短波红外荧光成像活体监测和评估植入的M2巨噬细胞在骨骼肌再生中的作用

陈蓦 ,  陈雨舟 ,  冯思嘉 ,  董世贤 ,  孙路易 ,  李惠珠 ,  陈福春 ,  Nguyen Thi Kim Thanh ,  李云霞 ,  陈世益 ,  王友 ,  陈俊

工程（英文） ›› 2024, Vol. 33 ›› Issue (2) : 306 -317.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 33 ›› Issue (2) : 306 -317. DOI: 10.1016/j.eng.2023.05.010
研究论文

短波红外荧光成像活体监测和评估植入的M2巨噬细胞在骨骼肌再生中的作用

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SWIR Fluorescence Imaging In Vivo Monitoring and Evaluating Implanted M2 Macrophages in Skeletal Muscle Regeneration

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摘要

骨骼肌具有强大的再生能力，但严重损伤、疾病和衰老会影响这种再生能力，从而导致骨骼肌相关疾病的发生。因此，改善骨骼肌再生是治疗骨骼肌相关疾病的关键挑战。由于M2型巨噬细胞（M2Mø）在组织再生中所起的重要作用，植入M2Mø具有改善骨骼肌再生的巨大潜力。本研究利用短波红外（short-wave infrared, SWIR）荧光成像技术深入评估了M2Mø植入后对骨骼肌再生效果的活体信息。该技术示踪了小鼠骨骼肌损伤模型中植入的M2Mø。结果表明，植入的M2Mø在损伤部位聚集达两周。随后，血管SWIR荧光成像显示M2Mø植入可改善损伤后第5天（1.09 ± 0.09 vs 0.85 ± 0.05; p = 0.01）和第9天（1.38 ± 0.16 vs 0.95 ± 0.03; p = 0.01）的相对灌注率，同时损伤后第13天的骨骼肌再生程度也得以改善。最后，多元线性回归分析明确了损伤后时间和相对灌注率可以作为评估骨骼肌再生的预测指标。这些结果为M2Mø在骨骼肌再生中的作用提供了更多体内细节，明确了M2Mø可促进血管生成和改善骨骼肌修复程度，这将指导未来M2Mø植入改善骨骼肌再生的进一步研究与发展。

Abstract

Skeletal muscle has a robust regeneration ability that is impaired by severe injury, disease, and aging, resulting in a decline in skeletal muscle function. Therefore, improving skeletal muscle regeneration is a key challenge in treating skeletal muscle-related disorders. Owing to their significant role in tissue regeneration, implantation of M2 macrophages (M2Mø) has great potential for improving skeletal muscle regeneration. Here, we present a short-wave infrared (SWIR) fluorescence imaging technique to obtain more in vivo information for an in-depth evaluation of the skeletal muscle regeneration effect after M2Mø transplantation. SWIR fluorescence imaging was employed to track implanted M2Mø in the injured skeletal muscle of mouse models. It is found that the implanted M2Mø accumulated at the injury site for two weeks. Then, SWIR fluorescence imaging of blood vessels showed that M2Mø implantation could improve the relative perfusion ratio on day 5 (1.09 ± 0.09 vs 0.85 ± 0.05; p = 0.01) and day 9 (1.38 ± 0.16 vs 0.95 ± 0.03; p = 0.01) post-injury, as well as augment the degree of skeletal muscle regeneration on day 13 post-injury. Finally, multiple linear regression analyses determined that post-injury time and relative perfusion ratio could be used as predictive indicators to evaluate skeletal muscle regeneration. These results provide more in vivo details about M2Mø in skeletal muscle regeneration and confirm that M2Mø could promote angiogenesis and improve the degree of skeletal muscle repair, which will guide the research and development of M2Mø implantation to improve skeletal muscle regeneration.

