基于液滴微流控的分级结构反蛋白石多孔支架用于仿生三维细胞共培养

邵长敏 ,  刘羽霄 ,  池俊杰 ,  叶方富 ,  赵远锦

工程（英文） ›› 2021, Vol. 7 ›› Issue (12) : 1778 -1785.

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工程（英文） ›› 2021, Vol. 7 ›› Issue (12) : 1778 -1785. DOI: 10.1016/j.eng.2020.06.031

基于液滴微流控的分级结构反蛋白石多孔支架用于仿生三维细胞共培养

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Hierarchically Inverse Opal Porous Scaffolds from Droplet Microfluidics for Biomimetic 3D Cell Co-Culture

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摘要

三维（3D）细胞培养具有更好地模拟天然组织特异性的优势，在药物开发、毒性测试和组织工程中发挥着重要作用。然而，现有的3D细胞培养的支架或微载体通常尺寸有限，并且在模拟生物体内血管复合体方面表现不佳。因此，本研究提出了一种通过简单的微流控方法制备的新型分级结构反蛋白石多孔支架，用于促进3D细胞共培养。该支架是基于微流控乳液液滴模板和惰性聚合物聚合的复合概念构建的。研究结果表明，该支架能够保证细胞培养过程中的营养供给，从而实现大面积的细胞培养。此外，通过在该支架中连续种植不同的细胞，本文还开发了内皮细胞包裹肝细胞的3D细胞共培养系统，用于构建功能化组织。研究结果表明，该支架用于细胞共培养系统，有助于维持肝细胞特定的体内功能。该分级结构反蛋白石多孔支架为3D细胞培养甚至仿生组织的构建奠定了基础。

Abstract

With the advantages of better mimicking the specificity of natural tissues, three-dimensional (3D) cell culture plays a major role in drug development, toxicity testing, and tissue engineering. However, existing scaffolds or microcarriers for 3D cell culture are often limited in size and show suboptimal performance in simulating the vascular complexes of living organisms. Therefore, we present a novel hierarchically inverse opal porous scaffold made via a simple microfluidic approach for promoting 3D cell co-culture techniques. The designed scaffold is constructed using a combined concept involving an emulsion droplet template and inert polymer polymerization. This work demonstrates that the resultant scaffolds ensure a sufficient supply of nutrients during cell culture, so as to achieve large-volume cell culture. In addition, by serially planting different cells in the scaffold, a 3D co-culture system of endothelial-cell-encapsulated hepatocytes can be developed for constructing certain functional tissues. It is also demonstrated that the use of the proposed scaffold for a co-culture system helps hepatocytes to maintain specific in vivo functions. These hierarchically inverse opal scaffolds lay the foundation for 3D cell culture and even the construction of biomimetic tissues.

关键词

微流控 / 反蛋白石 / 细胞培养 / 液滴 / 生物材料

Key words

Microfluidics / Inverse opal / Cell culture / Droplet / Biomaterial

引用本文

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邵长敏,刘羽霄,池俊杰,叶方富,赵远锦. 基于液滴微流控的分级结构反蛋白石多孔支架用于仿生三维细胞共培养[J]. 工程（英文）, 2021, 7(12): 1778-1785 DOI:10.1016/j.eng.2020.06.031

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1. 引言

三维（3D）细胞培养能够在培养过程中为细胞提供更接近体内生存条件的微环境[1-5]。同时，3D 培养中的细胞可以通过紧密连接或间隙连接在细胞之间以及细胞与细胞外基质之间建立连接，形成类似于体内细胞生长的3D结构[6-9]。因此，3D细胞培养不仅可以保留体内细胞微环境的物质结构基础，还可以体现细胞培养的直观性和条件可控性。这些优势促使3D细胞培养快速发展，并在各个领域（如组织工程、生物制药加工、毒性测试等）中广泛应用[10-16]。目前，3D细胞培养的最大局限在于：由于培养面积过大造成的营养供应不足，内部细胞在堆积过程中容易发生坏死。而由于丰富的微血管和微循环，这种坏死情况在体内是不会发生的。受这种现象的启发，诸多多孔材料或微通道已被构建用于3D细胞培养[17-22]。然而，由于缺乏有效的营养运输通道，大多数多孔材料通常尺寸太小，无法防止细胞坏死[23-25]。此外，传统的多孔材料无法有效模拟生物体内血管复合物的3D结构。因此，开发具有更复杂结构的新型多孔材料以实现3D细胞培养仍然值得期待。

