水泥基材料的多功能、可持续和生物非脲解自愈系统

Mohammad Fahimizadeh ,  Pooria Pasbakhsh ,  Lee Sui Mae ,  Joash Ban Lee Tan ,  R.K. Singh Raman

工程（英文） ›› 2022, Vol. 13 ›› Issue (6) : 217 -237.

工程（英文） ›› 2022, Vol. 13 ›› Issue (6) : 217 -237. DOI: 10.1016/j.eng.2021.11.016

水泥基材料的多功能、可持续和生物非脲解自愈系统

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Multifunctional, Sustainable, and Biological Non-Ureolytic Self-Healing Systems for Cement-Based Materials

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Abstract

Microbially induced calcium carbonate (CaCO3) precipitation (MICP) has been investigated as a sustainable alternative to conventional concrete remediation methods for improving the mechanical properties and durability of concrete structures. To date, urea-dependent MICP is the most widely employed MICP pathway in biological self-healing concrete research as its use has resulted in efficient CaCO3 precipitation rates. NH3 is a byproduct of ureolysis, and can be hazardous to cementitious structures and the health of various species. Accordingly, non-ureolytic bacterial concrete self-healing systems have been developed as eco-friendly alternatives to urea-dependent self-healing systems. Non-ureolytic pathways can improve the physical properties of concrete samples and incorporate the use of waste materials; they have the potential to be cost-effective and sustainable. Moreover, they can be applied in terrestrial and marine environments. To date, research on non-ureolytic concrete self-healing systems has been scarce compared to that on ureolytic systems. This article discusses the advances and challenges in non-ureolytic bacterial concrete self-healing studies and highlights the directions for future research.

关键词

自愈混凝土 / 机械性能 / 耐久性 / 非脲解途径 / 水泥复合材料 / 可持续性

Key words

Self-healing concrete / Mechanical properties / Durability / Non-ureolytic pathways / Cement composite / Sustainability

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Mohammad Fahimizadeh,Pooria Pasbakhsh,Lee Sui Mae,Joash Ban Lee Tan,R.K. Singh Raman. 水泥基材料的多功能、可持续和生物非脲解自愈系统[J]. 工程（英文）, 2022, 13(6): 217-237 DOI:10.1016/j.eng.2021.11.016

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1、 引言

由城市地区的迅速扩大和人为温室气体排放造成的越来越不稳定的天气模式，需要更具弹性和耐用性的结构，同时最大限度地减少其对环境的影响。改善城市基础设施已被强调为实现全球可持续发展的主要挑战[1]。基于对替代性建筑材料和策略的广泛研究，提出了一个可持续建筑实践的路线图，使建筑业能够适应当前千年的挑战。目标是创建出能够延长使用寿命并弹性抵抗各种压力的绿色结构，从而使不断扩大的建筑部门与温室气体排放脱离关系[2‒4]。提出的策略之一是使用智能自愈水泥复合材料，该材料受结构变化的影响，能够在没有人为干预的情况下做出相应的反应。

为了解决传统混凝土结构遇到的结构和环境问题，提出了混凝土自愈系统。这些问题包括：①混凝土的低抗拉强度、冻融和收缩导致结构表面形成裂缝；②水和腐蚀性物质会通过结构表面的裂缝和孔隙进入并在水泥基质的互连空隙中扩散；③在早期阶段就开始的极端结构退化；④混凝土的自愈能力在时间上和修复规模上均不足；⑤对可见和可触及的表面裂缝进行人工修复在时间和成本上存在局限性；⑥水泥工业带来了相当大的环境负担[5‒9]。混凝土能够具有自愈能力的原因在于：① Ca(OH)2的碳化产生CaCO3，可以堵塞小孔并修复小裂缝；②空隙和裂缝周围的水泥基质水化并膨胀；③通过水流将脱落的颗粒输送到空隙和裂缝中[10]。然而，Ca(OH)2的供应是有限的，相应的纯碳化速度也很慢。因此，研究人员试图在更好地了解不同的养护条件（如在湿、湿-干或潮湿条件下的养护）对混凝土自愈能力的影响的基础上[11‒13]，通过结合含有化学[14‒17]、生物[7,18‒22]或矿物[23]自愈剂的自愈系统，来提高混凝土的自愈能力。值得注意的是，混凝土自愈系统已经在各种水泥基材料上进行了设计和测试。在这一研究领域，混凝土一直被用作包含不同水泥复合材料的总称。

为了克服自愈混凝土修复的局限性，研究人员开发了基于矿物[24]、化学[14‒17]和生物[20‒21,25]自愈剂的混凝土自愈系统。这些试剂通过：①直接添加[18,26]、②封装[20,24]，以及③脉管系统[27‒29]进行输送；也可以固定在纤维上[30‒31]。基于化学的系统可能包括单一的自愈合剂，如氰基丙烯酸酯[14]和环氧树脂[32]，或者依赖于多种化学物质的反应，如双组分聚氨酯泡沫[33]。这类化学品可以在裂缝形成后发生膨胀，以阻止腐蚀性物质通过裂缝进入[33‒34]。化学混凝土自愈系统具有显著的优势，如基于两种化学品的系统具有较长的保质期，并且可能具有快速反应时间。然而，化学自愈系统可能会带来环境污染的风险，干扰未来的混凝土回收，并可能导致水泥黏结不充分[35]。

在过去的20年里，研究者已经探究了用以修复混凝土结构的生物技术策略[9,36‒38]。这类技术依靠沉淀CaCO3的微生物来修复混凝土结构的裂缝并堵塞孔隙。它们涉及人工将细菌孢子和营养物质引入开裂的混凝土样本表面，或将它们作为一种自愈机制掺入这些样本中。碳酸钙是一种天然的与水泥相容的填料，存在于混凝土中，不会对环境造成不利影响。当混凝土出现裂缝时，水和大气中的气体渗入结构并激活休眠的生物修复剂，如图1 [26]所示。自愈剂通过微生物诱导的CaCO3沉淀（MICP）来填补这些裂缝。当周围环境中存在钙时，大多数细菌会沉淀出CaCO3。假设细菌沉淀CaCO3是为了加强它们的细胞外基质和生物膜，以更好地抵抗环境压力，如高盐度和机械力，或者只是作为储存离子或调整其浓度的一种手段[39]。请注意，MICP可以通过不同的过程并在不同的环境条件下实现。适合渗入混凝土自修复系统的细菌必须满足：①能耐受碱性混凝土环境（pH值为9~13）；②能形成孢子；③能在水泥环境中沉淀出CaCO3 [26,36,40]。孢子的形成是必不可少的，因为无性繁殖的细菌细胞不能耐受混凝土的搅拌过程和高碱性的水泥环境。

图1 水流通过混凝土裂缝使休眠的细菌复苏（a），导致CaCO3沉淀并密封裂缝（b）[26]。

与细菌不同，孢子可以在恶劣的条件下存活，并在达到有利的条件（O2、水和营养物质的供应）之前保持休眠状态。这一特点可以防止孢子发芽，直到混凝土结构中的结构缺陷允许孢子发芽所需的水和氧气的渗透。对满足上述标准的细菌根据所利用的占主导地位的MICP途径进行分类。

根据基本的MICP途径，生物混凝土自愈系统大致可以分为两类。脲解系统使用尿素和微生物前体进行CaCO3沉淀[公式（1）和公式（2）]，而非脲解系统依靠各种营养物质和前体。到目前为止，脲解系统比非脲解系统的设计受到了更多的研究关注，主要是因为已经发现尿素分解菌在特定条件下能诱导CaCO3快速沉淀[35,41‒43]。脲解菌和脲酶的特征很清楚，尿素水解被认为是一种有效的MICP途径[44]。然而，尿素分解菌的MICP途径会产生NH4+作为副产品（每摩尔CaCO3产生1 mol NH4+）[36]。NH4+会引起pH值上升，从而增加脲解自愈混凝土的CaCO3沉淀率。然而，如果NH4+与硝化细菌接触或条件允许其以NH3 (g)气体的形式挥发[公式（3）]，则在pH值下降后可能会发生CaCO3溶解，这可能会损害混凝土结构[45]。此外，NH4+对包括人类在内的各种生物体的健康有害[46]。脲解混凝土自愈系统对环境的不利影响会限制其应用，阻碍其商业化。尽管大多数MICP研究是基于脲解菌，但这些微生物需要特定的条件才能生存并充分发挥作用，由此限制了它们在特定环境中的使用[41]。因此，不需要尿素的非脲解菌已经被研究，并被纳入混凝土自愈系统。

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本文综述了当前非脲解系统及其组成、研究成果和非脲解生物自愈混凝土的发展进程。还讨论了阻碍这些系统应用性的其他挑战以及研究空白和未解决的问题，并强调了未来的研究方向。

2、 非脲解MICP途径

迄今为止，已经报道了多种非脲解的MICP途径。这些自养途径包括：①非甲基化产甲烷[47]，②有氧、无氧光合作用[48]，以及③异养途径，如有机盐的转化[36,49]、甲烷氧化[50]、硫酸盐还原[51]和反硝化[52]。一般来说，非脲解MICP的影响因素包括：① Ca2+浓度；②溶解无机碳浓度；③pH值；④成核位点丰度[43,53‒54]。这些参数与细菌种群水平、细菌菌种和改变细菌活性的环境条件（如温度）一起，主要与CaCO3沉淀的规模有关。MICP途径及其对混凝土自愈的适用性已经得到全面研究[55]，影响MICP的因素也已经得到研究[22,54]。在此之前描述的非脲解MICP途径中，只有有机盐氧化、反硝化和光合作用驱动的MICP与混凝土自愈兼容。各种问题阻碍了其他途径的研究。例如，依赖氨化的MICP会导致大量NH3产生；依赖甲烷还原的MICP会释放硫化氢；硫酸盐还原菌的作用经常导致金属腐蚀，对建筑物构成严重威胁[56‒58]。因此，研究人员还没有研究混凝土自愈产生不必要的副产品的途径。新发现的非脲解和具有嗜碱性MICP能力的细菌物种，可用于生物非脲解性细菌混凝土自愈的研究，扩展所述的MICP途径[59]。

2.1 有机盐的氧化

某些依靠有机化合物（如乳酸）的代谢来生产能量的好氧（AE）细菌，能够沉淀CaCO3作为其代谢功能的副产品。有机钙盐，如乳酸钙（Ca-L）和乙酸钙（Ca-A），能够提供MICP所需的Ca2+，而细菌可以代谢有机阴离子以产生能量。某些AE异养细菌已作为混凝土的生物修复剂得到研究。

一些细菌种类对碱性水泥环境有抗性，如假强芽孢杆菌（Bacillus pseudofirmus）[20,36,40,49,60]、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）[61‒62]、科氏枯草芽孢杆菌（B. cohnii）[40,63‒65]、碱腈芽孢杆菌（B. alkalinitrilicus）[66]、结核芽胞杆菌（B. thuringiensis）[67]和嗜碱芽孢杆菌（B. halodurans）[40]。当应用于混凝土时，这些细菌能够成功沉淀CaCO3，实现混凝土自愈的各种独特功能。体外和原位研究中，已经报道了Ca-L中的假强芽孢杆菌等嗜碱菌能够有效沉淀CaCO3 [36,49]。在混凝土修复研究中，基于有机盐氧化的MICP已经被用作表面处理或自愈剂。从1 mol的Ca-L中，细菌可以产生1 mol的CaCO3和5 mol的CO2 [公式（4）] [68]。产生的CO2可以与混凝土基质中丰富的Ca(OH)2反应，产生CaCO3 [公式（5）]。在非限制性的Ca2+的存在下，1 mol的Ca-L可以导致6 mol的CaCO3沉淀[公式（4）和公式（5 ）]。在这个过程中释放的水有助于水泥水化和细菌活动。这种途径被认为是脲解的可持续替代方法；它不产生有害的副产品，可利用工业或发酵废弃物作为其潜在有机基质[69‒70]。

