用于冷冻保存的高效抗冻肽的理性设计及机理研究

齐海山 ,  高奕航 ,  张麟 ,  崔忠信 ,  睢晓洁 ,  马见帆 ,  杨静 ,  舒志全 ,  张雷

工程（英文） ›› 2024, Vol. 34 ›› Issue (3) : 171 -181.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 34 ›› Issue (3) : 171 -181. DOI: 10.1016/j.eng.2023.01.015
研究论文

用于冷冻保存的高效抗冻肽的理性设计及机理研究

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Rational Design of and Mechanism Insight into an Efficient Antifreeze Peptide for Cryopreservation

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摘要

开发可高效控制冰晶生长的抗冻肽已经引起了大量的关注，但仍然是一个巨大的挑战。在这项研究中，我们提出了一种新的设计方法，该方法基于对各种冰结合蛋白（IBP）中重复基序的深入研究和进化分析。通过这种方法，开发了几种具有显著抗冻活性的多肽。尤其是一种名为AVD的抗冻肽表现出理想的冰晶重结晶抑制（IRI）、溶解度和生物相容性，使其适合用作冷冻保护剂（CPA）。突变分析和分子动力学（MD）模拟表明，AVD肽的Thr6和Asn8残基是其冰结合能力的关键位点，而Ser18残基可以协同增强它们与冰的相互作用，揭示了AVD的抗冻机制。此外，AVD肽成功地用于多种细胞的冷冻保存，冷冻后细胞具有较高回收率。该项工作为设计抗冻材料开辟了新途径，并为合成生物学提供了抗冻功能模块。

Abstract

The development of effective antifreeze peptides to control ice growth has attracted a significant amount of attention yet still remains a great challenge. Here, we propose a novel design method based on in-depth investigation of repetitive motifs in various ice-binding proteins (IBPs) with evolution analysis. In this way, several peptides with notable antifreeze activity were developed. In particular, a designed antifreeze peptide named AVD exhibits ideal ice recrystallization inhibition (IRI), solubility, and biocompatibility, making it suitable for use as a cryoprotective agent (CPA). A mutation analysis and molecular dynamics (MD) simulations indicated that the Thr6 and Asn8 residues of the AVD peptide are fundamental to its ice-binding capacity, while the Ser18 residue can synergistically enhance their interaction with ice, revealing the antifreeze mechanism of AVD. Furthermore, to evaluate the cryoprotection potential of AVD, the peptide was successfully employed for the cryopreservation of various cells, which demonstrated significant post-freezing cell recovery. This work opens up a new avenue for designing antifreeze materials and provides peptide-based functional modules for synthetic biology.

关键词

抗冻肽 / 进化分析 / 冰晶重结晶抑制 / 分子动力学模拟 / 冷冻保存 / 合成生物学

Key words

Antifreeze peptides / Evolution analysis / Ice recrystallization inhibition / Molecular dynamics simulation / Cryopreservation / Synthetic biology

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齐海山,高奕航,张麟,崔忠信,睢晓洁,马见帆,杨静,舒志全,张雷. 用于冷冻保存的高效抗冻肽的理性设计及机理研究[J]. 工程（英文）, 2024, 34(3): 171-181 DOI:10.1016/j.eng.2023.01.015

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1 引言

细胞内部冰晶的形成和生长对生物系统极其有害，会导致细胞水平上致命的机械和化学损伤。在自然界中，耐寒生物体产生的冰结合蛋白（IBP）可以与冰晶结合并控制冰晶的生长，从而赋予宿主在零下条件下生存的能力[1‒2]。然而，IBP的免疫原性、不稳定性和高成本限制了它们的应用[3]。受IBP的启发，已经开发了聚合物、多肽、大分子和二维（2D）材料等仿生抗冻材料[4‒5]。抗冻肽因其低免疫原性和有效的抗冻活性引起广泛关注[1]。目前为止，还未完全解析清楚IBP的结构和功能关系，抗冻肽的理性设计仍然是困难和具有挑战性的。目前抗冻肽的获取策略包括诱变定向进化、食源性蛋白质的酶水解和IBP的简单结构模拟[3,6]。