本研究提出了一种通过液滴微流控方法制备的新型分级结构反蛋白石多孔支架（图1）。反蛋白石支架由于具有可控制的孔隙大小和从模板中继承的均匀孔隙而备受关注，其中模板中的孔隙是由密堆积的单分散微球或液滴晶格组成的[26-29]。同时，由于出色的流体控制能力，微流控技术能够为不同的应用，如微球模板或反蛋白石支架的液滴晶格制备高度单分散的乳剂[30-36]。基于3D结构特征，反蛋白石支架已广泛应用于光学材料、生物传感器、细胞支架等的构建[37-39]。然而，由于孔隙填充结构简单，且支架成分单一，目前使用反蛋白石支架进行3D血管化的研究仍然很少。

图1 （a）分级结构反蛋白石多孔支架的制备示意图；（b）3D细胞共培养示意图。

因此，通过乳液液滴模板和惰性聚合物聚合的复合概念，本研究构建了一种分级结构反蛋白石多孔支架，实现了3D血管的整合。在本文中，我们证明了所制备的支架在细胞培养过程中能够保证充足的营养供应，从而实现细胞的大面积培养。此外，通过在该支架中连续种植不同的细胞，本文还建立了内皮细胞包裹肝细胞的3D共培养系统，用于构建特定的功能组织。这种共培养系统能够促进较高水平的白蛋白和细胞色素P450（CYP450）的分泌，表明该支架中的共培养系统有助于维持肝细胞的活性和功能。这些特性使该分级结构反蛋白石多孔支架可作为理想的仿生支架用于组织工程和其他生物学研究。

2. 材料和方法

2.1. 材料

甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）由本实验室自行合成[40]。明胶（猪皮）、甲基丙烯酸酐、聚环氧乙烷（PEO，平均分子量为900 000）、光引发剂2-羟基-2-甲基丙烯酮（HMPP）、疏水剂十八烷基三氯硅烷（OTS）、聚（乙二醇）嵌段-聚（丙二醇）嵌段-聚（乙二醇）（F108）和十二烷基硫酸钠（SDS）均从美国Sigma-Aldrich公司获得。去离子水来自于Milli-Q纯水机，其他试剂均为分析级。

2.2. 分级结构反蛋白石支架的制备

通过乳液模板牺牲法制备分级结构反蛋白石支架。简单地说，将内相管和外相管在一个方管中进行组装，得到微流控装置。其中，内相管是一个由微电极拉制器（P-97, Sutter, USA）制备的尖端直径为80 μm的玻璃毛细管，并用OTS进行疏水处理。该微流控装置在组装后用AB胶加固密封。内相为甲基硅油，外相为GelMA/PEO溶液。内相和外相的典型流速分别为0.4 mL∙h-1和2 mL∙h-1。实验前将GelMA（质量分数为20%）和PEO（质量分数为1.5%）水溶液以4∶1的体积比混合，制备外相溶液。同时，在外相溶液中加入SDS（2%，表面活性剂）、F108（2%，表面活性剂）和HMPP（1%，光引发剂）。然后通过微蠕动泵（Harvard PHD 2000, Harvard Apparatus, USA）将相应的液体引入装置中，甲基硅油在内相管的出口被GelMA/PEO水溶液剪切成液滴。液滴自组装成六方密堆积结构后，外相溶液在紫外线下聚合。利用正己烷和乙醇进行至少5次超声去除油滴，最终得到第一分级结构的反蛋白石GelMA/PEO支架。之后，将制备的GelMA/PEO支架浸泡在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中至少48 h，从光交联的GelMA水凝胶中去除PEO相。为了观察PEO在水凝胶中的渗出，将PEO分子与异硫氰酸荧光素（FITC）分子偶联，进行PEO浸出试验。简而言之，将FITC（10 mmol∙L-1）与1.5% PEO溶液的混合溶液透析一周后冻干。按照上述方法得到聚合的GelMA/PEO水凝胶，然后放入PBS中。使用酶标仪（Synergy HT, BioTek, USA）测定水凝胶中释放的PEO的吸光度。最后，PEO从支架中渗出后生成二级结构的反蛋白石GelMA/PEO支架。

