新型冠状病毒HCoV-19 S蛋白与人ACE2蛋白表面糖链和独特翻译后修饰的质谱分析

工程（英文） ›› 2021, Vol. 7 ›› Issue (10) : 1441 -1451. DOI: 10.1016/j.eng.2020.07.014

孙泽宇 ^a ,
任科燚 ^a ,
张兴 ^b ,
陈景华 ^b ,
姜正一 ^a ,
江静 ^a ,
季飞洋 ^a ,
欧阳晓希 ^a ,
李兰娟 ^a

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Mass Spectrometry Analysis of Newly Emerging Coronavirus HCoV-19 Spike Protein and Human ACE2 Reveals Camouflaging Glycans and Unique Post-Translational Modifications

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摘要

当下新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的国际大流行促使全球科学家努力尝试揭秘新冠病毒HCoV-19的生物学特性。质谱分析（MS）发现，在HCoV-19 S蛋白的21个潜在糖基化修饰位点中，有20个位点完全被N-糖链占据，其糖型以低聚甘露糖为主。人血管紧张素转换酶2（hACE2）的7个糖基化位点完全被复合型N-糖链占据。然而，糖基化修饰并不能直接影响HCoV-19 S蛋白与hACE2之间的结合亲和力。另外，我们还发现了S蛋白和hACE2的多个甲基化修饰位点，以及hACE2的多个羟脯氨酸修饰位点。通过在最近发表的冷冻电镜（cryo-EM）结构的基础上加入N-糖链和蛋白质翻译后修饰（PTM），我们构建了HCoV-19 S蛋白和hACE2的精细结构模型。本研究揭示的HCoV-19 S蛋白和hACE2的PTM及糖基化图谱为研究病毒的宿主黏附、免疫反应，以及相关药物和疫苗的研发提供了更多的蛋白质结构细节。

Abstract

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has led to worldwide efforts to understand the biological traits of the newly identified human coronavirus (HCoV-19) virus. In this mass spectrometry (MS)-based study, we reveal that out of 21 possible glycosites in the HCoV-19 spike protein (S protein), 20 are completely occupied by N-glycans, predominantly of the oligomannose type. All seven glycosylation sites in human angiotensin I converting enzyme 2 (hACE2) were found to be completely occupied, mainly by complex N-glycans. However, glycosylation did not directly contribute to the binding affinity between HCoV-19 S protein and hACE2. Additional post-translational modification (PTM) was identified, including multiple methylated sites in both proteins and multiple sites with hydroxylproline in hACE2. Refined structural models of HCoV-19 S protein and hACE2 were built by adding N-glycan and PTMs to recently published cryogenic electron microscopy structures. The PTM and glycan maps of HCoV-19 S protein and hACE2 provide additional structural details for studying the mechanisms underlying host attachment and the immune response of HCoV-19, as well as knowledge for developing desperately needed remedies and vaccines.

关键词

N-糖基化 / COVID-19 / 棘突蛋白 / hACE2 / 蛋白结构

Key words

N-glycosylation / COVID-19 / Spike protein / hACE2 / Structure

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孙泽宇,任科燚,张兴,陈景华,姜正一,江静,季飞洋,欧阳晓希,李兰娟. 新型冠状病毒HCoV-19 S蛋白与人ACE2蛋白表面糖链和独特翻译后修饰的质谱分析[J]. 工程（英文）, 2021, 7(10): 1441-1451 DOI:10.1016/j.eng.2020.07.014

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1. 引言

自2019年12月暴发的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）已成为全球卫生领域的重大事件[1,3]。该疾病是由一种新发现的β-冠状病毒HCoV-19（也称为SARS-CoV-2）引起的。该病毒与严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）密切相关。与SARS病毒一样，HCoV-19病毒会引起下呼吸道感染（LRTI），最终可能发展为需要重症监护和机械通气的非典型肺炎[4,6]。与SARS-CoV相比，HCoV-19具有更强的传染性，在全球范围内会有更多的感染人群，因此死亡人数更多[4‒5]。虽然研究表明HCoV-19可能存在包括蝙蝠和穿山甲在内的多个中间宿主[3,7]，但仍需更多的研究来阐明其确切的病毒来源和传播途径[8,10]。迄今为止，还未出现针对冠状病毒感染（包括HCoV-19）的特效疫苗或药物。

与SARS-CoV相似，由HCoV-19 S基因编码的病毒表面棘突糖蛋白（S蛋白）对靶细胞的黏附和融合过程至关重要[11,13]。鉴于S蛋白在COVID-19发病机制中的重要性及其对疫苗开发的潜在免疫原性，在首个HCoV-19序列发表后不久，全球范围内多个研究组开始致力于阐明S蛋白的结构[1,13‒14]。HCoV-19 S糖蛋白是一种由1273个氨基酸构成的前体多肽，它可被宿主细胞蛋白酶（组织蛋白酶L，TMPRSS2）切割成含连接宿主受体——人血管紧张素I转换酶2（hACE2）——受体结合结构域（RBD）的S1片段，以及负责随后细胞膜融合的S2片段[1,12‒13]。S蛋白被预测含有一个可切割的N端信号序列（1~15），它可将S蛋白导向内质网（ER），并在病毒颗粒包装之前进行广泛的聚糖修饰。

