片仔癀通过调节小鼠的肠道菌群和代谢物抑制非酒精性脂肪性肝炎

曾宪一; 张翔; 苏浩; 苟红艳; 刘焯晞; 胡晓旭; 黄子恒; 李艳; 于君

doi:10.1016/j.eng.2022.10.010

工程（英文） ›› 2024, Vol. 35 ›› Issue (4) : 257 -269. DOI: 10.1016/j.eng.2022.10.010

研究论文

片仔癀通过调节小鼠的肠道菌群和代谢物抑制非酒精性脂肪性肝炎

曾宪一 ^a ,
张翔 ^a^,^b ,
苏浩 ^a ,
苟红艳 ^a ,
刘焯晞 ^b ,
胡晓旭 ^a ,
黄子恒 ^a ,
李艳 ^a ,
于君 ^a^,^b

作者信息 +

Pien Tze Huang Protects Against Non-Alcoholic Steatohepatitis by Modulating the Gut Microbiota and Metabolites in Mice

Xianyi Zeng ^a^,^# ,
Xiang Zhang ^a^,^b^,^# ,
Hao Su ^a ,
Hongyan Gou ^a ,
Harry Cheuk-Hay Lau ^b ,
Xiaoxu Hu ^a ,
Ziheng Huang ^a ,
Yan Li ^a ,
Jun Yu ^a^,^b^,^* ,

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摘要

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的进展阶段，目前尚无有效的治疗方法。传统中药片仔癀具有抗炎作用。本研究评估了片仔癀在NASH防治中的作用及潜在机制。研究结果显示，片仔癀能有效预防由多种饮食[包括高脂高胆固醇饮食（HFHC）、胆碱缺乏的高脂饮食（CD-HFD）以及蛋氨酸胆碱缺乏饮食（MCD）]引起的NASH进展，同时显著抑制肝损伤、肝脏甘油三酯聚集和脂质过氧化。此外，片仔癀可治疗MCD饮食诱导的NASH，显著改善小鼠的脂肪变性和肝损伤。通过对小鼠粪便样本进行宏基因组测序分析，我们发现片仔癀可修复肠道菌群失衡，显著增加包括乳酸杆菌、植物乳杆菌、乳酸链球菌以及枯草杆菌等在内的有益菌的丰度。而乳酸杆菌能有效抑制由MCD饮食诱导的NASH进展。此外，片仔癀可以恢复脂肪肝病变小鼠的肠道屏障功能，表现为肠道通透性降低，血清内毒素水平下降，以及上皮紧密连接蛋白E-cadherin表达增加。利用液相色谱-质谱联用技术进行代谢分析，发现片仔癀处理过的小鼠门静脉中胆汁酸代谢发生显著变化。进一步分析发现，完整的肠道菌群在片仔癀抗NASH作用中不可或缺。总之，片仔癀通过调节肠道菌群和代谢物发挥抑制NASH的作用，有望成为NASH防治的潜在药物。

Abstract

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is a severe form of non-alcoholic fatty liver disease without effective treatment. The traditional Chinese medicine formulation Pien Tze Huang (PTH) can suppress inflammatory diseases. Here, we evaluate the effects of PTH on the evolution of NASH and its underlying mechanisms. We found that PTH prevented the development of steatohepatitis induced by various dietary models, including a high-fat high-cholesterol (HFHC) diet, choline-deficient high-fat diet (CD-HFD), and methionine- and choline-deficient (MCD) diet, along with significant suppression of liver injury, hepatic triglyceride, and lipid peroxidation. Moreover, ten days of PTH treatment after the onset of NASH significantly ameliorated MCD diet-induced steatosis and liver injury in mice. Through the metagenomic sequencing of stool samples, we found that PTH administration restored the gut microbiota with enrichment of probiotics including Lactobacillus acidophilus (L. acidophilus), Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, and Bacillus subtilis. The enriched L. acidophilus prevented MCD diet-induced steatohepatitis. In addition, PTH restored the gut barrier function in mice with steatohepatitis, as evidenced by reduced intestinal permeability, decreased serum lipopolysaccharides (LPS) level, and increased epithelial tight-junction protein E-cadherin expression. Our metabolomic analysis via liquid chromatography-mass spectrometry profiling identified the alteration in the metabolism of bile acids in the portal vein of PTH-treated mice. We further confirmed that an intact gut microbiota is necessary for PTH to exhibit anti-steatohepatitis effects. In conclusion, PTH protects against steatohepatitis development by modulating the gut microbiota and metabolites. PTH is a potential promising prophylactic and therapeutic option for patients with NASH.