关键词

体内 / 短波红外 / 骨骼肌 / 巨噬细胞 / 再生

Key words

In vivo / Short-wave infrared / Skeletal muscle / Macrophage / Regeneration

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陈蓦,陈雨舟,冯思嘉,董世贤,孙路易,李惠珠,陈福春,Nguyen Thi Kim Thanh,李云霞,陈世益,王友,陈俊. 短波红外荧光成像活体监测和评估植入的M2巨噬细胞在骨骼肌再生中的作用[J]. 工程（英文）, 2024, 33(2): 306-317 DOI:10.1016/j.eng.2023.05.010

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1 引言

骨骼肌是人体中最丰富的组织，共有600多块，占据了近一半的体重[1‒3]。骨骼肌作为运动系统的重要组成部分，参与各种机械活动，如保持姿势、活动和呼吸[3‒4]。虽然骨骼肌具有强大的再生能力，能够从轻度损伤中完全恢复功能和结构，但是严重损伤和其他相关疾病会损害其再生能力，导致运动功能下降和一系列并发症。这些影响骨骼肌再生能力的疾病主要分为以下三类，①损伤：作为最常见的运动损伤，骨骼肌损伤约占所有运动损伤的50% [5]，其常伴有瘢痕形成和其他不良愈合问题，表现为功能恢复延迟、复发、慢性疼痛，甚至截肢[6‒7]。②炎症：特发性炎性肌病（IIMs）是一组以骨骼肌炎症为特征的肌肉自身免疫性疾病，包括皮肌炎、多肌炎、含嗜酸性体肌炎和其他特定类型的特发性肌炎[8]。轻度临床表现包括慢性无力、疲劳、肌肉疼痛和压痛，而重症患者无法完成穿衣、行走和坐立等基本活动[9‒10]。③衰老：骨骼肌衰老也称肌少症，特点是骨骼肌的数量、力量和再生能力降低[11‒12]。肌少症增加了跌倒、骨折、认知下降和心血管疾病的风险，并与死亡率的增加相关[13]。改善骨骼肌再生是治疗这些骨骼肌疾病的核心问题[14‒16]，这既是解决这一类问题的机遇，也是一个挑战。

巨噬细胞存在于几乎所有组织中，并具有多种功能亚型。它们参与发育、稳态、免疫和组织修复[17]，被认为是骨骼肌再生的主要调节因子之一[18‒19]。特别是在再生的晚期，M2型巨噬细胞（M2Mø）起着重要作用[2]。许多证据表明，M2Mø通过促进肌细胞再生和改善血管生成促进骨骼肌再生[20‒21]。此外，M2Mø属于不可增殖细胞系，在适宜条件下可存活两到三周，这些使得M2Mø植入更安全。综上所述，上述特性使M2Mø在用于提高骨骼肌疾病再生质量的细胞治疗中具有很大的研究潜力。然而，由于缺乏有效的体内成像技术来监测植入的M2Mø在骨骼肌再生中的相关动态变化，因此植入M2Mø促进骨骼肌修复的体内效果仍需进一步研究。

短波红外（short-wave infrared, SWIR）荧光成像是21世纪初开始研究的一种新兴的体内成像技术[22‒23]。与传统的光学成像技术相比，SWIR荧光成像具有实时、高空间分辨率和深穿透度等显著优势。因此，在不到20年的时间里，这项技术迅猛发展，显示出在活体细胞荧光示踪和活体血管成像方面的巨大潜力。在我们的前期研究中，量子点（quantum dots, QDs）被制备成SWIR荧光纳米探针，用于标记骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cell, BMSC）并示踪注射到肩袖损伤模型中的BMSC的体内命运[24]。通过小鼠尾静脉注射QDs也用于在时空维度上监测损伤骨骼肌中新生血管的生长分布[25]。以上结果均证实了该技术在细胞和血管的体内成像领域的成功应用。本研究将该技术应用于上述两方面（图1）。首先，利用QDs标记M2Mø以监测M2Mø植入损伤骨骼肌后的聚集位置和停留时间。然后，利用SWIR荧光成像体内监测损伤骨骼肌中的血管，以评估骨骼肌再生程度。用本方法比较了M2Mø植入组和对照组，并辅以病理染色和其他体外检测新生血管的方法，证实了与对照组相比，M2Mø植入组显著增加了血管新生并改善了骨骼肌再生程度。总之，本研究将为M2Mø治疗提供更多的体内数据，并指导M2Mø植入改善骨骼肌再生的研究。

