明胶调控异种复合植骨材料的降解速率及成骨效应

朱皓 ,  Håvard Jostein Haugen ,  Giuseppe Perale ,  Janne Elin Reseland ,  Liebert Parreiras Nogueira ,  Antonio Gonzalez Cantalapiedra ,  Fernando Maria Guzon Muñoz ,  Maria Permuy Mendaña ,  Felice Betge ,  Ståle Petter Lyngstadaas ,  肖骏

工程（英文） ›› 2022, Vol. 13 ›› Issue (6) : 197 -208.

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工程（英文） ›› 2022, Vol. 13 ›› Issue (6) : 197 -208. DOI: 10.1016/j.eng.2021.01.010

明胶调控异种复合植骨材料的降解速率及成骨效应

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Tailoring Resorption Rates and Osteogenic Response in Xeno-Hybrid Bone Grafts: The Effect of Added Gelatins

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摘要

由外伤、手术、先天性畸形和其他因素导致的骨缺损是当今最常见的健康问题之一。尽管自体骨移植和同种异体骨移植等策略是目前促进骨再生最成功的治疗方法，但仍存在移植物来源有限和并发症等局限性。Smartbone®是一种异种复合植骨材料（由牛骨基质、聚L-乳酸-己内酯和明胶制成），具有良好的临床骨再生效果。在这项研究中，我们研究了使用不同来源的明胶（牛和猪来源）制备的异种复合植骨材料（分别命名为SBN和SPK），并在体外和体内评估了其生物学效应。结果表明，来自牛和猪的明胶都可以成功且安全负载于Smartbone®上，并且能够承受苛刻制备过程。SBN和SPK在体外显示出不同的成骨细胞效应。SBN可促进人成骨细胞的骨钙蛋白分泌，而SPK可上调骨桥蛋白的表达。在体内实验中，两种植骨材料都促进了成骨，但SPK比SBN更早降解。我们的研究结果表明，SBN和SPK为优化骨修复植入物的吸收和再生平衡提供了不同的解决方案，这些异种复合植骨材料具有应用于骨缺损修复领域的巨大潜力。

Abstract

Bone defects resulting from trauma, surgery, congenital malformations, and other factors are among the most common health problems nowadays. Although current strategies such as autografts and allografts are recognized as the most successful treatments for stimulating bone regeneration, limitations such as graft source and complications still exist. SmartBone® is a xeno-hybrid bone graft (made from bovine bone matrix, poly(L-lactic-co-ε-caprolactone), and gelatin) with a positive clinical record for bone regeneration. In this study, the formulation for designing xeno-hybrid bone grafts using gelatins from different sources (bovine- and porcine-derived gelatin, with bone grafts named SBN and SPK, respectively) was investigated, and the biological responses were evaluated in vitro and in vivo. The results demonstrate that gelatins from both bovine and porcine sources can be loaded onto SmartBone® successfully and safely, withstanding the aggressive manufacturing processes. Different bone cell responses were observed in vitro. SBN was found to enhance osteocalcin secretion while SPK was found to upregulate osteopontin from human osteoblasts. In vivo, both bone grafts promoted osteogenesis, but SPK degraded earlier than SBN. Our findings suggest that SBN and SPK provide different yet comparable solutions for optimizing the bone resorption and regeneration balance. These xeno-hybrid bone grafts possess ideal potential for bone defect repairing.

关键词

骨移植物 / 异种复合 / 明胶来源 / 吸收 / 骨再生

Key words

Bone graft / Xeno-hybrid / Gelatin source / Resorption / Bone regeneration

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朱皓,Håvard Jostein Haugen,Giuseppe Perale,Janne Elin Reseland,Liebert Parreiras Nogueira,Antonio Gonzalez Cantalapiedra,Fernando Maria Guzon Muñoz,Maria Permuy Mendaña,Felice Betge,Ståle Petter Lyngstadaas,肖骏. 明胶调控异种复合植骨材料的降解速率及成骨效应[J]. 工程（英文）, 2022, 13(6): 197-208 DOI:10.1016/j.eng.2021.01.010

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1、 引言

由外伤、手术、先天性畸形等因素引起的骨缺损是当今最常见的健康问题之一[1]。虽然骨骼是一种血管丰富的组织，但在某些情况下，如骨缺损达到临界范围，其自愈能力不足以完全修复受损区域，可能会出现骨不连甚至假关节等并发症[2]。由钛和其合金制成的金属植入物在骨缺损治疗中展现出优良的临床疗效。然而，这些材料大多是不可降解的[3]。此外，在严重的情况下，骨替代材料不足以治疗大面积的不规则缺损，如髋关节翻修中的严重骨缺损，其中骨量的恢复至关重要[4]。