重复基序在生命领域14%的蛋白质中出现[7]；它们被认为起源于基因组的复制滑动和重组事件[8‒9]。许多天然IBP也包含重复基序，这些基序可以生成阵列并形成冰结合表面（IBS）以匹配冰晶格；这赋予了IBP冰晶重结晶抑制（IRI）和热滞后（TH）的抗冻特性[10‒11]。此外，蛋白质的保守残基区域通常在功能上是重要的，甚至是必需的，因为它们从数百万年的达尔文正向选择中提供了适应性优势[12]。这些信息已经被证明，并用于指导合成生物学中的酶定向进化和功能模块设计[13‒16]。由于IBP经历了长期零下环境的正向选择[17]，因此利用IBP氨基酸序列和结构的进化信息来指导抗冻模块的挖掘和设计是可行的。

本研究提出了一种基于重复基序理性设计抗冻肽的新策略。对来自22个耐冷物种的233个具有规则结构的IBP进行了系统分类和进化分析。联合使用HHrepID和MEME程序来定义分类IBP中的重复基序。此外，使用WebLogo算法进行保守分析设计抗冻肽，设计了具有抗冻特性的多肽。特别地，海洋单胞菌IBP（MpIBPs）衍生的抗冻肽AVD显示出最佳的IRI活性和溶解度。通过圆二色光谱（CD）和模型模拟确定了AVD的结构。突变分析和分子动力学模拟（MD）进一步解析了AVD的冰结合和抗冻机制的关键残基。最后，研究了AVD的生物相容性和细胞膜稳定功能，并将其用于细胞冷冻保存。该策略为新型抗冻肽的设计提供了启示。

2 材料和方法

2.1 材料

从GenBank和UniProt数据库中收集来自不同耐寒生物的IBP序列。NIH-3T3、RAW264.7和GLC-82细胞系购自中国科学院典型培养物保藏中心细胞库（上海）。所有多肽均来自GL Biochem（上海）。台盼蓝染色溶液、Fura-2和三磷酸腺苷（ATP）检测试剂盒购自Solarbio（北京）。异硫氰酸荧光素（FITC）单体购自上海麦克林生化有限公司，Tubulin-Tracker Red购自Beyotime Biotechnology（上海）。RNAiso Plus、PrimeScript RT试剂盒和SYBR Premix Ex Taq购自Takara（大连）。Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）、RPMI-1640和胎牛血清购自Gibco (Grand Island, NY, USA)。

2.2 系统发育分析

为了构建系统发育树，从GenBank和UniProt数据库中收集了甲虫（n=25）、云杉卷叶蛾（n=7）、多年生黑麦草（n=5）、海洋单胞菌（n=4）、胡萝卜（n=3）和南极发草（n=7）的IBP序列。首先，使用Clustal X对这些氨基酸序列进行比对。然后，根据贝叶斯信息准则，选择模型WAG+F+G作为最佳拟合模型。利用最大似然（ML）系统发育树进行了1000次复制，并通过IQ-tree评估了节点支持率。此外，还使用MRBayes v.3.26进行贝叶斯系统发育分析，运行了1000万代，每1000代采样一次。最后，获得了10 000棵系统发育树，其中25%因为老化被丢弃。

2.3 IRI活性的检测

在冷却台上通过光学显微镜检测多肽的IRI活性。首先，将20 μL溶液从1 m的高度滴到放置在液氮上的薄铝块上，形成载玻片。然后，将样品置于-60 ℃的冷却台上并保持1 min。之后，将样品以5 ℃∙min-1加热至-9 ℃，并在-9 ℃退火30 min。在退火过程中每5 min拍摄一次照片。采用NIS-Elements D成像软件测量冰晶的平均晶粒面积（MGA）。随机选择五个区域，测量这些区域中的所有冰晶区域。对每个样品进行三次实验，使用Prism 5.0计算平均面积。

2.4 圆二色谱测量

CD测量使用J-810分光旋光仪（Jasco, Germany）进行。将多肽溶解在最终浓度为1 mg·mL-1的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。然后，将它们置于0.1 mm光程的石英比色皿中。在25 ℃、15 ℃和4 ℃下，190~260 nm的远紫外（UV）光谱范围内测试它们的吸光性。采用Reed模型分析多肽二级结构的分布。

2.5 模型

使用海洋单胞菌IBP [蛋白质数据库（PDB）ID：3P4G]的结构作为模板，通过同源建模获得AVD的结构。然后，使用AVD的结构作为初始构象，运行四个独立的MD模拟100 ns。得到4000个模型。在MD模拟过程中，使用了CHARMM36力场，水使用TIP4P/Ice模型表示，温度设定为230 K。拉氏图用沿模拟轨迹的二面角统计数据构建。

