用于关节软骨组织工程的功能化水凝胶

周良彬 ,  郭鹏 ,  Matteo D’Este ,  童文学 ,  许建坤 ,  姚昊 ,  Martin J. Stoddart ,  Gerjo J.V.M. van Osch ,  何其威 ,  李真 ,  秦岭

工程（英文） ›› 2022, Vol. 13 ›› Issue (6) : 71 -90.

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工程（英文） ›› 2022, Vol. 13 ›› Issue (6) : 71 -90. DOI: 10.1016/j.eng.2022.03.008

用于关节软骨组织工程的功能化水凝胶

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Functionalized Hydrogels for Articular Cartilage Tissue Engineering

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摘要

关节软骨是位于关节骨表面的一种无血管且富有弹性的结缔组织。软骨损伤常出现于年轻人和经常从事体育活动的人的膝盖中，由于缺乏合适的基于组织工程的人工基质，目前针对软骨损伤的治疗，特别是对于全层软骨缺损和骨-软骨界面的治疗方式，依旧无法充分替代或再生受损的软骨。随着关节软骨组织工程研发的飞速进展，功能化水凝胶因其自身良好的生物力学性能、含水量、膨胀系数、细胞相容性、生物可降解性和润滑能力，而逐渐涌现成为富有前景的软骨基质替代物。功能化水凝胶可以被合理的设计和根据其理化性能被便捷的调整来模拟软骨的胞外基质。本综述先简要介绍了关节软骨的组成、结构、功能以及关节软骨损伤，然后全面回顾了功能化水凝胶用于关节软骨修复的各种精细的（生物）设计和（生物）制造方法。最后，我们总结了基于功能化水凝胶的关节软骨组织工程策略在体内外实验中所遭遇到的一些困难和挑战，同时为未来临床转化指明了方向。

Abstract

Articular cartilage (AC) is an avascular and flexible connective tissue located on the bone surface in the diarthrodial joints. AC defects are common in the knees of young and physically active individuals. Because of the lack of suitable tissue-engineered artificial matrices, current therapies for AC defects, especially full-thickness AC defects and osteochondral interfaces, fail to replace or regenerate damaged cartilage adequately. With rapid research and development advancements in AC tissue engineering (ACTE), functionalized hydrogels have emerged as promising cartilage matrix substitutes because of their favorable biomechanical properties, water content, swelling ability, cytocompatibility, biodegradability, and lubricating behaviors. They can be rationally designed and conveniently tuned to simulate the extracellular matrix of cartilage. This article briefly introduces the composition, structure, and function of AC and its defects, followed by a comprehensive review of the exquisite (bio)design and (bio)fabrication of functionalized hydrogels for AC repair. Finally, we summarize the challenges encountered in functionalized hydrogel-based strategies for ACTE both in vivo and in vitro and the future directions for clinical translation.

关键词

关节软骨 / 功能化水凝胶 / 软骨修复 / 软骨组织工程 / 临床转化

Key words

Articular cartilage / Functionalized hydrogels / Cartilage repair / Cartilage tissue engineering / Clinical translation

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周良彬,郭鹏,Matteo D’Este,童文学,许建坤,姚昊,Martin J. Stoddart,Gerjo J.V.M. van Osch,何其威,李真,秦岭. 用于关节软骨组织工程的功能化水凝胶[J]. 工程（英文）, 2022, 13(6): 71-90 DOI:10.1016/j.eng.2022.03.008

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1、 引言

关节软骨是一种材料非线性、异质、各向异性、多孔且富有黏弹性、高度异化的结缔组织，在正常的生理结构上没有淋巴管、血管和神经[1]。关节软骨的功能是通过减少滑膜关节的摩擦和增大关节的承受载荷来实现关节的平移和旋转，对机体运动非常关键[1]。关节软骨主要由细胞外基质（ECM）和少量的软骨细胞（小于人类关节软骨体积的10%）组成，这些基质和软骨细胞位于软骨的分层结构中。胶原纤维赋予软骨高强度和弹性，软骨细胞则有助于细胞外基质中有机组分的产生、分泌、组织和维持[2‒3]。关节软骨在解剖学和功能上有4个不同的分层，这4层共同赋予关节软骨一些高度异化的功能。如果缺乏及时和恰当的治疗，严重的关节软骨损伤由于内源性愈合能力有限，最终会进展成为关节功能障碍和残疾。迄今为止，在全球范围内关节软骨病变的真实发生概率尚无定论。每年大约有90万美国公民患有膝关节软骨损伤，其中超过20万人需要手术干预[4‒5]。如今，关节软骨损伤的临床治疗手段包括非手术治疗和手术治疗[微骨折、自体骨软骨移植和同种异体骨软骨移植、自体软骨细胞移植（ACI）和基质辅助自体软骨细胞移植（MACI）]，依旧面临许多挑战，且伴随着长期不一致的结果[图1（a）]。对于这些常见治疗手段，各自的适应症和优缺点在之前文献[6‒7]中已有总结。基于现存治疗手段的不足，通过将材料科学、工程学和生物医学科学相结合，从而极大地提升了关节软骨组织工程学的水平，生成用于修复受损关节软骨的新软骨组织。目前，许多基于组织工程的策略已经涌现，通过（生物）制造来生产具有良好力学性能和生化性能的软骨[1]；其中，水凝胶因广泛的特性和包裹细胞的能力而成为一种颇具前景的生物材料[8]。功能化水凝胶的（生物）设计和（生物）制造最近取得了实质性的进展，在关节软骨修复与再生应用方面的有效性得到了增强[图1（b）]。这些进展包括但不限于水凝胶的结构设计[如添加组分、表面超微结构、内部结构和三维（3D）结构、生物力学性能、结构性灵活度、降解特征和分层仿生结构设计]、新型制造技术[如四维（4D）（生物）打印]和载药（如治疗细胞的装载以及生物活性因子和RNA靶向分子的时空有序释控）。尽管关节软骨被业内预测是能够最先被成功制造的机体组织之一，但是仍面临巨大挑战，目前很少有研究能够进展到临床试验阶段。其中一个关键因素就是工程化的新软骨植入体与周围的天然软骨组织之间的生物力学不匹配。在体外制备生化性能具有一致性的新生软骨比较容易，但是不成熟的结构（如各向同性）会导致新生软骨的生物力学性能低于天然成熟的关节软骨组织[9‒10]。作为达沃斯AO研究所骨软骨缺损联合研究项目（AO Research Institute Davos Collaborative Research Program of Osteochondral Defect）的一个成员单位，本文研究团队多年以来一直致力于关节软骨的修复。团队的专长和研究重点是使用不同的基于生物材料的策略（包括各种功能化水凝胶）在体内外进行关节软骨再生。本文总结了目前用于软骨修复的最前沿的新型功能化水凝胶的工程化途径，并且致力于将其成功地转化为临床应用。

图1 用于关节软骨修复的常规手术疗法和基于功能化水凝胶的组织工程策略示意图，以及它们的优缺点。（a）用于关节软骨修复的传统手术疗法的图解说明，包括微骨折、自体骨软骨移植物和同种异体移植物、自体软骨细胞移植和基质辅助自体软骨细胞移植及其各自缺点和所面临的挑战。（b）新兴的基于功能化水凝胶的关节软骨组织工程的策略及其优势。PLA：聚乳酸；PLGA：聚丙交酯共乙交酯；PGA：聚乙交酯；PCL：聚己内酯；GelMA：明胶甲基丙烯酰；MSC：间充质干细胞；iPSC：诱导多能干细胞；mRNA：信使RNA；siRNA：小干扰RNA；miRNA：微小RNA；antagoMiR：一类反义寡核苷酸，用作抗miRNA。（a）源自参考文献[1]，且经过John Wiley and Sons ©2020版权许可；（b）利用BioRender软件作图。

2、 人体中的关节软骨

关节软骨呈透明状，位于滑膜关节（包括肩关节、肘关节、髋关节和膝关节）[图2（a）]。由于自身独特的组成和结构，修复或者恢复骨软骨界面和全层软骨缺损极具挑战[7]。关节软骨损伤可导致严重的肌肉骨骼疾病，因此针对关节软骨损伤给予及时恰当的诊断和治疗对于保护关节健康至关重要。健康的关节软骨在很大程度上依赖于其分层状的生物学、结构和生物力学特性的维持。

图2 膝关节关节软骨的生理学。（a）关节软骨通常位于滑膜关节处，包括肩关节、肘关节、髋关节和膝关节。（b）人体膝关节示意图，包括股骨、滑膜、关节软骨、关节腔、滑液和胫骨。关节软骨覆盖在膝关节骨骼的末端，在传递载荷方面起着至关重要的作用。（c）关节软骨分为4个主要区域：表层区（SZ）、中层区（MZ）、深层区（DZ）和钙化区（CZ）。关节软骨中软骨细胞、II型胶原蛋白、糖胺聚糖（GAG）的数量、大小和形状，水含量，以及关节软骨的力学性能与软骨所在层区紧密相关。（d）关节软骨中表层区的结构图。三种主要的大分子，包括润滑素（黄色）、瓶刷状蛋白聚糖（深蓝色），以及参与交流润滑的线性透明质酸（蓝色）。16周龄新西兰大白兔的股骨上关节软骨的苏木精-伊红染色（e）和番红/快速绿染色（f），白色虚线代表潮线。（g）16周龄新西兰大白兔的股骨上骨软骨缺损（OCD）的番红/快绿染色。（h）SD大鼠膝关节晚期关节炎的番红/快绿染色，黑色箭头代表退化的关节软骨。（c）源自参考文献[1]，且经过John Wiley and Sons ©2020版权许可。

