硫化氢促进脂肪细胞分化、增生和肥大

Richa Verma ,  傅明 ,  杨广东 ,  吴凌云 ,  王睿

工程（英文） ›› 2023, Vol. 20 ›› Issue (1) : 36 -48.

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工程（英文） ›› 2023, Vol. 20 ›› Issue (1) : 36 -48. DOI: 10.1016/j.eng.2022.09.010

硫化氢促进脂肪细胞分化、增生和肥大

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Hydrogen Sulfide Promotes Adipocyte Differentiation, Hyperplasia, and Hypertrophy

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摘要

硫化氢（H2S）在脂肪细胞和脂肪组织中内源性产生并刺激脂肪形成。然而，H2S 对肥胖症发展的综合致病作用及其潜在机制尚不清楚。本研究发现降低的内源性H2S水平降低了小鼠脂肪细胞中的脂质积累。在脂肪形成诱导6 d 后，外源性H2S 处理显著增加了原代小鼠前脂肪细胞的脂肪生成。在脂肪生成的早
期阶段，H2S增加细胞增殖并为细胞增生做好准备。H2S处理10 d 后，前脂肪细胞的细胞表面积和直径明显增大，表明细胞肥大。虽然H2S 刺激脂质积累和脂肪生成，但H2S 对脂肪分解没有影响。随着营养过载和高葡萄糖/胰岛素孵化，H2S 进一步刺激葡萄糖消耗并恶化脂肪细胞肥大。H2S 上调增生基因[CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPβ）、细胞分裂周期25（Cdc25）、微染色体维持3（Mcm3）和细胞分裂周期（Cdc45）]和细胞周期蛋白依赖性激酶2 蛋白（Cdk2），调节细胞增殖。H2S 还上调了胰岛素受体β（Irβ）激活的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和蛋白激酶B（Akt）通路，从而导致脂肪生成。总之，H2S 增加脂肪细胞分化、肥大和增生，提示它在肥胖症中起致病作用。

Abstract

Hydrogen sulfide (H2S) is endogenously produced in adipocytes and fat tissues and stimulates adipogenesis. The integrated pathogenic effects of H2S on the development of obesity and the underlying mechanisms, however, have been unclear. Here, we find that a decreased endogenous H2S level lowered lipid accumulation in mouse adipocytes. Exogenous H2S treatment significantly increased the adipogenesis of primary mouse preadipocytes after six days of adipogenic induction. In the early phase of adipogenesis, H2S increased cell proliferation and prepared cells to go through hyperplasia. After H2S treatment for ten days, preadipocytes exhibited significantly greater cell surface area and diameter, indicating cell hypertrophy. Although it stimulated lipid accumulation and adipogenesis, H2S had no effect on lipolysis. With nutrition overload and high glucose/insulin incubation, H2S further stimulated glucose consumption and deteriorated adipocyte hypertrophy. H2S upregulated hyperplasia genes (CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBPβ), cell division cycle 25 (Cdc25), minichromosome maintenance 3 (Mcm3), and cell division cycle (Cdc45)) and cyclin-dependent kinase 2 protein (Cdk2), which regulates cell proliferation. H2S also upregulated the insulin receptor β (Irβ)-activated mitogen-activated protein kinase (MAPK) and protein kinase B (Akt) pathways, leading to adipogenesis. In conclusion, H2S increases adipocyte differentiation, hypertrophy, and hyperplasia, implying that it plays a pathogenic role in obesity disorder.

关键词

脂肪形成 / 脂肪细胞 / 气态递质 / 葡萄糖 / 硫化氢 / 胰岛素 / 脂质 / 肥胖症

Key words

Adipogenesis / Adipocytes / Gasotransmitter / Glucose / H2S / Insulin / Lipid / Obesity

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Richa Verma,傅明,杨广东,吴凌云,王睿. 硫化氢促进脂肪细胞分化、增生和肥大[J]. 工程（英文）, 2023, 20(1): 36-48 DOI:10.1016/j.eng.2022.09.010

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1、 引言

硫化氢（H2S）是一种气体递质，在各种细胞信号通路中发挥关键作用[1‒3]。H2S的生理功能包括舒张血管、降低血压[4‒5]、抑制胃上皮细胞凋亡[6]、减轻炎症[7]和氧化应激[8]。另一方面，胰腺和周围组织中内源性H2S水平的升高也会引起糖尿病及其并发症[9]。

据世界卫生组织（WHO）统计，2016年18岁及以上成年人中有39%超重，13%为肥胖[10]。脂肪组织和脂肪细胞是肥胖症的源头，因为它们在体内储存和代谢脂质[11‒12]。前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，称为脂肪细胞分化，这一过程一直是肥胖症相关细胞研究的焦点。目前，H2S在3T3L1细胞中作为脂肪形成诱导剂的作用已被报道[13‒14]。Yang等[15]观察到H2S引起的过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）反式激活是通过PPARγ被巯基化修饰引起的，进而导致3T3L1的脂肪细胞分化增加。他们的研究还表明脂肪细胞分化启动子[胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）和地塞米松（DEX）]会增加胱硫醚γ-裂解酶（CSE）的表达，进而在分化前脂肪细胞时产生更多的H2S。