糖基化修饰是许多病毒棘突蛋白或包膜蛋白中最重要的翻译后修饰（PTM）类型之一，且被证明可介导细胞附着、免疫反应以及病毒粒子包装和出芽过程[15,24]。各类冠状病毒与其各自受体的结合被证明是由S蛋白寡甘露糖N-糖链介导的[19‒20,23]。此外，C型凝集素DC-SIGN和L-SIGN可通过与S蛋白糖链结合来促进病毒入侵[25‒26]。因此，通过干扰蛋白质糖基化或基于聚糖的相互作用可设计许多抗病毒策略[21,24,27‒28]。糖基化也被认为是开发有效疫苗的关键因素[29‒30]。

SARS-CoV冠状病毒的棘突蛋白含有23个N-连接的糖基化序列（N-X-S/T, X≠P）。与其类似，HCoV-19 棘突蛋白预计每个单体包含22个糖基化序列，也即每个三聚体含66个糖基化序列[13]。然而，HCoV-19 S蛋白的S1区的糖基化位点与SARS-CoV有所不同，而S2区的糖基化位点则明显保守。这种S1糖基化模式的差异可能与HCoV-19和其他冠状病毒的生物学和临床特征的差异相关。在本研究中，我们报道了HCoV-19 S蛋白和hACE2的N-糖基化及其他种类的PTM的高分辨率质谱分析（MS）结果，并在此基础上重新描绘了目前HCoV-19 S蛋白的最新空间结构模型，以突出与COVID-19发病机制相关的重要糖基化特征。但是，研究证明，HCoV-19 S蛋白与hACE2的结合与糖基化状态无关。

2. 材料与方法

2.1. HCoV-19 S蛋白胞外结构域和hACE2蛋白的表达与纯化

利用昆虫细胞表达的优化密码子合成HCoV-19的S基因（病毒株：武汉Hu-1；GenBank号QHD43416.1），然后将其胞外区（Val16-Pro1213）克隆到pFastBac载体（Life Technologies Inc.，美国）中，并在N端和C端分别连接蜜蜂蜂毒信号肽及His6和Flag标签。利用Bac-to-Bac系统（Life Technologies Inc.，美国），在Sf9昆虫细胞中表达HCoV-19 S蛋白，再从培养基中提取蛋白质，并先后使用Ni-NTA柱和Superdex 200凝胶过滤柱（GE Healthcare，英国）纯化S蛋白。含C端Fc标签的hACE2 (Gln18-Ser740, NP_068576.1)胞外结构域则在HEK 293细胞中表达，之后通过蛋白A sepharose层析柱（GE-Healthcare，英国）进行纯化。

2.2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

为了检测HCoV-19 S蛋白和hACE2蛋白的糖基化状态，在37 ℃的磷酸盐平衡生理盐水（PBS）中用PNGase F (NEB, 1∶50)对两者进行过夜去糖基酶解，然后用15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色分析糖基化和去糖基化形式的HCoV-19 S蛋白和hACE2蛋白。

2.3. 糖肽样品制备

参照之前文献[31]中的方法，hACE2和S蛋白先在含有10 mmol∙L^-1二硫苏糖醇的50 mmol∙L^-1碳酸氢铵（ABC）溶液中反应45 min，之后在室温下用碘乙酰胺烷基化45 min。然后利用丙酮沉淀法收集蛋白质，并在50 mmol∙L^-1 ABC溶液中重悬。使用质谱级胰蛋白酶、糜蛋白酶或Lys-C蛋白酶（所有蛋白酶均购自美国普洛麦格公司），按蛋白质与蛋白酶的比为1∶50在37 ℃下消化14 h。酶解后的多肽用固相萃取HLB柱（Waters，美国）脱盐。

多肽样品被分成两份。第一份样品在纯H₂O¹⁸重水制备的50 mmol∙L^-1 ABC中用PNGase F (NEB, 1∶100)进行37 ℃去糖基处理。第二份样品用亲水相互作用法（HILIC）富集完整的N-糖肽。简而言之，GlycoWorks柱（Waters，美国）先用加样缓冲液[含有15 mmol∙L^-1乙酸铵（AmA）和0.1%三氟乙酸（TFA）的80%乙腈（CAN）]进行预处理，再将溶解在加样缓冲液中的多肽加载于GlycoWorks柱中，并将未结合的流穿液收集起来。GlycoWorks柱用缓冲液洗涤两次后，用0.1% TFA洗脱柱子上结合的糖肽。在进行液相串联质谱LC-MS/MS分析之前，所有肽都用自制的C18柱进行脱盐处理。

2.4. LC-MS/MS实验

使用与Ultimate 3000液相色谱系统（Thermo Scientific，美国）串连的Q-Exactive HFX质谱仪（Thermo Scientific，美国）对多肽进行分析。质谱仪进行数据依赖性采集（DDA），并只对强度排在前20的前体离子进行高能碰撞解离（HCD）和MS2扫描。使用Xcalibur 2.3版本软件（Thermo Scientific，美国）记录MS和MS/MS谱图。液相色谱（LC）分离和MS采集的详细参数分别见Appendix A中的表S1和表S2。