2.1 关节软骨的组成、结构及功能

关节软骨的主要功能是提供一个润滑和光滑的关节表面，以很小的摩擦力来促进载荷的传递[图2（b）]。关节软骨主要由细胞外基质和软骨细胞构成。除了水（占总质量的65%~80%），细胞外基质主要由胶原蛋白、蛋白聚糖以及其他少量的糖蛋白和非胶原蛋白组成[11]。这种构成有助于在细胞外基质内保持水分，从而对保持关节软骨特殊的生物力学性能至关重要。在细胞外基质中，棒状的原胶原蛋白分子结构（直径为1.4 mm，长度为300 nm）聚合形成直径为25~40 nm的胶原纤维。

关节软骨在组织学上可以分为4层[图2（c）]。表层区（SZ）是关节软骨中最薄的一层（占软骨厚度的10%~20%）。表层区内的三个重要分子，即润滑素、蛋白聚糖和透明质酸参与关节软骨的润滑。关节软骨表面保持极低摩擦力的关键因素是边界润滑效应和流体膜的存在[图2（d）]。此外，表层区含有呈扁椭圆形的软骨细胞和胶原纤维（主要是II型和IX型胶原蛋白），这些组织紧密排列并与关节软骨表面平行，强化了关节软骨的拉伸强度以及对抗剪切力和抗压应力。因此，表层区的破坏可导致关节软骨在生物学和生物力学上的变化，表明骨关节炎（OA）已经发生了初始退行性病变。表层区下方是中层区（MZ）、深层区（DZ）和表层区之间关节软骨功能和解剖学的边界。中层区厚度一般占关节软骨厚度的40%~60%，由大直径斜行排列的胶原纤维、高浓度的蛋白聚糖以及低密度的嵌在大量细胞外基质中的球形软骨细胞组成。中层区在功能上为深层区的压缩力向表层区的剪切力转变提供过渡。深层区厚度约占总关节软骨厚度的30%。深层区内的胶原纤维呈放射状沉积，直径最大、蛋白多糖含量最高，而水浓度和软骨细胞密度最低。该层的软骨细胞呈球状分布，胶原纤维在关节软骨表面呈垂直状排列。深层区的功能是增加关节高负荷的承受力和保证其最大的耐压性。潮线[图2（e）、（f）]位于深层区和钙化层（CZ）之间，逐渐向弹性较差的软骨下骨（SB）转变。在深层区的胶原纤维和软骨下骨的羟基磷灰石晶体上，钙化层使关节软骨能够强有力地固定于软骨下骨之上。钙化层体积占关节软骨总体积的3.23%~8.80% [12]。在钙化基质中，稀有的肥大软骨细胞会表现出极低的代谢水平。钙化层具有屏障功能，防止软骨下骨的血管侵入。

2.2 关节软骨的生物力学性能

人体关节软骨的主要作用包括避免肢骨之间的磨损、防止软骨下骨的负荷过载、减小两关节面间的摩擦系数，以上都取决于关节软骨的生物力学性能。另外，关节软骨的生物力学性能高度归功于其独特而复杂的结构和由包括液相和固体基质构成的细胞外基质。在力学负荷中，间质液通过渗透的孔隙基质重新分布，传导主要的孔弹性力学信号。关节软骨所表现出的特性包括整体弹性模量（0.1~2.0 MPa）、抗压强度（14~59 MPa）、刚度（≥1 MPa）、抗拉强度（15~35 MPa）、拉伸断裂伸长率（80%）和泊松比（0.06~0.30）[13‒14]。

2.3 关节软骨损伤

关节软骨损伤范围广泛，从部分软骨缺损到骨软骨缺损（OCD）[图2（g）]和晚期退行性骨关节炎[图2（h）]，当炎症发作时，病情在很大程度上会加重并持续存在。关节软骨损伤通常来源于创伤性破坏或关节退行性疾病，常发生于膝关节。关节软骨损伤的患者常会出现骨关节炎、关节僵硬和活动受限等症状。国际软骨再生与关节保护协会（ICRS）制定了全面的分级系统，用于评价局灶性关节软骨损伤的等级[5]，而其中两大类是部分软骨损伤和全层软骨损伤。这两类软骨损伤之间的区别在于是否涉及软骨下骨的损伤。部分软骨损伤仅引起带状关节软骨的损伤，自愈能力不足。全层软骨损伤则是关节软骨和软骨下骨均受到波及。因此，全层软骨损伤的部位可充分进入血细胞、巨噬细胞和间充质干细胞等，为机体带来与愈合过程相耦合的自发免疫反应。然而，软骨损伤部位通常会产生纤维软骨，而纤维软骨具有不良的生物力学性能和通透性，触发机体短暂的自修复，随后又出现关节软骨退变。尽管可能会产生局部零星的透明软骨，但完美的完全修复很罕见，导致骨-骨接合后会伴有明显的疼痛、炎症，甚至残疾。

3、 基于组织工程软骨的关节软骨再生

目前，许多关节软骨修复与再生技术已被广泛使用，患者可根据自身症状进行选择，有一些技术也在一定程度上取得了较理想的临床结果[15‒16]。然而，当下的几种主流治疗方法都各有利弊，无论是单一方法还是联合治疗方案，都不能为大多数患者提供长期完全可靠的疗效。因此，创新技术的研发和现有治疗策略的进一步优化至关重要。作为一个新兴的跨学科领域，组织工程学（TE）充分利用了各种学科（如材料科学、工程学、化学和生物医学科学）的基础理论和方法，旨在将（生物）制造技术用于恢复、维持或改善受损组织功能的仿生替代品[17]。组织工程学通过利用各种细胞来源、支架和生物活性因子，使潜在可组合使用的仿生替代品数量呈指数级增长[17] [图3（a）]。此外，（生物）打印、生物力学、诱导多能干细胞、脱细胞器官、免疫调节、生物正交化学和基因编辑技术的进展极大地促进了组织工程学的发展[图3（b）]。极具挑战性的与衰老相关的肌肉骨骼疾病（如膝关节炎）的发生率不断增加，关节软骨修复技术的进步是促进全球关节软骨组织工程市场繁荣的关键驱动因素[1,18]。据统计，2016年关节软骨组织工程的市场规模为42亿美元，尽管2019年受到新冠病毒肺炎（COVID-19）疫情的影响，但2016—2025年该市场的复合年增长率将有望达到5.4%。迄今为止，已经有几种组织工程软骨产品获得临床批准。然而，美国批准的基于组织工程学的治疗策略仍然只有自体软骨细胞移植和基质辅助自体软骨细胞移植[19]。与此同时，目前有仍数百个处于不同阶段的临床试验（https://www.clinicaltrails.gov）。

图3 组织工程和基于组织工程软骨的关节软骨再生的基本概念和最新进展。（a）组织工程三要素。（b）与组织工程相关的最新进展。（c）在过去20年（截至2021年7月1日），以“水凝胶和软骨”为主题的研究论文的发表数量和引用数量显著增加。AMIC：基质辅助自体软骨细胞移植；CRISPR：规律间隔成簇短回文重复序列。（a）源自参考文献[18]，且经过Springer Nature ©2014版权许可；（b）源自参考文献[20]，且经过Springer Nature ©2016版权许可。

4、 功能化水凝胶作为关节软骨组织工程的指导性支架

由于关节软骨是一种含水量丰富、具有良好黏弹性的复杂组织，因此水凝胶被认为是用于关节软骨修复的理想生物材料基质。在过去10年中，研究人员发表了超过2000篇关于“软骨和水凝胶”主题的科学论文[图3（c）]，显著促进了关节软骨在组织工程学上的发展。水凝胶是一种交联聚合物，可保有大量的水，作为最佳生物材料能够用于改造含水量丰富的组织，如关节软骨[21]。在分子水平上，分子量、网络的筛孔大小和交联点间的聚合物链是水凝胶结构的三个最重要参数[图4（a）] [22]。根据材料来源、孔径大小、链间交联方法和电荷数量，通常可将水凝胶分为不同的类别 [23] [图4（b）]。一般采用几种天然和合成聚合物[图4（c）]、无机物和复合生物材料形成水凝胶，然后通过多种不同的方法[图4（d）]进行软骨修复，包括物理交联、化学交联、自组装、酶交联以及光交联[21]。由于在可降解性、生物力学、可控性、重现性和分子量方面具有优异的可调谐性，这些聚合物中的合成聚合物衍生水凝胶可以自我增强，以改善滑膜关节承受载荷的力学性能。然而，合成聚合物可引起不利的免疫应答甚至严重毒性，并表现出较低的生物活性[24]。相比合成聚合物，天然聚合物（基于蛋白多糖的生物材料）水凝胶具有一些内在优势，如与天然细胞外基质的高生物相容性、生物降解性和大分子相似性，可改善生物活性和细胞黏附性[25]。然而，天然水凝胶具有快速降解、水合作用不一致、不利的弹性和较差稳定性的特点，阻碍水凝胶进一步应用[25]。目前，已经开发了多种混合水凝胶来克服合成和天然水凝胶的缺点。在参考文献[26]和文献[27]中比较和总结了几种常用的用于关节软骨修复和再生的水凝胶的优缺点。