治疗骨缺损的常用策略是利用骨移植促进组织再生。骨移植是最成功的治疗方法之一，因为骨移植可以提供良好的环境，促进骨传导、骨诱导和成骨作用[5]。自体移植物是将个体一个区域的组织移植到同一个体的另一个区域，目前仍然是治疗骨缺损的“金标准”[6‒7]。然而，这种方法存在供区发病率高、来源有限等缺点，在小儿患者中难以实现[8‒9]。此外，一些患者在手术后两年内可能会有供区持续疼痛的症状[10]。同种异体移植物，即来自不同人类供体的骨移植物，可以治疗更大的缺损。事实上，打压植骨和结构植骨仍然被认为是髋关节翻修的有效方法[11‒12]。然而，伦理和监管问题都是目前潜在的障碍，而且供体来源对于大规模制造来说是困难的[13]。此外，免疫原性反应和传染病等潜在风险也不容忽视。

因此，研究人员建议使用不同来源的植骨材料，包括来自其他物种的植骨材料，如异种植骨材料和人工合成植骨材料（如生物聚合物、生物陶瓷及其复合材料）进行替代以解决上述问题[14‒19]。合适的植骨材料在力学性能、结构特征和生物学功能方面应尽可能与天然骨组织相似[8,20]。具有临床转化潜力的植骨材料应具有生物安全性且易于获得；更重要的是，应该具有骨诱导和（或）成血管潜力，且尺寸上没有限制、保质期长、成本合理[21]。人工合成的植骨材料相对更容易获得，并且结构在一定程度上是可调的。然而，与骨移植物相比，人工合成的植骨材料在生物学性能和力学性能方面仍然具有局限性。更重要的是，植骨材料在植入后通常会经历一个再吸收和重塑的过程。需恰当地调整再吸收和容量维持之间的平衡，以实现理想的骨重塑。因此，天然来源的植骨材料对于研究人员来说仍然具有重要意义和兴趣（因为这些植骨材料与更好的宿主反应有关）。

牛来源的松质骨植骨材料被认为具有与人骨相似的结构，其价格便宜，而且较容易大量获取，因此这些植骨材料成为生产异种骨植骨材料的理想选择[22]。然而，基本的制造过程，包括脱脂、脱细胞和脱蛋白，通常会影响植骨材料的韧性和整体力学性能[23]。人工合成的聚合物和生物分子是制备和增强生物材料性能的可行方法[24‒26]。因此，将天然骨矿物质基质与合成材料相结合，人们提出了异种复合植骨材料的策略来治疗骨缺损[20]。一个典型的产品是SmartBone®，该产品是通过用生物相容性聚合物涂层（聚L-乳酸-己内酯，也称为PLCL）和生物活性分子[精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD），即动物来源的明胶中暴露的胶原蛋白片段]以制备一种与天然骨具有相似特性的生物材料[27‒30]。添加上述两种材料可以改善力学性能和生物学性能[27,30]。

本文研究了使用来自不同来源的明胶制备异种复合植骨材料。本研究使用了市售的异种复合植骨材料Smartbone®（由瑞士I.B.I. SA公司制造）。SmartBone®的制造过程严格遵循了既往的研究[27,30]。但是，本研究使用了两种不同的明胶来源制备移植物：牛和猪来源的明胶。使用扫描电子显微镜（SEM）、能量色散X射线光谱（EDX）和微型计算机断层扫描（micro-CT）表征两种异种复合植骨材料。在体外评估人成骨细胞的细胞效应后，将该材料植入猪颅骨中，并在术后的第8周和第16周评估其宿主反应和骨再生潜力。

2、 材料与方法

2.1 SmartBone制备

本研究使用了市售的异种复合植骨材料Smartbone®。该材料主要由牛骨来源的矿物基质组成，通过PLCL涂层增强以及添加动物来源明胶的RGD暴露的胶原蛋白片段来改进性能。既往研究[27,30]已经报道了Smartbone®的详细制备过程。但是，本研究分别使用牛和猪来源的明胶制备Smartbone®，制备的异种复合植骨材料分别命名为SBN和SPK。两种明胶均进行了水解，冻力为（120 ± 10）g；按照欧洲明胶制造商的标准（https://www.gelatin.org/gme.html）制造，该标准源自经过认证的食品链动物，并有欧洲药品质量监管的认证。牛明胶来自骨骼，由Merck KGaA公司提供；而猪明胶从皮肤中提取，由Gelita Medical GmbH公司（德国）提供。两种明胶主要由I型胶原蛋白片段（> 80%）组成[31]，该片段是RGD末端的已知来源，通常用于组织工程和医疗设备行业。