关键词

片仔癀 / 非酒精性脂肪性肝病 / 肠黏膜屏障 / 肠道菌群

Key words

Pien Tze Huang / Non-alcoholic steatohepatitis / Gut barrier function / Gut microbiota

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曾宪一,张翔,苏浩,苟红艳,刘焯晞,胡晓旭,黄子恒,李艳,于君. 片仔癀通过调节小鼠的肠道菌群和代谢物抑制非酒精性脂肪性肝炎[J]. 工程（英文）, 2024, 35(4): 257-269 DOI:10.1016/j.eng.2022.10.010

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1 引言

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）已成为全球范围内重要的健康问题，影响了25%的世界人口，其中在亚洲人群中的发病率更是高达34% [1]。值得注意的是，约有20%的NAFLD患者会发展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），这是NAFLD的严重阶段，其主要特征是肝细胞损伤、肝炎和（或）纤维化[2]。尽管维生素E、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）激动剂和己酮可可碱等在NASH治疗中显示出一定的效果，但由于其副作用和（或）潜在的毒性，这些药物在临床应用上受到了限制[3‒4]。至今，尚无批准的NASH治疗药物。因此，寻找安全且有效的NASH治疗方法成为临床上的迫切需求。

中医药因其多靶点和多途径的作用机制而受到广泛关注[5]。片仔癀是一种在中国和东南亚地区用于治疗病毒性肝炎和炎症疾病的中药配方[6]。它由三七（85%）、麝香（3%）、牛黄（5%）和蛇胆（7%）这四种重要成分组成。然而，目前关于片仔癀在NASH中的治疗效果尚未有明确结论。

不同饮食模型可诱导NASH进展[7]。蛋氨酸和胆碱缺乏饮食（MCD）可在短时间内复制出NASH的组织学表型，包括严重的炎症、脂肪变性、氧化应激和纤维化。然而，MCD饮食可能引起体重下降，并且无法模拟NASH的代谢综合征特征[7]。相比之下，胆碱缺乏高脂饮食（CD-HFD）虽然需要较长的时间才能使小鼠发展成NASH，但它能更准确地模拟人类代谢综合征等NASH的关键特征[8]。然而CD-HFD是一种营养缺乏饮食模型，仍无法代表人类饮食。我们研究团队建立的高脂高胆固醇（HFHC）饮食模型是一个西方饮食模型[9]。它全面反映了NASH的各种表型及其相关的代谢变化，包括脂质积累、炎症、氧化应激、肝损伤、肥胖和胰岛素抵抗。此外，HFHC饮食还会引发肠道菌群失调和代谢物改变，进一步促进NASH的进展[9‒10]。

最近的研究已经证明了肠道菌群在NASH发展中的关键作用[9,11]。肠道菌群失调及其相关代谢物，如胆酸、三甲胺和短链脂肪酸（SCFAs），均与NASH的发生和发展密切相关[12]。鉴于微生物及其代谢物的重要性，已有研究提出通过调节肠道菌群来预防肝病。中医药长期以来都被认为可通过调节肠道菌群防治疾病。据报道，中药可通过调节肠道微生物群来改善代谢综合征[13]，并通过调节包括短链脂肪酸和胆汁酸在内的代谢产物来改善脂质代谢[14]。鉴于NASH是一种复杂的多因素疾病，中医药可能通过调节肠道菌群和宿主生理机能来展现其治疗潜力。在这项研究中，我们利用多种饮食小鼠模型深入探讨了片仔癀在预防和治疗NASH中的作用。还阐明了片仔癀治疗过程中NASH模型肠道微生物群和代谢产物的分布以及肠道屏障功能的改善情况。

2 材料和方法

2.1 小鼠模型和药物处理方案

雄性C57BL/6小鼠（6~7周龄）随机给予普通饮食（NC）、HFHC饮食并在饮水中补充23 g·L^-1果糖[15]持续12周，CD-HFD饮食（Specialty Feeds Pty. Ltd., Australia）20周（每组8~10只）。另外，给雄性C57BL/6小鼠（6~7周龄）喂食MCD饲料或对照饲料（Specialty Feeds Pty. Ltd., Australia）5天、10天或4周（每组8~10只）构建另一类NASH模型。分别用片仔癀（每日单次灌胃，每千克体重540 mg；中国漳州片仔癀药业有限公司提供）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）对小鼠进行灌胃。在实验结束时，小鼠禁食并收集血清和组织，记录体重、内脏脂肪重量和肝脏重量。此外，还收集了粪便样本和门静脉血液，分别用于宏基因组测序和代谢物分析。