图4 功能化水凝胶是关节软骨组织工程的理想支架材料。（a）水凝胶在分子水平上的结构。（b）聚合物水凝胶基于理化性质方面的分类。（c）一些天然聚合物（透明质酸、海藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖）和合成聚合物（聚丙交酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙醇酸、聚乙二醇、聚己内酯和聚乙烯醇）的化学结构。（d）通过几种不同途径制作水凝胶的例子：（I）通过Ca2+和海藻酸盐之间的离子相互作用进行原位成胶，以及化学交联策略；（II）通过H2O2和辣根过氧化物酶之间的酶促交联反应进行原位成胶；（III）通过光交联方法进行原位成胶；（IV）肝素和星型聚乙二醇交联形成水凝胶。M̅c：交联的聚合物链的分子量；hv：光能。（a）源自参考文献[22]，且经过Elsevier ©2020版权许可；（d）源自参考文献[21]，且经过IntechOpen ©2016版权许可。

水凝胶有利于包裹软骨细胞或基质细胞，其作用不仅是增强黏附力，以维持这些细胞的形态和成软骨表型，还能为细胞创造有利的局部三维微环境。在这个微环境中，细胞和网络相互影响。细胞可以感知水凝胶内的众多生物化学和生物物理学的探究信号，这些信号可以指导细胞行为（如迁移、增殖和分化）[28]。同时，细胞介导的仿生包裹水凝胶的重塑会影响其结构、力学性能和降解特征[28‒29]。此外，水凝胶作为一种渗透基质，可控释和释放可溶性生化因子。可以将细胞和水凝胶混合物直接注射到软骨损伤部位，使之原位凝胶化[30]，消除了细胞包裹和支架后（生物）制造程序的步骤，为患者提供了微创手术的选择。也可以在体外进行精确地（生物）设计和制造这些混合物，利用三维（生物）打印平台制作可植入式水凝胶。

传统的化学水凝胶通过共价键交联，但存在一些缺点，比如材料的脆性、凝胶化后难以注射、细胞增殖和迁移受限等。然而，一些功能化水凝胶，如一类新型超分子水凝胶具有有效的细胞递送、分散和存活、自愈和剪切变薄特性的优势，有利于软骨修复。功能化水凝胶具有化学、机械和电模拟生物组织的功能[31]。通过现代制造技术改造的功能化水凝胶创造了各种具有通用表面效应的功能性生物材料，在众多应用中有巨大的开发潜力。本文得出一些关于水凝胶的结论，尤其是刺激响应性水凝胶。在关节软骨的组织学运用场景中，功能化水凝胶可以被定义为“由许多创新（生物）设计和（生物）制造技术形成的一类仿生水凝胶，以实现用于治疗软骨损伤的天然软骨组织的相似结构、力学和生物学特性”。功能化水凝胶可作为药物、营养载体、弹性体和支架，使软骨再生。功能化水凝胶具有生物启发的可协调的宏观和微观结构以及良好的生物化学和生物物理功能，特别是在微创治疗的情况下，功能化水凝胶已经发展成为关节软骨修复的研究热点[32‒33]。

5、 软骨再生功能化水凝胶的（生物）设计

5.1 功能化水凝胶中细胞外基质成分的应用

多种成分可以作为软骨再生的传统生物活性分子被添加到水凝胶前体中发挥生物学作用，如外源性细胞、生长因子[34]、治疗性多肽[35]、促软骨生成分子[36]和RNA靶向分子[如小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、信使RNA（mRNA），以及一类具有抗miRNA功能的反义寡核苷酸（antagoMiR）] [37]。除上述成分外，细胞外基质具有天然仿生材料的固有优势，作为软骨再生功能分子被用于水凝胶，已广受关注。一般情况下，细胞外基质可以以溶解状态或基于颗粒形式被制备成功能化水凝胶，用于关节软骨损伤修复[38‒39]。

5.1.1. 溶解状态的细胞外基质成分

软骨细胞外基质最主要的两种成分是胶原蛋白和糖胺聚糖（GAG），二者已被广泛应用于水凝胶中以重建软骨细胞外基质。在软骨再生功能化水凝胶中，溶解状态的胶原蛋白和糖胺聚糖本身可以作为聚合物发挥交联作用，而无需添加其他聚合物或额外的促软骨生成分子[40]。尽管II型胶原蛋白在软骨胶原蛋白中占据主要成分，但由于难以获得且均一性不足，此前众多研究均使用I型胶原蛋白水凝胶促进软骨修复。在复合水凝胶中添加II型胶原蛋白可以促进软骨特异性细胞外基质的产生、软骨细胞增殖及软骨修复[41]。Kilmer等[42]创新性地应用I/II型胶原蛋白混合水凝胶促进了兔股骨软骨缺损部位糖胺聚糖的生成和关节软骨的修复。此外，糖胺聚糖和胶原蛋白混合水凝胶更接近天然软骨基质组分，显示出显著的优越性，已逐渐取代胶原蛋白水凝胶成为关节软骨组织工程的“金标准”[40]。然而，糖胺聚糖只是蛋白多糖的侧链分子，蛋白多糖才是软骨非胶原蛋白成分的主要功能单元。有研究证实，在2.25%琼脂糖水凝胶中加入0.25%蛋白多糖类似物，可以改善琼脂糖水凝胶的压缩和应力松弛性能，但是降低了水凝胶中人脂肪间充质干细胞（MSC）的代谢活性和活力[43]。进一步优化以同时保持蛋白多糖完整性和细胞活性，可以增强软骨再生水凝胶的力学性能和生物相容性。

另一种重建天然软骨细胞外基质的策略是将脱细胞基质（dECM）应用于水凝胶。脱细胞后的软骨基质主要成分是胶原蛋白，需要进一步通过酶消化以使其溶解，然后再重新聚合成胶；然而，关于酶消化后的脱细胞基质的生物活性仍存在争议[44]。此外，脱细胞基质即使在经酶和酸消化后，其溶解度也很低[仅3%（质量与体积之比）[39] ]，无法达到健康软骨内的胶原蛋白含量。通过一种消化-冻干-再溶解的方法，脱细胞基质的溶解度可以达到6%（质量与体积之比）[45]。灭活软骨（DVC）缺乏化学脱细胞过程，被认为比软骨脱细胞基质具有更强的成软骨诱导作用[46]。然而，溶解灭活软骨也存在类似的局限性（溶解度和生物活性低）。灭活软骨保留了原始细胞组分，可能引起体内免疫反应，因此需要深入研究。

5.1.2. 基于颗粒形式的细胞外基质成分

与由溶解性细胞外基质成分形成的水凝胶力学性能不佳和孔隙率低所不同，基于细胞外基质颗粒的水凝胶在生物学功能和力学性能方面对软骨再生具有优势[47]。此外，组织结构组分可以通过粉碎化并冻干成颗粒状态。脱细胞基质和灭活软骨颗粒可以在很大程度上保留组织成分的天然构象和拓扑结构，使构建具有不同几何构型和孔隙率的组织特异性水凝胶成为可能。脱细胞过程中糖胺聚糖的留存对于水凝胶的力学性能和脱细胞基质颗粒中生长因子的保留至关重要[48]。含有脱细胞基质颗粒的I型胶原蛋白水凝胶可以增强间充质干细胞的成软骨相关基因的表达，而且转化生长因子β3可以进一步强化这种作用[49]。对糖胺聚糖进行改性，使其与脱细胞基质颗粒进行化学交联，可以将脱细胞基质颗粒保留在水凝胶中，以模拟软骨的天然组分[50] [图5（a）]。灭活软骨颗粒在软骨诱导和力学性能方面均优于脱细胞基质颗粒[46]。此外，Levinson等[51]将自体软骨颗粒纳入纤维蛋白/胶原蛋白水凝胶中，以支持软骨细胞生存和生长。然而，自体软骨颗粒组织来源有限，难以广泛应用。