2.2 植骨材料制备、样品发放和表征

制备具有不同尺寸的SBN和SPK样品。使用立方体样品（10 mm × 10 mm × 10 mm）和长方体样品（10 mm × 10 mm × 30 mm）进行力学测试。高度为2 mm、直径为13 mm的样品用于体外细胞实验。高度为4 mm、直径为16 mm的样品用于体内动物实验评估。根据当前药品生产质量管理规范（c-GMP）和ISO13485-2016标准（Industrie Biomedicine Insubri SA，瑞士），所有批次均按照相同的SmartBone®标准发放程序发放。

使用SEM（Hitachi Analytical Table Top SEM TM3030; Hitachi，日本）对样品表面进行表征，背散射电子为15 KeV。对所有样品喷铂，然后在两种不同的放大倍数（100×和600×；n = 5）下观察。选取5个637 µm × 381 µm的区域进行元素分析和定量，样品倾斜45°（Quantax70; Hitachi，日本）。采集时间设置为60 s，X射线计数平均为1.7 kcps（kilocounts per second）。不同元素的浓度以原子百分比给出。

使用Zwicki（ZwickRoell GmbH & Co. KG，德国）万能试验机和testXpert（ZwickRoell GmbH & Co. KG，德国）软件进行力学性能测试，配备10 kN加载单元，压缩两个平板之间的样品，位移速度为1 mm·min-1。根据公式σ = 3FL/2bh2计算弯曲强度（单位：MPa），其中F为最大载荷、L为支撑跨度的长度、B为宽度、H为样品的厚度。

使用傅里叶变换衰减全反射红外光谱（ATR-FTIR; Spectrum 100; Perkin-Elmer Instruments，美国）进行化学表征。在中红外范围内对每种材料的5个样本进行扫描，分辨率为2 cm-1，扫描64次。为了提供最佳的接触，将样品立方切片（3 mm × 3 mm × 3 mm）压碎至粉末，并将其放在ATR晶体上。每个粉末的压力由红外（IR）软件（Perkin-Elmer Instruments，美国）控制，保持压力相同。对每个光谱进行自动基线校正和数据调整（QUANT+软件；Perkin-Elmer Instruments，美国）处理。每个样品的最终光谱为5个重复的平均值。

使用micro-CT系统（Bruker Microct1172，比利时）扫描样品，使用铝铜滤过板。扫描参数设置如下：104 μA、95 kV，图像旋转0.400°、分辨率为7.9 μm。使用软件CTvox（Bruker，比利时）将截面图像重建成三维模型，然后导出。使用软件CT Analysis（Bruker，比利时）分析结构参数，包括总孔隙率、表面/体积比、表面密度、交界面面积、结构厚度和结构分离度。

2.3 细胞培养

采用商品化的人成骨细胞（Lonza，德国）进行细胞实验，该细胞来自三名不同供体，表1展示了供体的详细信息。使用成骨细胞生长培养基（Promocell，德国）在标准细胞培养环境（37 °C、加湿、5%二氧化碳）中培养细胞。使用第5~7代细胞进行实验。每三天更换培养基进行细胞增殖。具体来说，首先将样品放在24孔板中，设置4个重复，并将200 μL含有8 × 104个细胞的悬液滴至每个样品的表面。孵育30 min后，再加入足量培养基，从而最大程度减少对黏附细胞的刺激。在每周的第2天、第5天和第7天更换培养基，整个实验持续28天。在第2天、第7天、第14天、第21天和第28天，即每次培养基更换的两天后，收集培养基以进行后续的蛋白定量分析。

表1 不同供体的相关信息

Donor numberGenderAgePosition
1Male32Distal femur
2Male13Femur bone end
3Female20Ulna/radius

2.4 细胞活力测定

使用乳酸脱氢酶（LDH）活性检测植骨材料对人成骨细胞的细胞毒性。在生长培养基中培养并用磷酸盐缓冲液（PBS）处理的细胞被用作阴性对照，而将用1% Triton X-100处理的细胞用作阳性对照。将催化剂和染料溶液以1:45的比例（Roche Diagnostics，德国）混合，提前配制反应混合物。细胞黏附并培养48 h后，吸出50 μL培养基至另一个新孔板中，并与50 μL的反应混合物混合。将样品在室温下孵育30 min，然后使用酶标仪在490 nm波长下读取数值。通过计算相对于对照组的吸光度（OD）值来评估细胞毒性，具体方法如下：