脂肪细胞增生（如细胞数量增加）在肥胖症发展中所起的作用一直存在争议[16‒18]。有报道提出具有较小脂肪细胞的增生可能具有保护作用[19]。脂肪组织的储存能力有限，更多脂肪细胞的存在可能会以脂质的形式储存多余的能量，从而降低脂毒性。其他研究表明，脂肪细胞增生的发生时间可能晚于脂肪细胞肥大（如细胞大小增加），并且可能与肥胖症相关代谢后果的严重程度和较低可逆性有关联[20‒22]。在正能量平衡的慢性状态下，当肥大脂肪细胞达到临界细胞大小后其代谢变得不活跃，主要特征是脂质过载和胰岛素抵抗。此时，额外的脂肪前体细胞被招募用于改善代谢的变化[23]。在持续营养过剩的情况下，脂肪细胞增生导致脂肪组织扩张，新募集的脂肪细胞在能量过剩的情况下变得肥大。在这种恶性循环中，脂肪细胞的增生和肥大都会增加脂肪组织质量并引发肥胖症及相关的代谢并发症[24]。

迄今为止，H2S在肥胖症发展中的作用主要是利用3T3L1细胞进行研究的。然而，这种永生化的白脂肪细胞系并不能复制体内前脂肪细胞的生理特征，从而使这种细胞模型无法在脂肪组织水平和全身水平全面阐述肥胖症发展的复杂性[24]。此外，目前对H2S在脂肪细胞肥大和增生中的作用依旧缺乏了解。因而，本文研究了外源性和内源性H2S对小鼠前脂肪细胞和脂肪组织中脂肪细胞分化、肥大和增生的影响，及其潜在的机制。

2、 材料与方法

2.1 脂肪组织中脂质的提取和 HS 产生率的测定

本研究选择的动物是具有C57BL/6J × 129SvEv混合遗传背景的野生型（WT）小鼠。纯合胱硫醚γ-裂解酶敲除（CSE-KO）小鼠是将至少十代杂合CSE-KO小鼠与具有相同遗传背景的WT小鼠回交获得的[4]。实验中使用的所有WT和CSE-KO小鼠均通过基因分型进行了验证。每组WT和匹配的CSE-KO小鼠（8周龄，雄性）来自同一代。首先取出附睾和皮下脂肪组织脂肪垫，然后采用Bligh和Dyer的方法[25‒27]从组织中提取脂质，并用脂肪组织质量归一化。所有动物实验均符合美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH出版号85-23，1996年修订）并经加拿大劳伦森大学动物护理委员会（Animal Care Committee of Laurentian University）批准。

如之前文献[15,28‒29]所述，测量了WT和CSE-KO脂肪组织的H2S产生率。简而言之，使用50 mmol·L-1冰磷酸钾缓冲液（pH = 6.8）分离并匀浆小鼠脂肪组织。然后将组织匀浆与10 mmol·L-1 L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，加拿大）在37 °C下孵育。90 min后，加入三氯乙酸（Sigma-Aldrich）终止反应。使用FLUOstar OPTIMA微孔板分光光度计（BMG LABTECH，德国）在670 nm的吸光度波长下检测H2S与N,N-二甲基对苯二胺硫酸盐（Sigma-Aldrich）相互作用产生的亚甲蓝水平。

2.2 细胞培养

前脂肪细胞依照文献[30]从小鼠附睾脂肪垫分离得到。清除附着的血管后，收集组织并用无菌Krebs-Ringer缓冲液（118 mmol·L-1 NaCl, 4.8 mmol·L-1 KCl, 1.3 mmol·L-1 CaCl2, 1.2 mmol·L-1 KH2PO4, 1.2 mmol·L-1 MgSO4, 24.8 mmol·L-1 NaHCO3）清洗三次，辅以3%牛血清白蛋白、5 mmol·L-1葡萄糖、100单位·mL-1青霉素和0.1 mg·mL-1链霉素。剪碎的组织在37 °C下用3 mg·mL-1的II型胶原酶消化45 min，同时轻轻搅拌。细胞悬浮液通过250 µm过滤器过滤。丢弃剩余的未消化的组织碎片。过滤后的细胞悬浮液在室温下以450g（g = 9.8 m·s-2）离心10 min。弃去含有成熟脂肪细胞的底层液体，再加入红细胞裂解液（Sigma-Aldrich）裂解红细胞。随后，将细胞通过40 µm筛网过滤并离心（450g，室温10 min）。将所得基质血管细胞（如前脂肪细胞）沉淀重悬于含有10%胎牛血清（FBS）和抗生素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。再用0.4%台盼蓝（细胞活力大于95%）进行细胞计数后，将细胞接种在多孔板中，并在含95%空气和5% CO2的潮湿环境中于37 °C下培养24 h。然后将细胞用胰蛋白酶消化并以每板0.8 × 105个细胞的密度接种在12孔板中。细胞汇合后，将培养基替换为含有IBMX（0.5 mmol·L-1）、DEX（0.25 µmol·L-1）和胰岛素（10 µg·mL-1）的脂肪形成培养基（ADP）。连续6 d诱导细胞形成脂肪后，再持续培养两天。在接下来的4 d里，培养基被换成仅含有胰岛素（10 µg·mL-1）的DMEM。为了研究营养过载的影响，使用棕榈酸（PA, 350 µmol·L-1）作为营养物处理原代培养的前脂肪细胞20 d。为研究能量失衡模型，在含有或不含NaHS（60 µmol·L-1）的ADP条件下，用高葡萄糖（HG, 25 mmol·L-1）和高胰岛素（HI, 50 µg·mL-1）刺激前脂肪细胞20 d。