图5 基于功能化水凝胶的代表性（生物）设计用于软骨再生。（a）低摩擦、双相和边界润滑三网络结构水凝胶用于关节软骨修复。（b）软骨仿生润滑水凝胶用于大鼠早期关节炎模型以促进软骨再生。（c）用N-羟基琥珀酰亚胺对硫酸软骨素分子进行化学修饰，以促进其与组织颗粒上的胺基团的结合。（d）挤出式打印的水凝胶细丝内胶原纤维的排向。（e）三维（生物）打印构造中两种不同的生物墨水和细胞的空间分布：（I）层状支架中生物墨水的带状分布；（II）（生物）打印层状支架的纵向横截面，其中软骨细胞（蓝色）被限制在顶层，而未标记的人类间充质干细胞和β-磷酸三钙颗粒（白色箭头指向的放大的钙化软骨中的区域）出现在支架的底部；（III）通过计算机断层扫描可见β-磷酸三钙颗粒在无细胞支架中沿着z轴分布。（f）软骨仿生带状水凝胶组装后，支架的刚度和II型胶原的形成呈梯度分布。PMPC：聚-2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱；HA/PA：将聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠盐共价结合到透明质酸主链上所合成的润滑剂；HA/PM：通过将聚-2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱共价连接到透明质酸主链上所合成的润滑剂。（a）源自参考文献[58]，且经过Elsevier ©2018版权许可；（b）源自参考文献[62]，且经过Springer Nature ©2021版权许可；（c）源自参考文献[50]，且经过Wiley Periodicals, Inc. ©2017版权许可；（d）源自参考文献[79]，且经过Springer Nature ©2019版权许可；（e）源自参考文献[83]，且经过IOP Publishing ©2019版权许可；（f）源自参考文献[87]，且经过ACS ©2018版权许可。

除了添加单一形式的附加成分外，许多研究聚焦于构建含有不同物理形态成分的水凝胶。近期的研究表明，在连续的水凝胶基质中嵌入微粒（MP）可以提高水凝胶的剪切强度和压缩模量[52]。由于聚合物链之间具有氢键或分子内纠缠等物理相互作用，微粒会对水凝胶交联网络产生拖拽力，从而提高其抗形变能力。既往研究也证实含有微粒的两相聚合物复合材料具有更优的韧性[53]、刚度和弹性[54]。将脱细胞基质颗粒嵌入溶解性胶原蛋白和糖胺聚糖混合水凝胶，因更接近天然基质构成而逐渐受到青睐[48]。此外，Beck等[55]尝试将不溶性的灭活软骨颗粒添加到溶解性的灭活软骨水凝胶中。溶解性的灭活软骨可以暴露更多的软骨细胞外基质反应位点，而灭活软骨颗粒模拟了软骨细胞外基质的天然结构。体内和体外实验结果表明，水凝胶的力学性能和成软骨生物活性都得到了改善。

为了模拟软骨基质的天然功能和组分，混合脱细胞基质颗粒和天然软骨来源的结构完整的蛋白多糖，以恢复关键组分的生理含量，这可能是一种有前途的软骨再生功能化水凝胶构建策略。此外，从免疫豁免组织获取细胞外基质从而构建水凝胶的技术也非常有前景。基于免疫豁免组织细胞外基质完整且未经修饰的纯天然结构和组分优势，Lindberg等[56]利用玻璃体组织构建了高相容性和生物活性的细胞外基质水凝胶，显著促进了人间充质干细胞增殖和软骨分化。

5.2 功能化水凝胶的表面润滑设计

由于关节表面和关节液的润滑效应，健康的关节软骨摩擦系数较低。为了降低表面摩擦力以恢复软骨功能，构建固有光滑表面成为一种组织工程策略。Means等[57]构建了接近软骨弹性模量和强度的双网络结构水凝胶，该水凝胶可以截留液体从而形成一个光滑的润滑表面。此外，Milner等[58]在不降低软骨细胞活力和增殖能力的前提下构建了一种低摩擦力、双相和边界润滑的三网络结构水凝胶[图5（a）]。受软骨天然毛刷状润滑层结构启发，聚合物水凝胶的润滑功能也有利于润滑表面的构建[59]。然而，即使在高挤压压力下，天然软骨也表现出超低的摩擦系数。将厚厚的亲水性聚电解质刷缠结在下硬质层中的双层水凝胶材料表面，构建了一种新型的软骨仿生双层水凝胶体系[60]。即使在重载荷条件（接触压力为10 MPa级）下经受5万次往复循环，水凝胶也能具有低摩擦系数（0.010级），其性能与天然关节软骨非常接近。水凝胶在苛刻的条件下仍能保持低摩擦系数，这对关节软骨修复来说具有重要意义。

在关节软骨组织工程中，润滑剂的使用也可以减少表面摩擦系数。Lin等[61]在软骨结构的启示下，在水凝胶中加入微量脂质，从而在界面形成脂质层。不断渗出的脂质可以在水凝胶表面形成光滑层，显著降低了水凝胶的摩擦系数和磨损，即使在水凝胶干燥和再水化后也可以观察到这一现象。这一策略有望维持软骨修复水凝胶的极端表面润滑性能。另一项体内研究也显示，在仿生透明质酸骨架上嫁接富含磺酸盐的润滑剂样聚合物或富含脂类磷胆碱的聚合物，可促进早期关节炎大鼠软骨再生[62] [图5（b）]。该体系的摩擦系数显著降低至天然关节软骨的极低水平，体内实验结果表明8周内可以实现软骨再生和骨关节炎的消退。这些方法为临床转化提供了潜在的实用策略。

5.3 功能化水凝胶的三维结构

5.3.1. 多孔结构

具有多孔结构的水凝胶为细胞附着、生长、增殖和分化提供了充足的空间。众多研究表明，软骨细胞和间充质干细胞增殖和软骨生成的推荐孔径为100~500 μm [63‒66]。孔隙过小会阻碍细胞渗透[66]，而孔隙相对较大的水凝胶则有利于细胞浸润、增殖和软骨生成[67]。生物材料的类型和交联强度对水凝胶的孔隙大小和孔隙率有显著影响。Al-Sabah等[68]比较了不同交联强度的海藻酸盐（ALG）和纳米纤维素水凝胶，结果显示氯化钙交联剂的浓度显著改变了水凝胶的总体孔径和孔率。等将海藻酸盐水凝胶冻干后发现，其孔径急剧增大至200~300 μm。另一项研究表明，水凝胶中脱细胞基质的纤维直径和凝胶孔隙面积随浓度的增加而减小，低浓度时分别为（0.094 ± 0.005）‍μm和（0.128 ± 0.017）‍μm2，高浓度时分别为（0.069 ± 0.005）‍μm和（0.059 ± 0.001）‍μm2 [70]。一般而言，交联强度高的单纯溶解性成分水凝胶结构致密，孔隙率低。然而，Qi等[71]通过光交联方法构建了单纯溶解性丝氨酸水凝胶，该水凝胶具有良好的孔径，可达（193.51 ± 7.68）‍μm，孔隙率高达97%。颗粒形式的成分被广泛用于增加水凝胶的孔隙尺寸。Almeida等[67]通过调整脱细胞基质颗粒的浓度，成功制备出孔径介于（32 ± 12）‍μm至（65 ± 20）‍μm的水凝胶。随着颗粒的加入，水凝胶孔隙数量显著增加。致孔剂的应用也可以控制软骨生成适宜的孔隙尺寸[72]。然而，考虑到致孔剂的单一功能，应该谨慎地平衡孔隙结构和材料的其他性能。特定刺激信号可以启动刺激响应性孔隙形成。此外，通过依次激活多种刺激响应性致孔剂可以实现时序性孔隙生成。Han等[73]通过螯合作用、温度和酶活性的协同刺激，动态控制刺激响应性三相致孔剂水凝胶的孔隙率。

5.3.2. 交联网络

一般来说，对于单一聚合物交联网络的水凝胶，其结构的可调节范围非常有限。增加交联强度可能会影响细胞的活力、渗透性和生物活性。多种聚合物联合形成的网络（如互穿网络、双网络、双交联网络、客-主网络）可以改善水凝胶的力学性能和孔隙率。可逆结合（非共价键）的独立网络可以形成互穿网络。Dinescu等[74]利用明胶、海藻酸盐和聚丙烯酰胺构建了一种互穿网络结构水凝胶，该水凝胶在长期培养过程中形成了高度有序的孔隙格局和明确的互通孔隙，极大地促进了干细胞的增殖和软骨分化。而双网络结构在同一个水凝胶体系中具有两个独立的交联网络。一般来说，一个网络是刚性的，另一个是柔性的。双网络结构水凝胶的力学性能和表面结构具有更接近天然软骨的潜力[58,75]。在双交联网络结构水凝胶中，两种聚合物在同一网络中共价交联。Beachley等[50]制备了一种脱细胞基质颗粒-糖胺聚糖双交联网络结构水凝胶，实现了水凝胶的可调性成胶和力学性能[图5（c）]。而两种聚合物之间的非共价交联作用有利于形成可逆的客-主网络。由于客-主网络的灵活性，通过O-羧甲基壳聚糖与三维动力分子之间形成的客-主网络而构建的剪切变稀水凝胶在软骨修复中取得了良好的结果[76]。