2 方法

2.1 小鼠骨髓源性巨噬细胞的提取和极化

骨髓源性巨噬细胞（bone-marrow-derived macrophage, BMDM）的提取和极化方法改编自文献[26]。从6~8周龄的ICR雌性小鼠的股骨和胫骨中分离出骨髓。将细胞在RPMI-1640培养基（Servicebio，中国）中培养，按体积比加入10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、1%青霉素和链霉素（100×；HyClone，美国）和1%丙酮酸钠（HyClone）。将细胞加入培养皿中，然后按20 ng·mL-1添加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte‒macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF；PeproTech，美国），并放入细胞孵化箱（37 ℃，5% CO2，饱和湿度）培养。在第2天和第3天，更换一半的培养液并全部更换培养基，新的培养基中分别加入40和20 ng·mL-1的GM-CSF。在第6天，更换所有培养基。此时培养皿中的细胞是骨髓源性巨噬细胞（M0型），显微镜观察形态并拍照。然后向新的培养基中添加白细胞介素4（Interleukin 4, IL-4）（10 ng·mL-1）。在第8天得到M2Mø，显微镜观察形态并拍照。

2.2 实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）

M2Mø经过冷的磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗后，在每个直径为3.5 cm的培养皿中加入1 mL RNA提取液裂解细胞。在无核酶的无菌管中按照指定的顺序添加以下试剂：模板RNA 2 μg、引物寡聚（dT）18引物0.5 μL和随机六聚体引物0.5 μL或基因特异性引物1 μL、5×反应缓冲液4 μL、Servicebio逆转录酶混合液1 μL，无核酸酶水加至20 μL。引物信息见附录A中的表S1。对于每个15 μL的反应体系，制备以下反应混合物7.5 μL：F/R引物（2.5 μmol·L-1）1.5 μL、cDNA 2.0 μL、无核酶水4.0 μL。在PCR扩增后，使用糖原醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，采用2-ΔΔ C t相对法对信使RNA（mRNA）的丰度进行定量。

2.3 细胞流式

CD11b和F4/80的抗原表达：细胞培养8天后，极化的M2Mø悬液被加入流式细胞仪试管中，确保每个试管中的细胞数超过1×106。1500 r·min-1离心5 min后弃上清。沉淀物与50 μL稀释的一抗抗体（CD11b和F4/80）混合，存放在4 ℃的黑暗中孵育30 min后，加入2 mL PBS终止反应。1500 r·min-1离心5 min后弃上清，重悬于1×PBS中，上机测试。

CD206：向细胞沉淀物中加入100 μL细胞内固定缓冲液，避光静置45 min。添加2 mL 1×固定液缓冲液，1500 r·min-1离心5 min后弃上清。随后，用100 μL 1×固定液缓冲液悬浮细胞，加入细胞内抗体CD206，避光孵育30 min。加入2 mL 1×固定液缓冲液，1500 r·min-1离心5 min后弃上清。细胞用500 μL染色缓冲液悬浮，上机测试。

2.4 QDs标记M2Mø的制备

制备QDs的方法在前文已描述[25]。简单来说，将500 μL来自牛胰腺的核酸酶A（50 mg·mL-1, Sigma-Aldrich，美国）与10 mmol·L-1三乙酸酯酸铅（500 μL）混合，然后依次加入1 mol·L-1氢氧化钠溶液（50 μL）和10 mmol·L-1的Na2S溶液（50 μL）。将混合物在功率30 W、70 ℃下的微波反应器（Discover SP；CEM，美国）中反应30 s。制备的QDs超滤三次以去除多余试剂并中和。制备的QDs的发射峰约1300 nm，荧光量子产率（quantum yield, Фf）为17.3，平均尺寸为(4.35 ± 0.07) nm [27]。