2.3. 细胞培养

将人肝癌细胞（HepG2，上海细胞库）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC，中国通派生物科技有限公司）培养在配制的培养基（DMEM高糖培养基+10%的胎牛血清+1%的青霉素和链霉素）中。将所有细胞置于二氧化碳（CO2）培养箱（Heracell 150, Thermo, USA）中，在37 °C、5% CO2条件下培养。将GelMA/PEO支架浸泡在浓度为75%的酒精中，并放置于超净台紫外线下消毒至少4 h。然后用PBS清洗支架三次后，将其转移到六孔板（Corning, USA）。将浓度为6 × 105 个细胞∙mL-1的HUVEC悬浮液50 μL种植于支架顶部，然后缓慢加入2 mL培养基。实验过程中每天更换培养基。用5 μmol∙L-1的calcein-AM（Molecular Probes, USA）染色细胞，观察细胞生长情况。在细胞共培养实验中，首先将6 × 105 个细胞∙mL-1的HUVEC种植于支架，然后将HepG2细胞（5 × 105 个细胞∙mL-1）接种到支架中进行共培养。采用5 μmol∙L-1的calcein-AM和 5 μmol∙L-1的DiD（Molecular Probes, USA）分别对HepG2和HUVEC进行染色，观察细胞在支架中的分布。采用MTT法测定细胞增殖率。简单来说，将支架置于24孔板中，加入MTT含量为10%的培养基。在培养箱中孵育4 h后，移走液体，然后加入500 μL的二甲亚砜使晶体溶解。用酶标仪测定吸光度（OD）。用大鼠白蛋白酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Abcam, UK）测定白蛋白含量。采用人CYP450 3A4酶联免疫吸附测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）检测CYP450活性。

2.4. 表征

微流控液滴的生成用显微镜（AE2000, Motic, China）和串联的相机（S-PRI F1, AOS Technologies AG, Switzerland）记录。利用光学显微镜（Olympus BX51, Japan）和场发射扫描电子显微镜（SEM, S-300N, Hitachi, Japan）对制备的支架结构进行表征。利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM, Olympus FV10i）对细胞进行观察。

3. 结果和讨论

在本实验中，采用微流控技术制备的水包油（O/W）单乳液液滴作为模板，制备分级结构反蛋白石支架，如图1 所示。选用GelMA和PEO混合溶液作为分级结构反蛋白石支架的骨架材料。GelMA是一种生物相容性良好的水凝胶，在3D细胞培养和组织工程领域有着广泛的应用[41-43]。同样，由于PEO具有生物相容性、惰性和易于修饰等优点，在水凝胶支架材料的制备中常被用作致孔剂[44-45]。在此背景下，我们将GelMA和PEO的混合物置于微流控装置中，然后去除PEO组分，制备出分级结构反蛋白石支架。

在本实验中，将玻璃毛细管同轴组装在一个载玻片上，制成了一个玻璃微流控装置。内相管用于引入分散相（如甲基硅油），外相管用于引入连续相（如GelMA与PEO混合溶液），最外侧的方形毛细管用于记录液滴在线生成过程。如图2（a）所示，甲基硅油在内相管出口被GelMA/PEO溶液乳化成液滴。通过调节两相溶液的流速，可以控制产生的液滴大小和支架对应的孔径。结果表明，随着分散相流速的增加，液滴直径明显增大，而连续相速率与液滴直径呈相反关系[图2（b）]。