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2.2 反硝化作用

与尿素分解和有机盐的氧化不同，反硝化作用不依赖大气中的O2，因为反硝化细菌利用NO3-作为有机基质氧化的最终电子受体，产生CO2，随后水化为HCO3- [公式（6）和公式（7）] [71]。因此，反硝化细菌可以在缺氧的环境中发挥作用，当有Ca2+时，可以在碱性条件下沉淀出CaCO3。反硝化途径涉及四种酶和中间体，如N2O，一种对脊椎动物健康有潜在危害的物质，可以作为钢铁腐蚀抑制剂[72]。在最佳条件下，N2O不会在系统中积累；但是，碱性的混凝土环境可能导致N2O的积累[73]。反硝化依赖性MICP已在混凝土修复中得到研究，并推荐应用于低氧环境，如积水土壤，因为它是唯一适合混凝土自愈的厌氧（AN）非尿素分解MICP途径[74]。硝酸钙（Ca-N）是钙和硝酸盐的来源，通常用于依赖反硝化的混凝土自愈系统[25,74]。铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和硝基还原菌（D. nitroreducens）在脱水、营养匮乏和高碱性的条件下表现出弹性；相应地，它们被提出并被研究用于混凝土修复方面[75]。

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2.3 光合作用

细菌可通过自养和异养途径摄取CO2以促进MICP。蓝藻的CaCO3沉淀取决于光合作用期间吸收CO2所产生的碱性胞外介质[76]。在光合作用过程中，CO2通过生化的CO2螯合机制在细胞内浓缩，从而在细菌细胞周围形成碱性环境。在钙的存在下，CaCO3可以在细胞外沉淀[公式（8）和公式（9）]。蓝藻通过有机同化物和CaCO3沉淀物的形式捕获CO2，这一能力使其成为值得关注的潜在碳捕集与封存（CCS）剂。通过在异养细菌中减少大气中CO2，MICP的发生归因于碳酸酐酶的作用，它同时促进了CO2的水化[77]。蓝细菌聚球藻PCC8806对混凝土环境具有耐受性，并能在混凝土的环境条件下沉淀出CaCO3 [48]。

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3、 非脲解生物混凝土自愈系统

与依赖尿素的系统相比，对非脲解生物混凝土自愈系统的研究较少。然而，它们是首批经过测试的生物混凝土自愈系统之一，并已成功应用于这一新的科学领域。它们为科学进步和工程应用提供了新的领域，其取得的进展基础可以概括为以下几点。

· 非脲解细菌可以在多种环境条件下通过各种代谢途径沉淀出CaCO3。这一特性使得开发多功能的修复系统成为可能，它可以依赖于不同的基质、在不同的环境条件下发挥作用，并服务于各种目的，如同时进行混凝土自愈和CCS。

· 非脲解细菌混凝土自愈系统可以在细菌群落（不同细菌种类的混合物）中包含一种以上的细菌种类。虽然对于脲解细菌也是如此，但非脲解菌群可以通过不同的非脲解MICP途径沉淀出CaCO3，表现出多功能和灵活的自愈性能。例如，非脲解菌群由能够在AE和AN条件下进行MICP的生物组成，满足混凝土表面和结构深处缺氧裂缝的自愈需求。

· 与脲解细菌不同，非脲解MICP不含有害和不必要的副产品，在自愈系统中不需要尿素。尽管从含有脲解细菌的混凝土结构中浸出的NH3/NH4+的量看起来很少，但在大规模或广泛应用的情况下可能构成严重的威胁。混凝土被认为是最丰富的人造材料。因此，自愈混凝土等新型混凝土技术在未来的大规模应用是必然的。此时，与脲解系统有关的NH3/NH4+的存在会成为一个问题。在许多生态系统中，NH3/NH4+是一种自然成分，与其他化学和生物成分处于平衡状态。改变它们的浓度可能会对自然环境造成灾难性的影响，因为活性氮物种，如NH3/NH4+，可导致森林[78]、湖泊和溪流[79]的富营养化和生物多样性的丧失，并会消耗平流层的臭氧[80]；总体而言，它们会造成人为的全球变暖。此外，NH3/NH4+会加重许多健康问题，如癌症、呼吸系统疾病和心脏疾病[81]。

· 非脲解生物混凝土自愈系统为可持续生产完全依靠回收的或环境友好组件的自愈系统提供了一个机会。通过这种策略，生物自愈系统可以推动废物衍生材料进入市场。可以根据特定地区的可用资源，在当地设计出非脲解系统。

对非脲解细菌混凝土自愈研究的关注，是由人们对找到脲解MICP的环境友好型替代品的兴趣所驱动的。这两种生物方法采用不同的细菌菌株，非脲解系统不包括尿素。然而，其余的组成部分，如氮和钙源、载体材料和自愈的评估方法，大体都是相似的。接下来将对迄今为止报道的非脲解系统进行阐述和讨论。

3.1 生物自愈混凝土的基质

3.1.1. 支持细菌生长、活动和CaCO沉淀

在开始自愈之前，必须支持细菌群体的健康生长。基本元素，如C、H、O和N，通常通过添加复杂的培养基，如酵母提取物，提供给生物混凝土系统。这种提取物包括酵母细胞自溶消化的水溶性残余物，主要由单一的氨基酸或短链肽、核酸、碳水化合物、糖、维生素和盐组成。酵母提取物是众所周知的氮源，富含B族维生素，是经过验证的廉价且安全的微生物培养基，可以支持各种微生物的生长。其他微生物培养基成分，如营养肉汤、肉类提取物（如牛肉提取物）和蛋白胨，也可用于支持生物混凝土系统中的细菌活性。与酵母提取物类似，上述成分以氨基酸和多肽提供氮，并含有碳水化合物、维生素和盐类。具体成分取决于制造商和基质来源。Ca的存在对于MICP必不可少，因为Ca离子浓度是决定MICP速率的主要因素。新鲜混凝土结构中Ca(OH)2的丰度表明更多的生物可利用Ca进行生物矿化。因此，在生物混凝土系统中，Ca源的存在对于早期的自愈不是必需的。由于Ca(OH)2的碳化程度极高且供应有限，在生物混凝土系统中添加Ca源对于老化的碳化水泥基结构的长期自愈至关重要[82]。非脲解细菌可以使用各种Ca基质进行MICP。有机钙盐，如Ca-L和Ca-A，已被用作钙和能量来源，因为细菌可以代谢有机阴离子作为碳源[83]。

不同的Ca基质对CaCO3沉淀和细菌种群生长的影响已有文献记载。Xu等[64]比较了以0.1 mol·L-1 Ca-L、Ca-Glut和氯化钙为基质的科氏枯草芽孢杆菌（107 cells·mL-1）的CaCO3体外沉淀情况。Ca-L和Ca-Glut都是可以作为钙源的有机盐，乳酸盐离子提供碳，谷氨酸离子含有碳和氮。培养28天后，据作者报道，与使用Ca-L的培养物相比，使用Ca-Glut（0.08 mol·L-1）的培养物的沉淀量是使用Ca-L的培养物的两倍；使用氯化钙的培养物的CaCO3沉淀率最低。作者认为，影响沉淀CaCO3总量的两个主要因素为钙源的选择和初始浓度，而不是CaCO3沉淀率。与含有Ca-Glut的培养物相比，使用Ca-L的培养物在培养一周后含有更高的细胞浓度（超过90%）。然而，28天后，使用Ca-Glut的培养物所含的细胞比使用Ca-L的培养物多大约50%；在所有培养物中，这些培养物的细胞存活率最低，最长可达28天。然而，28天后，它们保持了与使用Ca-L的培养物相同的种群水平。应该注意的是，初始钙浓度（0.05~0.2 mol·L-1）并不影响存活结果。细菌生长伴随着培养基的酸化，在使用Ca-L和Ca-Glut的培养物中，pH值从9.5下降到7.5~8.0。Tziviloglou等[83]在培养基中预培养了三种芽孢杆菌，每种培养基含有0.1 mol·L-1的Ca-L、Ca-A和谷氨酸钠。作者报道，在Ca-L和Ca-A上预先生长的分离物可能会在连续几代中产生对基质的偏好。该结果表明形成了代谢记忆，这可能导致前几代暴露于营养源的培养物中某些酶的上调。代谢记忆可以在遗传过程的不同层次上形成，是所有生命领域中普遍存在的一种现象[84]。未来的研究可以确定Tziviloglou等[83]报道的代谢偏好的因果遗传因素。Lors等[49]使用Ca-L（0.3 mol·L-1）和Ca-N（0.2 mol·L-1）的酵母提取物和不含Ca-N的酵母提取物，研究了假强芽孢杆菌的非脲解性MICP。研究人员报道了在有Ca-N的情况下的乳酸总消耗量，相反情况下则没有。在有Ca-N的情况下，观察到假强芽孢杆菌的种群水平增加了10倍。然而，这并没有增加CaCO3的沉淀，这可以解释为缺乏来自Ca-N的生物可用的Ca2+。种群水平可以显著影响沉淀的CaCO3的量[85]；因此，在基于MICP的修复系统中添加足够浓度的Ca-N以促进生长可能是有意义的。此外，无机钙盐，如Ca-N，可以与新鲜的混凝土基质反应，释放出游离的Ca2+，促进更多的CaCO3沉淀，改善自愈性能。与使用Ca-N相比，使用Ca-L的细菌CaCO3沉淀效果更好，也有关于脲解菌的报道[69]。请注意，在室温下，Ca-N的水溶性要比Ca-L高得多（即每100 mL分别为121 g和4.8 g）。

不同的有机钙源对混凝土结构的影响也得到了研究；Ca-N和Ca-F是成熟的混凝土外加剂，可以改善混凝土的物理性能并提供抗冻保护[74]。Jonkers等[36]报道，含有Ca-L的混凝土样本的抗压强度略有提高。Tziviloglou等[83]报道了含Ca-L（高达8%）和Ca-A（高达13.4%）的砂浆样本在固化28天后，以水泥重量的0.56%~2.24%供应时，抗压强度有所提高。Ducasse-Lapeyrusse等[86]发现，在经过一个月的固化后，Ca-L和Ca-Gluc有助于用方解石和钙矾石密封较大的新鲜裂缝（大于150 µm），这两种物质分别通过增加钙离子和碳酸盐浓度而产生自愈的产物。Ca-Gluc和Ca-L对小裂缝的密封效果均不显著。进一步研究添加了有机钙盐的水泥和混凝土样本的微观结构，可以揭示有机钙盐的影响是由于Ca2+浓度的增加，还是有机阴离子在沉降、凝胶形成和水泥基质水化中发挥作用。