2.5. 生物信息学

利用MaxQuant（1.6.10.43版本；Max-Planck-Institute of Biochemistry，德国），将从去糖基肽分析中获得的MS原始文件，对照UniProtKB中的人ACE2序列和美国国家生物技术信息中心（NCBI）中的HCoV-19 S序列（YP_009724390.1_3）进行搜索。将半胱氨酸氨甲酰化设置为固定修饰，将蛋氨酸氧化和¹⁸O脱酰胺化设置为可变修饰。将胰蛋白酶的漏切位点数目设置为最高两个。预搜索和主搜索的质量误差分别设置为15 ppm和4.5 ppm。对于全面的PTM分析，将磷酸化（S/T/Y）、乙酰化（K）、甲基化（K/R/E）、琥珀酰化（K）、巴豆酰化（K）、法尼酰化（K/N_term）、肉豆蔻酰化（K/N_term）、棕榈酰化或异戊烯化、糖基磷脂酰肌醇和脯氨酸氧化分别进行平行数据库检索。多肽水平的假阳性率（FDR）设置为1%，同时基于99%的定位概率对PTM进行了置信度筛选。利用修饰肽（MP）和相应的非修饰肽（NP）的峰值强度，通过公式MP/(MP+NP) × 100计算每种PTM的位点占有率。

为了研究N-糖基化形式，我们用pGlyco（2.2.2版本；中国科学院）[32]根据相同的hACE2和HCoV-19 S序列搜索HILIC实验获得的MS原始文件。将半胱氨酸氨甲酰化设置为固定修饰，将蛋氨酸氧化设置为可变修饰。将胰蛋白酶的漏切位点数目设置为最高两个。首次搜索和主搜索的质量误差分别设置为15 ppm和4.5 ppm。MS2图谱中潜在的糖链片段通过内置的糖链结构数据库pGlyco.gdb进行注释[32]。利用MaxQuant特征检测算法提取每个糖肽的峰强度。本研究所有LC-MS/MS原始数据均存放在iProX数据库（https://www.iprox.cn/page/PSV023.html;?url=1631583654953TDY8; password: th2J）。

2.6. 蛋白结构模型的改进

通过GLYCAM-Web (https://dev.glycam.org/gp)下载或预测PDB格式的糖链结构模型。在前人构建的蛋白质模型（PDB编码hACE2蛋白的6M18及S蛋白的6VXX）基础上，通过Coot软件在各个位点上添加质谱鉴定的糖基化修饰位点，得到hACE2和三聚体S蛋白的N-糖基化蛋白晶体结构[33]。此外，我们还用HCoV-19 S蛋白和hACE2复合物（PDB 6M0J）结构模型展示出PTM在两个蛋白结合区周围的分布。所有结构图均通过PyMOL（Schrödinger Inc.，美国）构建。

2.7. 生物膜干涉技术（BLI）评价HCoV-19 S蛋白与hACE2的结合力

采用Octet Re96E干涉仪（ForteBio，美国）测定HCoV-19 S蛋白与hACE2的结合力。简而言之，先使用氨基丙基硅烷生物传感器（18-5045；ForteBio，美国）对HCoV-19 S蛋白进行固定化处理。为了评估HCoV-19 S的糖基化对结合力的影响，我们预先在37 ℃条件下将S蛋白与1000 U·mL^-1的PNGase F去糖基化酶或灭活的PNGase F共孵育14 h。之后先用洗涤液（PBS，pH为7.4，0.01%的牛血清白蛋白BSA和0.002%的吐温-20）进行清洗，再将HCoV-19 S蛋白与动力缓冲液中不同浓度（6.25 nmol∙L^-1、12.5 nmol∙L^-1、25 nmol∙L^-1、50 nmol∙L^-1、100 nmol∙L^-1、200 nmol∙L^-1）的hACE2进行孵育，通过传感器测量两种蛋白质之间的结合力，其反应条件为在30 ℃下停留180 s。在结合阶段之后，将传感器置于30 ℃的1 × 动力学缓冲液中停留300 s以解离蛋白质。在采用等摩尔结合模型进行数据拟合之前，需要减去信号基线。结合速率常数K_on和解离速率常数K_off的平均值通过使用所有数据的全局拟合模型来确定。我们还通过使用不同浓度的HCoV-19 S蛋白溶液孵育载有固定化处理的hACE2传感器进行平行实验。同样，固定化的hACE2用PNGase F或失活的PNGase F进行预处理，以评估hACE2糖基化对蛋白质结合力的影响。在所有实验中，PNGase F的失活处理条件是75 ℃加热10 min。

3. 结果

3.1. HCoV-19 S蛋白和hACE2的-连接糖基化位点的测定

如图1（a）所示，在SDS-PAGE上，PNGase F的去糖基化作用使HCoV-19 S蛋白和hACE2的分子量均降低。PNGase F的消化作用使得N-连接糖基化从天冬酰胺的N-X-S/T基序中释放，这也引起了天冬酰胺的脱酰胺反应，即加入来自溶剂的一个氧的同时损失了一个氢和一个氮[34]。为了对糖基化位点进行彻底的排查，我们将这两种蛋白的酶解多肽在H₂O¹⁸重水中进行PNGase F去糖基化处理，这引起¹⁸O的掺入，并导致2.98 Da的质量增量，可用于特异性标记糖基化位点。