图2 微流控制备的液滴模板。（a）不同内相流速下液滴在线生成图像（标尺为500 μm）；（b）液滴直径与流速的关系（n = 3）（F1：外相流速，黑色方块；F2：内相流速，红色三角形）；（c）自组装的液滴模板（标尺为200 μm）；（d）液滴粒径分布（变异系数为4.35%）。

如图2（c）、（d）所示，生成的液滴尺寸均匀、球形度良好、单分散性高，是制备反蛋白石支架的理想模板。液滴组装成六方密堆积结构后，再将预凝胶溶液聚合，通过正己烷和乙醇洗去油相，最终得到了分级结构反蛋白石支架的第一个层次结构（即均质的大孔结构）。利用光学显微镜和SEM对制备的GelMA/PEO支架进行观察，如图3所示。观察发现，GelMA/PEO支架具有均匀且相互连通的大孔结构[图3（a）]。此外，相邻的孔洞通过多个均匀的窗口相互连接，有利于细胞长期培养过程中营养物质的运输和废物的排出[图3（b）]。

图3 分级结构反蛋白石多孔支架的结构表征。（a）支架第一级结构的光学显微镜图像；（b）支架第一级结构的 SEM 图像；（c）GelMA/PEO水凝胶第二级结构的3D重建荧光图像；（d）GelMA/PEO水凝胶第二级结构的SEM图像。（a）~（d）标尺分别为 200 μm、200 μm、100 μm、10 μm。

通过上述方法制备反蛋白石支架的第一级结构后，将生成的GelMA/PEO支架在PBS中浸泡至少48 h，去除固化的GelMA水凝胶中的PEO，形成第二级结构。为了观察PEO在水凝胶中的渗出情况，将PEO分子与FITC分子偶联，进行PEO浸出试验。结果发现，随着时间的推移，PEO逐渐渗出，48 h后吸光度变化趋于平缓（见附录A中的图S1）。通过SEM和CLSM的3D重建，观察合成的多孔微观结构。结果表明，PEO渗出后产生了二级微孔结构[图3（c）、（d）]。这些多孔网络结构能够大大缩短细胞之间的距离，保证在大面积和长期细胞培养过程中充足的氧气和营养物质的运输。

为了模拟体内血管网络的结构，将制备的支架用于培养HUVEC。首先，我们研究了材料的生物相容性。具体来说，HUVEC分别与GelMA水凝胶和GelMA/PEO复合膜共培养1 d、3 d、5 d和7 d，然后用calcein-AM染色后经CLSM观察。如附录A中的图S2所示，HUVEC在GelMA水凝胶和GelMA/PEO复合膜中增殖良好，与MTT法的定量结果一致。这些结果表明制备的支架材料具有理想的细胞生物相容性。

随后，为了验证支架在3D细胞培养中的性能，在第1、3、5、7和15天，通过CLSM对由上述两种材料制备的支架中的HUVEC的增殖进行定性观察，并通过MTT法定量评估（图4）。结果表明，前3天细胞在两个支架中增殖均良好。然而，3 d后，GelMA支架中的细胞增殖明显小于GelMA/PEO支架。这是由于传统支架在体外长期培养过程中，支架内缺乏氧气和营养物质，细胞容易坏死，而我们的分级结构反蛋白石支架能够克服这一限制。此外，在两种支架上生长的细胞形态也有明显差异。如附录A中的图S3所示，与GelMA支架中生长的细胞相比，GelMA/PEO支架中生长的细胞更容易黏附在支架壁上，呈梭形形态。这些结果表明，与普通无孔的GelMA支架相比，GelMA/PEO支架能有效促进细胞的生长、黏附、增殖和迁移，原因是分级的多孔结构更有利于细胞所需的氧气和营养物质的运输。

图4 （a）~（d）CLSM 3D重建荧光图像（标尺为200 μm）。（a）、（b）GelMA支架中生长的HUVEC；（c）、（d）GelMA/PEO支架中生长的 HUVEC；（e）MTT法检测在GelMA和GelMA/PEO支架中培养的HUVEC的增殖（***p < 0.001, n = 3）。