3.1.2. 作为非脲解生物自愈混凝土的营养或钙源的废弃物

非脲解MICP被认为是脲解MICP的环境友好型替代品；因此，非脲解MICP所需的基质也必须通过可持续的过程来获得，以实现一个真正的可持续产品。有人建议加入废弃物，以降低生物混凝土修复剂的生产成本，并增加产品的可持续性因子[26,87‒91]。对于非脲解系统，Ca-L一直是一类常用的钙基质，因为它可以改善混凝土的物理性能，并作为非脲解细菌的钙和碳源[36]。Ca-L可以从发酵的植物废弃物[70]、回收的聚乳酸（PLA）[92]和造纸厂废弃物[93]中获得，这可能有利于非脲解细菌混凝土自愈剂的经济可行性和可持续性。Mors和Jonkers [26]测试了含有乳酸衍生物的非脲解系统，如乳酸（一种钙源）和非脲解细菌孢子；他们报道，开裂的样本恢复了明显的水密性。已经发现乳酸可以通过增强水泥的结晶结构，并与新鲜水泥中的Ca(OH)2反应产生Ca-L，来改善水泥的水化[94]。使用Ca-N来维持反硝化细菌，提高了细菌的存活率；然而，与使用Ca-L时相比，它使CaCO3沉淀量降低[49]。Ca-L和Ca-N的联合使用还通过生存保护改善了非硝化细菌的功能。专家认为，钙和硝酸盐不会完全相互分离，并且在某种程度上仍然无法被细菌利用。混凝土的结构完整性也可以通过Ca-A来改善，Ca-A是一种已知的环境友好型除冰剂，来源是植物废弃物转化的乙酸[95]。Jin等[95]将植物废弃物中超过22%的总有机碳转化为乙酸，并使用牡蛎壳作为环保的钙源来获得Ca-A。另一种有机钙盐Ca-F，以前对其作为非脲解细菌混凝土自愈系统的营养源进行过测试，可以从氯碱工业废料中获得[96]。将废弃物引入自修复系统可以降低生产成本，并使有害物质远离垃圾填埋场和环境，进一步促进了生物基混凝土自愈系统的可持续性。Vermeer等[97]报道了一种将废弃物和废弃物衍生物质整合到生物自愈混凝土中的新策略。该技术包括精炼富含聚羟基烷烃（PHA）的废水残留物，以作为非脲解生物混凝土自愈系统中的细菌营养物。通过这种方法，研究人员为质量不足以满足传统生物塑料应用的PHA提出了一种替代用途。比较使用和不使用废物源性PHA作为非脲解科氏枯草芽孢杆菌的细菌营养剂的样本自愈结果，前者具有更高的裂缝修复效率和更低的吸水率。应该注意的是，科氏枯草芽孢杆菌产生胞外酶来代谢PHA。这种研究方法是基于混凝土的常规应用，利用生物自愈混凝土作为难以产生经济效益的废物衍生产品的利基领域。此外，它还确定了一条生物自愈混凝土可以为可持续资源管理做出贡献的途径。

Song等[92]使用可重复使用的惰性离子催化剂将PLA废弃物回收为Ca-L，得到了大于70%的Ca-L产率[93]。以软木预水解物和造纸厂废弃物的混合物为原料，合成乳酸，获得的Ca-L是一种不需要的副产品。因此，混凝土自愈系统可以利用其他行业的废弃物，为经济可行性和可持续发展做出贡献。某些工业废弃物，如高炉炉渣和废玻璃，已经成为替代水泥的既定选择[98‒101]。对类似废弃物的研究，包括钢铁、铜、锌和铁生产的炉渣，已经显示出作为潜在的水泥替代物的前景，因为它们富含水泥基材料，如钙和镁的氧化物，可以作为生物矿化前体加以利用[89,102‒103]。需要注意的是，当这种氧化物被用作MICP的钙源时，它们会引起不良的水泥膨胀[104]，这可以通过固定生物修复剂来预防。氧化物也可以从回收的蛋壳[105]和水生生物矿化动物（如软体动物和牡蛎）的壳中提取[106‒107]。

Røyne等[108]描述了用安全芽孢杆菌对石灰石进行微生物酸消化，随后用尿素分解菌进行再沉淀的过程，称为“BioZEment方法”（图2）。该技术可持续地将石灰石转化为MICP的廉价钙源（第一阶段）。然后，脲解细菌增加浆液的pH值并沉淀方解石晶体（第二阶段）。pH值的增加主要是由于尿素分解产生的NH4+的存在。即使在没有NH4+的情况下，浆液和来自添加的细菌营养物的氨基酸之间的相互作用也能将pH值提高到7。这种方法的可行性可能取决于使用哪种类型的非脲解细菌，并需要一个去酸化步骤。我们进一步进行了生命周期评估，并通过评估该过程的全球变暖潜力，研究该技术与传统混凝土生产相比的环境效益[109]。研究结果表明，BioZEment方法的全球变暖潜力比传统的混凝土生产低70%以上；但是，它需要更多的土地面积，并可能导致发生富营养化和NH3进入问题。使用BioZEment方法的成本估计超过传统混凝土生产的10%以上。

图2 提出的两阶段石灰石溶解-结晶过程的示意图（改编自参考文献[108]）。

本节所述的研究表明，可利用各种废弃物和副产品材料作为细菌营养物或钙源，用于非脲解自愈混凝土的MICP。此外，研究表明，非脲解生物自愈混凝土可以成为建筑业、污水处理部门以及产生有机垃圾或富含金属的企业的一个融合点。这个机会为非脲解生物混凝土自愈系统的研究人员提供了将其工作扩展到其他工业废弃物和副产品的前景。有几个实际步骤可以使未来对非脲解生物混凝土自愈的替代营养源的研究受益。例如，建立对细菌所进行的代谢过程的清晰认识，可以帮助研究人员预测各种因素（如细菌数量、温度、pH值、载体）对代谢的影响。此外，这可以帮助研究人员识别营养源消化后留下的代谢物或残余物，以确保不会随着时间的推移产生有害的副产品，这些副产品会破坏混凝土结构和载体材料，或抑制细菌生长。另一个关键步骤是自修复系统的生命周期评估，可能类似于Mors和Jonkers [26]进行的评估；该评估考虑了替代营养物或钙源的环境足迹。此外，它允许对系统的可持续性进行更细致的检查，并有助于确定在系统的生态足迹中未曾考虑的因素。

3.2 非脲解修复剂的固定化和存活评估

尽管脲解系统和非脲解系统用于生物自愈的载体材料没有区别，但两者用于评估固定化和应用后的细菌存活率的方法是不同的。Rajczakowska等[110]深入研究了生物自愈混凝土中使用的不同载体对水泥/混凝土样本物理性能的影响。在这项研究中，综述了固定化后用于评估细菌存活率的技术。研究脲解系统的研究人员经常使用总氨氮测定法的尿素酶活性来分析脲解细菌的活性。由于这种方法不适用于非脲解系统，因此采用了其他几种方法来确定非脲解系统中的细菌活性。

3.2.1. 直接计数

微生物细胞的直接计数包括通过在特定的生长介质上生长细胞来量化活的微生物。Jonkers等[36]在每立方厘米的水泥样本中直接加入2.4×108个B.cohnii的孢子，并在固化9天、22天、42天和153天后通过粉碎样本估计孢子的存活率。他们使用最可能数技术来测量细菌数量，报道称，9天后细菌活性为1%，然后在4个月后下降到最低测试检测限（小于0.5×103 cells·cm-3）。在该测试期间用于将细菌细胞从水泥基质中释放出来的高机械力可能会改变结果。

Sharma等[40]也直接将假强芽孢杆菌、科氏枯草芽孢杆菌和嗜碱芽孢杆菌的孢子加入水泥浆。7天后，最初的假强芽孢杆菌接种物的回收率不到5%，浸水28天后下降至不到1%。科氏枯草芽孢杆菌和嗜碱芽孢杆菌的孢子存活率也以与假强芽孢杆菌类似的方式下降；然而，它们的孢子损失更为严重。总体而言，将孢子直接添加到水泥中与孢子存活率低有关，这可能是由于高碱性的水泥环境缺乏营养或氧气，或者在混合和沉淀过程中容易受到剪切力的影响。

直接计数法也被用来评估固定在固体载体中/上的细菌的存活情况。一项研究通过真空浸渍（2.2×107 CFU·g-1）将假强芽孢杆菌放入膨胀黏土颗粒（ECP）中[111]。然后将负载的黏土颗粒涂上8种不同的材料，并结合到混凝土样本中。通过直接计数来自不同年龄的粉末状生物自修复混凝土样本的假强芽孢杆菌细菌进行存活能力评估。凭借该技术，作者评估了各种涂层的保护能力，并报道了MgO和苯乙烯-丙烯酸酯等涂层的卓越保护作用，这些涂层可以堵塞ECP的孔隙。他们还报道，这种技术的灵敏度不是最佳的，但足以区分高水平和低水平的保护。

3.2.2. NO/NO消耗

测量NO3-/NO2-的消耗量一直是评估具有反硝化能力的细菌活动的可靠方法。Erşan等[72]研究了在硅藻土、膨胀黏土和颗粒活性炭中真空封装的NO3-还原铜绿假单胞菌或硝基还原菌纯培养物加入砂浆后的存活情况。他们还对被称为活化紧凑型反硝化核心的自我保护NO3-还原细菌混合物进行了这项测试。然后通过重新悬浮和低频超声处理从断裂的砂浆中取出细菌的NO3-和NO2-消耗量来评估存活率。在用于纯培养物的载体材料中，膨胀黏土和活性炭为细菌提供了比硅藻土更好的保护。使用离子色谱法对NO3-/NO2-的浓度进行量化[72,112]。

3.2.3. 细菌活动的O消耗量的测量

推断细菌活动的一个既定方法是测量细菌对O2的吸收。研究人员已经用这种方法来显示自愈系统和生物混凝土样本中的细菌活动。Wiktor和Jonkers [66]用Ca-L、酵母提取物和碱腈芽孢杆菌真空浸渍ECP。通过测量O2消耗量，他们发现这些细菌在水泥内保留9个月后仍存活。Sierra-Beltran、Jonkers和Schlangen [63]用Ca-L、酵母提取物和科氏枯草芽孢杆菌孢子浸渍轻质骨料（LWA），并测量O2消耗量以证明砂浆中的细菌活性。结果显示，在浇铸样本三个月后细菌具有活性。Mors和Jonkers [26]评估了掺有细菌乳酸衍生物的用于非脲解性自愈系统的砂浆对O2的吸收。根据记录的O2消耗量，他们验证了带有细菌的样本的存活能力优于非生物对照样本。根据O2消耗量的测量，他们还确定，一周后营养物质水平已经达到足够低的数量，限制了细菌的活性。

对O2消耗量的测量也被用来验证海藻酸盐固定细菌孢子的存活能力[113‒114]。Palin、Wiktor和Jonkers [113]报道，与非生物对照样本相比，8 ℃下浸没在人工海水中的细菌荚膜上方1 mm边界内的溶解O2浓度较低。溶解O2的水平在浸泡的第二天达到了记录的最低浓度。这项技术证明了细菌在寒冷海洋条件下的活性和新陈代谢。然而，O2消耗评估不能收集细菌种群存活能力的精确证据，以及关于细菌孢子是否留在荚膜内或冒险出来的证据。此外，尚不清楚海藻酸钙珠对愈合剂的固定效率。多孔水凝胶在荚膜制备的钙浴阶段和悬浮过程中往往会浸出愈合剂。所描述的O2测量实例表明，这种技术可以使研究人员验证固定化愈合剂的一般存活能力，并获得营养消耗的估计值；然而，这些测量并不能提供有关存活细菌群体的定量信息。此外，对于生物愈合剂在固定化过程中成功与否（即愈合剂提供固定化的程度或真空封装是否影响孢子的存活），这无法得出任何结论。上述研究都提供了固定化后孢子存活的定性证明，表明这些存活评估方法并不能精确衡量细菌的存活率或固定化过程和具体环境对修复剂的影响。它们只表明，对于混凝土的自愈来说，可检测到数量的细菌仍然有活力。因此，固定化过程对孢子存活的影响、有活力的孢子的发芽以及细菌孢子的确切保护程度（如载体）仍然是推测的。定性的结果为孢子在各种固定化过程中的存活提供了保证。然而，对于生物自愈剂的大规模生产，有必要对固定化过程的影响进行定量分析。