将1 mL 0.1 mol·L-1 2-(N-吗啉基)乙磺酸（MES）溶液加入0.5 mL QDs溶液，将体系pH调整到5.5~6.5，加入2.4 mg 1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和2.4 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌20~40 min。向体系中加入1 mg稀释在二甲基亚砜（DMSO）中的Sulfo-SMCC，搅拌2 h，加入1 mg的转录激活因子（TAT）肽，然后在4 ℃下过夜。将反应液转移到10 kDa超滤管中，以1200 r·min-1离心5 min弃上清，用1×PBS洗涤三次以去除体系中未反应的QDs。最后，将沉淀用1× PBS重悬至100 μL（约2.0×105个）M2Mø。

2.5 模型

所有实验动物均为6~8周龄的ICR雌性小鼠，由上海杰思捷实验动物有限公司（中国）提供。研究方案经复旦大学医学院实验动物伦理委员会批准。以已发表的文献[28]中的方法为基础，建立了心脏毒素（CTX）诱导的骨骼肌损伤小鼠模型。将120 μL浓度为10 mmol·L-1的CTX溶液注射到腓肠肌、比目鱼肌和胫骨前肌肉中。小鼠安乐死后，暴露后肢皮肤以观察骨骼肌坏死情况。

2.6 SWIR荧光成像

我们使用了中国科学院上海药物研究所开发的SWIR荧光显微成像设备对标记有量子点的M2Mø进行了体外成像。在每次体内成像之前，小鼠（每个时间点n = 3只）在麻醉后以仰卧位固定，下腹部和后肢进行剃毛处理。激发光源为808 nm激光器。小鼠发出的光经过1250 nm长通滤光片过滤，并使用二维InGaAs相机（Photonic Science，英国）在50~100 ms的曝光时间下进行SWIR荧光成像。

2.6.1 SWIR荧光成像示踪体内植入M2Mø的命运

向小鼠后肢的损伤区域注射100 μL QDs标记的M2Mø（约2.0×105个M2Mø）细胞悬液，在伤后的第3天进行了SWIR荧光成像。随后，分别在伤后的第3、9、15和17天进行了损伤后肢的SWIR荧光成像。

通过在尾静脉注射0.3 mL QDs进行后肢骨骼肌中血管的SWIR荧光成像。在进行M2Mø植入之前，分别在损伤后的第1天和第3天对正常和损伤的后肢肌肉进行了成像。在M2Mø植入之后，对损伤后的后肢肌肉在损伤后的第5、9和13天进行了成像。

2.6.2 SWIR荧光成像监测骨骼肌血管

使用ImageJ软件测量荧光强度（FL）。FL的总值通过使用ImageJ软件荧光强度总和（integrated density）来计算。对于损伤后第9、15和17天，FL的平均值和总值均相对于伤后第3天的值进行了标准化处理。信噪比（signal-to-noise ratio, SNR）的计算与文献[25]相同，公式（1）可以表示为：

S N R = F L ( S ) σ

式中，FL(S)表示与QDs样品相对应的平均FL；σ表示没有样品的背景FL的标准差。相对灌注率（relative perfusion ratio）的计算基于Ma等[29]所描述的方法，公式（2）可以表示为：

r e l a t i v e   p e r f u s i o n   r a t i o = F L   o f   C T X   i n j e c t i o n   a r e a F L   o f   c o n t r o l   a r e a

相对灌注增长率（relative perfusion growth rate）是用来反映骨骼肌中新生血管增长速率的指标，如公式（3）所示，可以表示为：

r e l a t i v e   p e r f u s i o n   g r o w t h   r a t e = ∆ r e l a t i v e   p e r f u s i o n   r a t i o ∆ T i m e