图1 HCoV-19 棘突蛋白和人hACE2潜在的糖基化位点。（a）利用15% SDS-PAGE胶对糖基化与去糖基化的HCoV-19棘突蛋白及hACE2进行分析，左侧为分子量标记。（b）HCoV-19棘突蛋白（上图）及hACE2（下图）的功能域示意图。CD：连接区；CH：中心螺旋区；CT：细胞质尾部区；FP：融合肽；TM：穿膜区；UH：上游螺旋区；HR1/2：七肽重复区1/2。蓝色区域为可能的HCoV-19棘突蛋白与hACE2的结合区域。每个区域中可能的糖基化位点均已标出。红色标出的是本研究中证实存在糖基化的位点。HCoV-19棘突蛋白N331和N343位点（c）以及hACE2的N90位点（d）的去糖基化质谱图。

通过LC-MS/MS对S蛋白的去糖基化肽进行分析，确定了20个N-糖基化位点，包括N61、N74、N122、N165、N234、N282、N331、N343、N603、N616、N657、N709、N717、N801、N1074、N1098、N1134、N1158、N1173和N1194（表1）。两个N-X-S/T位点——N17和N149在任何去糖基化肽中均未被鉴定。然而，如后文所述，在未经PNGase F处理的样本中直接鉴定出了糖基化位点N149。因此在HCoV-19 S蛋白中的22个N-X-S/T位点中，共有21个糖基化位点被鉴定[图1（b）]。此外，对位点占有率的定量分析表明，共有18个位点被完全糖基化，而N603、N657的糖基化占有率分别为43%和74%（表1）。显示N331和N343糖基化修饰证据的示例质谱图见图1（c）。

表1 HCoV-19 S蛋白和hACE2去糖基化肽中PTM的鉴定总结

Sites	PTM	Sequence	Occupancy (%)
HCoV-19 S Protein
61, 74	N-glycosylation	SSVLHSTQDLFLPFFSN^aVTWFHAIHVSGTN^aGTK	100
74	N-glycosylation	HAIHVSGTN^aGTKRF	100
78	Methylation	R^aFDNPVLPFNDGVYFASTEK	100
122	N-glycosylation	TQSLLIVNN^aATNVVIK IVNN^aATNVVIKVCEF	100 100
165	N-glycosylation	VYSSANN^aCTFEYVSQPFLMDLEGK	100
224	Methylation	DLPQGFSALE^aPLVDLPIGINITR	100
234	N-glycosylation	VDLPIGIN^aITRF	100
282	N-glycosylation	YNEN^aGTITDAVDCALDPLSETK NEN^aGTITDAVDCALDPLSETKCTL	100 100
331	N-glycosylation	RVQPTESIVRFPN^aITNL	100
331, 334	N-glycosylation	FPN^aITNLCPFGEVFN^aATR	100
340	Methylation	FPNITNLCPFGE^aVFNATR	2.02
603	N-glycosylation	GGVSVITPGTN^aTSNQVAVL	43.50
616	N-glycosylation	YQDVN^aCTEVPVAIHADQL	100
654, 661	Methylation	AGCLIGAE^aHVNNSYE^aCDIPIGAGICASYQTQTNSPR	100
657	N-glycosylation	AGCLIGAEHVN^aNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPR IGAEHVN^aNSYECDIPIGAGICASY	74.80 79.76
709, 717	N-glycosylation	SN^aNSIAIPTN^aF	100
801	N-glycosylation	TPPIKDFGGFN^aFSQILPDPSKPSK N^aFSQILPDPSKPSKRSF	100 100
1074	N-glycosylation	N^aFTTAPAICHDGK	100
1098	N-glycosylation	VSN^aGTHWF	100
1134	N-glycosylation	VSGNCDVVIGIVN^aNTVY	100
1158, 1173	N-glycosylation	N^aHTSPDVDLGDISGIN^aASVVNIQKEIDRLNEVAK	99.17
1194	N-glycosylation	NLN^aESLIDLQELGK	99.73
hACE2
53	N-glycosylation	FNHEAEDLFYQSSLASWNYNTN^aITEENVQNMNNAGDK NYNTN^aITEENVQNMNNAGDKW	100 100
68	Methylation	NYNTNITEENVQNMNNAGDK^aW	100
84	Hydroxyproline	EQSTLAQMYP^aLQEIQNLTVK	20.74
90	N-glycosylation	WSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQN^aLTVK	100
103	N-glycosylation	LQLQALQQN^aGSSVLSEDKSK QLQALQQN^aGSSVL	100 100
253	Hydroxyproline	LMNAYP^aSYISPIGCLPAHLLGDMWGR	98.35
263	Hydroxyproline	LMNAYPSYISPIGCLP^aAHLLGDMWGR	88.57
284	Hydroxyproline	FWTNLYSLTVP^aFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQR	4.06
289	Hydroxyproline	P^aNIDVTDAMVDQAWDAQR	1.70
321	Hydroxyproline	FFVSVGLP^aNMTQGFWENSMLTDPGNVQK	58.24
322	N-glycosylation	FFVSVGLPN^aMTQGFWENSMLTDPGNVQK VSVGLPN^aMTQGF	100 100
329	Methylation	FFVSVGLPNMTQGFWE^aNSMLTDPGNVQK	100
346	Hydroxyproline	AVCHP^aTAWDLGK	88.88
415	Hydroxyproline	NGANEGFHEAVGEIMSLSAATP^aK	0.68
432	N-glycosylation	SIGLLSPDFQEDN^aETEINFLLK LSPDFQEDN^aETEINF	100 100
451	Hydroxyproline	QALTIVGTLP^aFTYMLEK	43.59
469	Hydroxyproline	GEIP^aKDQWMK	4.09
546	N-glycosylation	CDISN^aSTEAGQK HKCDISN^aSTEAGQKLF	100 100
565	Hydroxyproline	SEP^aWTLALENVVGAK	0.37
583	Hydroxyproline	NMNVRP^aLLNYFEPLFTWLK	2.12
612	Hydroxyproline	NSFVGWSTDWSP^aYADQSIK	0.21
690	N-glycosylation	ISFNFFVTAPKN^aVSDIIPR VTAPKN^aVSDIIPRTEVEKAIRM N^aVSDIIPRTEVEK	100 100 100