为了解决这些问题，我们尝试定量评估水凝胶固定化对细菌孢子的影响[20]。我们使用离子凝胶法将假强芽孢杆菌的孢子固定在藻酸钙荚膜中，该方法涉及藻酸单体与二价阳离子（如Ca2+）的交联。然后，实施一个优化的去交联程序来溶解藻酸钙荚膜，并使用直接计数法对孢子进行定量。结果表明，几乎所有的孢子都被成功地封装在荚膜内，在封装过程中没有丧失活力或发生浸出现象。此外，营养物质的存在并没有影响固定化过程的效率。可能是由于残留的水泥，去交联法不能溶解从水泥中取出的藻酸钙荚膜。然而，如果可以去除最外层，也就是说，如果涂层的藻酸钙荚膜与Gao等[60]描述的壳聚糖涂层的藻酸钙荚膜相似，那么可以评估放置在水泥中的藻酸钙荚膜中细菌的存活情况。

通过深入分析固定剂与保护载体之间的相互作用，可以更好地理解固定化过程对生物自愈剂的影响。这种分析可以阐明载体是否需要改进，以更好地保留或保护愈合剂，最终对材料支持的保护载体进行微调，为愈合剂提供长期功能。假设在一个虚构系统中加入108 spore·g-1的载体，99.99%的孢子如果不能在固定化或水泥浇铸中存活，106 spore·g-1的载体仍能以增强机械性能、裂缝修复和CaCO3沉淀的形式提供自愈结果。此外，细菌样本比对照样本消耗更多的O2。但是，自愈的效率显著降低。

同样，如果载体不能适当地保持愈合剂（如酵母提取物）与水泥基质隔离，自愈效率和功能就会降低，水泥基质可能会承受酵母提取物或类似MICP前体带来的有害影响。因此，研究人员不能忽视固定化技术和载体材料在保护和保持细菌孢子和其他愈合剂方面的效率。请注意，某些用于保护非脲解自愈剂的载体材料的性质可能不能精确和直接评估自愈剂的存活率和存活能力。Palin、Wiktor和Jonkers [114]使用O2测量数据来估计CaCO3的可能沉淀量；但是，他们没有报道估计量与获得的沉淀量的准确性；尽管如此，这种方法可以为研究人员提供一个策略。体外表征结果的相关性[例如，CaCO3沉淀量与这种性能指标（如O2消耗量）的估计之间的关系]可以产生更准确的存活能力估计值。此外，愈合剂的存活能力甚至可以帮助解释机械表征后系统的自愈行为。

4、 非脲解细菌混凝土自愈系统对混凝土的力学、物理和耐久性能的影响

非脲解生物混凝土自愈系统可以保护生物愈合剂，并为自愈作用提供所需的介质。相反，生物愈合剂在触发（如结构断层或裂缝）后执行自愈功能，这一触发能够促进休眠孢子发芽并导致营养物质和O2的生物利用。总体而言，非脲解生物自愈系统可以加强混凝土结构，提高其耐久性和机械物理性能。第3节描述了非脲解生物混凝土自愈系统的生物子系统和载体子系统之间的关系以及系统的保护功能。本节介绍了非脲解生物混凝土自愈系统的自愈功能（如非脲解自愈系统对混凝土样本的力学、物理性能和耐久性的影响）。

通过比较水泥和混凝土样本的力学参数（如抗压强度和抗弯强度）和物理性能（如孔隙率和裂缝尺寸的变化）的变化，研究了混凝土中非脲解系统的自愈能力。细菌的类型和数量、载体材料、营养物质、钙添加剂、样本组成和固化条件的变化不能够对报道结果进行稳定的比较。尽管如此，类似的测量技术已经被用来评估自愈前后的耐久性以及测样样本的力学和物理性能。这种共性使人们能够有意义地解释愈合剂对早期阶段样本特性的影响以及不同系统的自愈能力。

4.1 力学性能

4.1.1. 抗压强度

混凝土的抗压强度与结构耐久性的关联性已经得到确认。由于对载荷和压力的敏感性增加，压缩能力不足会导致裂缝的形成。这样的裂缝会通过增加水泥基质和钢筋对腐蚀剂的暴露，从而促使混凝土结构退化（即类似于高孔隙率的混凝土结构）[115]。因此，通常要对含有添加剂的实验性混凝土样本的抗压强度进行评估，以确定添加剂对结构强度和混凝土耐久性的影响。这种评估已得到广泛实施，目的是评估自愈系统对早期混凝土性能的影响，以及自愈系统随着时间推移增强混凝土结构强度的程度。

Mors和Jonkers [26]表明，直接加入6×108个假强芽孢杆菌孢子对水泥样本的初始抗压强度有延缓作用。在28天后，作者报道，与微裂缝（直径为0.01~0.1 μm）未被堵塞的对照样本相比，含有愈合剂的水泥样本中较大孔隙（0.8~1 μm）的频率下降。生物砂浆的最初抗压强度比非生物砂浆的抗压强度低60%。14天后，由于细菌的沉淀，它们的强度变得相似，并保持不变，直到第56天。Mondal和Ghosh [62]将103 cells·mL-1、105 cells·mL-1和107 cells·mL-1的枯草芽孢杆菌孢子加入混凝土中。他们报道，在3天后，所有细菌样本的抗压强度都高于对照样本，一直持续到第28天。在此期间，含有105 cells·mL-1的样本的抗压强度增长最高（与对照样本相比，增加了27%）。与相应的非生物对照样本相比，含有103 cells·mL-1、105 cells·mL-1和107 cells·mL-1的样本的吸水率也较低，即分别为13%、23%和27%。

Khaliq和Ehsan [61]直接加入或在LWA或石墨纳米颗粒（GNP）固定化后加入2.8×108 cells·mL-1的枯草芽孢杆菌和Ca-L孢子，据报道，与对照样本相比，细菌样本的抗压强度在第3天至第28天有所提高，导致LWA固定细菌的最大抗压强度提高12%，GNP固定细菌的最大抗压强度提高9.8%，但直接加入细菌的抗压强度仅提高3%。强度的提高归因于细菌的CaCO3沉淀，以及LWA和GNP替代了骨料从而改善了基质堆积，导致界面过渡带（ITZ）的形成减少。此外，细菌和载体表面之间的相互作用也可能影响愈合速度，产生成核位点，并促进生物膜的形成，可能会影响MICP，其方式类似于土壤颗粒对土壤细菌引起CaCO3沉淀的影响[116]。枯草芽孢杆菌使用Ca-A进行的体外MICP的评估表明，枯草芽孢杆菌通过生物膜的形成促进CaCO3沉淀[117]。之前的研究也注意到了枯草芽孢杆菌[118]和科氏枯草芽孢杆菌[64]的生物膜形成对MICP的重要性。使用Ca-A (0.25%, m/m)研究了枯草芽孢杆菌的体外CaCO3沉淀。他们报道，枯草芽孢杆菌通过生物膜的形成促进CaCO3的沉淀，并将pH值的上升与生物膜的发展联系起来。因此，关注细菌与载体的相互作用可以带来有益的发现，特别是当愈合剂是形成生物膜的细菌时。这种方法可以侧重于关注影响生物膜发育的因素，包括水的可用性[119]。

Khaliq和Ehsan [61]报道的直接添加愈合剂后抗压强度的提高与Jonkers等[36]的研究结果不同；后者表明，细菌孢子对混凝土抗压强度的延缓作用可能与物种有关。这一建议是可能的，因为这两项研究都使用Ca-L作为主要的营养源，而且孢子的浓度也相当。此外，数据表明10%的Ca-L对抗压强度有轻微的积极影响[36]。比较Khaliq和Ehsan [61]与Ramachandran和Ramakrishnan [37]（他们直接加入7.2×107 cell·cm-3的脲解巴氏芽孢杆菌，发现抗压强度没有改善）的研究结果，就抗压强度而言，枯草芽孢杆菌是直接添加的更好选择。然而，考虑到混凝土的结构完整性和自愈效率，直接在混凝土中添加愈合剂可能是不利的。

Luo和Qian [120]比较了由非脲解细菌孢子、Ca-L、Ca-N和Ca-F组成的系统的自愈能力。作者报道了细菌/Ca-F (1%, m/m)对水泥样本抗压强度的影响，即强度随着细菌/Ca-F浓度的增加而降低。从所报道的细菌/Ca-L的抗压强度结果中也可以明显看出不同水平的钙基质对抗压强度的影响。当3% (m/m)的细菌/Ca-L被添加到水泥样本中时，观察到最好的性能，导致最初的抗压强度损失；然而，10天后，其抗压性超过了对照样本。含有Ca-N的细菌随着Ca-N水平的增加而降低了抗压强度。据报道，孔径分布与使用的钙基质有关。对照样本的孔隙主要在10~100 nm的范围内，但加入自愈剂后，孔隙大小分布转移到100~1000 nm的范围内。作者建议将这一观察结果作为抗压强度变化的可能解释，并报道了使用细菌/Ca-L时对水泥凝固时间的不利影响；相反，细菌/Ca-N和细菌/Ca-F减少了水泥凝固时间。这种模式也报道了三种基材对水泥水化动力学的影响。这些发现提高了对自愈系统及其成分对水泥结构和系统优化影响的理解。

4.1.2. 抗弯强度

由于混凝土的抗弯强度较低（通常为抗压强度的10%~20%），混凝土结构因外力而发生弯曲往往会形成裂缝。因此，混凝土自愈系统对抗弯强度的影响已被评估为自愈基准。

在一项较早的研究中，Xu和Yao [65]评估了107 cells·mL-1科氏枯草芽孢杆菌孢子和Ca-L或Ca-Glut作为表面处理时的愈合能力。他们进一步评估了修复系统作为表面处理或自愈系统加入时对砂浆抗弯强度的影响。他们报道，在加入砂浆中时，没有因单个系统成分而对抗弯强度产生不利影响，甚至在早期研究中注意到在加入Ca-L的情况下，抗弯强度有轻微改善[36]。28天后，经过表面处理的砂浆的抗弯强度高于含有愈合剂的砂浆。在含有愈合剂的样本中，含有Ca-Glut的样本的抗弯强度是对照样本的两倍；含有孢子和Ca-L的样本表现不佳。含有Ca-Glut的样本的抗弯强度恢复率较高，这是因为细菌对Ca-Glut的CaCO3转化率较高。这导致生物沉积矿物层与水泥基质之间的过渡带更大、更密集（图3 [65]），在沉积层与水泥基质之间形成了牢固的结合。抗弯强度结果通过网格纳米压痕进行确认，并测量了不同样本的砂浆、外部沉淀物和过渡带的硬度和模量。在含有Ca-Glut的样本的过渡带观察到了最高的模量和硬度值，而在含有Ca-L的样本的过渡带观察到了最低的测量值。