在另一项独立实验中，为了验证肠道菌群在片仔癀抑制NASH中的作用，抗生素混合物处理雄性C57BL/6小鼠（6~7周龄）。饮用水中添加了抗生素混合物（包括0.2 g·L^-1氨苄西林、0.2 g·L^-1新霉素、0.2 g·L^-1甲硝唑和0.1 g·L^-1万古霉素），持续两周，并每隔两周重复一次，直至实验结束，以清除肠道菌群[16]。给予小鼠12周HFHC饲料或4周MCD饲料处理诱导NASH。

为了探索益生菌在片仔癀改善NASH中的作用，对MCD饲料喂养的雄性C57BL/6小鼠（6~7周龄）连续10天灌胃嗜酸乳杆菌[1×10⁹ CFU·(200 μL)^-1·d^-1]、大肠杆菌（E. coli）菌株MG1655（细菌对照）或PBS（空白对照）。所有小鼠均保持在具有受控条件的无特定病原体环境中：在20~22 ℃和45%±5%湿度下进行12 h的光/暗周期。所有实验流程均严格遵循香港理工大学深圳研究机构动物实验伦理委员会批准的指南（IACUC编号：181105）。

2.2 宏基因组测序和分析

为了研究片仔癀对肠道菌群的影响，我们采用宏基因组测序。首先，利用QIAamp DNA mini kit（QIAGEN, Germany）从小鼠粪便样本中提取DNA。随后在Illumina HiSeq 2000平台（Illumina, USA）上对小鼠粪便DNA进行鸟枪法宏基因组测序。测序得到的原始序列经过Trimmomatic（版本0.39）修剪，利用Bowtie2（版本2.4.4）将修建后的序列与小鼠mm10宿主基因进行比对，以排除与人类基因组相关的读数，确保分析的准确性。然后使用Kraken2（版本2.0.8）对未映射的reads进行分类（附录A中的表S1）。Bracken用于根据Kraken2的结果进行准确的物种水平丰度估计。多样性丰富度（Chao1指数）采用R包phyloseq和vegan计算。不同组间微生物群的可视化基于Bray-Curtis差异矩阵。我们使用Ebseq对宏基因组数据进行差异分析。我们使用三元图法在属水平上鉴定与片仔癀治疗相关的细菌。

2.3 代谢物剖析和分析

液相色谱-质谱（LC-MS）分析由上海百趣生物科技有限公司提供，使用了超高效液相色谱（UPLC）系统（1290; Agilent Technologies, USA）和Waters UPLC BEH C18色谱柱（1.7 μm、2.1 mm×100 mm; USA）。柱温设定为55 ℃，样品进样体积设定为5 μL，流速设定为0.5 mL·min^-1。

流动相由0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液组成。多步线性洗脱梯度程序如下：0~11.0 min, 85%~25% A; 11.0~12.0 min, 25%~2% A; 12.0~14.0 min, 2%~2% A; 14.0~14.1 min, 2%~85% A; 14.1~15.0 min, 85%~85% A; 15~16 min, 85%~85% A。采用Q Exactive Focus质谱仪（Thermo Fisher Scientific, Finland）与Xcalibur软件相结合，基于信息相关采集模式获取质谱（MS）和串联质谱（MS/MS）数据。在每个采集周期中，质量范围为100~1500。筛选每个周期的前三个质量数据，并进一步获取相应的MS/MS数据。鞘套气体流量为45任意单位（Arb），辅助气体流量为15 Arb，毛细管温度为400 ℃，全MS分辨率为70 000，MS/MS分辨率为17 500，在归一化碰撞能量（NCE）模式下，碰撞能量为15/30/45，喷雾电压为4.0 kV（正）或‒3.6 kV（负）。应用MS2数据库进行代谢物鉴定，并使用Limma软件包进行代谢组学分析数据的差异分析。为了控制假阳性率，我们采用Benjamini-Hochberg方法控制错误发现率（FDR）。当FDR<0.01和|log(fold change)|>2时，我们认为代谢物在不同组之间存在显著差异。根据筛选出差异代谢物的结果进行聚类分析。

2.4 生化检测

通过离心全血样本获得血清。使用Catalyst One化学分析仪（美国IDEXX实验室）测定血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、胆固醇和甘油三酯的水平。通过相应的检测试剂盒（上海江来生物科技有限公司）测定小鼠肝脏中的总胆固醇（JL13847-48T）和甘油三酯（JL13528-48T）。使用硫代巴比妥酸反应物质（TBARs）测定法（上海江来生物科技有限公司）测定丙二醛来定量脂质过氧化。