（1）

2.5 共聚焦显微镜

在第2天、第7天、第14天和第28天使用共聚焦显微镜观察细胞形态。在设计的时间点，将样品用PBS洗涤三次，并在4%多聚甲醛中固定12 min。再次使用PBS洗涤后，将样品用由Alexa 488标记的鬼笔环肽染色1 h，并用4′,6-二胺-2-苯基吲哚（DAPI）染色20 min。使用激光扫描共聚焦显微镜（Leica TCS SPE Microsystems Wetzlar GmbH，德国）拍摄共聚焦图像，并使用Image J软件（National Institutes of Health，美国）进行分析。

2.6 细胞分泌蛋白定量分析

在第2天、第7天、第14天、第21天和第28天收集每个孔中的培养基。使用Luminex 200系统（Luminex，美国）对每个培养基样品进行蛋白质水平分析（Multi-Analyte Profiling, xMAP）。本研究使用骨代谢试剂盒（Human Bone Magnetic Bead Panel; MILLIPLEX, 德国）测定骨钙蛋白（OC）、骨桥蛋白（OPN）、骨保护素（OPG）、Dickkopf相关蛋白-1（DKK-1）、骨硬化蛋白（SOST）、白介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等指标。在xPONENT 3.1软件（Luminex，美国）中分析获得荧光数据。所有流程均按照制造商的说明书完成。

2.7 动物手术

本研究涉及的实验是在西班牙卢戈圣地亚哥大学的兽医教学医院完成的。Rof Codina基金会的伦理委员会（Lugo, 西班牙）批准了该研究方案（伦理编号：CEBIO-VET：AE-LV-001）。该动物实验的审查根据西班牙和欧盟法规（欧洲共同体委员会指令86/609/EEC）执行。使用来自西班牙繁殖农场的杂交猪（年龄：3~4个月；隔离期：21天）进行体内实验评估。实验动物被饲养在一处有自然光、空气流通和温度可控的区域，并给予特定的颗粒饮食和充足的饮水。在兽医操作下，使用氯胺酮（10.0 mg·kg-1）、咪达唑仑（0.5 mg·kg-1）、吗啡（0.5 mg·kg--1）和美洛昔康（0.2 mg·kg-1）肌肉注射预处理，以便进行疼痛管理。手术操作是在全身麻醉[静脉注射丙泊酚（2~4 mg·kg-1; Abbott Laboratories，英国）]下进行的，并用七氟烷（Schering-Plow，西班牙）维持。在麻醉期间，监测心电、二氧化碳、脉搏血氧饱和度和无创血压。术后由受过培训和认证的兽医每天对猪进行监测。

在手术操作方面，首先在额骨水平进行纵向切开，并剥离肌肉。然后，在无菌盐水连续冲洗下，在额叶和顶骨水平进行4个位置的钻孔。然后将4个圆片样品（高度为4 mm，直径为16 mm）植入缺损部位。所有缺损均用牛心包膜（Tutogen Medical GmbH）覆盖，并用5个钛螺钉固定，这对于以后的micro-CT和组织学分析也很重要[图1（a）~（d）]。然后轻柔地缝合并关闭肌肉、皮下和皮肤组织。术后一周每天预防性皮下注射抗生素阿莫西林（20 mg·kg-1）一次。术后即刻、术后8周和16周后进行锥行束计算机断层扫描（CBCT）。在8周和16周，在适当镇静后，通过静脉注射过量的戊巴比妥（40~60 mg·kg-1）处死动物。解剖头骨，并在4 °C的4%多聚甲醛中固定样品4~7天。

图1 动物手术示意图。（a）~（d）手术设计：（a）在颅骨中以五个钛钉作为参考，在颅骨中制作四个全层骨缺损；（b）缺损制作；（c）样品植入；（d）用钛钉固定心包膜。（e）~（g）组织学切片方法：（e）首先将样品切成四块；（f）根据绿色平面将每块分成两半；（g）根据红色平面进行切片。