图3 含有Ca-L（a）和含有Ca-Glut（b）的样本中过渡带的扫描电子显微镜（SEM）照片[65]。

Sierra-Beltran等[63]用Ca-L和酵母提取物浸渍LWA，并将科氏枯草芽孢杆菌孢子添加到应变硬化水泥基复合材料（SHCC）中。与对照样本相比，细菌的存在导致了抗弯强度的提高。此外，与对照样本相比，修复剂只稍微改善了SHCC的机械性能，CaCO3沉淀量不明显。营养水平不足被认为是细菌样本中缺乏可辨别的CaCO3沉淀物的可能解释，建议进一步研究。关于这一主题的文献报道很少；然而，这项研究可以作为评估未来水泥变体愈合系统的基准。

我们以前曾将海藻酸钙固定化的假强芽孢杆菌孢子和营养液加入水泥浆和砂浆中，发现水泥浆和砂浆的初始抗弯强度损失分别为38.96%和58.50% [20]。这可能是由于超吸水聚合物（SAP）过度吸水而对水泥基质产生的有害影响，导致基质中形成空隙[121]。对经过56天干湿培养的人工开裂样本的分析表明，水泥浆和砂浆样本的抗弯曲强度分别恢复了32.5%和39.6%。与非生物对照样本相比，细菌的存在使水泥浆和砂浆的抗弯强度的恢复水平分别提高了17.1%和10.3%。虽然最初的强度损失对于56天的自愈作用来说是非常高的，但结果表明海藻酸钙是一种很有前途的载体，能够支持修复剂到56天。结果进一步表明，砂浆中沙子的存在加速了抗弯强度的恢复，其中69%发生在孵化的前28天。相比之下，水泥浆样本的抗弯强度的恢复主要是在后28天观察到的（67%）；这可以归因于沙粒充当了CaCO3沉淀的额外成核点。这突出了海藻酸钙荚膜长期保护愈合剂的潜力。需要更长的潜伏期才能更好地了解如何改进这样的系统以延长自愈性能并在未来的研究中进行评估。

Gao等[60]用壳聚糖包覆含有假强芽孢杆菌的海藻酸钙荚膜，与不含荚膜的对照样本相比，抗弯强度增加了3.78%；仅1.2%~1.5%（含荚膜/含水泥）的荚膜被包含在内，这减少了预期的强度降低。此外，由于壳聚糖的pH响应性和较高的干燥温度（65 ℃）而减少的膨胀可以降低荚膜的膨胀和吸水率。虽然海藻酸盐荚膜的内部固化潜力严重减弱，但作者已经说明了水凝胶如何在混凝土中被用作细菌载体而不会造成最初的强度损失。未来，MICP驱动的自愈对水泥基样本的干燥收缩和自收缩的影响可以成为关于SAP包裹的生物混凝土自愈的研究方向，因为最近的研究结果表明，SAP的添加可能加剧水泥基样本的质量损失和收缩[122‒123]。

4.2 物理特性和耐久性

非脲解生物自愈系统对混凝土耐久性的影响主要是通过研究结构的透水性来评估的。非脲解混凝土自愈系统通过孔隙和空隙的堵塞以及CaCO3的沉淀进行裂缝的修复来实现这一功能。因此，提高了混凝土对化学和物理劣化的耐久性。

4.2.1. 孔隙度

尽管流体可以通过多种传输机制进入混凝土，但混凝土劣化的最重要参数是水泥基质的互连孔隙系统通过微裂缝进一步暴露于环境的程度[124]。因此，通过减少混凝土孔隙率来限制混凝土暴露在腐蚀中，一直是实现更耐用的建筑材料的策略[125‒126]。

Mondal和Ghosh [62]在混凝土中分别加入103 cells·mL-1、105 cells·mL-1和107 cells·mL-1的枯草芽孢杆菌孢子，并报道吸水率分别降低了13%、23%和27%；他们还报道，与相应的非生物对照样本相比，水的渗透深度降低了（图4）。然而，如第4.1.1节所述，在有105 cells·mL-1的样本中观察到抗压强度的改善最明显，这表明抗压强度与孔隙率测量之间存在差异。这种差异的原因被认为是细菌浓度越高，表面的CaCO3沉淀就越多。这减少了水和氧气从早期阶段就进入水泥基质的机会，可能会干扰水泥的水化和基质内的细菌活动。因不同的细菌水平而观察到的孔隙率和抗压强度的改善之间的差异，对于在不同的环境中或在不同的负载诱导压力下的应用可能具有实际意义。

图4 不同细菌浓度下28天的表面孔隙率变化。每张图片代表50 cm×50 cm的截面[62]。

Luo和Qian [120]比较了由非脲解细菌孢子和Ca-L、Ca-N或Ca-F组成的系统的自愈能力；他们报道，孔径分布与使用的钙基质有关。对照样本主要有10~100 nm范围内的孔隙，而加入自愈剂后，孔隙大小分布范围扩大到100~1000 nm。

除了将非脲解细菌掺入混凝土结构之外，还对这些细菌的表面处理进行了研究。Xu等[64]报道，在含有Ca-L或Ca-Glut的营养介质中培养两周后，表面涂有科氏枯草芽孢杆菌的水泥砂浆的吸水能力下降了约50%。这种减少是由于细菌的CaCO3沉淀造成了孔隙堵塞。钙源的选择对这种表面涂层方法的孔隙阻断作用没有显著影响。然而，与Ca-L产生的沉淀层（100~140 µm）相比，Ca-Glut产生的CaCO3沉淀层（260~360 µm）明显更厚。据观察，当含有Ca-L和CaCl2时，CaCO3沉淀物的形态与结晶良好的方解石的形态不一样；当提供Ca-Glut时，它与球霰石的形态不一致。这种结晶度的变化可归因于不同的有机物质，如乳酸或谷氨酸，它们改变了沿不同平面的晶体生长速率。

此外，在混凝土粉末溶液（pH值为11.7）中研究了蓝藻细菌聚球藻PCC8806的MICP [48]；24 h后，聚球藻PCC8806细胞在pH值为11.7时仍有活力。加入氯化钙（50 mmol·L-1）作为钙源，以评估蓝藻对混凝土环境的影响，其中Ca2+浓度被估计为4 mmol·L-1；然而，没有加入对照设置。据报道，聚球藻PCC8806没有影响混凝土样本的碳化，不能使用Ca(OH)2沉淀CaCO3，但在加入氯化钙后，24 h后它利用了38%的可用Ca2+。通过将蓝藻加入到混凝土立方体中，并将立方体浸泡在氯化钙溶液中45天，以研究蓝藻的钙化行为。在经过处理的立方体上观察到了沉淀的表面层（厚200~270 µm），而非生物对照样本有成片的沉淀物，最大厚度为115 µm。经生物处理的混凝土立方体吸收的水（3 g·cm-2）明显少于对照的混凝土立方体；然而，据报道，脲解MICP会导致更剧烈的吸水损失（1 g·cm-2）[19]。蓝藻作为混凝土钢筋的初步结合产生了很好的结果。通过更长的实验时间、遵守标准的现场方法，以及评估广泛使用的力学参数（如抗压强度），可以更好地评估蓝藻在混凝土愈合中的潜力。没有获得有关光对聚球藻介导的MICP影响的信息。未来研究的一个潜在领域是这种光合细菌可能暴露在不同的光照水平下。了解蓝藻在混凝土表面进行生物矿化的适应性对CCS领域非常有益，因为许多蓝藻物种可以在各种生态环境和极端环境条件下进行生物矿化，并有可能从废弃物（如有机废物流）中隔离碳[127]。

4.2.2. 裂缝愈合

通过非脲解细菌混凝土自愈系统进行裂缝愈合，可以防止微裂缝扩展并形成更大的裂缝，从而防止有害的环境因素进入结构中。通过监测裂缝宽度随时间的变化、愈合剂的视觉和化学分析，以及通过裂缝的水流和吸收的变化，评估了非脲解生物混凝土愈合裂缝的效率。

Wiktor和Jonkers [66]用Ca-L、酵母提取物和1×105 cells·mL-1的碱腈芽孢杆菌孢子浸渍ECP，观察到在固化100天后裂缝愈合达0.46 mm，对照样本的裂缝修复达0.18 mm，这归因于水泥基结构的自愈。与以前的研究结果[36]相比，自愈剂的固定化大大改善了系统的性能。这一结论是基于该系统功能的改善，在整个100天内以理想的速度发生自愈，而最初的研究只报道了7天的功能。

其他的保护性载体也与非脲解细菌一起得到了研究，并取得了良好的裂缝愈合效果。Khaliq和Ehsan [61]将2.8×108 cells·mL-1的枯草芽孢杆菌孢子和Ca-L直接或固定在LWA或GNP中。在制备后3~28天预开裂的样本上测量裂纹愈合情况。在3天和7天后预开裂的样本中，28天后观察到含有GNP的砂浆样本的裂缝愈合度最高，两个数值都略微超过0.8 mm，其次是含有LWA的样本，裂缝修复度约为0.6 mm。含有直接添加愈合剂的样本表现出约0.35 mm的愈合，比对照样本多0.2 mm。然而，在14天和28天后预开裂的样本中，含有LWA的样本在28天后观察到大部分裂纹得到愈合，愈合度分别为0.59 mm和0.52 mm。含有GNP且在14天和28天后预开裂的样本分别显示0.41 mm和0.38 mm的愈合。直接加入愈合剂并在14天和28天时预开裂的样本愈合度分别为0.21 mm和0.15 mm。观察到开裂时样本年龄和愈合效率之间的趋势；在3天和7天预开裂的“年轻”样本显示所有处理组的裂纹愈合比在14天和28天开裂的样本观察到的愈合要高。然而，在含有GNP的样本中的裂纹愈合更为明显。结果表明，LWA在保护细菌孢子方面比GNP更好。枯草芽孢杆菌的存活率随着样本年龄的增加而降低，这是降低系统功能的因素。另一项研究发现，直接添加时，裂缝愈合的最佳枯草杆菌浓度为107 cells·mL-1 [62]。Khaliq和Ehsan [61]认为GNP颗粒不能保护细菌免受致密混凝土微观结构的影响，因为混凝土微观结构会压碎孢子。作者给出的一个可能的解释是GNP对多轴载荷具有敏感性，这可以增加愈合剂在水泥环境中的暴露。Khaliq和Ehsan [61]采用的技术比较了不同年龄预开裂的样本的自愈效率，清楚地说明了LWA与GNP之间保护能力的差异。该技术更广泛的适应性可以帮助研究人员比较不同载体的保护潜力，并可能通过在更短的孵育时间内，不同系统之间提供更明显的对比来使研究领域受益。Khaliq和Ehsan [61]对不同样本的微观结构的视觉分析表明，在裂缝闭合率较高的样本中，有更丰富的CaCO3晶体形成，这与以前关于生物混凝土裂缝愈合的报道一致[36,128]。

Xu和Yao [65]研究了含有细菌孢子、Ca-L或Ca-Glut或在含有愈合剂的溶液中固化的混凝土的裂缝愈合。在固化溶液中含有愈合剂的样本具有更高的孢子发芽率，并且需要更少的营养物质。相比之下，含有嵌入式愈合剂的样本的孢子发芽率较低，需要更多的营养物质。自愈合系统成功地愈合了0.4 mm宽的裂缝。作者报道，在裂缝愈合效率和愈合后的抗弯强度方面，Ca-Glut比Ca-L的性能更好。他们将这一发现归因于Ca-Glut具有更高的CaCO3沉淀率、更密集的晶体结构（尤其是在过渡带）以及连接水泥表面和CaCO3沉淀物主体的长度为微米级的CaCO3层（图3 [65]）。这些发现的结论为：Ca-Glut在基于MICP的混凝土自愈合系统中是适用的。