hACE2蛋白中所有7个潜在的糖基化位点——N53、N90、N103、N322、N432、N546和N690，在我们的实验中都被证实是糖基化的（表1）。N90位点糖基化的质谱图如图1（d）所示。位点占有率的定量分析显示7个位点都是完全糖基化（表1）。所有这些数据表明HCoV-19 S蛋白和hACE2都被N-糖基化高度修饰。

3.2. HCoV-19 S蛋白和hACE2的其他PTM鉴定

为了揭示糖基化以外的可能PTM，我们对HCoV-19 S蛋白和hACE2去糖肽的LC-MS/MS数据进行了多轮谱图数据库匹配。在这两种蛋白质中，我们发现PTM以赖氨酸、精氨酸或谷氨酸的甲基化为主（表1）。以占有率大于50%为标准，我们发现HCoV-19 S蛋白中的78R、224E、654E和661E，及hACE2中的57E、68K和329E高度甲基化。此外，hACE2中253、263、321和346位点的脯氨酸显著被氧化从而转化为羟脯氨酸。然而，HCoV-19 S蛋白和hACE2中均未发现磷酸化、乙酰化及其他形式的脂肪酸酰化。

3.3. HCoV-19 S蛋白和hACE2的-糖基化修饰图谱

为了揭示HCoV-19 S蛋白和hACE2表面覆盖的糖链，我们直接利用专用于检测N-糖基化修饰的高分子量肽的LC-MS/MS方法，对蛋白酶消化和HILIC SPE分馏后得到的完整糖肽进行分析。由于糖链的高度异质性，在我们的研究中，一种独特的糖肽被定义为一种独特的多肽序列和一种特定N-糖链形成的组合。根据该标准，我们分别从HCoV-19 S蛋白和hACE2中鉴定了出419个和467个独特的N-糖肽（表2、表3）。除N1134外，在PNGase-F去糖基化实验中，在鉴定出的20个HCoV-19 S糖基化位点中有19个被含糖肽的质谱图证实。此外，N149位点的N-糖基化也被发现。尽管hACE2中的7个糖基化位点在带有脱酰胺标记的去糖基化肽中都被鉴定出来，但只在N90、N103、N432、N546和N690这5个位点上得到了N-糖基化图谱。HCoV-19 S蛋白和hACE2的N-糖基化图谱示例见Appendix A中的图S1。