2.5 组织学分析

通过石蜡包埋切片的苏木精和伊红（H&E）染色评估肝脏组织学特征。两名对分组不知情的病理学家独立对染色的载玻片进行评估，并对其脂肪变性和炎症进行评分。根据以下标准对脂肪变性进行评分：0（<5%）、1（5%~33%）、2（33%~66%）或3（>66%）。根据以下标准对所有炎症病灶进行总体评估：0（无验证病灶）、1（每200×视野小于2个病灶）、2（每200×视野2~4个病灶）或3（每200×视野大于4个病灶）。采用最佳切割温度复合包埋冷冻肝切片进行油红O染色。评估肝脏中的脂肪含量。

2.6 炎症因子测定

使用小鼠TNFα酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒和小鼠IL-6 ELISA试剂盒（上海江来生物科技有限公司）测量小鼠血清肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素-6（IL-6）水平。

2.7 定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）

使用TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific）从小鼠肝脏中提取总RNA。使用分光光度计测定RNA质量，并使用互补DNA转换试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行逆转录。使用QIAamp DNA mini试剂盒提取粪便细菌DNA。在Light Cycler 480实时荧光定量PCR系统（Roche）中使用SYBR Green预混液（Roche, Switzerland）对肝脏互补DNA（cDNA）和细菌DNA进行qRT-PCR。所用引物列于附录A的表S2中。

2.8 肠道通透性检测

用100 mg·mL^-1的荧光素异硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖（Sigma-Aldrich, USA）溶液给每只小鼠（0.3 mg·g^-1体重）灌胃。FITC-葡聚糖给药后5 h收集眶后血，并在4 ℃保存过夜。随后将血液以3000 r·min^-1）离心20 min。在激发波长为490 nm、发射波长为530 nm时测定血清中的FITC-葡聚糖[17]。

2.9 测定血清脂多糖

在试验结束时从小鼠的门静脉收集血清。使用小鼠脂多糖（LPS）酶联免疫吸附试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）测量血清LPS水平。

2.10 蛋白质印迹实验

使用CytoBuster蛋白提取试剂（Merch Chemicals, UK）获得30~50 mg组织中的总蛋白。使用去污剂相容性蛋白质测定法（BIO-RAD, USA）测量蛋白质浓度。蛋白质（20~40 mg）首先通过5%的上凝胶和10%的下凝胶分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上（GE Healthcare, USA）。首先将膜置于E-cadherin一抗（货号：14472；Cell Signaling Technology, USA）在4 ℃下过夜，然后在室温下用二抗孵育1 h。使用ECL Plus Western Blot检测试剂（GE Healthcare）对E-cadherin蛋白进行成像。内参选用β-actin。

2.11 统计分析

通过Student’s t检验或Mann-Whitney U检验比较两组之间的差异。使用Kruskal-Wallis检验或单因素方差分析（ANOVA）进行多组之间的比较。所有统计测试均使用GraphPad Prism或R软件进行。P < 0.05被视为存在统计学意义。

3 结果

3.1 片仔癀预防高脂高胆固醇饮食诱导的脂肪肝炎

为探索片仔癀对脂肪肝炎的干预效果，给予C57BL/6小鼠HFHC饮食持续喂养12周，以诱导非酒精性脂肪肝炎（NASH）的发生。用片仔癀或PBS对照溶液灌胃HFHC饲养的C57BL/6小鼠[图1（a）]。实验结果显示，与PBS对照处理的HFHC饮食小鼠相比，片仔癀处理的小鼠体重显著降低（P < 0.01）[图1（b）]。肝脏切片的组织学检查显示，片仔癀治疗显著改善了肝脏组织学表现，减少了肝脏的脂肪变性（P < 0.01）和炎症细胞浸润（P < 0.05）[图1（c）]。油红O染色进一步证实了片仔癀治疗的小鼠肝脏中脂质积累减少[图1（c）]。与组织学结果一致，生化分析结果表明片仔癀显著降低了小鼠血清和肝脏中的甘油三酯和总胆固醇水平（P < 0.05和P < 0.001）[图1（d）]。通过测量肝脏脂质过氧化物（P < 0.01）以及血清ALT和AST（均P < 0.05），结果显示，片仔癀可有效保护小鼠免受HFHC饮食诱导的肝损伤[图1（e）和（f）]。此外，片仔癀显著降低了HFHC饮食小鼠肝脏的TNFα（P < 0.01）和IL-6（P < 0.001）水平[图1（g）]。这些结果表明，片仔癀对HFHC诱导的脂肪性肝炎具有显著的预防作用。