式中，∆相对灌注率为该时间点与上一个时间点的相对灌注率差值；∆时间为该时间点与上一个时间点的天数差值。

2.8 免疫组织化学和定量分析

免疫组织化学中使用了以下一抗和稀释倍数：CD163（Ab182422, 1:500; Abcam，英国）、血小板内皮细胞黏附分子-1（CD31; Ab182981, 1:2000; Abcam)、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA; 14395-1-AP, 1:3000; Proteintech, 中国）和von Willebrand因子（VWF; 11778-1-AP, 1:250; Proteintech）。骨骼肌组织在4%多聚甲醛中固定后进行常规石蜡包埋。4 μm的切片脱蜡至水。然后，将其浸泡在柠檬酸钠抗原修复液中，用3%的H2O2阻断，在室温下用10%的正常兔血清封闭30 min，在兔抗CD31一抗（ab182981, 1:1000; Abcam）的作用下孵育过夜，随后使用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（GB23303, 1:200; Servicebio）。对每个高倍视野（200倍）进行免疫组织化学（immunohistochemical, IHC）定量分析。根据之前的报道[30]，计算IHC H评分（H-score）。

2.9 统计分析

测量值的结果以均值±标准差（SD）表示。两组之间的差异使用双侧Student’s t-检验进行分析。使用GraphPad Prism 8软件进行统计分析，包括Pearson相关系数和多元线性回归分析。p < 0.05被认为是显著差异，p < 0.01被认为是高度显著差异。

3 结果

3.1 M2Mø的体外极化和SWIR荧光标记

M2Mø从BMDMs中提取和极化，并用SWIR QDs体外标记，为随后的肌内植入和体内SWIR荧光示踪做准备。与加入IL-4前的第6天培养相比，细胞形态在第8天培养时显著变化，初步表明巨噬细胞已经极化成M2Mø [图2（a）]。流式细胞术和qRT-PCR的结果进一步确认了M2Mø极化成功。此外，流式细胞结果表明，在培养第8天时，98.74%的M2Mø呈F4/80和CD11b阳性[图2（b）]，96.81%呈CD206阳性[图2（c）]。同时，qRT-PCR的结果显示，与iNOS（<1倍）、CD80（<1倍）和CD86（<1倍）等M1Mø标志物相比，精氨酸酶-1（ARG1；19倍）、抵抗素样蛋白α（retnla；84倍）和几丁质酶3样蛋白3（chitinase 3-like 3, YM1；137倍）等M2Mø标志物的表达水平指数级增加[图2（d）]。确认极化成功后，利用SWIR QDs对M2Mø进行了SWIR荧光标记。标记的M2Mø的SWIR荧光轮廓与在同一视野下可见光下观察到的一致（20倍放大）[图2（e）]，表明M2Mø已成功被SWIR荧光标记。另外，如图2（f）所示，标记的M2Mø在PBS溶液中呈现白色沉淀物，在808 nm激光激发下显示出强烈的SWIR荧光信号。此外，在曝光时间从50 ms到450 ms增加时，荧光强度逐渐增加[图2（g）]。而当曝光时间超过100 ms时，SNR先增加然后保持相对稳定[图2（h）]。这些结果表明M2Mø被成功地分离、极化和被SWIR QDs标记，从而使标记的M2Mø可以进行后续的SWIR荧光成像。

3.2 植入的M2Mø在损伤区积累了14天

随后，极化的M2Mø在骨骼肌损伤后第3天被植入[图3（a）]。与未进行M2Mø植入的对照组观察到的白色坏死组织相比，M2Mø植入后的骨骼肌坏死组织面积显著减少[图3（b）]。这个结果表明，在M2Mø植入后骨骼肌修复能力得到了提升。如图3（c）所示，在损伤后第3天将标记的M2Mø经肌肉注射到损伤的骨骼肌中后，立即观察到广泛的荧光，而在损伤后第9天，荧光的强度和面积明显减少，仅在可能是严重受损的小面积区域内停留。最后，标记的M2Mø的荧光在损伤后第17天消失。定量分析显示，从损伤后第3天到第9天，FL的标准化平均值和总值显著减少（90.2%±4.9％; 97.6%±2.2％），并且从损伤后第9天到第17天，下降减少（6.7%±3.6%; 2.0%±1.8%）[图3（d）和（e）]。这表明，M2Mø在植入后在骨骼肌中持续存在14天，而M2Mø的主要作用时间在植入后的6天内。损伤后第17天，骨骼肌和器官的苏木精-伊红（H&E）染色显示植入M2Mø的累积未在组织和器官中引起炎症反应[图3（f）]。这表明，植入的M2Mø可以在损伤区域内积累并停留长达14天，而不引起组织和器官炎症反应。