表2 HCoV-19S蛋白的糖肽和-聚糖鉴定总结

Domain	Site	Sequences	Most abundant composition	Most likely structure
S1	61	FSN^aVTWF FSN^aVTW	Hex6HexNAc2
	74	SSVLHSTQDLFLPFFSN^aVTWFHAIHVSGTN^aGTK SSVLHSTQDLFLPFFSN^aVTWFHAIHVSGTN^aGTKR HAIHVSGTN^aGTKRF	Fuc1NeuGc2Hex6HexNAc4
	122	TQSLLIVNN^aATNVVIK IVNN^aATNVVIKVCEF LIVNN^aATNVVIKVCEF	Hex3HexNAc2
	149	VCEFQFCNDPFLGVYYHKNN^aK YHKNN^aKSWMESEF HKNN^aKSWMESEF	Hex3HexNAc2
	165	VYSSANN^aCTFEYVSQPFLMDLEGK SSANN^aCTFEY SSANN^aCTFEYVSQPF	Hex4HexNAc2
	234	DLPQGFSALEPLVDLPIGIN^aITR VDLPIGIN^aITRF	Hex5HexNAc2
	282	YNEN^aGTITDAVDCALDPLSETK	Hex4HexNAc2
	331	FPN^aITNLCPFGEVFN^aATR RVQPTESIVRFPN^aITNLCPF RVQPTESIVRFPN^aITNL	Hex3HexNAc2
	343	FPNITNLCPFGEVFN^aATR CPFGEVFN^aATRF GEVFN^aATRF	Fuc1NeuGc2Hex5HexNAc4
	603	GGVSVITPGTN^aTSNQVAVLY GGVSVITPGTN^aTSNQVAVL	Fuc1Hex3HexNAc2
	616	YQDVN^aCTEVPVAIHADQLTPTW QDVN^aCTEVPVAIHADQLTPTW QDVN^aCTEVPVAIHADQLTPTWRVY YQDVN^aCTEVPVAIHADQL QDVN^aCTEVPVAIHADQL	Hex3HexNAc2
	657	AGCLIGAEHVN^aNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPR QTRAGCLIGAEHVN^aNSYECDIPIGAGICASY IGAEHVN^aNSYECDIPIGAGICASY QTRAGCLIGAEHVN^aNSY	Fuc1Hex3HexNAc2
S2	709	SN^aNSIAIPTNF	Hex3HexNAc3
	717	SNNSIAIPTN^aF	Fuc1NeuGc2Hex4HexNAc4
	801	DFGGFN^aFSQILPDPSKPSK DFGGFN^aFSQILPDPSKPSKR TPPIKDFGGFN^aFSQILPDPSK TPPIKDFGGFN^aFSQILPDPSKPSK DFGGFN^aFSQILPDPSK N^aFSQILPDPSKPSKRSF	Hex3HexNAc2
S2(S2´)	1074	N^aFTTAPAICHDGK LHVTYVPAQEKN^aF	Hex3HexNAc2
	1098	EGVFVSN^aGTHWFVTQR AHFPREGVFVSN^aGTHWFVTQR VSN^aGTHWF VSN^aGTHW	Hex3HexNAc2
	1134^b	‒	‒	‒
	1158	N^aHTSPDVDLGDISGINASVVNIQK YFKN^aHTSPDVDLGDISGINASVVNIQK	Fuc1Hex3HexNAc2
	1173	YFKNHTSPDVDLGDISGIN^aASVVNIQK NHTSPDVDLGDISGIN^aASVVNIQK	Fuc2NeuGc1Hex5HexNAc4
	1194	NLN^aESLIDLQELGKYEQYIK NLN^aESLIDLQELGK	Fuc1Hex3HexNAc2

表3 hACE2蛋白的糖肽和-聚糖鉴定总结

Domain	Site	Sequences	Most abundant composition	Most likely structure
PD	53^a	‒	‒	‒
	90	EQSTLAQMYPLQEIQN^bLTVK	NeuGc1Hex5HexNAc4
	103	LQLQALQQN^bGSSVLSEDK LQLQALQQN^bGSSVLSEDKSK LQLQALQQN^bGSSVLSEDKSKR	Fuc1NeuGc1Hex5HexNAc4
	322^a	‒	‒	‒
	423	SIGLLSPDFQEDN^bETEINFLLK	Fuc1Hex3HexNAc4
	546	CDISN^bSTEAGQK	Fuc1Hex5HexNAc4
CLD	690	N^bVSDIIPR ISFNFFVTAPKN^bVSDIIPR	NeuGc1Hex5HexNAc4

HCoV-19 S蛋白中共发现了144种N-糖链，其中大多数含有共同的N-乙酰氨基葡萄糖核心（表2）。S蛋白中的所有N-糖基化位点均有多种N-糖链，其中N343位点含有种类最丰富的N-糖链形态。HCoV-19 S N-糖链成分主要是由寡糖型或高甘露糖型组成，但4个N-糖基化位点（N73、N343、N717和N1173）含有较高比例的复合型和杂交型N-糖链[图2（a）、（b）和表2]。LC-MS分析表明，寡甘露糖Hex3HexNAc2是HCoV-19 S蛋白中最常见的N-糖链类型。有趣的是，在HCoV-19 S蛋白的N-糖链中没有发现唾液酸成分。

图2 HCoV-19 棘突蛋白和人hACE2的糖肽鉴定总结。（a）四种主要糖型在两个蛋白中的整体比例；（b）每个蛋白功能域中的糖基化位点上含量最高的糖基化类型图示；（c）热图总结了每个位点上四种糖型的相对质谱信号的强度，右侧条状图显示了每个位点所有糖型种类总数。

hACE2中共发现了220个N-糖链，其中93%为复合型，而杂交型、高甘露糖型和寡甘露糖型糖链仅分别占4%、2%和1% [图2（a）和表3]。LC-MS分析表明，hACE2多糖的主要成分为NeuGc1Hex5HexNAc4，推测其为末端含有唾液酸的双支链复合糖。所有hACE2位点的N-糖型主要为复合型。值得注意的是，位点N90、N103和N690都含有100多种N-糖型，其中最主要的形式都含有唾液酸末端。

总之，我们的LC-MS/MS数据证实了HCoV-19 S蛋白及其受体hACE2在其预测的N-X-S/T序列中确实占有大量N-糖链。HCoV-19 S蛋白和hACE2的每个位点中最主要的N-糖链成分和预测结构如图2（c）所示。