2.6 分子动力学模拟

采用全原子CHARMM36力场对水中溶解或不溶解AVD的系统进行模拟。MD模拟使用TIP4P/冰水模型，该模型适用于模拟与冰接触的生物分子[18]。使用GROMACS 5.1.4。模拟箱的尺寸为9 nm × 5 nm × 9 nm。没有AVD的模拟箱包含3696个冰晶和9891个水分子。对于具有AVD的系统，将一个AVD分子放入平衡后的冰/水盒中，在冰的附近得到一个包含一个AVD分子、3696个冰晶、9891个水分子和4个Na+作为平衡离子的模拟盒子。在进行MD模拟之前，使用固定冰的最快下降算法进行10 000步的能量最小化。接下来，运行五次独立的模拟；在230 K下，每个长度都有50 ns。在三维空间中应用周期性边界条件（PBC），并将Verlet算法的积分时间步长设置为2 fs。范德华力和静电相互作用的截止值设定为1.2 nm。使用LINCS算法约束所有键。所有数据每5 ns收集一次。通过Pymol 2.3.4分析在冰形成过程中AVD肽与冰之间的相互作用。为了确定某个水分子是属于冰晶还是过冷相，采用了基于F4序参数和角序参数（AOP）/F3参数的策略。

2.7 动态冰成型

使用纳升渗透压计观察冰形状的形态和冰生长速率，并用照相机（Nikon Y-TV55, Japan）记录。简而言之，将一侧涂有硅油的六孔样品架置于热控制台上。然后，使用微量注射器将亚微升体积的多肽溶液注射到样品池中。之后，样品以0.35 ℃∙s-1的冷却速率从室温快速冷冻至-20 ℃，形成冰浆；随后以0.35 ℃∙s-1的速率快速融化，直到观察到许多小冰粒。融化速率从0.35 ℃∙s-1改变为0.01 ℃∙s-1，小冰粒继续融化，直到得到单个冰晶。当形成的单冰晶不再熔化时，记录熔点（T m）。之后，以0.01 ℃∙s-1的冷却速率将样品冷却，并用摄像机记录冰的生长过程。使用ImageJ测量生长速率，其根据冰晶直径（Δd）在所需时间（Δt）内的伸长率计算。在该研究中对每个样品重复三个独立的实验。

2.8 细胞冷冻保存和回收分析

将所有类型的细胞在37 ℃、5% CO2下在培养箱中培养。首先将细胞用胰蛋白酶消化并使用血细胞计数器（Sigma-Aldrich）计数。将细胞密度调节至每毫升2 × 105个细胞。然后，将1 mL细胞放入离心管中，以800 r·min-1离心5 min。除去上清液并与1 mL冷冻保护剂（CPA）一起重悬于冷冻管（Corning, USA）中。CPA的制备如下：将不同浓度的AVD或AVD-3肽与2%、3%或1%二甲基亚砜（DMSO）在DMEM中混合，其中，AVD和AVD-3的溶解度可达到10 mg·mL-1。之后，将冷冻管转移到细胞冷冻容器（BeyoCool™FCFC012, Beyotime Biotechnology）中。然后，将它们在-80 ℃的冰箱中储存24 h。

对于细胞回收，将冷冻保存的样品在37 ℃下解冻直至所有冰融化。然后将细胞以800 r·min-1离心5 min。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL新鲜细胞培养基中。然后，将样品转移到24孔板中，并在37 ℃下保持在5% CO2的环境中培养24 h。细胞悬浮液用于台盼蓝排除试验[19]。将细胞用0.04%台盼蓝染色并使用血细胞计数器计数。细胞回收率计算为

C e l l   r e c o v e r y = N a f t e r N b e f o r e × 100 %

式中，N after是冷冻保存后的活细胞数；N before是冷冻保存前的活细胞总数。

2.9 细胞增殖

将解冻后的细胞以每孔200个细胞的密度接种在96孔板中。每24 h用ATP测定试剂盒（Solarbio）检测细胞活力。

2.10 微管蛋白构型的测定

将解冻后的细胞放入培养皿中培养24 h。然后，将它们用4%多聚甲醛固定15 min。之后，将Tubulin-Tracker Red与细胞培养45 min以标记微管蛋白，并将Hoechst 33342与细胞培养5 min以跟踪细胞核。每个步骤之后用含有0.5% Triton-100的PBS洗涤三次（每次5 min）。通过共焦显微镜（Nikon, Japan）进行荧光成像。