在不同的实验中，ADP诱导分化的前脂肪细胞经蛋白激酶B（Akt）抑制剂capivasertib（5 µmol·L-1）[31‒32]处理6 d，或经细胞周期蛋白依赖性激酶2（Cdk2）抑制剂3-[1-(3H)-Imidazol-4-yl)-meth-(Z)-ylidene]-5-methoxy-1,3-dihydro-indol-2-one（SU9516）（5 µmol·L‒1）[33‒34]在脂肪形成诱导的前三天进行处理。

2.3 油红O染色检测与甘油三酯定量

油红O染料能与甘油三酯结合从而检测成脂分化程度。油红O工作溶液的制备：用4 mL蒸馏水稀释6 mL油红O溶液（O1391, Sigma-Aldrich）并经过0.22 µm过滤器过滤。实验设计4个细胞处理组，分别进行0 μmol·L-1、10 μmol·L-1、30 μmol·L-1、60 μmol·L-1和100 μmol·L-1 NaHS处理。其中第1组作为对照，是DMEM培养的WT前脂肪细胞；第2组是在ADP中培养的WT前脂肪细胞；第3组是在ADP + DL-炔丙基甘氨酸（PPG）培养的WT前脂肪细胞，DL表示外消旋混合物；第4组是在ADP中培养的CSE-KO前脂肪细胞。脂肪生成诱导6 d后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞三次，并用4%福尔马林溶液固定1 h。去除福尔马林后，用PBS洗涤细胞三次。接下来，将500 µL的60%异丙醇添加到培养板中，然后快速移除。待细胞培养板完全干燥后，向细胞中加入500 µL油红O工作液。加入油红O抚育20 min后，在显微镜下观察细胞的染色情况。如果染色没有被细胞吸收，可将细胞在油红O溶液中再保存10 min。然后用蒸馏水洗涤细胞以除去所有染色残留物并再次用显微镜观察。图像拍摄使用的是IX71倒置显微镜（Olympus，加拿大）。所有图像均使用DP2-BSW 2.1q版软件进行处理。

为了量化染色细胞中的甘油三酯，使用1 mL 100%异丙醇从细胞中提取油红O色剂，并通过上下吹打将细胞与异丙醇充分混合。使用FLUOstar OPTIMA微孔板分光光度计（BMG LABTECH）在510 nm处读取异丙醇中所得油红O提取物的吸光度。根据Ramirez-Zacarias等[35]的报道制备了三油酸甘油酯校准曲线。先把代表脂质积累水平的三油酸甘油酯以不同浓度溶解在氯仿中，然后用氮气吹扫蒸发溶剂并在通风橱中放置过夜。三油酸甘油酯在Eppendorf管中固化，并用油红O作溶液染色。20 min后油红O残留物用双蒸馏水洗涤3~5次。最后用异丙醇提取被三油酸酯吸收的油红O，并在510 nm处检测其吸光度。根据固定量的甘油三酯制作标准曲线，用于测定前脂肪细胞中未知的甘油三酯含量（mg）。

2.4 非酯化游离脂肪酸含量

使用Elabscience（中国）NEFA比色测定试剂盒测定WT和CSE-KO小鼠的脂肪组织或前脂肪细胞的非酯化游离脂肪酸（FFA）含量[36‒37]。组织或细胞的匀浆用于测量总游离脂肪酸含量。将总脂质积累同脂质含量与FFA浓度的比率进行比较，后者可以描述为：每毫克蛋白质的FFA释放量（mmol·L-1）除以每毫克蛋白质的脂质含量（mg）。

2.5 脂肪细胞直径和细胞表面积

使用ImageJ 1.52a软件（NIH，美国）测量油红O染色细胞的直径和表面积并进行数字分析。

2.6 小鼠脂肪细胞的葡萄糖消耗测定

脂肪形成诱导20 d后，先用PBS洗涤细胞，再用含有低葡萄糖水平（5.5 mmol·L-1）的无胎牛血清DMEM对细胞进行饥饿。24 h后用PBS重新洗涤细胞，将细胞置于含有10% FBS、25 mmol·L-1葡萄糖和50 µg·mL-1胰岛素的DMEM培养液中培养12 h。收集培养基并使用美国Abcam公司的葡萄糖比色测定试剂盒（ab282922）检测葡萄糖浓度。葡萄糖消耗计算通过比较原始葡萄糖浓度（25 mmol·L-1）与在培养基中孵育12 h后的浓度之间的差异得到。

2.7 试剂与抗体

胰岛素和DEX购自Sigma-Aldrich公司，IBMX购自美国ACROS公司，NaHS购自美国Calbiochem公司。磷酸丝裂原活化蛋白激酶激酶抗体（MEK）（1∶1000, sc-81503）、MEK（1∶1000, sc-81504）、激素敏感性脂肪酶抗体（HSL）（1∶1000, 4107）和p-HSL抗体（1∶1000, 45804）购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。磷酸化Akt抗体（1∶1000, 9271）、Akt抗体（1∶1000, 9272）、磷酸化胰岛素受体β抗体（IrβY1146）（1∶500, 3023）、Irβ抗体（1∶500, 3025）、脂联素抗体（1∶1000, 2789）、PPARγ抗体（1∶1000, 95128）、CCAAT/增强子结合蛋白β（C/EBPβ）抗体 （1∶1000, 3082）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体（GAPDH）（1∶2000, 5174）购自英国Cell Signaling Technology公司。capivasertib购自美国MedChem express公司，SU9516购自美国Selleck Chemicals LLC公司。