3.4. 用糖基化和PTM改进的HCoV-19 S-hACE2复合物结构模型

将LC-MS/MS结果中每个位点含量最丰富的N-糖链结构添加到HCoV-19 S蛋白和hACE2的冷冻电镜模型中，生成了最新的原子模型，该模型代表了这两种蛋白质上N-糖链最可能的空间分布[图3（a）、（b）]。尽管S蛋白的4个位点（N74、N149、N1158和N1194）在缺失残基模型6VXX中没有显示，但我们的模型表明，N-糖链屏蔽了HCoV-19 S蛋白表面2/3以上的部分，这可能与S蛋白的宿主黏附和免疫逃避相关。此外，HCoV-19 S-hACE2结合模型显示，HCoV-19 S蛋白的N331、N343位点糖链和hACE2的N90位点糖链在空间上靠近，尽管并不完全在它们的结合区内[图3（c）、（d）]。HCoV-19 S-hACE2结合模型还表明，hACE2中的3个甲基化位点（57E、68K和329E）形成了一个三叉戟结构，包围了hACE2的K353~R357与HCoV-19 S的N501位点之间形成的接触区域（见Appendix A中的图S2）。

图3 含糖链结构的HCoV-19棘突蛋白三聚体和人hACE2的结构模型。（a）每个单聚体由不同颜色表示的HCoV-19棘突蛋白三聚体结构3D带状图；（b）每个结构域由不同颜色表示的hACE2结构带状图。不含糖链（左侧图）与含糖链（右侧图）的蛋白质结构均提供了侧视图（上图）和病毒或细胞膜朝向的俯视图（下图）。HCoV-19棘突蛋白三聚体（c）与hACE2（d）结合区域附近的糖链通过两个蛋白质的俯视图显示，其中红色为结合区域，枝条形状显示的是糖链。

3.5. HCoV-19 S蛋白与hACE2的结合不依赖-糖基化

为了解蛋白质糖基化对HCoV-19 S蛋白与hACE2之间相互作用的影响，我们在BLI实验中比较了纯化的hACE2胞外域与固定在生物传感器表面的糖基化和去糖基化的HCoV-19 S-ECD的结合动力学及亲和力。我们发现hACE2与活性或灭活的PNGase F预处理后的HCoV-19 S蛋白结合的平衡解离常数K_d分别为1.7 nmol∙L^-1 [图4（a）]和1.5 nmol∙L^-1 [图4（b）]。本研究中测定的hACE2与HCoV-19 S蛋白结合的亲和力与先前的报告一致[13]。当HCoV-19 S ECD与固定化的hACE2 [K_d = 16.7 nmol∙L^-1，图4（c）]或去糖基的hACE2 [K_d = 18.2 nmol∙L^-1，图4（d）]结合时，也观察到类似的现象。因此，我们的数据表明糖基化状态并不直接影响HCoV-19 S蛋白与hACE2的结合。BLI结合动力学的详细总结见Appendix A中的表S3。

图4 糖基化对HCoV-19棘突蛋白和人hACE2结合的影响。生物膜层干涉仪检测HCoV-19棘突蛋白和人hACE2的结合。在生物感应器上固定完整的HCoV-19棘突蛋白（a）和去糖基化的棘突蛋白（b）并将其暴露在含6个不同浓度hACE2的溶液中。互换实验中则将完整的hACE2（c）和去糖基化的hACE2（d）固定后与含6个不同浓度HCoV-19棘突蛋白进行孵育。红色标识的是通过等摩尔结合模型得出的数据整体拟合曲线。

4. 讨论

糖基化是一种普遍且复杂的蛋白质翻译后修饰类型，它极大地丰富了蛋白质的结构和功能。然而，表征蛋白质N-糖基化在技术上具有挑战性。由于去糖基肽比其糖基化肽前体更容易被LC-MS分析，为了确定HCoV-19 S蛋白和hACE2中的N-糖基化位点，本研究通过在H₂O¹⁸的环境中，由PNGase F介导的水解反应插入的¹⁸O同位素所造成的特殊修饰来确保糖基化位点鉴定的可信度。之后，本研究通过进行完整的N-糖肽分析进一步验证了糖基化修饰存在，并提供了每个位点的N-糖链组成和结构异质性的详细信息。我们的研究表明，除N17位点外，HCoV-19 S蛋白的所有位点都被糖基化高度修饰。根据S蛋白的N-糖链模型，蛋白质表面有很大一部分面积被糖链覆盖，这与以前各种S蛋白的报道一致[14,34,36]。当比较HCoV-19和SARS-CoV的S蛋白时，我们注意到糖基化位点的大部分差异发生在S1亚单位的远端，因此导致由棘突三聚体形成的病毒最外层的糖链谱有显著差异。糖基化的差异可能是宿主或环境压力选择的结果，并可能暗示该病毒在感染性、发病机制和宿主反应方面的特性。在本研究进行过程中，我们也注意到，其他几个研究小组也在试图破解HCoV-19 S蛋白的糖链谱。所有这些研究都证实了HCoV-19 S蛋白是高度糖基化的[35‒36]。