2.11 统计分析

数据表示为平均值±平均值的标准误差（SEM）。使用双尾学生未配对t检验进行统计分析。GraphPad Prism 5.0用于分析和绘图。所有实验均一式三份进行。

3 结果与讨论

3.1 具有重复基序IBP的进化分析

不同结构的IBP在零下温度提供的强大生死选择压力下经历趋同进化。例如，许多IBP包含平坦疏水的IBS，其由重复的结构环形成[20]。在这些环中，参与结合冰晶的关键氨基酸残基往往以相同的方向排列，产生共有基序[20‒23]。在漫长的适应过程中，IBP的有益突变赋予宿主功能优势，同时增加宿主在群体中保留下来的概率。因此，具有更保守序列的IBP通常具有更强的抗冻能力[12]。在这项工作中，受IBP的启发，通过分析IBP中的规则环并通过进化分析优化IBP中的残基来设计抗冻肽[图1（a）]。首先，基于PDB数据库收集了具有规则环的IBP的结构景观（附录A中的图S1）。南极发草IBP与多年生黑麦草IBP高度同源，类似地，加拿大拟步甲虫、小胸鳖甲和光滑鳖甲的IBP也因与黄粉虫IBP的高度同源性，而被采集使用[24]。最终，来自22个不同耐冷物种的总共233个IBP被分类用于后续分析（附录A中的表S2）。

序列-结构-功能关系显示，规则结构通常由重复的一级序列组成。然而，部分IBP的一级序列可能不是保守的，尽管它们的结构是规则的，这归因于在长期进化过程中IBP中氨基酸残基的交换、插入和缺失。因此，在这项工作中，HHrepID程序——一种新的从头鉴定蛋白质重复序列的自动化程序——被用来研究IBP [25‒27]。在附录A的图S2中，IBP序列的重复区域用深色对角线表示，并用红色圈出。以这种方式，选择了来自9个具有重复序列的物种的51个序列，包括黄粉虫（n=14）、加拿大拟步甲虫（n=5）、小胸鳖甲（n=4）、光滑鳖甲（n=2）（统称为“甲虫”）及云杉卷叶蛾（n=7）、多年生黑麦草（n=5）、海洋单胞菌（n=4）、南极发草（n=7）和胡萝卜（n=3）（图S2）。

许多IBP宿主居住在海冰环境中，这些环境被认为是水平基因转移（HGT）的“热点”[28]。因此，某些IBP可能是高度同源的，尽管它们的系统发育较远[29]。例如，来自嗜冷南极酵母的两种亚型具有低序列同一性，因为它们通过HGT从不同的细菌独立进化而来[29]。因此，使用系统发育树来描述上述51个具有重复一级序列的序列的进化距离[图1（b）；附录A中的图S3]。贝叶斯树和ML树的拓扑几乎彼此一致。从图1（b）和图S3中可以看出，属于同一物种的亚型几乎共享一个共同的亚分支，表明它们起源于同一祖先。更具体地说，甲虫IBP和云杉卷叶蛾IBP（CfIBP）嵌套在包含两个亚分支的一个亚科中，表明它们的进化距离很近[图1（b）]。此外，来自多年生黑麦草和南极发草的IBP共享一个共同的子分支，反映了它们的高度同源性。胡萝卜IBP (DcaIBP)和MpIBP都嵌套在各自的亚科中，它们的远距离系统发育关系显示了分子起源的多样性。

因此，将这些序列分为五组[图1（b）]。MEME程序是一种用于在蛋白质序列中搜索基序的无监督学习算法，进一步分析重复基序。如附录A中的图S4所示，所有组都显示重复基序，表明分类是可靠的[30]。还进行了重复基序的选择和保守分析[图1（c）~（j）]。如附录A中的图S5至图S9所示，重复基序包含冰结合位点，关键残基参与稳定蛋白质结构。基于对基序中保守和非保守残基的综合分析，设计了8种多肽[图1（c）~（j）；附录A中的表S3]。