5.3.3. 具有软骨特异性分层结构的仿生水凝胶

关节软骨组织工程的一个关键方向是模拟软骨组织高度分层结构、细胞外基质组分和分层关节软骨的力学特性。一般来说，水凝胶缺乏内部定向结构。两种脱细胞基质水凝胶的扫描电子显微镜（SEM）结果显示，两种水凝胶网络均未获得方向性排列，角度归一化取向指数接近零[70]。为了模拟关节软骨浅层胶原纤维分布，Owida等[77]通过静电纺丝技术生产了一种包裹特定排列方向纳米纤维网的透明质酸水凝胶。由于可以控制打印基质成分的方向，三维（生物）打印具有重建软骨复杂结构的巨大潜力。Schwab等[78]通过三维（生物）打印技术实现了剪切诱导的胶原纤维排列。胶原纤维的排列在浅层呈水平方向，在中间层呈各向同性，在深层呈垂直方向。Moncal等[79]基于热控挤压式（生物）打印平台打印了低各向异性的胶原纤维[图5（d）]。此外，在水凝胶中加入磁性颗粒还可以以磁场引导的方式调整分子的排列[80]。在（生物）打印过程中，将含有铁纳米颗粒的琼脂糖-I型胶原蛋白生物墨水暴露在磁场中，可以使胶原纤维排列整齐；在琼脂糖浓度低于0.5%时，水凝胶浓度越低，排列对齐效果越好。

在设计软骨组织工程仿生水凝胶时，除了考虑胶原纤维的分布和方向外，还应考虑不同细胞类型、细胞密度和细胞排列所形成的软骨特异性分层结构[81‒84] [图5（e）、（f）]。目前已经报道了部分基于分层水凝胶的关节软骨再生策略（表1 [77,81‒90]）。通过这种方法，水凝胶中负载的细胞有望表现出分层特异的性能。根据深度相关细胞密度设计，不同分层负载不同密度软骨细胞的均质II型胶原蛋白水凝胶，不同分层细胞生物合成活性不同，且细胞外基质呈梯度分布[81]。此外，通过调控水凝胶中的细胞排列和延伸，可以调节其糖胺聚糖和胶原蛋白的生物合成[82]。混合间充质干细胞和关节软骨细胞的软骨水凝胶可以显著地促进软骨生成[83]。另一种组织工程软骨的构建方法是用不同组分（均质或非均质）的水凝胶构建分层结构。利用这种方法，不同分层中负载细胞的水凝胶各不相同，这些水凝胶在大鼠模型中实现了理想的骨软骨缺损再生[83]。

表1 具有软骨特异性带状结构的生物仿生水凝胶用于软骨缺损的修复

StrategyHydrogelApproachAimKey outcomesReference
Zonal cellsCollagen II3DBPCell density gradient

• Gradient distribution of ECM

• Affected the biosynthetic ability of chondrocytes through the cell distribution pattern and total cell density

[81]
CS-g-PNIPAAmMicro-moldingCell alignment and elongation

• Aligned cells in the SZ and unpatterned cells in the MZ

• Increased secretion of GAGs and total collagen

[82]
ALGCell culture insert in the designed magnetic fieldZonal cell arrangement

• Vertical cell arrangement

• Upregulated expression of Col2a1 and aggrecan

• Zonal ECM organization

[84]
Fiber orientationHANanofiber meshZonal nanofiber orientation

• Low production of collagen II and GAGs, elongated cell morphology, high production of collagen I, and high cell proliferation activity in the SZ

• Clustered cells and high expression of collagen II in the MZ

• Highest GAG production, lowest collagen I expression and cell proliferation in the DZ

[77]
Zonal polymersALG + GelMA + CS-AEMA + HAMA3DBPHyaline + calcified cartilage, zonal cell types

• High cell viability

• Upregulated expression of hypertrophic biomarkers in the homogenous equivalent of calcified cartilage but not in the gradient heterogeneous construct

• The bioprinted scaffolds were beneficial for OCD regeneration in rats

• The mineralized matrix consisted of hypertrophic proteins, GAG, osteocalcin, and collagen type X was formed

[83]
Gradient componentsAgarose + gelatinCircular silicon moldCS/BG gradient

• Chondrocytes secreted hyaline-like matrix with higher sulfated GAG, aggrecan, and collagen II on CS fibers

• Enhanced mineralization on BG fibers

• Continuous opposing gradients of GAG enriched and mineralized ECM in response to the physical gradients of raw materials CS and BG

[88]
Gradient oxygen supplyPectin + fibroinMixing chamberThe depth-dependent gradient of oxygen releasing• The increased amount of produced oxygen from the lowermost to the uppermost section[85]
Gradient osteochondral unitPEGDMA3DBPOsteochondral gradient

• Precise cell distribution

• Increased cell viability

• Firm attachment with adjacent tissue and more proteoglycan deposition at the interface between implanted construct and native cartilage

• Elevated GAG contents

[86]
Hybrid approachesChitosan‒gelatin hydrogel/PLGAGlass tube orificeThe graded transition from the hydrogel to PLGA scaffold and graded variation in the amount of BMP-2 and TGF-β1

• Promote bone marrow MSCs toward chondrogenesis and osteogenesis, respectively

• Better integration of the regenerated hyaline-like cartilage and SB with the surrounding tissues by utilizing the BMP-2 and TGF-β1 double-loaded hydrogel/PLGA graded scaffold in vivo

[89]
PEG + CSInterconnected chamberCS gradient + mechanical gradient

• Depth-dependent stiffness and gradient biochemical properties

• Increased expression of hyaline cartilage markers, and upregulated collagen deposition and chondrocyte proliferation in a zonal-dependent manner

• Enhanced zonal organization by chondrocytes

[87]
GelMACustom-made Teflon injection moldZonal growth factors + superficial/deep cartilage + SB + depth-dependent fiber organization

• Downregulated osteogenesis and chondrogenesis of MSCs, and cellular phenotype and matrix accumulation profiles resembling those of the native tissue

• The defects have been repaired by the formation of neocartilage with a more lubricating and wear-resistant surface and the denser SB

[90]

此外，氧含量梯度分布是不同软骨分层区中影响软骨细胞生物活性的重要因素。目前已有水凝胶实现了从最底部到最顶部氧含量的逐渐升高，这为基于分层水凝胶设计的关节软骨组织工程开辟了新的方向[85]。设计具有梯度力学性能的水凝胶是制备软骨功能化水凝胶的关键[86‒87]。尽管有很多方法可以利用水凝胶来模拟软骨特异性的分层结构和性能，但迄今为止还没有一种方法可以构建出与天然关节软骨组织相当的软骨移植物。

5.3.4. 结构可变性

水凝胶可以吸收高达其干重数千倍的水分[91]。可降解水凝胶在降解过程中的溶胀率会不断增加[92]。通过改变交联密度可以实现可控的溶胀率。增加聚乙二醇的浓度、降低聚乙二醇高分子的分子量或使用支链聚乙二醇结构代替线性结构均可降低聚乙二醇水凝胶的溶胀率[93]。

值得注意的是，细胞介导的收缩效应会给负载细胞的水凝胶带来潜在的应用风险[94]。水凝胶的性质随着大分子的收缩而改变。而且，体内水凝胶收缩后会与周围组织之间失去接触，从而阻碍水凝胶与周围组织的整合。增强水凝胶的交联强度可以抵抗细胞介导的收缩效应。然而，交联强度的增加会降低细胞渗透性和活性。因此，水凝胶的交联强度和细胞介导的收缩效应之间的平衡至关重要。Cheng等[95]用不同浓度的吉尼平（天然生物交联剂）构建了基质来源的无收缩效应水凝胶，其中由0.05%吉尼平形成的中度交联水凝胶具有软骨诱导作用，且在培养期间没有明显的细胞介导的收缩效应。此外，通常在水凝胶中加入颗粒成分可以避免不适宜的收缩效应。含有灭活软骨颗粒的甲基丙烯酸化溶解性灭活软骨水凝胶在培养6周后体积变化不明显，而单纯的甲基丙烯酸化溶解性灭活软骨水凝胶的体积则收缩了18% [55]。

自愈合特性允许水凝胶动态地改变和恢复自身框架结构，这使水凝胶具有可注射性，从而有利于临床应用。具有动态共价反应（化学交联）和（或）非共价反应（物理交联）的水凝胶可实现自愈合性能[32,96]。Yu等[76]基于O-羧甲基壳聚糖和由苯-1,3,5三羧醛与聚醚胺反应生成的可溶性化合物构建了一种新型动态水凝胶，用作关节软骨组织工程支架，该水凝胶具有良好的pH敏感的溶胀率和自愈合性能。Zhang等[97]进一步制备了一种在生理条件下交联的醛功能化纤维素纳米晶体/胶原蛋白水凝胶，该水凝胶具备了优异的剪切变稀和自愈合特性。这种自修复水凝胶可以保护细胞在被注射到不规则软骨缺陷区域时不会遭受高剪切应力的影响。

5.4 定制形状和尺寸以适应不规则软骨缺损需求

由于水凝胶具有灵活性和可塑性，可以匹配不规则组织缺陷，因此水凝胶原位聚合技术在组织工程中得到了广泛应用[98]。原位聚合水凝胶（如一些可注射的水凝胶）的形状和大小可以精确匹配软骨缺损区域的解剖结构，从而填充不规则形状的缺损，并与周围组织形成良好接触。然而，传统方法难以在损伤区域产生高精度、理想形状的关节软骨移植物。三维（生物）打印技术可以构建具有异质成分和复杂结构的软骨水凝胶，并实现高形状保真度[83,99]。通过精确的空间控制可以设计和实现水凝胶三维形状和定制的复杂结构[100]。这对水凝胶构建过程中模拟组织缺损区域的形状和异质结构以及各向异性的软骨结构至关重要。