3.2 片仔癀预防CD-HFD或MCD饮食诱导的脂肪肝炎

为了进一步明确片仔癀对NASH的预防效果，我们建立了由CD-HFD诱导的另一个NASH小鼠模型。在饲养CD-HFD的过程中，小鼠分为两组，分别给予片仔癀或PBS对照溶液灌胃处理。小鼠在饲喂CD-HFD造模20周后发展为脂肪肝炎[图2（a）]。与HFHC饲喂的小鼠模型结果相似，CD-HFD饲喂的小鼠在接受片仔癀治疗后，体重、肝重、脂肪组织重均显著减少（所有P < 0.001）[图2（b）]。片仔癀显著减轻了脂肪性肝炎的发展，并改善了肝脏的组织学表现，具体而言，片仔癀治疗显著减少了肝脏的脂肪变性（P < 0.01）和炎症（P < 0.001）[图2（c）]。多项指标证实片仔癀可降低NASH的病变程度，包括血清胆固醇、肝甘油三酯、肝总胆固醇水平降低[图2（d）]；肝脂质过氧化物降低[图2（e）]；血清ALT水平降低[图2（f）]以及炎症性细胞因子TNFα和IL-6降低[图2（g）]。

为了全面评估片仔癀在不同阶段脂肪性肝炎发展中的抑制作用，我们建立了第三个NASH小鼠模型，即通过饲喂C57BL/6小鼠10天或4周的MCD饮食。在此过程中，小鼠被分为两组，分别接受片仔癀和PBS对照溶液处理，以研究片仔癀对NASH发展的影响[图3（a）]。MCD饮食会显著诱导小鼠体重下降，而片仔癀处理进一步降低了小鼠体重（附件A中的图S1）。在10天和4周的MCD模型中，片仔癀均减缓了小鼠MCD饮食诱导的脂肪性肝炎的过程，显著减少了肝脂肪变性（10天MCD模型中P < 0.05；4周MCD模型中P < 0.01）和炎症（10天MCD模型中P < 0.05；4周MCD模型中P < 0.01）[图3（b）]。与此一致，与对照组相比，片仔癀处理的小鼠，不论是喂食MCD饮食10天或4周，其肝脏甘油三酯（均P < 0.001）和脂质过氧化物（在MCD饮食10天的P < 0.001；在MCD饮食4周的P < 0.01）都显著减少[图3（c）]。片仔癀处理后的不同造模周期的小鼠，血清ALT和AST水平均显著降低（均P < 0.001）[图3（d）]，提示其肝损伤也都得到改善。4周MCD模型小鼠中，片仔癀处理降低了增加的血清TNFα和IL-6水平（附录A中的图S2）。此外，对片仔癀处理5天的MCD喂养的小鼠，亦可显著降低肝脏甘油三酯（P < 0.001）、脂质过氧化（P < 0.001）、血清ALT（P < 0.001）和AST的水平（P < 0.001）（附录A中的图S3）。综上所述，通过多个不同NASH小鼠模型的研究，我们得出结论：片仔癀对饮食诱导的NASH的发生、发展具有预防作用。

3.3 片仔癀对已经形成的脂肪肝炎有治疗效果

在确认了片仔癀对NASH的预防作用后，我们进一步深入研究了其对已形成的脂肪肝炎的治疗效果。采用MCD饮食喂养小鼠3周后，成功诱导出脂肪性肝炎模型，随后使用片仔癀或PBS对照处理这些小鼠10天[图4（a）]。肝脏样本的组织学检查显示，与对照组相比，片仔癀治疗10天的MCD饮食喂养小鼠的脂质积累和炎症细胞浸润显著减少（均P<0.001）[图4（b）]。片仔癀治疗还显著降低了肝脏总胆固醇（P < 0.01）、甘油三酯（P < 0.01）、脂质过氧化（P < 0.001）[图4（c）]、血清ALT（P < 0.01）和AST水平（P < 0.001）[图4（d）]，表明片仔癀的治疗明显缓解了MCD饮食诱导的肝损伤。以上结果显示片仔癀对已经形成的NASH也具有治疗效果。