2.8 micro-CT分析

使用micro-CT系统对固定好的猪头骨进行扫描。扫描参数设置如下：104 μA、95 kV、图像旋转0.400°、分辨率为7.9 μm。重建后，根据先前植入的钛钉的指引将目标区域（ROI）重新定位。在每个样品中，对直径为16 mm、厚度为4 mm的圆柱形ROI进行定量。为了研究样品对对缺损区域以外空间的影响，创建另一个高度扩大为5 mm（两侧为2.5 mm）的ROI。对形态学参数如骨体积比（BV/TV）、骨表面/体积比（BS/BV）、骨表面密度（BS/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁分离度（Tb.SP）进行计算。针对与缺损中心不同距离的环形区域（每步直径变化为1 mm）计算其BV/TV，以构建缺损区域的BV/TV变化曲线。

2.9 组织学分析

以钛钉为参考，首先将获得的颅骨分割为4个区域，以免损坏实验区域[图1（e）]。对于每块切割后的颅骨，首先通过缺损中心将样品切割成两半，然后在每半样品上进行横向组织切片[图1（f）]。根据标准硬组织切片方法处理样品。简言之，样品用乙醇逐步脱水，并包埋进甲基丙烯酸甲酯（MMA）树脂中。沿着垂直于从圆心到圆周的连线进行切片[图1（g）]。切片后进行Van Gieson染色。

2.10 统计分析

首先进行正态性检验，对于满足正态分布的数据，结果表示为平均值±标准差。对于多组之间的比较，使用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验。而对于多个时间点的结果，应用双因素方差分析和Bonferroni检验。使用SPSS12（IBM SPSS，美国）进行统计学分析。p < 0.05代表有统计学差异。

3、 结果

3.1 SBN和SPK的基本特征

SEM结果显示，SBN和SPK均具有松质骨的微观结构，它们之间的形态没有显著差异。能量色散X射线光谱（EDX）表明，所有元素包括钙、氧、碳、氮和磷都均匀分布（图2），在元素定量中也没有发现显著差异（表2）。由于氮仅存在于矿化基质和PLCL中，因此可以被视为明胶的标记元素，这表明明胶在移植物表面均匀分布。

图2 SPK和SBN的SEM和EDX结果的代表性图像。HL：高分辨率镜头；HV：高压；WD：工作距离；BSE：背散射电子。

表2 EDX对SBN组和SPK组元素的定量分析

ElementSBNSPKSignificant difference
Oxygen43.100 ± 0.36943.100 ± 0.401None
Calcium16.400 ± 0.40916.400 ± 0.405None
Carbon26.800 ± 0.04526.800 ± 0.045None
Phosphorus8.000 ± 0.0857.800 ± 0.409None
Nitrogen5.000 ± 0.1154.900 ± 0.044None
Sodium0.400 ± 0.0450.500 ± 0.159None
Magnesium0.200 ± 0.0350.200 ± 0.035None

3.2 SBN和SPK的力学测试

本文评估了SBN和SPK的力学性能。如表3所示，SBN和SPK的压缩强度、压缩模量和弯曲强度没有显著差异。

表3 SBN和SPK的抗压性能（ = 6）

Mechanical propertiesSBNSPKSignificant difference
Maximum compressive stress (MPa)28.20 ± 2.6027.70 ± 3.10None
Compressive modulus (GPa)0.45 ± 0.090.41 ± 0.11None
Flexural strength (MPa)13.80 ± 0.7013.30 ± 0.90None

3.3 SBN和SPK的化学表征

图3给出了每个样品的5个不同吸收光谱的平均值，结果显示SPK和SBN之间的有机成分没有明显差异。SBN和SPK的PLCL聚合物涂层的存在可由以下特征峰表明：3450 cm-1（—OH基团）；2950 cm-1（不对称CH3伸缩）；1410 c-1、2030 c-1和2160 c-1（羰基）；1640 cm-1（C—O—C）。基质的矿物质是通过在600 cm-1和1050 cm-1处的磷酸基团证实的，这是羟基磷灰石的典型特征。1651 cm-1（酰胺I）和1551 cm-1（酰胺II）处的特征蛋白带证明了明胶的存在。因此，可以看出，聚合物和明胶有效地沉积于SPK和SBN的骨基质，并且测试样品之间没有化学组分的差异。

图3 来自5个SBN和SPK样品的平均FTIR光谱，显示相同的化学结构。主要红外吸收峰已被标记。

3.4 SBN和SPK的结构表征

micro-CT的结果显示，在总孔隙率、表面/体积比、表面密度、交界面面积、结构厚度和结构分离度方面两组之间没有显著差异（表4）。植骨材料内部的孔道彼此相通，未检测到封闭孔隙。由于有机物和矿化基质在X射线上有不同程度的衰减，因此用不同的颜色对其进行标记，以更好地观察。有机组分PLCL和明胶均匀地分布在移植物的孔之间，而不会影响开放的孔道的连通性（图4）。