3.3 SWIR荧光成像监测血管可作为评价骨骼肌再生程度的敏感指标

为研究M2Mø植入对骨骼肌再生的促进效果，作为评价骨骼肌的敏感指标，引入SWIR荧光成像评估血管，验证其是否适用于实时评价骨骼肌再生。如图4（a）所示，将损伤前的正常骨骼肌与损伤后第1天、第3天的骨骼肌进行比较，损伤后第1天未见坏死组织，损伤后第3天观察到了明显的坏死组织（坏死面积比=0.64±0.10）[图4（b）、（c）]。损伤后第3天坏死面积最大（见附录A中的图S1）。在SWIR荧光成像中，由于FL随QDs注射后时间的增加而逐渐减弱，因此首先研究计算相对灌注率随注射时间的稳定性。相对灌注率在注射后35 s内随注射时间的增加而线性增加，但在注射后35 s至4 min内稳定在0.75左右，不受FL随注射时间增加而减少的影响（图S2和附录A中的录像S1）。在SWIR荧光成像确定相对灌注率的稳定性后，在相应时间点对骨骼肌进行成像。

与直接观察结果相比，SWIR荧光成像获得的最低相对灌注率出现在损伤后第1天[图4（d）和（e）]，这说明血管损伤的峰值出现在损伤后第1天（附录A中的图S3），这一点在损伤后13天内的观察中也得到了证实。损伤骨骼肌的H&E染色证实了直接观察的结果，损伤后第3天每个视野中正常肌纤维数较损伤后第1天减少，说明损伤后第3天骨骼肌损伤更严重[图4（f）和（g）]。Masson染色结果显示，损伤后第1天胶原体积分数（collagen volume fraction, CVF）在所观察的时间点中最高，表明组织修复在损伤后第1天开始活跃[图4（h）和（i）]。总之，血管变化伴随着修复的开始，优先于骨骼肌的变化。可见，通过SWIR荧光成像监测血管变化可作为实时监测M2Mø参与骨骼肌再生的灵敏指标。

3.4 体内和体外实验结果证实了M2Mø植入损伤的骨骼肌能促进血管生成、提高修复质量

在证实SWIR荧光成像可以评估骨骼肌再生质量后，用此来评估体内植入M2Mø对损伤骨骼肌的作用，并通过离体测试来验证其疗效。简单来说，将M2Mø植入组与对照组在损伤后第5、9、13天的大体形态、血管SWIR荧光成像、H&E染色和Masson染色的结果进行比较[图5（a）、（b）]。大体形态学显示，与对照组相比，M2Mø植入组的坏死面积比在第5天（0.05±0.05 vs 0.32±0.04; p < 0.01）和第9天（0.01±0.01 vs 0.04±0.01; p = 0.04）显著降低，损伤后第13天的坏死面积比相当（0±0 vs 0.01±0.02; p = 0.37）[图5（c）]，说明M2Mø植入后骨骼肌损伤的修复程度明显提高。对于骨骼肌血管的SWIR荧光成像，M2Mø植入组的相对灌注率在第5天（1.09±0.09 vs 0.85±0.05; p= 0.01）和第9天（1.38±0.16 vs 0.95±0.03; p = 0.01）更高，而两组在损伤后第13天的相对灌注率无显著差异（1.23±0.13 vs 1.23±0.30; p = 0.99）[图5（d）]。这表明M2Mø植入组血流灌注更丰富，在损伤后第5天和第9天血管生成更多。如图5（e）所示，M2Mø植入组在损伤后第5天核位于中心（centrally localized nuclei, CLN）的再生肌纤维的数量明显更多（92.3±30.1 vs 13.8±4.0; p = 0.01），但M2Mø植入组与对照组在损伤后第9天的差异无统计学意义（48.4±8.9 vs 40.7±21.9; p = 0.60），损伤后第13天显著降低（3.4±1.8 vs 40.7±11.8; p < 0.01）。这种逐渐减少的趋势表明M2Mø植入后新生肌纤维的再生时间提前。最后，从Masson染色结果来看，M2Mø植入组与对照组在损伤后第5天的CVF差异无统计学意义（14.2±5.2 vs 9.5±2.2; p = 0.22），随后M2Mø植入组的CVF在损伤后第9天显著升高（16.7±3.6 vs 5.8±3.5; p = 0.02），在损伤后第13天显著降低（3.4±1.8 vs 11.2±3.5; p = 0.03）[图5（f）]。SWIR荧光成像的相对灌注率与大体形态的坏死面积比和Masson染色的CVF显著相关[附录A中的图S4（a）~（c）]，这提示相对灌注率与骨骼肌损伤的修复程度和胶原生成有着千丝万丝的联系。综上所述，M2Mø植入可促进血管生成，增加胶原生成，从而促进新生肌纤维再生进程，提高骨骼肌再生程度。