2.8 蛋白质印迹法

首先用含有蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich）的RIPA缓冲液在冰上裂解细胞。将等量的变性蛋白质（每孔60 μg/20 μL）用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，然后转移至硝酸纤维素膜（Pall Corporation，美国）。此后，将膜用5%牛奶封闭，然后在振荡器上与一抗（1∶1000）在4 ℃下孵育过夜。使用过氧化物酶偶联的二抗（1∶2000）进行孵育，并通过增强的化学发光（GE Healthcare，英国）显示特定的蛋白质条带。

2.9 核糖核酸的提取和逆转录聚合酶链反应

为了进行核糖核酸（RNA）分离和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），使用TriReagent（Invitrogen，美国）从细胞中分离总RNA。第一链互补脱氧核糖核酸（cDNA）是根据New England Biolabs公司（加拿大）的使用说明通过逆转录酶和随机寡核苷酸引物进行逆转录而制备的。基因引物信息如下：C/EBPβ的引物是5´-ACAGCGACGAGTACAAGATCC-3´（上游）和5´-GACAGTTGCTCCACCTTCTTCT-3´（下游）；细胞分裂周期45基因（Cdc45l）的引物是5´-AAGGGGAATCTGCGAGAAAT-3´（上游）和5´-GGCCAGGAATTTATGCTTGA-3´（下游）；微染色体维持3（Mcm3）的引物是5´-TGAGCAAGACTGTGGACCTG-3´（上游）和5´-CTTCCTCCTTTTCCGCTTCT-3´（下游）；go-ichi-ni-san1（Gins1）的引物是5´-CTGGACGAGGGGATCTGATA-3´（上游）和5´-CCCATATTCCCACCTGAGTG-3´（下游）；Cdc25引物是5´-CCATTCAGATGGAGGAGGAA-3´（上游）和5´-TTTAAGGCTCCCAGGATGTG-3´（下游）。使用SYBR green（BioRad，美国）聚合酶链反应（PCR）预混液（Bio-Rad，加拿大）对信使RNA（mRNA）表达水平进行定量。该反应使用的仪器和软件分别是iCycler iQ5装置（Bio-Rad）和iCycler光学系统软件（版本3.1）。通过使用“2-ΔΔCT”[38]计算相对mRNA定量，其中ΔCT是给定目标互补脱氧核糖核酸和内源性β-肌动蛋白基因参考的阈值循环之间的差异。ΔΔCT是目标样本和对照样本之间的ΔCT差异，对照样本是未经ADP处理的细胞的结果。

2.10 统计分析

所有数据均以平均值±标准误差的形式呈现。统计分析通过单向方差分析（ANOVA）和Dunnett多重比较事后检验进行。p值低于0.05 被认为具有统计学意义。

3、 结果

3.1 脂质含量和HS的产生率

CSE-KO脂肪组织包括皮下和内脏脂肪，与WT脂肪组织相比脂质含量和H2S产生率都显著降低[图1（a）]。 WT和CSE-KO脂肪组织之间FFA浓度的差异不显著[图1（b）]。从WT和CSE-KO小鼠分离的脂肪细胞，经NaHS处理，细胞中的FFA浓度没有变化[图1（c）]。

图1 CSE-KO和WT小鼠脂肪组织中的脂质积累和脂肪分解。（a）皮下和内脏脂肪组织中的脂质含量（*p < 0.05，脂肪组织组间比较，n = 6）。（b）每毫克组织每毫克脂质的内脏和皮下脂肪组织的游离脂肪酸水平（µmol）（每组n = 6）。（c）从WT和CSE-KO小鼠中分离出的原代脂肪细胞中的FFA水平（µmol），即每106个细胞的每毫克脂质（n = 6）。（d）内脏脂肪组织和小鼠原代内脏脂肪细胞中不同蛋白质的表达水平。p-HSL/HSL在内脏脂肪组织（e）和小鼠原代内脏脂肪细胞（f）中的表达水平（n = 6）。PPARγ和C/EBPβ在内脏脂肪组织（g）和小鼠原代内脏脂肪细胞（h）中的表达水平（n = 6）。KO-ADP和WT-ADP分别来自CSE-KO和WT小鼠的ADP诱导的脂肪细胞。# p < 0.05 vs. KO-ADP; @ p < 0.05 vs. KO-ADP + NaHS; * p < 0.05 vs. WT-ADP。

HSL被认为是脂肪组织中甘油三酯分解代谢为游离脂肪酸的主要酶[39]。HSL的磷酸化激活在WT和CSE-KO脂肪组织中处于相同水平[图1（d）、（e）]。与之类似的是WT和CSE-KO原代脂肪细胞的磷酸化HSL水平之间没有显著差异，它们根本不受NaHS的影响[图1（d）、（f）]。

WT中脂肪形成标志物PPARγ和C/EBPβ的表达水平都比CSE-KO脂肪组织和原代脂肪细胞中的高[图1（d）、（g）和（h）]。经NaHS处理, 使得WT和CSE-KO小鼠的原代脂肪细胞中这两种标记物的表达增加[图1（d）、（h）]。

3.2 小鼠前脂肪细胞的脂肪生成

用NaHS处理（10~100 µmol·L-1）前脂肪细胞会使其脂​​质积累增加，其中用60 µmol·L-1 NaHS处理的前脂肪细胞中检测到的油红O染色结果最高。在没有分化培养基（对照组）的条件下，用10~100 µmol·L-1 NaHS处理不会影响WT小鼠前脂肪细胞的脂肪形成。用CSE抑制剂PPG孵育WT前脂肪细胞显著降低脂肪形成[图2（a）、（b）]。分化的CSE-KO前脂肪细胞（KO + ADP）的油红O染色结果明显低于WT前脂肪细胞组。在没有NaHS处理的情况下，CSE-KO + ADP、WT + ADP + PPG和非分化对照组之间并没有显著差异。然而经60 µmol·L-1和100 µmol·L-1的NaHS处理，PPG预处理组和CSE-KO前脂肪细胞组的细胞均发生分化。