Tziviloglou等[119]研究了由固定在LWA中的芽孢杆菌孢子、Ca-L和酵母提取物组成的愈合系统的效果。对裂纹的场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）分析显示，28天后，细菌样本中的CaCO3沉淀物比对照样本中的沉淀物大，在晶体表面可以分辨出细菌细胞的印记。这种印记是细菌生物矿化的一个有据可查的特征[129‒130]。培养56天后对裂纹表面的观察得出了同样的结论，即细菌和对照组样本都发生了晶体生长的情况；但是，在细菌样本中观察到了更光滑的晶体表面。细菌印记消失的原因很有趣。此外，可以提出几个问题：增加矿物层与愈合剂之间的距离能否减少细菌对晶体生长的影响？生物自愈在56天后就停止，还是自愈的速度比56天后更快？这类问题的答案可以帮助研究人员改进对愈合系统在现场应用中性能的预测。

Vermeer等[97]将科氏枯草芽孢杆菌相关物种与酵母提取物一起固定在精制废水来源的PHA片（0.5~1.0 mm）中，并将非脲解自愈剂掺入砂浆样本。砂浆在固化28天后开裂，并在潮湿[相对湿度（RH）大于95%]、室温的条件下培养56天；裂缝大小在0.46~0.48 mm之间。使用Mors和Jonkers [26,131]描述的基于乳酸衍生物的自愈系统制作了一个阳性对照样本。经过56天的培养，作者观察到阳性对照样本和含有基于PHA的非脲解自愈系统的砂浆的裂缝几乎完全愈合。相比之下，阴性对照样本中的裂缝只有部分愈合。环境扫描电子显微镜（ESEM）对沉淀物的观察显示，含有自愈剂的样本的裂缝表面有较大的CaCO3晶体。在细菌样本中观察到的沉淀物含有杆状的细菌细胞印记，与Tziviloglou等[119]的报道相似，他们在28天后才观察到这些印记；56天后这些印记消失了。这种差异可能源于系统的各种自愈效率，也可能源于所采用的不同固化条件。

为了克服生物自愈混凝土研究中使用的典型实验室条件与承载相当一部分水泥基结构的环境之间的差异，一项研究[113]评估了海藻酸钙固定化的盐敏芽孢杆菌与酵母提取物和矿物前体在低温海洋环境应用中的自愈潜力。考虑到加固结构容易受到氯化物和硫酸盐的侵蚀，将非脲解细菌混凝土自愈系统的应用扩展到海洋环境是一个重要步骤。裂缝愈合评估的结果显示，对照组和细菌砂浆之间的裂缝闭合程度没有明显差异。在细菌砂浆中，在裂缝边缘观察到有限的沉淀，与在对照样本中观察到的结果相似。在细菌砂浆中，观察到沉淀物在某些地方修复了裂缝。沉淀物的能量色散光谱学元素分析显示，在裂缝周围和荚膜表面分别存在镁基和钙基沉淀物。有人指出，水凝胶海藻酸盐荚膜的膨胀能力（高达3 mm）[114]可能有助于修复较大的裂缝；作者报道了28天抗压强度的降低。这种现象被认为是海藻酸盐荚膜相对于水泥基质的柔软性和水凝胶荚膜周围的水泥基质中形成的孔隙造成的。后者被认为是由于从基质到水凝胶过度吸水造成，可能是在水泥二次水化阶段[121]。

同样，我们的研究小组以前通过将水泥浆和砂浆样本在干湿条件下培养56天，研究了海藻酸钙荚膜中包裹的假强芽孢杆菌和营养液的裂缝愈合潜力[20]。引入宽度不超过350 µm的人工裂缝。所有的裂缝最终在生物和非生物样本中都被封住了；生物样本中的裂缝被完全封住了（28天），而对照样本中的裂缝在56天后被封住了。用FE-SEM观察水泥基质，发现生物样本中，特别是砂浆样本中的方解石晶体比水泥浆样本中的大且多。尽管对足够小的自愈裂缝的加速愈合的研究是有趣的，但该系统的自愈潜力也必须用更宽的裂缝进行研究。湿-干培养方案可能会对样本产生一定的影响；这些影响可能包括O2和CO2浓度的交替，以及生物和自愈混凝土产生的自愈能力的加强。然而，这种具有持续更新水分的技术会导致Ca(OH)2的损失，降低自愈效率[132]。Gao等[60]用含有假强芽孢杆菌孢子的壳聚糖包覆海藻酸钙荚膜诱导混凝土样本出现毫米宽的裂缝，报道称28天后1 mm宽的裂缝完全愈合。

Zhang等[133]研究了混合细菌培养物在混凝土自愈方面的潜力。他们测试了AE、兼性好氧（FA）和AN菌群，这些菌群是根据它们以Ca-L为主要营养源沉淀CaCO3的能力来选择的。为了评估这三个菌群对混凝土的影响，ECP渗入了每个菌群和适当的营养物质：对于AE，为8 g·L-1的Ca-L和1 g·L-1的酵母提取物；对于FA和AN，为4 g·L-1的Ca-L、4 g·L-1的Ca-N和1 g·L-1的酵母提取物。将含有每种菌群的ECP添加到各自的混凝土样本中，对照样本不含添加的细菌。样本中产生了0.1~0.9 mm的裂缝，并在固化28天后进行了重新检查。据报道，AE菌群的修复速度最快（0.36 mm），其次是AN菌群（0.33 mm）和FA菌群（0.28 mm）。作者认为，这一观察结果可能无法反映出FA菌群的真正潜力，因为环境可能不够恶劣，无法实现最佳的CaCO3沉淀。然而，这些结果要求研究者对细菌菌群的应用进行更深入的研究。此外，与纯培养的自愈处理相比，在现实条件下的培养可能会突出菌群在抵御环境波动方面的假设性优势。研究人员确定了每个菌群中存在的主要菌属，并发现柠檬酸菌属和气单胞菌属在AE菌群中富集，而假单胞菌属和固氮菌属在FA和AN菌群中也存在富集。大多数用于混凝土加固和愈合的非脲解MICP研究应用都集中在有机盐的氧化上。反硝化作用和光合作用也已被研究用于潜在的混凝土愈合。Erşan等[74]制造了含有反硝化细菌和有机物的自愈颗粒；将Ca-F、Ca-N和干燥的颗粒添加到水泥混合物中。通过CaCO3沉淀，观察到28天内0.5 mm裂缝的愈合率约为90%。在没有颗粒的对照样本中200~250 µm裂缝实现了自愈。含有颗粒的样本的孔隙率比对照水泥样本低。作者发现，分散在水泥基质中的硝酸盐离子只有大约15%可以被细菌利用。此外，含有Ca-F和Ca-N的对照样本比不含的样本存在更多的自愈行为。这是意料之中的，因为Ca-F和Ca-N是常见的混凝土添加剂，可以改善力学性能并充当防冻剂。这些发现表明了反硝化细菌的应用潜力。Erşan等[25]继续将反硝化细菌固定在ECP和颗粒活性碳（GAC）颗粒中。作者报道，经过28天和56天的培养，完全愈合的裂缝的最大宽度分别约为370 µm和480 µm。涉及固定化的硝基还原菌的处理方法优于铜绿假单胞菌的处理方法，前者在14天内就实现了明显的裂缝愈合，而后者需要28天。裂缝的显微照片见图5 [25]。

图5 显示水浸泡28天和56天后裂缝演变的显微照片。（a）参考砂浆；（b）非生物控制；（c）含有GAC颗粒中的硝基还原菌的砂浆；（d）含有GAC颗粒中的铜绿假单胞菌的砂浆（给定值代表所示裂缝的平均宽度±标准偏差）[25]。

4.2.3. 裂缝水密性

评估水流通过新鲜裂缝和愈合裂缝的情况，可以提供有关非脲解生物混凝土裂缝愈合效率的额外信息，例如，在不可见的裂缝深度的愈合情况以及愈合产品对水流的阻力。Tziviloglou等[119]研究了由芽孢杆菌孢子、Ca-L和固定在LWA中的酵母提取物组成的愈合系统的效果。在两种不同的固化条件下处理砂浆样本，根据通过裂缝的水流变化或根据重获的水密性（RWT）来评估裂缝的愈合：①湿固化；②湿-干循环。当样本在湿润条件下固化56天时，含有愈合系统的砂浆样本的RWT与对照样本的RWT没有较大的差异。对照样本和细菌样本的RWT分别提高了大约80%和90%。然而，湿-干培养导致RWT结果大不相同。作者解释说，在湿-干循环中，非脲解自愈剂所得的RWT是由于裂缝中较高的O2水平可能促进了细菌的作用。

Vermeer等[97]比较了自愈循环前后通过砂浆样本裂缝的水流量；他们观察到阴性对照、阳性对照和PHA样本的流量分别减少了55%、81%和88%。这些观察结果与有水流过愈合开裂的混凝土样本的报道相当类似，从完全愈合的裂缝的目视检查中可以看出它不能实现完全的裂缝密封[113,119,134]。

同样，Mors和Jonkers [26]在砂浆中加入了含有非脲解细菌孢子的乳酸基薄片，比较了在水浴或潮湿环境（RH大于95%）中培养的砂浆的水流量。砂浆在固化28天后开裂。据观察，在水浴或潮湿条件下孵育后，对照和含有宽度小于0.2 mm裂缝的细菌砂浆完全密封；然而，在裂缝重新打开后，只有细菌样本恢复了密封。根据新的水流量确定相应的裂缝宽度，并重复培养。据观察，样本干燥后，在水浴中培养的细菌样本保持了95%的RWT，而在潮湿条件下培养的细菌样本的RWT为65%。观察到自愈系统的裂缝愈合阈值为0.7 mm。此外，据报道，愈合系统的循环WTR效率在第四次循环后受到阻碍。必须进一步研究在水浴中形成的沉淀物和在潮湿条件下结晶的沉淀物的流动阻力之间的差异。沉淀物的X射线衍射分析可能会揭示出导致所报道的砂浆干燥后流速相差30%的结构变化。通过纳米压痕检查分析沉淀物和砂浆不同阶段之间的附着物也可能有利于研究[65,135]。

Palin等[113]评估了含有SAP封装的非脲解自愈剂的砂浆的水渗透性。砂浆样本固化了28天，在8 ℃的人工海水中开裂并进行培养。先前在体外评估了基于藻酸盐的系统在寒冷海洋环境中的适用性[114]。测量了水通过砂浆裂缝的渗透性和砂浆的裂缝愈合能力。经过56天的培养，作者报道，裂缝宽度为0.4 mm的细菌样本的透水性降低了95%，裂缝宽度为0.6 mm的细菌样本的渗透率降低了93%。细菌砂浆的渗透性降低比对照砂浆的记录高约30%。此外，据报道，与对照砂浆相比，含有珠粒的样本在干燥前后的渗透率变化更大。

Erşan等[25]继续将反硝化细菌固定在ECP和GAC颗粒中。培养56天后，在含有生物愈合剂的水泥样本裂缝中恢复的RWT比非生物对照组高85%。RWT评估强调了非生物样本的非脲解自愈和自体愈合之间的重要区别。自体愈合只是封住了裂缝口，让内部的裂缝表面暴露在水流中。相比之下，非脲解生物愈合剂导致沿内裂缝壁的方解石和文石沉淀，大大减少了通过裂缝的水流。非生物的样本含有丰富的水化产物，如钙矾石和C-S-H。这些结果强调了细菌代谢产生的CO32-对深层裂缝愈合的重要性，在这种情况下，低二氧化碳浓度可能会限制自生的自愈[136]。这一特性可以帮助保护钢筋和结构的核心免受退化。这些发现突出了生物混凝土研究中硝酸盐还原对有机碳源（如Ca-F）的AN氧化的潜力。表1总结了某些非脲解性细菌混凝土自愈系统[25,61‒66,120,133,137‒138]。