3.2 多肽的IRI性能

通过固相合成上述多肽。多肽的质谱（MS）和高效液相色谱（HPLC）数据在附录A的图S10至图S17中提供。此外还测量了多肽的溶解度，并在附录A中的表S4中给出。在这些多肽中，TCT、TCTN和AVD可溶于PBS，进一步测试了它们的IRI特性。首先，对冰粒大小进行时间追踪[图2（a）]。在退火过程中，一部分冰粒继续增加，而其他较小的冰粒由于Oswald熟化而普遍融化消失，这可以降低整个系统的表面自由能。与PBS对照相比，TCT、TCTN和AVD样品中的冰粒重结晶被显著抑制。退火30 min后，相对于PBS对照，TCT、TCTN和AVD样品的MGA分别为74.7%、65.7%和14.1% [图2（b）]。进一步研究了这些多肽在不同浓度下的IRI性能。如附录A中的图S18所示，这些多肽的IRI活性是浓度依赖性的。

将含有交替带正电荷的赖氨酸（K）和带负电荷的谷氨酸（E）的亲水性两性离子多肽融合到SNNT、SNNV、PKE、SNNVV和SNNTV肽的C端以改善它们的溶解度。这些肽的MS和HPLC数据见附录A中的图S19至图S23。SNNT、PKE和SNNVV肽在EKylation后可溶解在PBS中，并表现出IRI活性（附录A中的图S24）。在1 mg·mL-1时，它们的MGA相对于PBS分别为52%、44%和43%，IRI活性比AVD弱。附录A中的表S5提供了AVD和报道的其他材料的抗冻能力比较，AVD表现出最高的IRI活性。还将AVD与典型防冻材料的剂量反应进行了比较（附录A中的图S25）。与其他报道的IRI活性材料如PVA56 [31]和PC-AFP22单体[32]相比，AVD显示出更高的IRI活性。当与环状冰结合肽（肽8）相比时，AVD和肽8显示出各自的特征。AVD在低浓度（<0.5 mg·mL-1）下具有较高的IRI活性，而肽8在高浓度下表现出优势。氧化石墨烯也表现出与PVA相似的优异IRI活性[33]。

进一步比较AVD肽及其原始蛋白MpIBP的抗冻能力。两者都显示出优异的IRI活性（附录A中的表S6）。AVD溶液中的冰晶以逐步方式生长，主要沿a轴方向生长，与MpIBP溶液中冰晶的生长相似。然而，在AVD溶液中的生长模式要平滑和缓慢得多，这有利于细胞冷冻保存。因此，考虑到其溶解度和抗冻活性，选择AVD进行更深入的机制研究。

3.3 AVD肽的结构

在远紫外光谱范围（190~260 nm波长）内，采用CD检测了AVD在4~25 ℃的温度范围内的二级结构。在图3（a）和（b）中，β折叠百分比在25 ℃下为56.1%，在15 ℃下为56.1%，在4 ℃下为55.2%。这些结果表明AVD的二级结构在不同温度下是稳定的。还采用MD模拟来确定AVD肽的三维（3D）模型。使用MpIBP（PDB条目：3P4G）作为模板建立多肽的初始构象模型，并对该结构进行100 ns的平衡。然后根据它们在拉氏图中的分布概率对获得的构象进行分类。AVD肽在298 K下的拉氏图如图3（c）所示。这些图表示作为氨基酸之间二面角的函数的分布概率。β折叠构象是最主要的二级结构，占69.2%，这与CD结果和根蛋白MpIBP的结构一致[22]。该实验和MD模拟结果表明，AVD肽主要由β折叠元件组成。

选择拉氏图计算的得分最高的模型，并在图3（d）中给出。空间构象显示Thr6和Asn8侧链的氧原子之间的间距为7.8 Å；这与冰晶的主棱镜平面和基平面上氧原子的间距相匹配[20,34]。附录A中的图S26总结了相对分布概率和得分最高的10个AVD结构，其间距从4.2 Å到12.0 Å不等。附录A中的图S27中给出的均方根偏差（RMSD）值表明AVD在模拟过程中平衡良好。

