q-LIT串联质谱仪的影响，我们对四极滤质器和线形离子阱两种隔离方法进行了比较。使用1.0 μg·mL-1的利血平标准溶液，根据捕获离子的数量测量质量分辨率、质量位移和响应强度。如图5（a）所示，在不损失质量分辨率的情况下，线形离子阱隔离时间可以从0.1 s提高到0.8 s，四极杆隔离时间从0.1 s提高到0.4 s。当四极杆隔离时间为0.6 s时，分辨率先下降约100，然后保持不变。当离子阱隔离时间从1.0 s增加到8.0 s，分辨率不断下降200。此外，通过隔离可以有效地改善质量漂移，如图5（b）所示。例如，两种分离方法在0.1~8.0 s时，质量偏移均约为0.38 amu。另外，图5（c）定量表征了空间电荷效应引起的响应强度变化。从0.1 s到0.8 s，随着离子注入时间的增加，离子阱隔离的响应强度逐渐增大，当离子注入时间大于0.8 s时，响应强度急剧下降。离子注入时间小于7 s时，四极杆隔离的响应强度一直在逐渐增加。在100 μg·mL-1的蛋氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸（MRFA）溶液（m/z 524.56）中添加10 ng·mL-1利血平，检测利血平，也得到了类似的结果。因此，对于离子阱动态范围内的相对纯溶液分析，离子阱的存储波形反傅里叶变换（SWIFT）分离在分辨率和响应强度上优于四极杆隔离，且质量偏移与四极杆隔离相同。然而，在复杂基质分析中，如在2 mL干血斑提取液中加入20 ng利血平（其浓度为10 ng·mL-1），离子阱隔离会受到强烈基质干扰的影响，从而直接导致空间电荷效应，完全无法检出利血平。而四极杆隔离可有效检出，且响应强度随着离子注入时间增加而继续增加，如图5（d）所示。以上结果表明，对于复杂的样品基质，实际样品的基质效应过大，单离子阱分析容易产生空间电荷效应。此外，实际样品中目标化合物浓度未知，需要较大的线性动态范围。因此，Q-LIT具有优势，可以选择性地将母离子从复杂基质样品中分离出来，以减少基质干扰和空间电荷效应，同时可免除复杂样品的色谱分离，从而简化前处理过程。

《图5》

图5 Q-LIT串联质谱的空间电荷研究（利血平，正离子m/z 609.30）。（a）由空间电荷效应引起的利血平标准液的质量分辨率的变化；（b）由空间电荷效应引起的利血平标准液的质量偏移；（c）利血平标准溶液的质量强度随离子注入时间的增加而变化；（d）干血斑中添加10 ng·mL-1利血平的响应强度随离子注入时间而变化。

《3.3 应用》

3.3 应用

质谱作为分析方法中的金标准，在新生儿筛查和其他领域应用中具有重要意义[7]。在Q-LIT V2串联质谱分析中，首先在四极杆中选择目标物母离子，同时在线形离子阱中注入、捕获、碎裂获得并富集目标子离子。多级碎裂离子直接被一起富集。每个分析物选择一个离子对，GAA、D2-GAA、CRE和D3-CRE的子离子分别为m/z 101.12、103.12、90.11和93.10。如图6和图7所示，GAA和D2-GAA的母离子分别为m/z 118.11和m/z 120.09，丢氨（NH3）产生的子离子分别为m/z 118.11和m/z 120.09 [27]。CRE和D3-CRE的质谱图也反映了这一现象，但信号响应不足，明显低于CRE的m/z 90.11离子和D3-CRE的m/z 93.10离子，如附录A中的图S1和S2所示。这些子离子的形成过程被认为丢失氰胺基团（CN2H2）。此外，如图6所示，未经四极杆选择而直接进入LIT的母离子在离子阱中引起空间电荷效应问题。然而，四极杆选择的母离子会大大降低空间电荷效应，如图7所示。最后，对相应的管透镜、离子导引Q0直流偏压、预四极PreQ直流偏压和杆ROD的直流偏压进行了优化，以提高检测灵敏度，如附录A中的图S3所示。

《图6》

图6 未经四极杆筛选而直接注入线形离子阱的离子质谱图。（a）GAA标准溶液的所有离子质谱图；（b）GAA的碎裂离子质谱图；（c）D2-GAA标准溶液的所有离子质谱图；（d）D2-GAA的碎裂离子质谱图。[M+H]+：母离子。