3.4 片仔癀恢复脂肪肝炎小鼠的肠道菌群

我们通过宏基因组测序，分析了片仔癀对NASH小鼠肠道菌群的影响。过主成分分析（PCoA），我们观察到片仔癀处理组、HFHC模型对照组以及NC空白对照组小鼠的肠道微生物群落存在显著差异[图5（a）]。与空白对照组小鼠相比，饲喂HFHC的小鼠的细菌多样性（Chao1指数）显著降低（P < 0.0001），而片仔癀处理能够恢复这种菌群的多样性（P < 0.05）[图5（b）]。图5（c）中显示了三组小鼠的粪便细菌群落的构成差异。

我们使用三元图法在属水平上鉴定与片仔癀处理相关的细菌[图5（d）]。乳酸杆菌（Lactobacillus）是一个包括众多益生菌物种的属[18]，其在HFHC饮食喂养的小鼠中显著减少，而片仔癀治疗则能将其分布丰度恢复到与空白对照相似的水平[图5（d）]。而通过在种水平上对微生物群的分析，我们发现片仔癀对某些菌群的分布具有显著影响[图5（e）]。大部分受片仔癀影响增加的细菌为益生菌，包括乳酸杆菌（如革兰氏阳性的乳酸杆菌以及植物乳杆菌）、乳酸球菌（如乳酸乳球菌）和芽孢杆菌（如枯草芽孢杆菌）[图5（e）]。相反，片仔癀处理降低了来自沙雷氏菌属和铜绿假单胞菌属[19]的几种病原菌的丰度[图5（e）]。在给予片仔癀的正常饲养小鼠的粪便中也发现了嗜酸乳杆菌（P < 0.0001）和乳酸乳球菌（P < 0.001）的丰度增加[图5（f）]。总的来说，我们的宏基因组分析表明片仔癀可以通过诱导益生菌丰度提高，来恢复脂肪肝炎小鼠的肠道菌群。

3.5 嗜酸乳杆菌可以预防脂肪性肝炎

我们接下来评估了在片仔癀处理后被富集的益生菌嗜酸乳杆菌预防NASH的效果。饲喂MCD饮食的小鼠被灌胃接种嗜酸乳杆菌、大肠杆菌或者PBS，持续10天[图5（g）]。嗜酸乳杆菌处理后的小鼠明显改善了肝组织病理学表现，与大肠杆菌或PBS处理的小鼠相比，脂肪变性和炎症细胞浸润明显减少[图5（g）]。与此同时，嗜酸乳杆菌处理显著地降低了肝体积与体重的比率[图5（g）]。这些结果明确提示嗜酸乳杆菌可以抑制小鼠脂肪肝炎的发展。

3.6 片仔癀恢复小鼠的肠道屏障功能

由微生物失调引发的肠道屏障功能损伤是NASH发展的先决条件[20]。为了测试肠道屏障是否与片仔癀的抗脂肪性肝炎效应相关，我们通过测量血清内脂多糖（LPS）水平，测试了小鼠肠道的细胞旁通透性。与正常饲养或相应对照饮食的小鼠相比，饲喂HFHC、CD-HFD和MCD饮食的小鼠，其血清LPS浓度均升高（各组P < 0.001）[图6（a）]，这证实了在不同NASH小鼠模型中肠道屏障功能均有受损。相比于PBS处理的小鼠，片仔癀在所有NASH小鼠模型中均显著降低了血清LPS水平（CD-HFD模型 P < 0.05；HFHC和MCD模型 P < 0.001）[图6（a）]。根据FITC-葡聚糖检测，片仔癀处理后MCD模型小鼠表现出了肠道通透性的显著降低（P < 0.05）[图6（b）]，提示在片仔癀处理可以恢复肠道屏障功能。同样在片仔癀处理的HFHC（P < 0.01）、MCD（P < 0.05）和CD-HFD模型中，E-钙黏蛋白（一种细胞黏附分子和肠道屏障完整性的标志物）的表达显著增加[图6（c）]。此外与PBS对照组相比，MCD模型脂肪性肝炎发病后10天的片仔癀治疗同样降低了小鼠的血清LPS水平（P < 0.001）[图6（d）]。这些结果表明，片仔癀在一定程度上可以通过恢复功能性肠道屏障来缓解NASH的发展。