3.4 AVD抗冻活性的突变分析和MD模拟

通过定点突变和MD模拟研究了AVD肽和冰晶之间相互作用的分子机制。如前所述，AVD中Thr6和Asn8残基之间的间距类似于冰晶的基面和棱柱面之间的冰晶格距离[图3（d）]。因此，我们假设这个AVD位置可以作为一个冰结合位点。此外，由于AVD上冰结合位点的甲基在维持构象刚性和固定水分子方面起着重要作用[35]，进一步选择Ser作为替代氨基酸，因为它没有甲基[36]。因此，制备了三种突变肽，其中，Thr6、Asn8或两者被Ser取代[图4（a）]。这些肽的MS和HPLC数据在附录A的图S28至图S30中提供。然后评估三种突变肽的动态冰成形和IRI活性[图4（b）~（e）]。突变体显示出更高的冰生长速率和显著降低的IRI活性，表明Thr6和Asn8残基在阻止冰生长中是必不可少的。

通过MD模拟分析了AVD肽和冰晶之间的相互作用机制。对每个样品进行四次独立的模拟，每个模拟在220 K下运行。在模拟开始时，将AVD肽以随机取向放置在生长的冰锋附近。如图4（f）和（g）所示，AVD肽在模拟中显著抑制冰晶的形成。无AVD组中，40 ns时冰生长进入稳定阶段，约占整个系统的85%，而在AVD组中，冰在40 ns时仅占59%。如图4（h）所示，在轨迹2中从两个角度在40 ns拍摄与冰结合的AVD肽的快照。这些快照显示，Thr6和Asn8残基被推入冰面的空腔中。这些结果进一步证实了Thr6和Asn8残基在AVD与冰结合中的重要作用。有趣的是，我们还发现在所有独立的模拟中，Ser18的羰基都通过氢键与冰晶相互作用（附录A中的图S31），同时Thr6和Asn8也与冰结合。对这些氢键相互作用的详细分析表明，它们主要发生在20 ns后（附录A中的图S32）。因此，通过在该位置插入氨基己酸（Ahx）来设计缺乏Ser18和Gly19之间的正常酰胺键的突变体，称之为AVD-5 [图4（a）]。突变体AVD-5的MS和HPLC数据见附录A中的图S33。突变体的抗冻性能如图4（b）和（d）所示，AVD-5显示出比AVD更高的冰生长速率。此外，AVD-5失去了大部分IRI活性，与突变体AVD-2类似[图4（c）和（e）]，这进一步表明了残基Ser18的辅助作用。这种补充作用可以协同稳定AVD肽与冰的结合并阻碍冰的生长。

3.5 AVD细胞冷冻保存

基于细胞的治疗和诊断对医疗健康具有重要作用，用于该目的的细胞通常需要冷冻保存以供临床应用[37‒40]。在本文中，AVD被用于细胞冷冻保存的新型CPA。首先，进行细胞毒性、血液相容性和免疫原性试验，以评估AVD的生物相容性。分别用不同浓度的AVD培养含有成纤维细胞NIH-3T3、巨噬细胞RAW264.7和肺腺癌细胞GLC-82的细胞系。如附录A中的图S34（a）所示，对于每种细胞系，在实验组和对照组之间没有观察到差异。此外，检测RAW264.7的半胱天冬酶信号通路以评估细胞相容性。半胱天冬酶3、4、8和9的转录水平在所有样品中差异不显著[附录A中的图S34（b）]，表明AVD具有细胞相容性。此外，在血液相容性试验中，发现所有AVD样本的溶血率（HR）均小于0.8%，满足临床要求（HR<5%）[附录A中的图S34（c）和（d）]。免疫原性通过测定促炎和抗炎标志物的转录水平进行了研究，包括TNF-α、CD163、IL-1、iNOS、VEGF、CD206、Arg-1和IL-10。在对照组和AVD组中，标记物的相对信使RNA（mRNA）水平相当，表明免疫原性可忽略不计[附录A中的图S34（e）]。

AVD肽优异的IRI和生物相容性为细胞冷冻保存铺平了道路。这里，AVD和阴性对照AVD-3肽用于细胞冷冻保存。选择三种细胞系，包括NIH-3T3、RAW264.7和GLC-82。在解冻后24 h检测细胞回收率，以使细胞凋亡事件发生并避免假阳性结果[41]。随着AVD浓度的增加，获得了更高的细胞回收率。使用10 mg∙mL-1的AVD作为CPA，NIH-3T3、RAW264.7和GLC-82的细胞回收率分别为70.9%、34.9%和95.7%，较没有AVD的细胞回收率分别高2.5倍、14.5倍和3.1倍[图5（a）~（c）]。这些回收率也比AVD-3肽高2.6倍、1.8倍和1.3倍，表明AVD是有效的CPA组分[图5（a）~（c）]。