3.5 免疫组化证实M2Mø能促进损伤骨骼肌的血管生成

免疫组化染色（IHC）利用CD163和新生血管标志物（如CD31、VWF和α-SMA）定量检测M2Mø和新生血管在受损骨骼肌区域的数量，并确认M2Mø植入对受损骨骼肌的血管生成具有增强作用。根据CD163免疫组化染色的结果[图6（a）]，M2Mø植入组在损伤后第5天（18.8 ± 7.5 vs 11.6 ± 2.0）、第9天（12.6 ± 2.9 vs 9.7 ± 3.9）和第13天（16.2 ± 10.0 vs 12.5 ± 3.7）的H评分均值高于对照组（图6），说明M2Mø植入能够在损伤后9天内增加M2Mø的数量，并加速再生过程。

3.6 损伤后时间和相对灌注率是评价骨骼肌再生程度的重要指标

在这项研究中，骨骼肌再生程度是一个重要的观察指标，也是重要的临床监测结果。通过对新生血管的观察因素与骨骼肌再生程度进行相关分析和多元回归分析，探讨骨骼肌再生的相关因素，便于骨骼肌再生程度的评价。在血管生成相关标志物的IHC结果中，只有VWF阳性H评分与相对灌注增长率显著相关（r = 0.51, p = 0.03）[图7（a）]，表明VWF可能是标记骨骼肌中新生血管的理想IHC血管生成相关标志物。只有α-SMA阳性MVD与CD163阳性H评分显著相关（r = 0.45, p = 0.03）。如图7（b）所示，损伤后时间（r = -0.46, p = 0.02）、相对灌注率（r = -0.44, p = 0.03）和α-SMA阳性MVD（r = -0.46, p = 0.02）与坏死面积比显著相关。以损伤后时间-x 1、相对灌注率-x 2、α-SMA阳性MVD-x 3为自变量进行多元线性回归分析，拟合程度良好（对照组：y = 0.5586 - 0.0608x 1 + 0.0204x 2 + 0.0010x 3, R 2 = 0.9240；M2Mø植入组：y = 0.2479 - 0.0025x 1 - 0.1364x 2 - 0.0003x 3, R 2 = 0.7143）[图7（c）]。在三个自变量中，由于α-SMA阳性MVD是在体外评估的，因此仅以损伤后时间和相对灌注率作为自变量进行二元线性回归分析，通过体内监测指标评价骨骼肌再生程度。结果表明，虽然对三个自变量进行多元线性回归分析的拟合程度略差，但二元线性回归方程的拟合程度仍较好（对照组：y = 0.3580 - 0.0460x 1 + 0.1777x 2, R 2 = 0.8286；M2Mø植入组：y = 0.1613 - 0.0056x 1 - 0.0728x 2; R 2 = 0.5239）[图7（d）]。综上所述，损伤后时间和相对灌注率是评价骨骼肌再生程度的重要指标，这两个参数可以用来评价骨骼肌再生的程度。