3.7 片仔癀影响小鼠门静脉血的胆酸代谢

肠道微生物菌群失调会损害肠肝轴，导致代谢物从肠道无限制地转移到肝脏。其中一些易位代谢物可能是有害的，可能引发肝损伤并导致NASH的发生[12]。为了揭示与片仔癀治疗相关的代谢组学表现，我们分别对空白对照、HFHC对照和片仔癀处理的HFHC组小鼠的门静脉血进行了非靶向代谢组学检测。主成分分析显示三组小鼠门静脉中的代谢物分布存在显著差异[图7（a）]。与对照组小鼠相比，有19种代谢物在片仔癀处理的HFHC模型小鼠门静脉中显著增加[图7（b）]。与此同时片仔癀处理的HFHC模型小鼠门静脉中，有21种代谢物分布降低。为了解富集代谢物的功能特征，我们进行了通路富集分析，发现胆汁酸生物合成是片仔癀处理后小鼠门静脉代谢物中改变最多的通路之一[图7（c）]。门静脉代谢物的进一步分析显示，血清共轭胆汁酸水平，包括牛磺熊去氧胆酸（TUDCA; P < 0.001）、牛磺脱氧胆酸（TDCA; P < 0.01）、甘氨胆酸（GCA; P < 0.01）、牛磺胆酸（TCA; P < 0.001）和鹅去氧胆酸（CDCA；与对照组相比，P < 0.05）在片仔癀处理的HFHC模型小鼠中显著上调[图7（d）和附录A中的图S4]。此外，在片仔癀处理的HFHC模型小鼠中，门静脉中脱氧胆酸（DCA）与CDCA的比率（人类NASH的标志物[12]）显著降低（P < 0.05）[图7（e）]。

结合胆汁酸在NASH疾病过程中发挥重要作用，它与肠道中的法尼醇X受体（FXR）结合，调节激素成纤维细胞生长因子15（FGF15）的产生，FGF15分泌到肝脏中，减少胆汁酸的合成[21]。鉴于片仔癀给药后共轭胆汁酸的上调，我们分析了HFHC饮食喂养小鼠肠道中Fxr和Fgf15的表达。结果表明，补充片仔癀后肠道Fxr和Fgf15 mRNA水平显著降低（P < 0.01）[图7（f）]。此外，与对照组相比片仔癀处理后的模型小鼠，肝脏中胆酸生物合成包括细胞色素酶P450（Cyp7a1, Cyp7b1, Cyp27a1）的mRNA表达显著增加（P < 0.01）[图7（f）]。综上所述，我们的结果提示片仔癀主要上调结合胆汁酸并减少肠道Fgf15的分泌，从而部分地抑制了NASH的发展。

我们同样利用液相色谱-质谱法研究了片仔癀的化学成分。片仔癀配方的主要化合物包括人参皂苷（人参皂苷Rg1、Rg2、Rg5、Rf、Rb1、Rb3和F2）和胆汁酸（CA、CDCA、去氧胆酸、龙胆酸和石胆酸）。主要化合物的相关MS/MS谱图见附录A中的图S5。

3.8 完整的肠道菌群对片仔癀改善脂肪性肝炎至关重要

为了评估肠道微生物群在片仔癀诱导的NASH预防中的作用，我们在实验组和对照组中均使用抗生素混合物来消除HFHC饮食喂养或MCD饮食喂养的小鼠的肠道微生物群（附录A中的图S6和图S7）。实验结果显示，在肠道微生物群被消除的HFHC模型中，片仔癀无法有效改善脂肪性肝炎的疾病进展。具体而言，片仔癀处理组与对照组小鼠在脂肪变性、炎症以及肝脂质过氧化程度方面均没有显著差异（图S6）。同样地，在MCD模型中，片仔癀处理组与对照组小鼠在血清ALT、AST、肝甘油三酯以及脂质过氧化程度方面也没有显著差异（图S7）。值得注意的是，我们的研究还发现抗生素处理能够清除片仔癀原本可以富集的益生菌群（附录A中的图S8）。这些发现表明，肠道微生物群在片仔癀预防NASH发展中的关键作用。

4 讨论

片仔癀因其抗炎作用而闻名，但其在NASH中的疗效尚未得到充分研究。在本研究中，我们发现片仔癀在多个小鼠模型中均展示出显著的预防饮食诱导的NASH发展的能力。此外，它还能有效逆转已经发生的NASH模型，揭示了其在NASH治疗中的巨大潜力。片仔癀处理能够明显改善肝脏组织形态，显著降低甘油三酯、胆固醇和脂质过氧化物，同时减少了血清ALT和AST水平。这些结果均表明，片仔癀不仅有助于预防NASH的发生，还能促进受损肝脏的修复。片仔癀的历史悠久，已有600多年的使用历史，广泛用于治疗各种肝病[22]。临床前研究表明，片仔癀可减轻四氯化碳诱导的肝损伤、炎症和纤维化[23‒24]，并抑制肝癌细胞系的增殖[25]。因此，我们的研究进一步扩展了片仔癀的应用领域，为其成为NASH的新型预防和治疗药物提供了有力支持。