图2 从WT和CSE-KO小鼠分离的前脂肪细胞的脂肪形成。（a）细胞在不同条件下培养6 d；它们的分化通过油红O染色显示（Ctrl：未经任何处理的WT细胞组；比例尺代表200 μm）。（b）不同组小鼠脂肪细胞中甘油三酯的积累（*p < 0.05; n = 6）。Ctrl代表对照组。

3.3 NaHS诱导的脂肪生成时间依赖性

图3（a）描述的是WT小鼠前脂肪细胞成脂诱导6 d的实验设计。不同时期分化细胞也都经60 µmol·L-1 NaHS处理[图3（b）]。NaHS处理的前两天并没有引起分化细胞油红O染色的显著变化。延长NaHS处理时间到4 d和6 d后，分化细胞中油红O染色和脂质积累的程度有显著的增加[图3（c）、（d）]。

图3 NaHS诱导的脂肪形成的时间线。（a）脂肪生成诱导设计方案。（b）不同实验组（Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组）的NaHS处理方案。箭头表示H2S + ADP处理的持续时间，虚线仅表示ADP处理的持续时间。（c）前脂肪细胞与WT小鼠脂肪组织的分化；来自所有组（Ⅰ~Ⅳ）的细胞用油红O染色以表示脂肪形成分化（比例尺代表200 μm；n = 6）。（d）分化的小鼠前脂肪细胞组中甘油三酯的积累；6 d后使用三油酸甘油酯标准曲线对甘油三酯进行量化（*p < 0.05 vs.Ⅰ组；n = 6）。

3.4 NaHS诱导的前脂肪细胞肥大

将WT小鼠前脂肪细胞培养20 d以诱导脂肪分化。单独使用NaHS处理的前脂肪细胞在孵育10 d后无法存活并死亡。在用PA或HG/HI诱导脂肪形成20 d后，脂肪细胞和脂滴变得明显大于仅被ADP处理的细胞。NaHS的处理进一步增强了棕榈酸PA和高葡萄糖HG/高胰岛素HI的作用[图4（a）]。此外，所有NaHS处理组的葡萄糖消耗量显著高于非 NaHS处理组[图4（b）]。本实验使用ImageJ软件计算脂滴直径和细胞大小[图4（c）、（d）]。

图4 NaHS诱导的WT小鼠脂肪组织分化的脂肪细胞肥大。小鼠原代前脂肪细胞被诱导20 d。（a）培养第10天（灰色）和第20天（油红O染色）的细胞图像。比例尺在两个NaHS处理组的左侧图中为 200 µm，在中间和右侧图中为50 µm。（b）用含有25 mmol·L-1葡萄糖的新鲜DMEM孵育脂肪细胞12 h后每毫克蛋白质的葡萄糖消耗量（mg·dL-1）（n = 6）。使用ImageJ软件测量脂滴直径（c）和脂肪细胞直径（d）（n = 10; * p < 0.05 vs. ADP + PA; # p < 0.05 vs. ADP+HG/HI; X p < 0.05 vs. ADP; @ p < 0.05）。 HG: 25 mmol·L-1, HI: 50 µg·mL-1。

3.5 NaHS诱导的小鼠前脂肪细胞增生

分化前脂肪细胞经NaHS处理（ADP + NaHS）24 h的实验结果显示，有丝分裂克隆扩增（MCE）基因（C/EBPβ、Cdc451、Mcm3和Cdc25）均有上调，但Gins1除外[图5（a）]。溴脱氧尿苷（BrdU）测定数据证实，10~100 µmol·L-1的NaHS处理增加了ADP处理的分化细胞和非分化对照细胞的增殖[图5（b）]。3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）测定结果表明，分化细胞经NaHS处理后活细胞的数量增加[图5（c）]。

图5 培养24 h后NaHS诱导的前脂肪细胞增生。（a）在有或者无60 µmol·L-1 NaHS的情况下，检测前脂肪细胞中增生基因的mRNA水平（n = 5）。（b）BrdU测定不同条件下的细胞增殖（n = 5）。（c）MTT测定不同条件下的细胞活力（n = 4）。（d）通过蛋白质印迹法检测不同条件下前脂肪细胞中p27和Cdk2的蛋白质水平（n = 6）。GAPDH用作上样对照（* p < 0.05 vs. Ctrl; # p < 0.05 vs. 0 µmol·L-1时的 NaHS）。

接下来研究了NaHS对负责细胞周期从G0到G1的调节因子的影响。如图5（d）所示，与非分化对照细胞相比，在ADP的培养条件下，脂肪形成分化显著降低了p27（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂）的蛋白质表达水平，但Cdk2的蛋白质表达水平没有降低。在NaHS处理（ADP + NaHS）的脂肪形成分化组中p27的表达进一步降低，但CdK2 的表达有所增加。对比非分化对照细胞和用NaHS处理（Ctrl + NaHS）的非分化细胞，尽管变化并不显著，但分别观察到Cdk2和p27表达的增加和减少趋势。

3.6 NaHS对MAPK和PI3/Akt通路的影响

NaHS处理的非分化细胞，不会使Irβ磷酸化[图6（a）]。然而，NaHS处理（ADP + NaHS）的分化细胞，在最初的6 h后就发现Irβ和MEK磷酸化增加[图6（a）、（b）]。单独用ADP培养，结果显示Irβ的磷酸化以时间依赖性方式增加。通过ADP诱导或NaHS处理，MEK磷酸化在所有时间点（即第6 h、12 h和 24 h）均有增加[图6（b）]。