5.5 力学性能

功能化水凝胶已广泛应用于软骨修复。由于关节软骨是承重组织，其破裂强度为几十兆帕，模量为1 MPa，失效伸长率为100% [13]，水凝胶的力学性能在这些应用中至关重要。许多研究聚焦于构建仿生水凝胶以模拟软骨细胞外基质力学性能。一般而言，较高浓度的水凝胶成分或较高水平的交联强度会使凝胶刚度更大和（或）更脆。交联网络结构以及额外添加的材料和细胞也有助于改变水凝胶的力学性能。已有研究表明，聚乙烯醇（PVA）水凝胶的压缩模量、剪切模量、拉伸模量和渗透性比其他水凝胶更接近软骨[92]。DeVolder等[54]研究表明，在胶原蛋白水凝胶中添加聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微粒，可以调节水凝胶的刚度和弹性。水凝胶的力学性能也可以通过连续纤维加固来增强[101]。Qiao等[90]用高模量的纤维聚合物增强了本身脆弱的甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶，并获得了与天然软骨相当的压缩模量。此外，双网络结构水凝胶是优异的结构平台，可以将不同的力学性能整合到单一生物材料中，因此备受关注。Yan等[102]构建了明胶/聚丙烯酰胺双网络结构水凝胶，与传统的单网络结构水凝胶相比，该水凝胶具有优越的力学性能（高弹性模量、破坏拉伸应力和应变，以及破裂能量）。此外，研究者还尝试动态地改变凝胶的力学性能，如构建刚度随时间尺度增加而逐渐增加的水凝胶[103]。除了优化韧性、应变、刚度和动态力学响应外，水凝胶的力学均一性一直被广泛忽视。Xue等[104]制备的马来酰亚胺-硫醇交联的聚乙二醇水凝胶具有明确可控的均一性，基质刚度的纳米级变化可以显著地调控细胞命运。

5.6 可调的降解性和生物相容性

在软骨再生过程中，降解相关的新生组织重塑对功能化水凝胶至关重要。目前设计具有适当降解性能和质量丢失的水凝胶支架仍极具挑战。降解过程不仅破坏了水凝胶的交联网络，而且降低了其力学性能。因此，通过调节水凝胶的可降解性可以在一定程度上调控水凝胶随时间变化的超微结构和力学性能。水凝胶的降解过程可以受多种途径调控（如水解、蛋白酶介导的降解以及外部刺激触发的降解）。在理想情况下，植入体内的水凝胶的降解应与基质沉积和新生软骨形成相对应。降解过快会导致不良的力学支持，而降解过慢会阻碍新生软骨组织的长入。当下，利用多种策略可以控制水凝胶在体内和体外的降解。Kloxin等[105]发现，在基于聚乙二醇的水凝胶中加入可光降解的成分，通过光照时间、强度和面积可以控制水凝胶的降解。成分随时间变化的光降解凝胶可以促进干细胞成软骨分化。然而，这种方法在体内并不适用。一种由基质金属蛋白酶基团修饰的基于聚乙二醇的生物反应性水凝胶可以平衡细胞介导的降解和软骨生成[106]。Wang等[107]开发了一种含有鱼来源的自组装胶原蛋白和自交联聚乙烯醇的新型双网络结构水凝胶，通过调整聚乙烯醇与胶原蛋白的比例可以实现这种水凝胶的可控降解。

此外，对于关节软骨组织工程来说，理想的功能化水凝胶软骨移植需要良好的生物相容性，这通常被定义为植入的生物材料能够引起适度的宿主反应。近年来，人们对各种水凝胶进行了化学改性以提高其在关节软骨修复和再生中的生物相容性[108]。

5.7 生物化学因子的可控传递和释放

水凝胶是药物传递的首选材料。由于其高含水量、可调的网格大小和黏弹性，水凝胶可以装载小型生物药物或细胞。水凝胶提供的三维环境可以保护其有效载荷，而对其释放的时空控制可以通过物理化学作用、网格大小、黏弹性或“智能”水凝胶中的主动机制来调节。关于水凝胶用于药物输送的研究已经非常成熟，并已成功转化为临床应用，其中最著名的例子是Infuse® [一种胶原蛋白，用于在围手术期制备水凝胶，以递送骨形态发生蛋白-2（BMP-2）] [109]。其他临床批准的基于水凝胶的药物传递系统包括抗癌药物、抗生素和伤口敷料的传递系统。在研发中探索的应用范围更广，大量的文献描述了控制药物从水凝胶中释放的物理化学原理[110]。

水凝胶的靶向给药可以防止脱靶系统效应并增加局部药物浓度，而不会使其他器官暴露于大剂量药物。用于药物传递的生物材料可充当物理屏障并保护其有效载荷，或减缓降解酶的渗透从而增加药物半衰期，特别是生物药物。这些水合的聚合物网络可以捕获、呈递和释放类似于生理软骨细胞外基质的生化因子。

鉴于影响水凝胶药物递送的物理化学方面的因素，需要考虑的主要参数是网格尺寸和基于特定官能团的化学相互作用。网格尺寸是确定水凝胶中药物扩散速率的基础。对于大多数水凝胶来说，典型的网格尺寸为5~100 nm [111]。牛血清的流体动力学半径约为5 nm，分子量为66 kDa [112]。对于球状蛋白，流体动力学半径与分子量成正比。TGF-β和BMP-2的活性形式的分子量分别约为25 kDa和26 kDa，意味着对于这种尺寸的蛋白质，水凝胶网格尺寸通常显著大于活性分子尺寸，其扩散基本不受阻碍。较大的蛋白分子（如抗体）与相对较小网格尺寸的水凝胶相结合，可以利用网格大小来限制药物载荷的扩散。例如，Hiemstra等[113]比较了通过立体复合形成的PEG/PLA水凝胶中溶菌酶（流体动力学半径为4.1 nm）和免疫球蛋白G（IgG）（流体动力学半径为10.7 nm）的释放。较小的溶菌酶的释放遵循一级动力学，而IgG的释放几乎为零级，这与基质降解而非整个网状物的扩散所调节的释放一致。

虽然在大多数情况下，单凭网格大小不足以调节小分子药物或生物药物的释放，但水凝胶可以用作颗粒或细胞的载体。从水凝胶中释放的分子可以通过特异性官能团介导的化学相互作用（如离子或疏水作用）来控制。一个典型的例子是，注射用肝素结合透明质酸水凝胶用于局部传递TGF-β1，促进软骨再生[114]。实现以微创的方式构建整个宏观水凝胶的方法有三种：剪切变稀、原位成型和形状记忆。剪切变稀材料在高剪切作用下（如通过套管注入时）的黏度相对较低，但一旦力学刺激消除，其黏度就会恢复。这种行为赋予了材料类似于液体物质的可注射特性，同时使材料保持在注入部位并在注射后保持黏性。高于一定分子量和浓度的水溶性聚合物或轻度交联的分子网络本质上会显示剪切变稀特性，这也使得它们成为药物传递系统的可行选项。剪切变稀的水凝胶也可以来源于客-主相互作用或动态共价化学反应[115]。

原位成型的水凝胶以液态前体的形式注入，并在植入后通常由交联反应驱动而转化为凝胶。典型的原位成胶体系最初有两个独立的成分，两种成分在注射过程中或注射后才混合，如使用静态混合器套管或同轴针，其中各成分只在末端互相接触。若反应动力学可以被调节到足够慢以允许无堵塞注射，或者足够快以在植入部位获得黏性材料，则可以在注射前混合这两种成分。之前的一项研究[116]利用结合透明质酸的硫醇衍生物与聚乙二醇乙烯砜阐述了这种方法。两种成分混合后，经历迈克尔加成反应的大分子成胶时间在不到1 min和14 min之间变化。软骨细胞可以被加载到这种复合凝胶中，说明这种方法在关节软骨组织工程中的应用潜力。

形状记忆水凝胶可以在发生极大变形后，如在挤出套管时完全恢复形状[117‒118]。大孔隙的水凝胶就是这类凝胶中的一个例子，其中占据大孔隙的水相成分可以被可逆地排出，实现可逆的机械坍塌[119]。在关节软骨组织工程中，晶胶已被用于构建细胞外基质来源的微孔软骨支架[120]、甲基丙烯酸羟乙酯-乳酸-葡聚糖晶胶[121]、具有互通孔隙的聚乙二醇支架[122]和透明质酸-明胶支架[123]。微米或纳米级的凝胶是在软骨中进行药物和细胞传递的实用体系。微珠可以作为关节软骨组织工程的模板[124‒125]。它们的尺寸通常比针的尺寸小得多，易于注射，并已被用于输送小分子和蛋白质以促进软骨修复[126]。聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球可以负载BMP-2和TGF-β1，形成骨软骨缺损修复的双层体系[127]。在另一项研究中，（生物）打印间充质干细胞和聚乳酸微载体可以用于骨软骨修复[128]。另一种有趣的方法是使用纳米晶体聚合物颗粒，这种晶体特性使药物释放窗口延长到几个月。通过在炎症性抗原诱导的小鼠关节炎模型中递送p38α/β丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂PH-797804证明了这种方法[129‒130]。用于关节内药物传递的纳米结构是通过具有热响应基团的透明质酸在暴露于体温时自发地自排列成纳米颗粒而生成的[131]。之前的文献[132]已经总结了其他用于骨关节炎治疗的关节内给药系统。