肠道微生物群与肝脏疾病的关联已得到越来越多的关注。在NASH患者[26,27]和小鼠NASH模型[9]中均报道了肠道微生物组失调。然而，NASH患者表现出拟杆菌门[28]和变形菌门[29]的丰度增加，而小鼠NASH模型中表现为肠杆菌[30]的富集。尽管人和小鼠NASH之间改变的细菌不同，但通过益生菌（乳酸杆菌和双歧杆菌）或粪便微生物组移植调节肠道微生态，可以改善人类和小鼠的NASH [11,31]。我们的宏基因组分析发现，在片仔癀处理后益生菌乳杆菌属、另枝菌属和芽孢杆菌属细菌丰度增加。两种已被广泛商业化的乳酸杆菌种（嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌），在片仔癀处理的小鼠模型中显著富集，并可显著改善NASH。初步临床研究表明，含有嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的益生菌配方可减少NASH患者的肝脏脂肪变性并改善肝损伤[32]。本研究证实富集的嗜酸乳杆菌可预防MCD饮食喂养引发的小鼠的脂肪性肝炎。乳酸乳球菌是一种抑制肝脂肪变性和炎症的有益微生物[33]，在片仔癀处理的小鼠中富集。益生菌枯草芽孢杆菌可改善NAFLD小鼠的肝脏炎症，改善肠道屏障功能，并调节肠道微生物群[34]。我们前期的研究发现，高胆固醇饮食会诱发小鼠的微生物生态失调，继而引发NASH并促进其相关肝癌[9]。已有研究证实，部分传统中药可以通过调节肠道微生物群来有效改善人类NAFLD [35]。总的来说，我们的研究表明，片仔癀通过缓解菌群生态失调和丰富益生菌来抑制NASH。

肠道微生物失调通过多种方式促进肝病的发展，尤其是通过损害肠道屏障并显著增加肠道通透性[36]。一般而言，菌群失调会损害肠道屏障，使更多的致病菌及其衍生的毒性代谢物通过门静脉循环转移到肝脏[36]。我们的研究结果表明，饮食诱导的脂肪肝炎小鼠出现肠道屏障功能受损。而片仔癀处理恢复了受损的肠道屏障，表现为肠道通透性降低、血清内毒素LPS水平降低和紧密连接蛋白E-cadherin的表达增加。片仔癀恢复的肠道屏障可能防止致病细菌和有毒代谢物向肝脏转移，从而保护小鼠免受肝损伤。事实上，改善肠道屏障的药物可以预防和治疗NASH [20]。我们的研究结果表明，片仔癀可以作为一种药物修复肠道屏障并抑制NASH的进展。

肠道微生物产生的代谢物在脂肪肝炎的发展中起着重要的作用，有毒的代谢物可以通过肠-肝轴诱导肝脏损伤[11]。在这项研究中，我们的代谢组学分析揭示了结合胆汁酸的富集，包括TUDCA、TCA、TDCA和GCA。胆汁酸是调节脂质代谢的关键代谢产物[37]。TUDCA通过调节肠道菌群和改善肠道屏障功能来减轻饮食诱导的肝脏脂肪变性、炎症、肥胖和胰岛素抵抗[38]。TUDCA还抑制肠道FXR-FGF15信号传导，后者介导肝细胞中细胞色素P450家族酶的激活和胆汁酸的代谢[39]。在我们的实验中，片仔癀处理可以抑制肠道Fxr-Fgf15，并上调胆汁酸合成的肝脏基因，包括Cyp7a1、Cyp7b1和Cyp27a1。因此，我们的结果表明，片仔癀可以抑制肠道FXR信号通路，促进肝脏胆汁酸合成，从而抑制NASH的发生发展。

5 结论

本研究首次证明，片仔癀可能是预防和治疗脂肪肝炎的有效药物。从机制上讲，片仔癀调节肠道菌群，恢复肠道屏障，改变肠道代谢物的功能，从而通过肠-肝轴缓解NASH的发生和进展。

Authors’ contribution

Xianyi Zeng and Xiang Zhang performed experiments, analyzed the data, and drafted the manuscript; Hao Su, Hongyan Gou, and Yan Li performed experiments; Harry Cheuk-Hay Lau revised the manuscript; Xiaoxu Hu and Ziheng Huang performed the bioinformatic analysis; Jun Yu designed and supervised the study and wrote the paper.

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