图6 NaHS激活的MEK/细胞外信号调节激酶（ERK）和Akt通路。用60 µmol·L-1 NaHS处理从WT小鼠分离的前脂肪细胞，并在指定时间用或不用ADP诱导。（a）Irβ（p-Irβ）蛋白的磷酸化。（b）MEK（p-MEK）蛋白的磷酸化。脂肪形成诱导6 d后的Akt磷酸化水平（c）和脂联素表达水平（d）（ n = 6; * p < 0.05 vs. ADP; # p < 0.05 vs. NaHS）。（e）NaHS激活的MEK/ERK和Akt通路。

NaHS处理分化前脂肪细胞（NaHS + ADP）6 d后，与单独使用ADP或NaHS处理相比，前者显著增加了Akt的磷酸化和脂联素的表达[图6（c）~（e）]。已有研究表明脂联素可促进脂肪生成并增加成熟前脂肪细胞中的脂质含量[16]。

3.7 抑制Cdk2和Akt对小鼠脂肪细胞的影响

在前三天用或不用NaHS处理的前脂肪细胞分化过程中使用SU9516抑制Cdk2。SU9516的处理显著抑制了NaHS处理组和未处理组的细胞增殖[图7（a）]。SU9516自身对NaHS处理的分化前脂肪细胞的活力没有显著影响[图7（a）]。在分化前脂肪细胞的全部6 d中持续使用Akt的抑制剂capivasertib，如图7（b）所示，NaHS对分化的脂肪细胞中脂质积累的刺激作用被消除。MTT测定结果证实了SU9516对前脂肪细胞活力具有抑制作用[图7（c）]。油红O和脂质定量测定显示capivasertib抑制脂肪生成和脂质积累[图7（d）]。

图7 Cdk2和Akt介导NaHS刺激的小鼠脂肪细胞增生和脂肪形成。（a）SU9516抑制Cdk2活性后脂肪细胞增生和脂质积累。（b）油红O染色测量capivasertib抑制Akt活性后脂肪细胞中的脂质积累。（c）MTT方法检测Cdk2抑制剂（SU9516）对脂肪细胞的活性的影响。使用以下公式计算细胞活力：第3天/第0天 × 100%。（d）Akt 抑制剂capivasertib对不同组小鼠脂肪细胞中每毫克蛋白质甘油三酯积累（mg）的影响（n = 6; * p < 0.05）。

4、 讨论

脂肪细胞是特异型细胞，在能量过剩期间积累大量甘油三酯，然后在能量不足时消耗储存的甘油三酯[40‒41]。脂肪细胞的发育始于成为脂肪细胞谱系的间充质干细胞，即前脂肪细胞[40‒42]。脂肪形成是伴随着前脂肪细胞形状、大小和其他形态和生理特征的变化而发生的。已有报道显示大鼠主动脉周围、附睾、肾周和棕色脂肪组织会产生内源性H2S [42‒43]。除了CSE之外，另一种产生H2S的酶是胱硫醚β-合成酶（CBS）。尽管已在大鼠脂肪组织中检测到CSE蛋白和CBS转录本，但这些组织中H2S生成的主要来源还是CSE，因为生成的75%~80% H2S可以被CSE抑制剂PPG或β-cyano-L-丙氨酸所抑制[44]。之前报道，利用RT-PCR和蛋白质印迹方法，CBS和CSE在3T3L1前脂肪细胞、小鼠白色脂肪组织（附睾、肾周和肠系膜）和棕色脂肪组织中表达，其中CBS mRNA和蛋白质水平均低于CSE [15]。在3-巯基丙酮酸硫转移酶（MST）催化的作用下还存在一种H2S生成途径。已有研究表明，胰岛素、地塞米松和IBMX的混合物可刺激脂肪生成，并与CBS、CSE和MST的上调相关，以及增加3T3L1细胞中的H2S浓度[13,15,44]。由于CSE在内脏和皮下脂肪组织中的表达比CBS和MST更丰富[15]，因此CSE对脂肪组织中H2S的产生贡献最大。

如果生长超过70%汇合度并随后进行传代，3T3L1细胞将失去在激素刺激下完全分化的能力[45‒46]。而原代培养的前脂肪细胞表现出与特定组织相似的特征，为研究脂肪组织的复杂性提供了生理学相关模型。此外，对于来自脂肪基质细胞的前脂肪细胞，可以长时间冷冻保存，并使其增殖和分化能力的损失最小。进而原代培养的前脂肪细胞可以分离自具有不同遗传背景的WT或转基因动物，这对于3T3L1等同质细胞系是不可能的[47]。

本研究使用的脂肪组织取自5周龄大的小鼠。在这个年龄段，小鼠产生比成熟脂肪细胞更多的未分化前脂肪细胞[30]。原代前脂肪细胞培养中有两种类型的细胞污染：红细胞和内皮细胞。在消化之前，首先从脂肪组织中去除了所有可见的血管；然后，使用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞。来自血管的内皮细胞在离心后聚集在一起，并使用40 µm孔径过滤器过滤掉。如果在培养过程中注意到任何异常细胞形状（相对于前脂肪细胞的纺锤形），则标记该区域并使用细胞刮刀刮擦。原代前脂肪细胞培养物显示没有内皮细胞污染，这会形成特征性的鹅卵石单层。成熟的脂肪细胞 （即载脂细胞）存在于漂浮层中，在每次对消化的组织样本进行离心分离时，都会丢弃漂浮层。为了确认脂肪细胞谱系，在分化过程结束时观察了脂肪细胞特异性生物标志物PPARγ和脂肪酸结合蛋白4（FABP4）的蛋白质表达[48]。冷冻保存只具有PPARγ和FABP4表达的前脂肪细胞培养批次，并用于进一步研究。