《图7》

图7 经过四极杆筛选后注入线形离子阱的离子质谱图。（a）GAA的母离子质谱图；（b）GAA的碎裂离子质谱图；（c）D2-GAA的母离子质谱图；（d）D2-GAA的碎裂离子质谱图。

FIA-ESI-MS/MS方法被广泛用于测定不同生物基质中的多种生物标志物[7,28]。由于FIA-ESI-MS/MS方法对每个样品的分析时间仅为1.0~2.5 min，如附录A中的表S3所示，因此该方法在多种疾病的高通量筛查中具有很大的潜力。FIA-ESI-MS/MS方法已被用于分析和检测临床样本中的氨基酸、酰基鸟嘌呤、CRE、GAA以及其他生物标志物[27,29‒30]。为了提高灵敏度，一些目标物通常衍生为丁基酯，如氨基酸、GAA、CRE和25-羟基维生素D [27,31‒32]。Carducci等[27]率先建立了FIA-ESI-MS/MS法，即1.0 min测定干血斑提取物中GAA和CRE的方法。然而，该方法使用衍生化法，前处理步骤烦琐且耗时。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）也广泛用于检测GAA和CRE，但耗时5~10 min [5,33]。本研究开发的FIA-ESI-Q-LIT方法的总采集时间为1.5 min，使得分析快速且高效。与液相色谱方法相比，所需的时间减少了三倍以上。此外，与文献报道的用于检测GAA和CRE的FIA-ESI-MS/MS方法相比[27]，我们建立的方法无需衍生化，用于质谱分析的样品制备只需要一步固液萃取。综上所述，FIA-ESI-Q-LIT方法适用于新生儿GAMT和AGAT疾病的高通量筛查。

在最佳实验条件下（附录A中的表S1和S2），对Q-LIT V2方法的线性范围、灵敏度、准确性和平方回归系数进行了验证。在1.20~9.84 μmol·L-1范围内，GAA的线形相关系数（R2）为0.9908。CRE在122.05~656.76 μmol·L-1范围内，R2为0.9902。全血中GAA的加标浓度为3.0 μmol·L-1和8.0 μmol·L-1，CRE的加标浓度为150.0 μmol·L-1和300.0 μmol·L-1时，平均回收率为112.4%~119.9%，变异系数≤7.73%。此外，低质控和高质控重复测定10次，用日内精密度评估方法重复性，低质控的GAA和CRE日内精密度分别为6.38%和8.19%，而高质控的日内精密度分别为6.88%和8.40%。当信噪比为3时，GAA和CRE的检出限分别为0.35 nmol·L-1和0.07 nmol·L-1，信噪比为10时，定量限分别为1.0 nmol·L-1和0.2 nmol·L-1。此外，使用美国赛默飞世尔科技公司的TSQ Altis质谱仪，方法如附录A中的表S5所示，验证数据列于附录A中的表S4，表明Q-LIT和TSQ Altis的灵敏度、线性、质控和回收率具有同等水平。虽然Q-LIT的重复性满足临床要求，但对其稳定性仍需在未来进行深入研究。

方法验证后，对77例实际样品进行分析。这些实际样本是人干血斑。采用Q-LIT V2和TSQ Altis对样品进行检测。Q-LIT V2检测结果与TSQ Altis检测结果一致，Q-LIT检测结果均在TSQ Altis结果均值±标准差范围内。详细结果见附录A中的表S6。此外，提取离子质谱图和FIA色谱图见图8。通过多例真实临床样本的检测，表明Q-LIT V2具有良好的定性和定量能力。

《图8》

图8 FIA-ESI-Q-LIT检测真实干血斑样本所得提取离子质谱图和色谱图。（a）GAA；（b）CRE；（c）D3-CRE；（d）D2-GAA。

《4、 结论》

4、 结论

自主研制Q-LIT串联质谱可用于临床生物标志物分析。对其质量范围、扫描速度和碎裂效率进行了评估。实验结果表明，该技术可以减少进入LIT的离子数量，有效降低空间电荷效应。此外，该技术还解决了液相色谱法样品分析过程复杂、耗时的缺点。本文所开发和验证的FIA-ESI-Q-LIT方法也可以作为一种快速、简单、可靠的工具，应用于复杂临床基质中痕量或超痕量化合物的定量分析。