表4 SBN和SPK的Micro-CT分析结果

Morphometrical parametersSBNSPKSignificant difference
Total porosity (%)73.41 ± 2.0674.32 ± 1.32None
Surface/volume ratio (mm-1)29.45 ± 4.9327.27 ± 3.72None
Surface density (mm2)7.77 ± 0.796.97 ± 0.65None
Intersection surface (mm2)13.13 ± 0.6613.76 ± 0.71None
Structure thickness (μm)139.87 ± 12.95149.10 ± 10.17None
Structure separation (μm)396.26 ± 11.01446.10 ± 40.31None

图4 micro-CT分析中的代表性图像。（a）截面图像；（b）3D重建模型；（c）带有颜色标记的3D重建模型。红色表示有机物（PLCL和明胶），绿色表示矿化基质。

3.5 SBN和SPK的细胞毒性测试

未检测到两组材料对来自三个不同供体的成骨细胞的细胞毒性作用的差异。供体1和供体3中的细胞活力高于供体2（图5）。

图5 使用LDH活性测定法测定三个不同供体的人成骨细胞在SBN和SPK上培养48 h后的细胞毒性作用。

3.6 SBN和SPK对细胞行为的影响

通过激光扫描共聚焦显微镜观察样品表面的细胞形态。将细胞骨架用由Alexa488标记的鬼笔环肽（绿色）染色，并用DAPI（蓝色）染色细胞核。在初始阶段，在所有供体细胞培养两天后，可以检测到SPK上的细胞附着较好，而SBN培养的细胞继续呈现圆形。与SBN组相比，在14天后，在SPK组中观察到很强的促增殖作用，随后在28天后观察到大量细胞黏附。三种供体细胞表现出相似的趋势（见图6以及附录A中的图S1和图S2）。进一步对细胞覆盖率（肌动蛋白面积/移植物面积）进行定量。供体1细胞在第7天、第14天和第28天，供体2细胞在第2天和第28天，供体3细胞在每个时间点均发现了显著差异（图7）。

图6 在第2天、第7天、第14天和第28天通过激光扫描共聚焦显微镜拍摄的供体1成骨细胞行为的代表性图像。

图7 植骨材料的细胞覆盖率定量，即肌动蛋白区域/移植物区域。（a）供体1；（b）供体2；（c）供体3。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。

3.7 SBN和SPK的分泌蛋白定量分析

对于成骨相关标志物，OC在SBN中表现出比在SPK中更高的表达。图8显示第2天和第7天的供体1细胞，第2天、第21天和第28天的供体2细胞和所有时间点（第21天除外）的供体3细胞，两组的OC表达具有显著差异。然而，与在SBN上培养的细胞相比，在SPK上培养的细胞分泌更多的OPN和OPG。在培养时间点的晚期，OPN显著增加，如所有三个供体细胞在SPK上培养21天和28天之后的OPN。供体1细胞和供体2细胞第14天的OPN表达也存在统计学差异。SPK上的细胞的OPG分泌高于SBN上的，但是只在第7天、第14天和第21天观察到供体1细胞存在显著差异，供体2细胞只在第28天观察到差异。对于DKK-1和SOST，仅在供体2细胞培养第2天时发现了显著性差异。对于IL-6，两组之间只在供体2细胞培养第7天时发现差异。对于TNF-α，在SBN和SPK两组中的分泌均保持在低水平。在整个实验中，所有三个供体细胞都显示出相似的趋势（图8）。

图8 特定分泌蛋白的定量。（a）供体1；（b）供体2；（c）供体3。 *p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。

3.8 动物实验和CBCT评估愈合结果

使用猪的颅骨缺损构建体内评估的骨缺损模型。术后即刻以及术后的第8周和第16周，进行CBCT扫描并获取图像。术后第8周，植入SBN和SPK的骨缺损区域被新骨覆盖，而对照组仍有一半区域无骨组织填充（图9）。经过16周的观察，对照组中的缺损仍然很明显，而SBN和SPK组显示出完全愈合的迹象。

图9 CBCT分析在不同时间点的代表性图像。（a）、（d）手术后即刻；（b）、（e）手术后8周；（c）、（f）手术后16周。

3.9 micro-CT评估

分析micro-CT重建的模型。值得注意的是，经过8周的愈合，SBN样品没有完全降解，而植入SPK样品的缺损区域无法检测到残留样品，表明该植骨材料被完全吸收。经过16周的愈合，由于新骨形成，缺损区域无法检测到SBN和SPK（图10）。