CSE-KO小鼠作为一种独特的模型可以用于评估CSE催化产生的内源性H2S在脂肪形成过程中的作用[4]。在本研究中，发现CSE-KO小鼠脂肪组织中的脂质积累显著降低，其内源性H2S水平显著低于WT小鼠的脂肪组织。作为首次报道的直接证据，结果表明内源性H2S有助于增加脂肪组织中的脂质积累。PPG对CSE的抑制降低了脂肪形成的程度，进一步说明CSE在脂肪形成过程中的作用（图2）。

本研究显示在脂肪形成刺激下，用外源性H2S（NaHS, 10~100 µmol·L-1）处理小鼠前脂肪细胞会显著增加脂肪形成和脂质积累。在CSE抑制剂PPG存在的情况下或CSE-KO前脂肪细胞中，WT前脂肪细胞在分化时表现出脂质积累减少，证明了CSE产生的内源性H2S在脂肪生成中的作用。在上述条件下，NaHS形式的外源性H2S也增加了脂肪形成（图2）。显然，本研究表明H2S对脂肪形成的影响取决于脂肪形成诱导剂，因为在没有脂肪形成诱导剂的情况下，前脂肪细胞中没有观察到脂质积累。此外，H2S处理培养的脂肪细胞不会改变脂肪分解，因为它不会改变FFA浓度或HSL磷酸化。这些观察结果表明H2S刺激的脂肪生成和脂质积累与脂肪分解无关。

胰岛素是脂肪生成的主要激素诱导剂，它通过胰岛素受体（IR）激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）/Akt通路，从而促进脂肪细胞分化。IBMX和地塞米松联合调节PPARγ，通过蛋白激酶A（PKA）通路促进脂肪生成。Xue等[49]报道了外源性H2S通过增加IR敏感性激活肌管和3T3L1细胞中的PI3K/AKT通路，从而改善体外和体内的葡萄糖摄取。胰岛素敏感性可以通过IR底物蛋白IRS1和IRS2的丝氨酸/苏氨酸磷酸化来调节。Akt是脂肪生成的重要下游介导蛋白。实验结果已表明，抑制Akt的活性会导致脂肪生成受抑制[图7（b）、（d）]。此外，抑制Akt通路可降低NaHS诱导的前脂肪细胞中甘油三酯的积累。因此，研究证明NaHS刺激其下游Akt信号的传导，并诱导小鼠前脂肪细胞中的脂肪形成。

成脂分化有两个主要阶段：早期分化或MCE和终末分化。MCE是一个以C/EBPβ增加为标志的同步过程。当暴露于适当的环境和遗传诱因时，前脂肪细胞会经历MCE，增加DNA复制，形成克隆，并转化为脂肪细胞表型[50]。脂滴积累发生在终末期[40,42,50‒53]，与PPARγ上调相关。每个脂肪形成的阶段都表现为不同的转录和遗传变化和调节[52‒54]。通过油红O染色和脂质积累的实验结果证明，在ADP培养条件下延长H2S处理时间到4 d和6 d会导致小鼠前脂肪细胞中更大程度的脂肪形成。NaHS在成脂诱导下上调MCE基因（Cdc45l、Mcm3和Cdc25c）的表达和Cdk2蛋白的表达（图5）。H2S还可以通过磷酸化激活MEK（图6）。Akt和MEK磷酸化通过PPARγ反式激活为脂质积累和分化铺平道路[15]，并以此标志为终末期。因此，H2S通过作用于其早期和终末阶段来增加脂肪生成。

在之前的研究中阐述了H2S会导致3T3L1细胞中的PPARγ巯基化[15]。本研究证实WT脂肪组织比CSE-KO脂肪组织具有更高的C/EBPβ和PPARγ表达。同样，在脂肪形成诱导的前两天，外源性H2S会增加原代前脂肪细胞中C/EBPβ和PPARγ的表达。胰岛素等成脂诱导剂通过MAPK通路启动MCE，从而增强C/EBPβ的活性[6,55]。C/EBPβ是启动转录级联反应的关键因素，该级联反应最终导致PPARγ的表达[6]并诱导PPARγ的巯基化增加[15]和脂肪细胞分化。在脂肪形成诱导后24 h内，MAPK [MEK/细胞外信号调节激酶（ERK）]和Cdk2将Threonine-188磷酸化，C/EBPβ被激活[6,15,56]。H2S处理显著上调分化细胞中Cdk2和MEK的表达，也使得C/EBPβ基因的表达上调[图5（a）]。此外，C/EBPβ可刺激有利于激活DNA解旋酶的克隆扩增基因，从而有助于DNA复制。