表1 非脲解细菌混凝土自愈系统

Healing agentMost effective treatmentImproved characteristicsCarrier/method/viability determinationCuring daysReport

B. alkalinitrilicus

Ca-L

ECP carrying 1.7 × 105 bacterial spore·g-1 ECP, 6% Ca-L (m/m ECP), and yeast extract0.46 mm crack healing, 60% crack healing improvement compared to the control. Bacterial survival up to 100 dECP/vacuum impregnation/O2 emission100[66]

B. cohnii

(I) Ca-L

(II) Ca-G

Direct addition of bacteria and Ca-G50% decrease in capillary water absorption with B. cohnii with both Ca-L and Ca-G. Total CaCO3 precipitation (mol·L-1): Ca-L: 0.081, Ca-G: 0.092 (from 0.2 mol·L-1)—40[64]
Direct addition of bacteria and Ca-L0.40 mm crack healed. Change in flexural strength (MPa): Ca-L: +7%, Ca-G: no sig. difference—28[65]

B. cohnii

Ca-L

LWA-immobilized healing agentsPresence of bacteria lead to reduced delamination, improved flexural strength and deflection capacityLWA/—/—56[63]

Alkaliphilic bacteria

(I) Ca-L

(II) Ca-F

(III) Ca-N

Bacteria with Ca-LCa‒L and bacteria improved compressive strength as 1%‒3% of cement weight, highest improvement in 3% samples. Ca-F and spores improve compressive strength, but the improvement did not correlate with % added. The abundance of 10‒100 nm pores decreased in all treatments, with an increase in abundance of 100‒1000 nm, the highest change in porosity seen in samples with Ca-N—28[120]

B. subtilis

Ca-L

LWA-immobilized bacteria and Ca-LGNP resulted in better crack healing at an early age, but LWA offered more long-term protection and sustained crack healing. Both carry improved compressive strength compared to controls (LWA 12%; GNP 9.8%). 0.81 mm max. crack healed with GNP, 0.60 mm with LWA

(I) LWA and

(II) GNP/—/—

28[61]
B. subtilisDirect addition of bacteria27% gain of compressive strength when 105 cells·mL-1 was used—28[62]

3 mixed bacterial cultures:

① AE; ② AN; ③ FA

(I) Ca-L

(II) Ca-N

AE mixture with salt mixThe highest crack healing was reported by the AE mixture (0.36 mm), followed by the AN mixture (0.33 mm) and the FA mixture (0.28 mm)Expanded perlite/—/—28[133]
D. nitroreducens P. aeruginosaD. nitroreducens with Ca-F immobilized in GNPMaximum width of fully healed cracks as approximately 370 μm in 28 d and 480 μm in 56 d of incubation

(I) ECP and

(II) GNP/—/—

28[25]
AN (Aa) mixture, Anoxic (Ao) mixture, B. coh nii Ca-L and/ without Ca-N 1%‒2% wt cementMix bacteria treatment immobilized in EP5.2 × 108 spore·cm-3 of 3 different bacterial treatments showed better crack healing by mixed cultures. After 7 d: Aa 0.73 mm, Ao 0.62 mm, B. cohnii 0.52 mm. After 28 d, Ao sample possessed a 1.22 mm healed crack, 0.79 mm with B. cohnii and 0.73 mm with Aa. 28 d water permeability coefficients reduction: 73.2% Ao, 65.9% Aa, 63.1% B. cohnii, 22.8% control. Production cost of mixed cultures was 61% cheaper than pure culturesEP/vacuum/—28[137]
B. subtilis, B. megaterium (ureolytic), their mixture

B.subtilis for compressive strength and

B. megaterium for tensile strength

Improved 28 d compressive strength by 14.36% (B. subtilis), 22.58% (B. megaterium) and 15.86% (mixture). Improved tensile strength by 25.3% (B. subtilis), 18.29% (B. megaterium) and 19.51% (mixture) compared to controlDirect/—/—28[138]
B. subtilis105 cells·mL-1 for water absorbance reduction and compressive strength improvement, 107 cells·mL-1 for crack healing

103, 105, and 107 cells·mL-1 were added to mortar samples. With increasing bacterial concentration water absorption decreased by 15%, 27% and 19%, respectively Compressive strength increased by 15%, 27%, and 19%, respectively. Water penetration depth reduced by 23%, 30%, and 53%, respectively

Maximum healed crack width was 0.6, 0.9, and 1.2 mm, respectively

Direct/—/—28[62]

5、 用于混凝土自愈合的非脲解细菌的基因改造

基因操作技术可以通过为以前不存在的细胞机制提供基础编码来扩展微生物的功能库。Sarkar等[139]针对的是先前报道的一种可增强混凝土力学性能的二氧化硅浸出蛋白[140]。作者用表达类似生物愈合剂蛋白的二氧化硅浸出基因转化了大肠杆菌（E. coli）的细菌菌株。将转基因的大肠杆菌掺入到砂浆中，抗压强度提高了30%；在基质中观察到一种含二氧化硅的矿物，经鉴定为gehlentine。由于大肠杆菌不形成孢子，所以仅将存活了一周的无性细胞添加到砂浆中。然后，作者将具有相同基因的枯草芽胞杆菌转入，以研究二氧化硅浸出蛋白对孢子形成的细菌的功能[141]。在砂浆中加入改性的枯草芽胞杆菌，可以将力学强度和裂缝愈合时间延长至28天（图6 [141]）。这种改善归因于微孔填充的增强、基质密实度的增加和ITZ的增强。

图6 在不同天数下转基因枯草芽胞杆菌在砂浆中的形成过程的FE-SEM图像。（a）休眠细菌孢子；（b）载荷引起的裂纹旁边的细菌孢子；（c）养护7天后的水泥基体；（d）养护14天后的水泥基体；（e）、（f）养护28天后的水泥基体[141]。

上述项目展示了基因工程在生物自愈混凝土方面的潜力。考虑到生物矿化，细胞可以配备能够沉淀不同矿物质的蛋白质（如前所述），或类似于在多细胞生物中观察到的通过生物控制矿化（BCM）形成的更复杂的矿物形式（如牙齿和骨骼）。通过BCM形成的矿物是由各种蛋白质严格控制的，这些蛋白质将来可能会被用于建筑领域。此外，可以插入整个代谢途径，或修改现有途径以提高效率和速度。这种前景依赖于蛋白质组学研究，涉及给蛋白质分配一个特定的角色；这可能是其他研究人员随后可以使用的一个功能。

6、 非脲解细菌混凝土自愈的可行性

第3节和第4节中描述的非脲解自愈系统通过MICP改善了混凝土/水泥/砂浆样本的物理和力学性能。这些系统包括在不同的氧气水平下，利用大量的前体和不同的细菌种类实现自愈的试剂。在这里，从可持续性方面讨论了实施非脲解细菌混凝土自愈系统的可行性和在实验室外使用该技术的尝试，以及接下来的挑战和未来的发展方向。

6.1 可持续性

尽管混凝土本身对环境的影响相对较小，但不断增长的使用需求导致了一个日益严重的全球性问题。混凝土自愈合系统在本质上是可持续的。然而，必须考虑到可持续性的所有方面，以确保生物自愈混凝土的应用可以从实验室升级到全球应用。正如进一步讨论的那样，当目标是生物自愈混凝土的广泛使用和社会接受时，可持续性的三个主要支柱——环境、经济和社会可持续性——是相互联系的。

非脲解混凝土自愈系统通过采用各种降低成本和减少废弃物的措施，扩展了混凝土自愈产品的可持续性质。通过加入工业和农业废弃物，可以得到更好的自愈合性能并提高混凝土的可持续性，这些废弃物可以作为水泥替代品和（或）增强混凝土的物理和力学性能，并延长结构的使用寿命。生物混凝土自愈系统具有类似的目的，但可以在较长的时间内发挥作用并经历各种循环。通过纳米材料，如纳米黏土、多孔胶囊或多通道纤维，实施控制释放机制，可能是未来延长非脲解细菌混凝土自愈系统的使用寿命的解决方案[142‒146]。水硬型或膨胀型纳米黏土，如埃洛石纳米管、蒙脱石和高岭土，作为具有控制释放特性的可持续载体已得到广泛研究。此外，它们通过改善混凝土的力学性能及其对碱-硅反应和裂缝形成的弹性，显示出其与水泥结构的相容性[143,147‒153]。在水泥与水硬型纳米黏土的反应可能不利于生物愈合剂，或者需要对生物愈合剂进行额外保护的情况下，用于生物自愈混凝土系统的黏土颗粒可能会从保护层中受益[111,154]。

此外，如第3.1节所述，非脲解生物自愈系统还可以结合各种废弃物，如细菌营养物、钙源或载体材料。整合当地来源的废弃物作为愈合剂或载体可以降低建筑业的CO2排放量和自愈产品的成本[155‒156]。细菌混凝土自愈系统同时封存CO2和沉淀CaCO3的前景也可以使该系统更接近商业化。然而，这需要深入调查，以评估影响CaCO3沉淀的因素。除了通过细菌作用进行CO2封存外，使用捕获CO2的载体材料，如生物炭，可以增加混凝土自愈产品的可持续性[157‒158]。

此外，利用当地资源可以为当地劳动力带来就业收益。预计建筑业将成为发展中国家的主要市场[159]。这种快速增长的经济体可以成为有关新型材料和建筑方法的教育和社会融合的启动平台。自愈混凝土系统的生产和销售可以成为一个紧跟建筑业预期增长的行业。如果在投资、政府为环保努力减税、积极和广泛的媒体报道以及社会对可持续发展目标的接受度等方面为当地工业和企业提供足够的支持，这就是可能的。尽管生物自愈系统一般通过增加耐久性和改善结构完整性表现出积极的影响，但它们还不足以获得社会的认可和经济的青睐。

6.1.1. 经济可行性

只有在使用统一的评估方法对系统进行大规模的应用和测试，并进行长期研究以获得建筑业决策者的信任后，才能实现生物自愈系统的经济可行性[160‒161]。这些工作还可以展示此类系统对施工速度的影响，并清楚地了解此类应用的成本。他们可以进一步展示对自愈系统认知程度有限或中等的建筑工人如何使用这些产品，评估含有自愈系统的新鲜混凝土混合物的质量，甚至识别与自愈系统的应用有关的错误或问题。如果有政府机构、非营利组织和其他环保实体的支持，可以极大加强大型试点项目。这种支持可以提高公众对混凝土的认识，并致力于开发更环保的产品。生物混凝土自愈系统的大规模实施可能会受益于与已被用于建造各种结构的新型建筑技术（如混凝土的三维打印）的结合[162]。其他建筑领域，如地下建筑（其带来的挑战与城市结构中遇到的挑战不同[163]）和水泥坝建筑[164]。这些结构也可能对特定的破坏力具有弹性，如设计用于承受地震的抗震结构[165]。一个值得注意的例子是将化学混凝土自愈系统用于隧道工程[166]。