图10 对照组（a）、SBN组（b）和SPK组（c）愈合8周和16周后缺损区域的Micro-CT 3D重建的代表性图像。

在每个样品中选取直径为16 mm、厚度为4 mm的圆柱形ROI进行定量（图11）。为了研究样品对缺损区域以外空间的影响，创建了另一个高度为5 mm（两侧为2.5 mm）的ROI区域[图11（a）、（b）]。经过16周的愈合，观察到两组之间的BV/TV存在显著差异。与对照组和SPK组相比，SBN组的BV/TV最高，且有显著差异。与对照组相比，SPK组也表现出更高的BV/TV [图11（e）]。对于BS/BV，两组未检测到显著差异[图11（f）]。在术后8周，将SPK组与对照组进行比较，BS/TV存在显著差异，并且在16周后两个治疗组与对照组之间存在显著差异[图11（g）]。对于骨小梁的相关参数，与对照组相比，SPK组的Tb.Th和Tb.Sp较低[图11（h）、（i）]。SBN组在16周后也表现出最低的Tb.Sp，与对照组和SPK组相比存在显著差异[图11（i）]。

图11 缺损区域中新骨形成的定量分析。（a）、（b）ROI示意图。ROI设置为一个圆柱体，具有两个不同的高度（4 mm和5 mm）；（c）、（d）从边界到缺损区中心的代表性BV/TV变化曲线，高度为4 mm。（e）~（i）基于4 mm高度ROI的定量结果；（j）~（n）基于5 mm高度ROI的定量结果，*p < 0.05表示SPK与SBN之间有显著差异，#p < 0.05表示SPK组与对照组之间有显著差异。

对高度为5 mm的扩展ROI区域进行分析，尽管SBN和SPK组在术后16周均有较高的BV/TV，但仅在比较SBN和对照组时才检测到显著差异[图11（j）]。BS/BV、BS/TV、Tb.Th和Tb.Sp的结果显示出与4 mm高度的ROI区域结果相似的趋势[图11（k）~（n）]。

观察BV/TV随着缺损边缘至中心的变化曲线，可以看到SBN组和SPK组整体比对照组表现更好。经过8周的愈合，在缺损边界附近，SBN组的骨量高于SPK组；而在靠近中心处，SPK组比SBN组促进了更多的骨形成。经过16周的愈合，SBN组和SPK组均表现出均匀分布的BV/TV，SBN组的BV/TV整体比SPK组更高[图11（c）、（d）]。

3.10 缺损区域的组织学评估

经过8周的愈合，在SBN组和SPK组中均观察到新骨形成，骨组织完全覆盖在靠近底部（脑侧）的缺损区域。而在顶部仍可以观察到来自植骨材料的残留颗粒（图12）。经过16周的愈合，在SPK组中观察到了新生的全层厚度的骨组织，并且植骨材料已被完全吸收。但是，SBN在降解方面弱于SPK。在对照组中，缺损区域也形成了骨组织，尽管骨量低于实验组。在SPK组中，从中心到边界骨骼结构逐渐成熟，靠近中心的骨小梁厚度整体大于接近边界的骨小梁厚度，在新生骨组织和缺损边缘之间存在明显的边界。

图12 三组植入物Van Gieson染色的代表性图像。（a）经过8周的愈合；（b）经过16周的愈合。

4、 讨论

SBN具有类似于天然人松质骨的微观结构，与基于牛的异种骨相比，聚合物增强的SBN具有更好的骨整合性能[30,32]。在分析SPK上的聚合物涂层时，发现其微观结构与SBN相当。此外，EDX分析结果显示明胶均匀分布在支架上。这是一种统计学上均匀的涂层结构，该结构是为了模仿天然骨组织并不完全均匀的结构特征[33]。

micro-CT分析证实，SBN和SPK都具有令人满意的结构特征。添加不同类型的明胶不会影响植骨材料的孔结构。SBN和SPK都具有理想的孔隙率和孔径，所有孔都是相互连通和开放的。由生物聚合物和明胶制成的涂层均匀地分布在孔中，而不会影响其连通性。这种组合为细胞附着提供了一个理想的环境，从而允许细胞迁移和增殖。