6、 软骨再生功能化水凝胶的（生物）制造

6.1 原位聚合成胶

除了可以完美匹配不规则的关节软骨缺陷外，水凝胶原位聚合的另一个优点是可以改善与周围组织的整合。用多肽对水凝胶聚合物进行功能改性是提高水凝胶与活体组织之间黏附性的传统方法。Tamesue等[133] 利用渗透到水凝胶网络中的线状聚合物进行原位聚合，构建了一种使用简便的黏附性水凝胶体系。Lee等[134]发现水凝胶上细胞黏附性精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）多肽的光触发激活可促进体内细胞黏附和组织整合。近年来，有研究报道了一种新型的光诱导亚胺交联水凝胶，其中邻硝基苄醇基团修饰的透明制酸可以产生光引发的醛基，这些醛基随后与组织表面的氨基结合。通过这种方法，水凝胶的黏附性和原位无缝组织整合得到了明显改善[135] [图6（a）]。此外，Zhou等[136]制备了一种由甲基丙烯酸明胶、氧化葡聚糖和明胶组成的具有光引发醛基的双网络结构水凝胶，同时实现了新生组织和现有软骨之间的良好整合以及力学性能的改善[图6（b）和（c）]。

图6 功能化水凝胶的代表性（生物）制造方法用于软骨修复。（a）原位光引发成胶的水凝胶增强组织结合的示意图。（b）、（c）扫描电子显微镜图像显示了原位聚合后的甲基丙烯酰基明胶与软骨的整合。（d）涉及水凝胶生物墨水的4种经典的三维（生物）制造方法。（e）手持式三维打印机的设计（I）和外观（II）、芯和壳分布示意图（III），以及三维打印多层纵横交错-交叉模式的模块（IV）。（f）机器人辅助原位三维（生物）打印软骨再生的示意图。（g）具有6个自由度机器人辅助的原位三维（生物）打印平台用于兔软骨缺损修复模型。UV：紫外线；SLA：立体光刻；DOF：自由度。（a）源自参考文献[135]，且经过WILEY-VCH ©2016版权许可；（b）、（c）均来自参考文献[136]，且经过Elsevier ©2018版权许可；（d）源自参考文献[139]，且经过WILEY-VCH ©2018版权许可；（e）源自参考文献[150]，且经过John Wiley & Sons ©2017版权许可；（f）、（g）均来自参考文献[160]，且经过Elsevier ©2020版权许可。

6.2 凝胶成型

在关节软骨组织工程制备功能化水凝胶过程中，凝胶成型是一种非常灵活和简单的（生物）制造技术。塑料、聚合物和金属可用于构建水凝胶的结构，其中应用最广泛的是聚合物和弹性体[137]。目前，可以采用多种定制模具来制备软骨修复水凝胶。成型过程有助于构建具有分层结构以及特定细胞和纤维导向的高精度软骨仿生水凝胶。一种具有平行条带的光罩已被用于指导细胞排列，从而实现对天然软骨不同分层中细胞表型的模拟[82]。三维微型设计的负载间充质干细胞的水凝胶模拟了软骨浅层的细胞形态和排布，培养4周后糖胺聚糖和总胶原蛋白分泌明显增加。微图形化是模拟细胞分层排列的一种有效方法，为水凝胶的（生物）制造提供了一种方便和精确的策略。Owida等[77]构建了分层结构特异性三维混合支架（含有整齐排列的聚乳酸纳米纤维网络的透明制酸水凝胶）以模拟软骨基质中的胶原蛋白导向，从而诱导分层结构特异性的软骨细胞形态和细胞外基质合成。由于导电性[138]和导磁性[80]复合生物材料的快速发展，功能化水凝胶可以将传导性材料的一些固有优势特性与自身可高度调控的物理和生化特性结合起来。水凝胶成型的（生物）制造精度可以达到微米级甚至纳米级。

6.3 三维（生物）打印

三维（生物）打印是一种使用自下而上的方法，逐层构建组织或器官的增材制造形式，在关节软骨组织工程领域吸引了越来越多的关注。与三维打印不同，三维（生物）打印具有额外的复杂性（如生物材料类型的选择、细胞来源、生物活性因子，以及与活细胞的敏感性和新组织的形成相关的技术问题）。为了关节透明软骨再生，许多新型功能化水凝胶作为（生物）墨水在三维（生物）打印技术，如喷墨、激光辅助和挤出式（生物）打印中得到了广泛的探索[1,139] [图6（d）]。

（1）喷墨（生物）打印通过精确控制液滴可以高速打印功能化水凝胶结构体，同时实现高细胞活力和低成本[140]。喷墨（生物）打印的缺点包括生物墨水种类有限、喷嘴易堵塞、结构完整性受到限制、细胞的声应力和热应力以及细胞密度低[141]。Gao等[142]利用喷墨（生物）打印技术制备了一种负载人间充质干细胞的聚（乙二醇）二甲基丙烯酸酯（PEGDMA）-甲基丙烯酰化明胶混合水凝胶，用于关节软骨组织工程，该水凝胶具有良好的力学性能。最近，一种基于凝胶前体与交联剂微滴在空气中碰撞的微反应喷墨（生物）打印系统实现了独立的海藻酸盐水凝胶微结构，这在一定程度上解决了传统喷墨（生物）打印方法的不足[143]。

（2）激光辅助（生物）打印是一种改进的激光诱导顺向转移技术。一般而言，这种技术保留了高细胞活力、密度和打印精度，并允许广泛黏度。但其成本相对较高，难以构建薄型结构，且对黏度高达300 MPa·s-1的材料的可用性有限[140‒141]。Gruene等[144]应用激光辅助（生物）打印技术制备了负载间充质干细胞的海藻酸盐水凝胶，激光打印的间充质干细胞移植物可以在体外分化成软骨并且高表达软骨标志物。

（3）挤出式（生物）打印（机器分配）是应用最广泛的方法，在成本、黏度范围（30~6 × 107 MPa·s-1）、细胞密度和多种材料联合打印方面具有明显的优势[140]。Pati等[39]通过挤压式（生物）打印技术，利用脱细胞基质水凝胶制备软骨移植物，打印的脱细胞基质结构实现了高细胞活力和良好的功能。然而，该方法也存在一些缺点，包括喷嘴对细胞的机械或剪切应力，打印速度低以及打印精度相对较低[141]。换句话说，（生物）打印的主要问题是需要在打印参数优化和材料性能控制之间取得平衡，从而构建具有高生物活性的仿生结构[145]。对于挤压式（生物）打印，在（生物）打印过程中保护细胞免受过大剪切力的同时，提供高精度和结构可靠的打印结构是一大挑战。Zandi等[146]分别基于硅酸盐纳米材料、硅酸镁锂和糖胺聚糖纳米颗粒构建了三种类型的纳米复合水凝胶，并发现纳米复合水凝胶的剪切变稀特性可以防止细胞在（生物）打印过程中遭受过强的剪切应力。通过在支撑基质中进行挤压式（生物）打印，建立了一种名为悬浮水凝胶自由可逆式嵌入（FRESH）的新策略[147]。FRESH在屈服应力支撑基质中挤出生物墨水，并将生物墨水保持在目标位置直至基质愈合[148]。支撑基质可以是带有交联剂的溶液或具有自愈合能力的脆弱预凝胶。将细胞悬浮在支撑基质中可以完全消除对细胞活力的担忧。进一步解除或增强支撑基质可以获得最终的水凝胶。

同轴挤压（生物）打印可以通过使用一种具有温和、独立的生物组装组织条的新型生物墨水来实现。O’Connell等[149]设计了一种同轴挤压（生物）打印系统，该系统允许两种不同的生物墨水在一个核/壳分配系统中。使用定制的钛喷嘴可以获得共线几何形状的墨水配方。该系统提供了一种手持式软骨修复手术打印设备[150‒151]。研究者进一步开发了“Biopen”打印机，并在喷嘴尖端附近添加了一个405 nm发光二极管进行改造[152]。这一改进使得脆弱的或液态的生物墨水可以保留在快速光交联的壳水凝胶中。此外，Yu等[153]通过机器人辅助同轴挤压（生物）打印技术，成功地利用海藻酸盐生物墨水制备了软骨组织补片。体内结果显示，软骨形成和与周围软骨组织整合得到了增强。此外，为了提高挤压式（生物）打印的打印分辨率，Castilho等[154]开发了用于细胞电子书写的新型水凝胶生物墨水（基于明胶和丝素蛋白），由其打印的排布良好负载细胞的纤维结构的直径为5~40 μm，这为重建活体组织的固有功能和形态提供了极具吸引力的机会。