基于GelMA/PEO支架在3D细胞培养中的优越性能，本研究构建了一种新型的3D仿生血管网络，该血管网络对于研究大面积细胞培养中复杂的细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用具有重要意义。为此，将HUVEC均匀接种于 GelMA/PEO支架中，通过calcein-AM染色后经CLSM和SEM进行观察（见图5和附录A中的图S4），可以观察到细胞均匀地生长于支架的孔洞中。如图5所示，接种后第一天，细胞均匀分布于支架的整个表面，并主要在支架的骨架上拉伸。在培养的过程中，细胞占据了大部分孔隙空间，形成了3D细胞网络。此外，通过CLSM层扫观察内部细胞的生存能力（见附录A中的图S5）。结果发现，支架中的细胞在不同深度和位置均生长良好，这解决了传统支架在大面积细胞培养过程中由于缺氧气和营养，内部细胞容易坏死的问题。因此，改进支架的微观结构可以使细胞均匀分布于分级结构的GelMA/PEO支架中，同时防止支架内细胞坏死，促进细胞与细胞之间的信号传导。

图5 在GelMA/PEO支架中培养的HUVEC的CLSM图像（标尺为200 μm）。（a）第1天、（b）第3天、（c）第7天：（i）荧光图像、（ii）明场图像、（iii）叠加图像。

为了进一步开发所制备的分级结构GelMA/PEO支架的功能，通过依次将不同细胞植入支架中，实现了内皮细胞包裹肝细胞的3D多层细胞共培养系统（图6）。将HUVEC和HepG2细胞植入支架中进行培养。为了检测细胞在支架中的生长状态，分别用DiD细胞标记液（红色）和calcein-AM（绿色）对HUVEC和HepG2细胞进行染色。利用CLSM获得支架中共培养细胞的图像[图6（a）]。结果表明，接种到支架上的两种细胞在共培养过程中均表现出良好的活性，从细胞共培养系统的侧面也可以看出两个细胞是分层的。

图6 （a）培养7 d后，HUVEC（红色）和HepG2细胞（绿色）在GelMA/PEO支架中共培养的CLSM图像：（i）HUVEC；（ii）HepG2；（iii）叠加图像；（iv）侧视图（标尺为100 μm）。（b）GelMA和GelMA/PEO支架中与HUVEC共培养的HepG2细胞的白蛋白分泌和CYP450的表达情况（*p < 0.05, **p < 0.01, n = 3）。

最后，本研究检测了肝细胞与HUVEC共培养后与肝脏相关的酶的分泌水平，白蛋白和CYP450是肝细胞培养中细胞生理学的关键参数。结果表明，与普通的GelMA支架相比，在GelMA/PEO支架中肝细胞和HUVEC共培养分泌了更高水平的白蛋白和CYP450 [见图6（b）、（c）及附录A中的图S6]。GelMA/PEO支架共培养肝细胞的白蛋白分泌量和CYP450表达量分别是普通GelMA支架共培养肝细胞的1.36倍和1.17倍。这些结果表明，在GelMA/PEO支架中共培养的肝细胞在培养过程中能够保持酶活性，且表现出比GelMA支架更高的酶活性。本研究制备的GelMA/PEO支架的这些特点使其在组织工程领域具有广阔的应用前景。

4. 结论

总之，本研究提出了通过简单的微流控方法制备一种分级结构的反蛋白石多孔支架促进3D细胞培养。该支架的设计采用了一种复合概念，包括乳液滴模板和惰性聚合物聚合。结果表明，设计的支架在细胞增殖过程中保证了充足的营养供应，从而实现了细胞的大面积培养。此外，通过在支架中连续接种不同的细胞，建立了内皮细胞包裹肝细胞的3D共培养体系，构建了具有一定功能的肝细胞组织。这种共培养系统促进了较高水平的白蛋白和CYP450的分泌，表明支架中的共培养系统有助于维持肝细胞的活性和功能。该支架将为体外构建类器官提供了新的思路。

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