S蛋白中的N-糖链具有明显的异质性，这极大地扩展S蛋白的构象灵活性和表位多样性。虽然在S蛋白中发现了一小部分复合型和杂交型N-糖链，但大多数位点被低聚甘露糖型糖链占据，这与先前关于SARS-CoV冠状病毒糖基化特征的描述是一致的[37,39]。许多病毒蛋白质都带有大量低聚甘露糖型糖链，这可能是由高密度糖基化位点的空间位阻效应导致的糖链不完全成熟的标志[40]。有趣的是，靠近结合面的N343位点具有最多样性的N-糖链类型，且主要为杂交型和复合型的糖链。此外，与SARS-CoV和Marburg病毒蛋白一样[41‒42]，我们发现SARS-CoV S蛋白糖链中的唾液酸含量也是可以忽略的。鉴于目前全球正在努力研发以S蛋白为候选抗原的疫苗，而糖链可以显著调节蛋白质的免疫原性，因此疫苗开发人员应考虑在S蛋白三聚体表面占据大面积的不同糖链形式。有趣的是，将我们的数据与其他糖基化分析研究进行比较时，我们发现不同的蛋白表达体系可以显著地影响糖基化类型[35‒36]。与昆虫细胞相比，哺乳动物细胞更倾向于将复杂的糖链组装到S蛋白上。因此，我们也应对基于不同糖基化状态的S蛋白生产的疫苗的不同保护性保持警惕。

冠状病毒S蛋白与它们各自受体的结合被证明是由其寡甘露糖N-糖链介导的[19‒20,23]。SARS-CoV冠状病毒S蛋白含有3个与RBD相关的糖基（N318、N330和N357），而HCoV-19只有两个（N331和N343）糖基化位点围绕在结合口袋区周围。我们假设这两个位点的N-糖链可能参与受体结合的极性相互作用。但事实与之相反，BLI结合实验证明，去糖基化不会改变S蛋白对hACE2的亲和力。然而，这种阴性的BLI结合结果并不能够排除糖基化影响其他病毒入侵步骤的可能性，包括蛋白酶切割和聚糖介导DC/L-SIGN相互作用，这些步骤被证明可以增强SARS-CoV的病毒的入侵过程[25‒26]。因此需要进一步的研究来确定糖基化在HCoV-19感染过程中的作用。

抗原糖基化在很大程度上决定了宿主的免疫反应。糖基化的一个重要功能是通过屏蔽病毒包膜或表面蛋白中的免疫原性表位来实现逃避免疫[17,43‒44]。HCoV-19 S蛋白的大部分糖基化位点被糖基化完全修饰，表明该病毒能够以隐秘的方式入侵宿主细胞。HCoV-19在感染早期成功地逃避了先天性免疫，这可能解释了该病毒的较长的无症状潜伏期的由来[4,6]。HCoV-19短期内再感染的病例也已有报道，表明病毒可能会逃避抗体介导的中和作用[45]。另外，抗体也可以通过糖基化反应促进对其他免疫分子的识别。N-糖链是半乳糖凝集素的已知配体，可触发细胞因子释放和免疫细胞浸润等炎症事件[46‒47]，这些事件可能参与了HCoV-19的发病机制，并与疾病严重程度相关。此外，流行病学研究表明，ABO血型多态性与HCoV-19和SARS-CoV在人群中的易感性差异有关[48‒49]。由于ABH糖链表位和病毒蛋白糖链都是由内质网糖基化酶系统合成的，抗-A或抗-B抗体可部分阻断病毒与宿主的相互作用[50]，因此O型血的个体对病毒感染的抵抗力更强。S蛋白的糖基化状态是否影响感染人群中病毒的反应和个体间临床结局的差异仍需进一步研究。

本研究还分析了hACE2的糖基化状况。hACE2中的7个糖基化位点均被糖链完全占据，包括结合表面附近的N90位点。然而，我们发现糖链并没有直接影响其与HCoV-19 S蛋白的结合。这与先前的发现一致，即ACE2糖基化的抑制并不影响其与SARS-CoV冠状病毒S蛋白的结合[51]。但是去糖基化的ACE2确实可以抑制病毒入侵及传染性SARS-CoV病毒粒子的生成过程[51]。因此，糖基化的ACE2仍然被认为是干预冠状病毒感染的重要靶点。事实上，氯喹对抗HCoV-19感染的能力被认为是其抑制ACE2糖基化以及提高核内体pH值的共同结果[28,52]。

除糖基化外，我们还研究了其他翻译后修饰类型。甲基化修饰在S蛋白和hACE2的多个位点都被鉴定。尤其是hACE2与S蛋白的RBD结合位点周围的57E、68K和329E位点被完全甲基化。甲基化会导致电荷损失，从而增加这些位点的疏水性。在hACE2的蛋白酶结构域中鉴定出4种羟脯氨酸修饰位点（即253、263、321和346位点）。额外的羟基可能会增加脯氨酸在hACE2细胞外区域的亲水性。未来还需要进一步研究以揭示这些PTM可能的生物学作用。在我们的数据集中没有发现磷酸化和乙酰化修饰，这和先前对SARS-CoV的PTM研究相一致[38]。脂肪酸酰化在本研究中也被考虑，因为它们通常存在于表面病毒蛋白中，可以促进膜融合和病毒入侵。然而，本研究并没有发现HCoV-19 S蛋白中存在酰化修饰的证据。考虑到多种蛋白酶处理的蛋白质组学实验几乎可以实现对这两种蛋白质的全覆盖，我们认为HCoV-19 S蛋白和hACE2的翻译后修饰组学主要由糖基化、甲基化和脯氨酸氧化组成。

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2020-05-12
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