多肽的冷冻保存效果促使我们研究其他潜在机制，因为IRI可能不是抗冻材料的冷冻保存能力的唯一因素[42‒43]。采用活/死分析来探索解冻后的膜渗透[44‒45]。如附录A中的图S35所示，在没有多肽的情况下冷冻保存的细胞在解冻后出现大量受损的膜，导致更多的红色细胞核。相反，添加AVD和AVD-3肽后，细胞膜受损的比例显著降低，这表明这些肽可以在冷冻/解冻循环期间稳定细胞膜。

进一步使用FITC标记的AVD研究其在保护细胞膜中的作用。用FITC标记的AVD培养细胞后，细胞膜上出现荧光，而仅用FITC分子培养细胞后，在整个细胞上观察到荧光，表明AVD与细胞膜相互作用[附录A中的图S36（a）]。还使用亲脂性阴离子荧光染料D43检测细胞膜电位（细胞膜电位是确定膜功能完整性的敏感指标）[46]。在4 ℃下储存48 h后，与AVD一起培养的细胞显示出与新鲜细胞相似的荧光强度，而没有AVD的对照样品显示出更强的荧光，表明细胞膜发生了去极化和损伤[附录A中的图S36（b）和（c）]。

此外，阻断Ca2+泵可以平衡离子组成，防止冷冻保存过程中的膜损伤[47]。因此，通过监测荧光比率（R340/380）的变化来研究细胞膜中的Ca2+渗透性[附录A中的图S36（d）]。经Ca2+处理后，对照组的R340/380比值显著升高，AVD组变化不大。相应地，在对照组中观察到从红色到绿色的快速而强烈的转变，而在AVD组中，颜色变化是适中且稳定的[附录A中的图S36（e）]。此外，在对照组中观察到较高的荧光比率，而在AVD组，随着Ca2+浓度的增加，荧光比率呈稳定的趋势（附录A中的图S37）。这些结果表明，AVD可以通过在冷冻保存期间平衡离子组成来保持细胞膜的完整性。总体而言，AVD可以通过协同抑制冰重结晶和在解冻/融化期间稳定细胞膜来冷冻保护细胞[图5（d）]。

研究细胞在反复冻融后是否真正有活力也很重要。这里对细胞的附着和增殖进行了评估。如图5（e）和（f）所示，与新鲜细胞相似，解冻后的细胞仍然能够附着在基底上，并有明显的肌动蛋白依赖性突起和细胞质突起，表明AVD可以维持细胞的超微结构。此外，与新鲜细胞相比，解冻后的细胞具有相似的增殖速率，证明了它们的正常活力和细胞代谢[图5（g）]。与新鲜细胞相比，解冻后的细胞也具有相似的ATP水平[图5（h）]，证明了其线粒体的功能性，其在冻融过程中很容易受损[48]。AVD和其他报道的IBP或IBP模拟物的细胞冷冻保存效率总结在附录A的表S7中。总之，这些结果证明AVD可用作在冻融循环后维持细胞功能的高效CPA。应该注意的是，在玻璃化的升温过程中冰的重结晶特别严重[49]。因此，在未来的工作中，我们将采用玻璃化法，以AVD为CPA进行细胞冷冻保存。

4 结论

通过系统分类和进化分析，将所有报道IBP中的重复基序用于设计高效的抗冻肽。在综合评估样品的溶解度和IRI活性后，选择性能最优的AVD肽进行更详细的机制研究。基于突变分析和MD模拟，得出AVD肽的Thr6和Asn8残基对其与冰的结合能力至关重要，而Ser18残基可以通过氢键进一步稳定肽与冰的相互作用。此外，AVD表现出优异的生物相容性，可以通过阻断Ca2+通道与细胞膜相互作用并稳定细胞膜。基于这些优点，AVD肽被成功地用作CPA，显著增加了冷冻后的细胞回收率。这项工作中提出的策略可用于设计新型抗冻肽，不仅丰富合成生物学的功能模块库，并有望对细胞和组织冷冻保存领域产生重大影响。

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