尽管不同供体细胞的活力有所不同，但改变明胶来源并未显著影响植骨材料的细胞毒性。实验结果表面，SPK具有比SBN更好的微环境以利于成骨细胞的黏附和增殖；这不仅表现在初始阶段，而且在后期的时间点亦是如此。定量结果进一步证明，SPK表面具有更高比例的细胞覆盖率。

Luminex结果提供了有关SBN和SPK如何影响成骨细胞表型的详细信息。OC是骨骼中最丰富的蛋白质之一，仅由成骨细胞产生[34‒37]。SBN具有牛来源的明胶涂层，促进了OC的分泌。OC参与矿化过程而不是基质的生成。因此，SBN上的细胞更倾向处于矿物沉积状态，而不是增殖状态。OPN是一种分泌的磷蛋白，在骨骼的矿化基质中被首次鉴定。OPN与免疫调节和伤口愈合有关[38‒43]。OPN也是骨基质中连接有机-矿物界面的结构分子，并有助于骨骼的结构完整性和韧性[44]。来自所有供体的成骨细胞在SPK样品上分泌了更多的OPN，表明这些细胞经历了组织修复和再生的过程。另一方面，由于OPN也是含RGD序列的分子[45‒47]，因此SPK组中OPN的分泌增强可以进一步促进细胞迁移、黏附和增殖，从而与SBN骨移植相比增强了其生物活性。在所有供体细胞中，DKK-1和SOST的分泌几乎没有任何差异。因此，SBN或SPK都不会抑制成骨。

OPG是核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的诱饵受体；由于它阻断了核因子κB受体活化因子配体/核因子κB受体活化因子（RANKL/RANK）之间的相互作用，因此抑制了破骨细胞的分化和功能[48‒51]。在SPK表面的成骨细胞整体表现出比在SBN表面细胞的更高的OPG表达，这表明将SPK植入骨缺损区域，可能会抑制破骨细胞活性，有利于骨修复的过程。IL-6和TNF-α也是破骨细胞形成的重要介质[52‒53]。尽管TNF-α在整个过程中表达上升，但在任何供体中，两组之间都没有差异，并且浓度保持在较低水平。在整个实验中，所有供体的IL-6水平相对稳定，除了供体2细胞在SBN组培养7天后降低。这些结果表明，SBN和SPK对破骨细胞的激活影响较弱。

动物实验进一步证实了SBN和SPK的成骨功能。植入8周和16周后使用CBCT可以观察到骨长入和缺损修复。使用micro-CT分析，发现SBN和SPK都可以促进新骨形成，而SBN产生的骨量高于SPK。当将ROI区域扩大到5 mm高度时，骨结构参数几乎没有下降，表明植入物的修复效果不仅限于骨移植面积，而且还扩展到周围的组织。BV/TV变化曲线进一步证明，在成骨早期SPK的成骨作用比SBN更强，而在16周后，SBN的骨形成比SPK更多。材料植入16周后，SBN组和SPK组的新生骨均表现出均质的结构。组织学评估进一步表明，术后8周，SBN和SPK并未被完全吸收；而术后16周，SPK被完全降解，缺损区域被新生的骨组织填充，且该骨组织具有相对成熟的结构。

植骨材料通常在植入后经历吸收和重塑过程。吸收和体积维持之间的适当平衡对于实现理想的骨重塑很重要。因此，理想的植骨材料应当被骨骼取代，并以合适的吸收率进行重塑[20,54‒55]。在本研究中，SBN和SPK显示出不同的降解速度。与SPK相比，SBN的吸收速度较低，但是植入16周后，均被完全吸收。尽管在此过程中，低龄猪具有相对较高的代谢水平（这可能会加速吸收过程），但其再生速度仍然与降解速度相匹配。组织学分析结果也证实了这一发现：从中心到边界形成了成熟的骨组织。因此，SBN和SPK提供了不同的吸收/再生平衡的解决方案。

5、 结论

本文研究了不同来源明胶的骨再生潜力。为了评估成骨性能，将不同来源的明胶整合到异种复合植骨材料Smartbone®中。研究证明，来自牛和猪的明胶可以被成功、安全地负载于植骨材料上，并可以承受制备过程，包括使用侵蚀性溶剂和灭菌的过程。体外实验证明明胶的添加可以影响成骨细胞的生物效应，体内实验证明了其成骨效应。研究结果发现SBN可以增强人成骨细胞OC的分泌，而SPK可以上调OPN。两种植骨材料都促进了成骨，但SPK比SBN更早降解。总的来说，这些异种复合植骨材料可以实现理想的吸收和骨再生平衡。

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