到目前为止，混凝土自愈产品的长期性能仍然是一个猜测的问题。然而，这可以在大规模使用混凝土自愈系统的试点项目中得到研究，可以在环境暴露多年后进行分析。非脲解细菌混凝土自愈系统已被应用于荷兰的一个老化的停车场[167]和厄瓜多尔的一条水渠[30]。据报道，与实验室评估相比，水渠的现场条件（温度为5 ℃，海拔为2000 m）会导致自愈的波动，进一步突出了现场研究在该研究领域的重要性。低温会大大降低细菌的活性和钙盐的溶解度，如Ca-L [168]；高海拔相当于较低的大气压力。因此，较低浓度的气体，如O2和CO2，会阻碍细菌活动并延缓混凝土的物理性能。Wiktor和Jonkers [167]对位于沿海地区的一个停车场的表面进行了处理，用非脲解愈合剂对其进行冻融循环。它有效地封住了严重渗漏的混凝土裂缝，提高了混凝土结构的抗冻融性。与含有非生物愈合剂的面板相比，在处理和浇注时产生相同数量的愈合剂方面，在英国威尔士的一条高速公路旁添加含有假强芽孢杆菌的轻质珍珠岩骨料具有挑战性[169]。孢子和营养物质被固定在独立的珍珠岩颗粒上，并且面板设计有一个进料网络。总的来说，细菌面板显示出比对照样本略低的开裂载荷和强度；但是，这些参数都在可接受的范围内。此类研究以及长期影响的报道可以阐明有关MICP对混凝土结构的长期影响和生物自愈系统功能的未解决问题。

在现实条件下评估非脲解自愈混凝土系统的影响需要无损监测和检测技术，而在实验室测量中很少需要这些技术。监测各种民用和历史结构的无损检测测试已经建立[170‒172]；但是，目前还没有关于生物自愈混凝土的这样的例子。尽管在实验室条件下精确确定生物愈合剂的可行性方面存在这些挑战，但必须对这一研究领域的主要目的进行预先考虑。生物混凝土自愈合系统的现场应用必须伴随着无损测试，这些测试可以提供关于结构健康和生物成分状态的信息。这种革命性的技术可能来自混凝土监测方面的新进展，如机器学习和人工智能[173]。在医疗方面，已经开发出治疗诊断系统来提供包含检测功能的治疗剂，从而使治疗和检测同时进行[174]。由于生物仿生学是生物自愈的基础，这一领域的未来可能包括基于类似原则运作的系统。结合可检测元素，如纳米金属颗粒或具有强烈荧光信号的成分，再加上先进的检测方法，可能是未来解决生物自愈混凝土长期适用性问题的方案。

生物混凝土自愈系统的生产成本以前被认为是一个挑战[87‒88]。在这方面，非脲解自愈系统包括了各种降低成本的策略。如第3.1.2节中所讨论的，非脲解系统可以依靠几种不同的基质（不同的有机钙盐），这些基质来自于各种废弃物。同样的废弃物也可以被同化到脲解生物混凝土系统中，作为与尿素一起的钙源。深入了解细菌在自愈过程中的营养需求和营养物质的生物利用率，被认为是改善细菌生长的策略，可以获得更好的自愈性能和经济可行性[112,175]。这种方法的潜力可以通过未来的研究进行评估。使用混合细菌培养物已被提议作为混凝土自愈产品的一个大幅降低成本的选择，因为据报道，与使用无菌纯孢子培养物相比，从非纯细菌培养物中生产的非无菌孢子要便宜70%以上[87]。混合细菌培养物可以同时加入脲解菌和非脲解菌[67,158,176]。未来的研究可以测试不同MICP途径在混合培养条件下同时发生时的效率和局限性。

除了降低生产成本，混合培养物允许单一的自愈系统在各种环境条件下运行，通过执行单一细菌物种不可能或预期的代谢过程的组合，从而提高细胞生存MICP性能[67,177‒178]。使用混合细菌培养物进行混凝土自愈可以拓宽该领域的研究前景，因为这种培养物在各种条件下的表现可能截然不同，从合作关系转变为竞争状态[179]。因此，通过研究不同条件下的种间相互作用，考察混合培养物在混凝土环境中的行为，可以阐明这种系统或混凝土自愈的潜力。此外，将混合培养物固定为独立的纯培养物或单一的混合培养物，可以深入了解其混凝土自愈潜力。未来研究可以关注一些因素，如不同环境对混合培养物行为的影响、最佳的物种数量和个体种群水平、不同物种之间的接触程度以及适用于混合培养物混凝土自愈系统的固定化技术。研究人员还必须设计出混合培养的质量控制方案。混合培养物种群的动态变化可能由于某些原因而发生改变，如氧气的可用性或细菌对条件的偏好（如盐度或温度）。这种情况可能会导致一些物种的过度生长，而其他细菌可能难以发挥作用并维持其种群水平。根据混合培养物和组合钙源时获得的MICP和混凝土自愈结果[133]，未来对不同细菌组合和钙基质混合物的研究可以进一步确定这种系统的适用性。

尿素依赖性和非依赖性混凝土自愈系统的环境适用范围取决于所用细菌的代谢要求。通常情况下，可以在广泛条件下作为非脲解MICP途径（例如，有机盐的氧化和反硝化）运行的非脲解系统是AE和AN。然而，某些脲解细菌在缺氧时也能沉淀出CaCO3 [180]。总的来说，非脲解细菌混凝土自愈系统似乎比基于尿素的生物混凝土产品更具可持续性和广泛适用性，因此值得研究人员更多地关注。Silva等[87]强调，生物混凝土产品的额外成本可以通过增加结构的使用寿命和此类产品的环境友好性来证明，特别是在生态转向的市场。非脲解细菌混凝土自愈系统的应用无疑是朝着这个方向迈出的一步。

另一种更便宜地生产非脲解孢子的方法是对由细菌和有机物组成的颗粒进行硝化[181]。得到的颗粒具有自我保护功能，并依靠既定的混凝土添加剂（即Ca-N和Ca-F）作为主要营养来源。这些特性进一步降低了愈合剂的生产成本，提供了与固定化生物混凝土产品类似的混凝土自愈程度[74]。据报道，这些颗粒物被培养了两个月；然而，它们代表了一种愈合剂，在生产成本方面比Silva等[87]分析的脲解系统便宜约95%。

6.1.2. 社会意识——健康问题

未来可以用于住宅空间的细菌产品的安全性绝不能成为一个猜测的问题，因为公众的信任是一个关键的增长因素。尽管大多数用于生物自愈混凝土的细菌不致病，也不具有致病性，但具体例子还是值得一提的。球形芽孢杆菌是生物混凝土研究中广泛使用的脲解菌株，可以引起免疫力低下的人的感染[182]。此类风险可能会妨碍公众对生物混凝土产品的信任，限制其用于敏感环境，如医院。然而，健康风险也可能与用于生物混凝土研究的某些非脲解菌株（如枯草芽孢杆菌）有关；特定的枯草芽孢杆菌可引起食物中毒[183]。患病的可能性并不意味着枯草芽孢杆菌不能用于生物混凝土研究；它只是意味着在实施大规模应用之前必须彻底调查健康危害。此外，研究人员必须确保所使用的细菌菌株不带有致病基因。通过考虑生物愈合剂与商业牲畜的兼容性，并确定愈合剂和用于建造生物稳定农场的特定添加剂之间是否可能产生任何相互作用，来获得进一步的保证[184]。

另一个与健康有关的问题是细菌群落的使用。尽管使用此类微生物混合物的研究人员报道了构成混合物的主要细菌种类，但仍需要进行额外的安全检查以确定混合物中是否存在任何病原微生物，以确保产品安全。

如前所述，转基因细菌已经显示出很好的效果。在转基因过程中，通常包含抗菌耐药基因，以选择转移的细菌对抗未转移的野生型细菌。由于抗菌素耐药性的传播是一个严重的致命问题，当打算将细菌用于住宅空间时，研究人员应重新考虑这种基因操作策略；其他选择策略，如代谢选择，也是可以的。

6.2 局限性

遗憾的是，大多数关于非脲解自愈的报道中都没有用载体或胶囊来保护愈合剂。尽管在可控的实验室条件下，这种处理方法仍能改善物理参数，但会使愈合剂不必要地牺牲在苛刻的混合条件和恶劣的水泥环境中。因此，这些处理方法几乎没有对该领域的发展做出贡献。直接添加孢子和无性繁殖的细菌细胞会导致有机物质的释放，从而延缓水泥的水化，破坏水泥基质的整体物理性能。同样，当将酵母提取物直接添加到水泥中时也会发生这种情况。此外，大多数无性细胞或孢子不能在混合过程中存活，但情况并非总是如此。Chaurasia等[185]重点研究了营养匮乏和营养良好的脲解菌和非脲解菌对水泥微观结构特性的影响，并提出细菌可能参与第2节中提到的通常MICP途径以外的途径，从而改善水泥基质。

关于环境条件对混凝土自愈影响的报道很少[186]；目前还没有关于生物自愈剂这种影响的报道。尽管该领域使用的细菌是多功能的、有活力的生物，但其自愈作用的速度和影响会因环境条件而发生明显改变。因此，对这一主题的深入分析可以为在不同环境中应用生物愈合剂制定具体标准。此外，还应该考虑全球变暖的影响。

6.3 替代应用

全球变暖、城市化加速、农业砍伐和其他不可持续的农业做法等因素的相互作用，是导致沙漠地区增加的原因。两个主要的可持续发展目标是抵制荒漠化和土地退化[187‒188]。具有脲解和非脲解MICP能力的细菌已被用作沙土和土壤的固化剂[189‒191]；因此，使用它们是克服上述日益严重的生态威胁的环境友好手段。使用细菌固化策略的主要挑战是需要相当数量的愈合剂，特别是钙源。研究具有细菌物种的混凝土自愈剂的潜力（例如，枯草芽孢杆菌，它可以在中性pH值下生长和进行MICP）可以减少所需的固化剂数量并通过定位固化剂来提高固化效率。

将NH3释放到水生环境中是危险的，因为它会阻碍尿素自愈混凝土系统在海洋环境中的应用[192]和用于生态目的的结构，如人工鱼礁建设。使用自愈性混凝土系统而不是典型的混凝土结构，对人工鱼礁是有利的，因为它们可以加速CaCO3的沉积，这已被证明可以延长珊瑚的寿命[193‒194]。此外，一般建议人工鱼礁的表面含有CaCO3 [195‒196]。考虑到有可能使人工鱼礁受益的生物范围（如光合蓝藻或电活性细菌），在这种应用中使用非脲解生物混凝土系统的前景是广阔的。

7、 总结

非脲解细菌混凝土自愈剂已被证明是脲解系统的可行替代品。此外，它们还允许实施降低成本的策略（如结合废弃物和使用混合细菌培养物），以潜在地将生物混凝土自愈系统商业化。非脲解MICP途径通过提供环境友好的选择，消除了脲解MICP带来的环境负担，这些选择可以在各种条件下使用各种基质进行活动。非脲解细菌混合物可以同时进行代谢活动，这在纯细菌培养物中是不可能的；此外，它们可以忍受剧烈的环境变化。混合培养的生物混凝土系统还可以包括钙质基质的混合物，这些基质可以来自工业废弃物。非脲解途径的混凝土自愈潜力，如光合作用，一般没有得到开发，但呈现出积极的前景。现场研究很少，大多数自愈分析都没有考虑到现场条件波动的影响。生物混凝土自愈系统的长期性能仍然是推测的。未来在评估非脲解生物混凝土自愈系统的长期性能及其大规模应用方面的进展可以与监测和评估方法的进展相结合。这些方法预计会提供有关结构健康和生物愈合剂状态的信息。总的来说，非脲解细菌混凝土自愈系统代表了生物混凝土研究的未来。它们是可以负担得起的、可持续的并可适用于各种环境和用途。

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