C/EBPβ的激活会增加重要的细胞周期基因Cdc45l、Mcm3、Gins1和Cdc25c的表达。这种情况下，前脂肪细胞中的DNA复制会被上调，进而使细胞增殖[54‒55,57]。细胞周期基因通过DNA解旋酶发挥作用。复制性DNA解旋酶的核心由6种不同的多肽（Mcm2至Mcm7）组成。复制解旋酶的激活是通过与Cdc45和异四聚体Gins形成复合物，即Cdc45-Mcm2-7-Gins（CMG）复合物。Mcm3是Mcm2-7复合体的一个组成部分，而Gins1是Gins（go-ichi-ni-san）复合物亚基[22,58‒59]。因此，CMG复合物可以调节真核染色体DNA复制。Cdc25是一种磷酸酪氨酸磷酸酶，其作用是有助于细胞进入S期和M期。以上这些基因的敲除会导致3T3L1前脂肪细胞中MCE的抑制[22,58‒60]。这种抑制作用证明上述基因是C/EBPβ促进MCE的关键下游效应子。

Cdk2是一种重要的细胞周期调节因子，可通过G1/S转换控制克隆扩增。使用Cdk2抑制剂（SU9516）阻断前脂肪细胞进入S期，在前三天抑制了前脂肪细胞的克隆扩增[图7（a）]。较低的克隆扩增导致脂肪细胞中甘油三酯的积累显著降低[图7（a）、（c）]。该实验证明，Cdk2调节的前脂肪细胞克隆扩增是脂肪细胞分化所必需的。

本研究证明H2S能促进脂肪细胞分化早期的MCE进程，其中显著上调的Cdk2和被抑制的p27水平证明了这一点。此外，H2S处理显著增加了除Gins1以外所有其他C/EBPβ靶基因的表达[图5（a）]。Gins、Cdc45与MCM2-7的结合所得复合物提高了对DNA的亲和力，并使结合效果大于单独的MCM复合物[59]。虽然Gins1的表达在H2S处理的分化细胞中没有变化，但由于Mcm和Cdc45基因引起的整体DNA解旋酶反应显著增加，从而增加DNA复制和MCE。

利用BrdU和MTT两种检测方法，发现H2S增加分化和非分化前脂肪细胞的增殖[图5（b）]，从而证明H2S可以诱导MCE。已有研究表明H2S在间充质干细胞[28,61]和其他非脂肪细胞（如心肌细胞和脐静脉内皮细胞）中具有类似的促增殖作用[62‒64]。有趣的是，MTT测定显示H2S仅在脂肪形成诱导下增加活细胞数量[图5（c）]。这两个实验的不同点在于BrdU检测的是S期DNA复制的程度，但MTT检测的是细胞活力的终点。脂肪形成诱导可能会推动细胞通过细胞周期进程的所有检查点，并且H2S会增加这些细胞的活力。

通过初始祖细胞重新分化，脂肪细胞肥大或增生可以形成脂肪量扩张[65]。在对细胞周期的研究中，发现H2S通过增加细胞分裂募集额外的前脂肪细胞，进一步增加细胞的脂质质量。在MCE和增生之后，脂滴以多室模式积累和终末分化，其中脂肪细胞包含​​较大的脂滴。到最后，细胞体积增大，同时积累脂质空泡，脂质空泡聚结并最终充满细胞[40,42]。PI3-Akt通路调节脂肪细胞中的脂质积累和脂肪细胞分化（脂肪合成）[66‒68]。在第2天到第6天的末期，随着时间的推移，H2S促进ADP诱导的脂肪形成（图3）。此外，发现H2S可以作为细胞周期进程的启动因子影响胰岛素信号通路，从而有助于脂肪生成过程中启动MCE。胰岛素刺激还会导致Irβ的β亚基发生自身磷酸化[图6（a）]。H2S还显著刺激ADP诱导的MEK和Akt激活[图6（b）、（c）]。这些结果强烈表明，H2S可以与ADP一起通过激活Irβ以及MAPK和Akt的下游信号来改善胰岛素信号通路。由于没有胰岛素，在没有ADP的情况下，单独的H2S不能使Irβ磷酸化。本文研究结果与Manna等[69]的结果一致，其研究表明H2S可以抵御3T3L1细胞中高血糖症的胰岛素抵抗。补充维生素D会增加CSE活性，同时产生更多的H2S。然后CSE/H2S系统激活PI3/Akt通路和葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）易位，从而增加葡萄糖利用[69]。

总结本文研究结果（图8），H2S可以通过增加脂肪细胞分化、肥大和增生来提高脂肪细胞扩张和小鼠脂肪细胞中的脂质积累。内源性和外源性H2S均可以通过MEK和Akt调节的C/EBPβ/α和PPARγ活化，以及通过在MCE基因上调之后发生的C/EBPβ激活，增加小鼠脂肪细胞的分化。H2S通过增加Cdk2和减少p27的表达，促进细胞周期进程和增生。最后，H2S 还可以增加负责激活下游的其他靶蛋白（如Akt）的Irβ磷酸化，导致小鼠脂肪细胞中积累更多的脂质和脂肪细胞肥大。

图8 H2S在脂肪生成、脂质积累和脂肪细胞扩张中的复杂和重要角色，以及潜在机制。

5、 结论

肥胖症是全世界死亡的主要原因之一，但由于与肥胖症相关的其他代谢紊乱，目前的治疗失败率很高。为了减少治疗失败，确定肥胖症的具体危险因素和致病关键点至关重要。本研究强调了CSE/H2S系统在以脂肪细胞为中心的肥胖症发展中的作用。更好地了解H2S的致肥特性，将有助于针对H2S诱导的前脂肪细胞向脂肪细胞的转化（分化）、致病性脂肪细胞增大（肥大）和前脂肪细胞募集（增生）设计新颖且基于机制的安全治疗方案。未来的研究重点是探究H2S在脂肪形成过程中对胰岛素敏感性的作用，以便更深入地了解H2S/CSE相关的肥胖症疗法。

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