（4）立体光刻（SLA）是一种利用光敏生物墨水在聚合平面进行光（如紫外线）交联的三维（生物）打印工艺[155]。只有较小黏度范围的光交联聚合物能进行立体光刻（生物）打印，这阻碍了该技术的应用。最近，Hong等[156]使用丝素蛋白水凝胶进行数字光处理三维（生物）打印，并在体外和体内促进了软骨生成。Aisenbrey等[157]打印了一种混合支架，该支架结合了基于立体光刻三维打印的支撑结构和可注射、可光聚合的水凝胶，用于递送软骨细胞以修复软骨缺损病灶。

6.4 原位三维（生物）打印

体外三维（生物）打印技术存在一些弱点，包括与患者特定缺损部位不匹配、步骤繁琐、污染风险和后处理操作需求，阻碍了其临床转化。因此，作为三维（生物）打印的下一个前沿技术，原位三维（生物）打印试图在接受手术治疗的患者体内直接构建新组织[158]。

最近，一种新型原位三维打印机“Biopen” 在体内被用于修复重建羊标准化临界全层软骨缺损[150] [图6（e）]。基于“Biopen”原位（生物）制造的灵活性，外科医生可以自由地用不同的水凝胶生物墨水填充不规则的软骨缺损。作为一种手动操作的便携式医疗设备，该打印机能以比原位聚合水凝胶更高的分辨率逐层打印功能化水凝胶三维结构，为软骨缺损区域提供高的几何和形态可塑性以及高保真度。Li等[159]通过手持式三维扫描仪进行原位三维（生物）打印以修复软骨缺损，证明了动态成像用于评估实时修正的可行性和高效性。Ma等[160]利用透明质酸甲基丙烯酸酯生物墨水进一步建立了一个用于体内软骨再生的六自由度机器人辅助原位三维（生物）打印平台[图6（f）、（g）]，并成功地开发了一种基于树脂模型的快速中心点校准工具以提高机器人移动和原位三维打印精准度，校准后的表面误差小于30 μm。同时，微型计算机断层扫描（μ-CT）可以对机器人辅助三维（生物）打印过程进行监控。兔体内实验结果表明，切实可靠的原位三维（生物）打印系统可使ICRS IV级软骨损伤于12周后得到修复。该研究揭示了这项技术的临床应用潜力。

为了促进原位三维（生物）打印技术向临床应用转化，需要进一步改进功能化水凝胶墨水的配方和鉴定。此外，尚需解决三维（生物）原位打印存在的部分问题以实现高形状保真度、快速凝胶化、优异的力学性能和生物相容性，以及更少的后处理过程步骤[158]。

6.5 四维（生物）制造

如前所述，三维（生物）制造，特别是三维（生物）打印，可以通过生物材料逐层沉积来进行仿生构建，从而精确控制具有复杂结构的打印组织的尺寸和特性。然而，三维（生物）制造的物体拥有三维（生物）制造的结构，同时其形状、性质和（或）功能在制备后，当暴露于预定的外部刺激（如温度、电场、磁场、光、pH值和离子）时，可以随着时间的推移而自我转变[161‒163] [图7（a）、（b）]。自2013年引入四维打印这一新兴领域以来，学术界和工业界对其兴趣日益浓厚。刺激反应性水凝胶因优良的变形性、良好的生物相容性、低成本和简单的制造工艺，已成为四维打印中极具竞争力的多功能生物材料。Hua等[164]基于四维打印提出了一种将热响应性和韧性组分结合在单个水凝胶网络中的生物材料设计，与传统聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAm）水凝胶相比，该水凝胶具备高韧性（韧性提高100倍，约10 MJ·m-3）和驱动性能（驱动应力提高20倍，约10 kPa）[图7（c）]。Gladman等[163]构建了一系列功能性折叠花架构（花型花瓣），通过产生简单的曲面图案来展示四维打印的能力[图7（d）]。

图7 功能化水凝胶的四维（生物）制造示意图及其刺激响应特性（如高韧性和复杂形态）。（a）水凝胶从一维到四维转变演进的概念。功能化水凝胶在一些形状转换刺激条件下的四维设计，以实现有利的暂时性的形状记忆效应（可逆或不可逆）。（b）水凝胶的四维打印。（c）一种可以用于四维打印的高韧性和热响应性水凝胶。（d）四维结构仿生打印产生的复杂花朵形态（比例尺为5 mm，插图比例尺为2.5 mm）。PVA-MA：聚乙烯醇-丙烯酸甲酯；NIPAm：N-异丙基丙烯酰胺。（a）源自参考文献[161]，且经过MDPI ©2021版权许可；（b）源自参考文献[162]，且经过John Wiley & Sons ©2020版权许可；（c）源自参考文献[164]，且经过American Chemical Society ©2021版权许可；（d）源自参考文献[163]，且经过Springer Nature ©2016版权许可。

在关节软骨组织工程中，四维（生物）制造的水凝胶能够随着时间的推移而改变其原有的形状、结构、功能和性能，从而有利于软骨组织的愈合。例如，结构性和降解响应性水凝胶具有可变的内部结构和可控的降解速率，这对协调动态结构支撑和组织长入空间至关重要。水凝胶的快速降解或不降解都可能导致不良后果，如力学支撑不足或阻碍新生软骨的生长。因此，应谨慎地平衡功能化水凝胶的降解和结构变化与软骨生成的速度。然而，要准确地控制水凝胶的性质非常困难。在某些情况下，当水凝胶能够感知动态变化并随新生组织实时调整其性能时，就有可能在整个再生过程中，而不仅仅是在某个特定时期维持所需的性能。形状记忆材料有望实现这一目标[165]。Almeida等[166]构建了一种可变形的海藻酸盐水凝胶以支持复杂软骨组织的体外发育。这种生物材料可以感知水凝胶中新合成的胶原蛋白和糖胺聚糖，并动态改变其结构以维持关节软骨组织工程所需的结构和力学性能。到目前为止，在体外和体内增强关节软骨修复和再生方面，虽然许多三维打印功能化水凝胶已经被广泛报道，但用于软骨修复的四维打印案例很少。因此，更多四维（生物）制造的水凝胶，尤其是四维打印功能化水凝胶的临床前研究备受期待。

7、 结论与展望

在过去的20年中，研究者利用功能化水凝胶在关节软骨组织工程学领域取得了巨大进展，为未来提供无限的可能性。然而，对于真正的仿生软骨再生疗法的研发，还需要做更多的工作。功能化水凝胶向市场的成功转化取决于多种因素。目前，该领域仍然存在几个关键的挑战需要克服，除了水凝胶的材料来源、功能化水凝胶内细胞和生物活性因子的分布、细胞（如内源性和外源性细胞）对生物物理和生物化学线索的响应、水凝胶的生物力学性能（如弹性、刚度和限定空间），还应该考虑与邻近软骨或骨组织整合的充分程度。换句话说，功能化水凝胶应该具有良好的生物相容性和非免疫原性，防止患者在植入后出现有害炎症反应；一些创新方法，比如通过提高植入式水凝胶支架的生存、适应和承受力以应对关节在生物力学上的严苛环境。这表明在进行体内研究之前，可能需要大量地使用离体多轴生物反应器进行体外测试。再者，水凝胶材料适合用于形成具有定制形状的新软骨。从转化的角度来看，审批程序的精简化和国际标准化，开发更合适的用于体内评价关节软骨缺损再生的动物模型、标准化的生物力学和生物化学评估来确认新生软骨，相对于邻近组织的质量以及合理设计的临床试验都扮演着至关重要的角色。针对关节软骨修复评价的综合量化系统及其特定的参数应该被确定下来。在条件允许的情况下，最好在整个实验过程中使用无创和实时定量的方法来获取长期结果的信息。这些结果信息意义重大，将会被用来确认哪一类基于水凝胶的策略可以真正地再生成与天然健康软骨相似的新生软骨。应对这些宏伟的挑战，需要具有生物医学、材料学、化学和工程学等不同学科背景的科学家和研究人员，以及临床医生、公司和监管主体进行长期密切的合作。

截至目前，尚未提出一种理想的基于功能化水凝胶的策略来再生可以长期维持关节功能的新的透明软骨。因此，今后的研究应聚焦在以下几个目标：①探索新型（生物）制造技术[如原位聚合成胶、三维（生物）打印和四维（生物）制造]，合成具有理想三维架构、可降解性、生物力学、可塑性、黏附性、细胞相容性和软骨诱导特性的功能化水凝胶。②将细胞包裹在水凝胶中，同时以时空有序调控的方式在水凝胶中呈现和缓释生化因子，以此修复具有特定带状结构和力学性能的软骨缺损。同时，阐明细胞迁移和分化机制、表型维持、细胞-水凝胶相互作用的潜在分子机制，以及细胞和生物活性因子的抗炎、免疫调节和修复效果。③致力于临床转化，开发可应用于修复关节软骨损伤的基于功能化水凝胶的生物产品。

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