4 讨论

在M2Mø植入之前的损伤后三天，通过直接观察、SWIR荧光成像骨骼肌中的血管、H&E染色和Masson染色来评估CTX诱导的骨骼肌损伤的早期阶段。在这四种方法中，SWIR荧光成像骨骼肌中的血管是评估骨骼肌质量的唯一间接方法，通过计算相对灌注率定量评估血管损伤的严重程度。SWIR荧光成像显示，相对灌注率在损伤后的第1天最低，表明与骨骼肌损伤相关的血管损伤发生迅速而显著，且监测血管损伤可能在损伤后的第1天间接监测骨骼肌损伤。Masson染色支持了SWIR荧光成像中观察到的血管损伤。损伤后的第1天CVF高于第3天，表明胶原生成在损伤后的第1天最为活跃。然而，直接观察和H&E染色均显示，骨骼肌坏死的严重程度在损伤后第3天要高于第1天。这表明，虽然血管损伤和骨骼肌坏死均由于损伤引起，但血管损伤的高峰期比骨骼肌坏死的高峰期更早。在受伤的早期阶段，可以通过SWIR荧光成像明显检测到血管损伤，证明监测血管损伤可以实现对骨骼肌损伤的早期诊断。

在M2Mø植入后，无论在损伤后的第5天和第9天是否存在统计学差异，M2Mø植入组的平均血液灌注（SWIR荧光成像中的相对灌注率）、肌肉质量（直接观察中的坏死区域比例）、再生肌纤维（H&E染色中CLN的再生肌纤维）和胶原（Masson染色中的CVF）均高于对照组。这表明，在植入后的前6天，M2Mø显著改善了血管生成和骨骼肌再生质量。损伤后第13天，这些指标在两组之间要么没有显著差异，要么在M2Mø植入组中明显降低。此外，这些值更接近正常骨骼肌（图4），表明植入后的第10天骨骼肌已经修复到比对照组更接近正常骨骼肌的状态。因此，M2Mø植入促进了骨骼肌再生，改善了修复质量，加速了骨骼肌再生的过程。

值得注意的是，两组之间最常用和最知名的标记物之一——CD31的数量差异与VWF和α-SMA的结果相反，并且在损伤后的第9天，对照组中的CD31水平甚至高于M2Mø植入组。两组之间出现相反的血管生成相关标志物水平的情况也有报道。Bösmüller等[32]比较了肝内胆管细胞癌和匹配对照组织中CD31和血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2）染色评估的阳性微血管密度。肝内胆管细胞癌的VEGFR-2阳性微血管数量[高倍视野：15.4 (2.0~77.0)]显著少于匹配对照组织[42.3 (4.6~109.0)]，而CD31的微血管密度在两者之间是相当的[32.1 (5.3~78.0) vs 28.0 (5.3~57.0); p = 0.89]。不同的血管生成标志物在不同的部位有表达。例如，CD31在内皮细胞上表达[31]，α-SMA存在于毛细血管中环绕内皮细胞的周细胞中[33]，而VWF存在于内皮下基质中[34]。即使对于在内皮细胞上表达的两种类型的血管生成相关标志物，不同抗原的免疫组化表达也存在差异。Figueiredo等[35]使用在内皮细胞上表达的血管生成相关标志物CD31和CD105抗体，对聚醚聚氨酯诱导的小鼠血管生成进行双重免疫组织化学标记，发现CD31标记的血管数量明显低于CD105。

此外，使用双重免疫荧光染色标记CD31和CD105的血管数目显著低于用H&E染色计数的血管数目。Figueiredo等[35]认为，这些发现显示了双重免疫荧光染色CD31和CD105在标记植入物内新生血管方面的局限性。这也反映了免疫组化染色的局限性和不确定性。此外，CD31作为最具代表性的血管生成标志物的地位也受到质疑，因为其表达水平可能受到组织和模型类型的影响，甚至在血管生成过程中也有变化。Van Amerongen等[36]发现，在皮下胶原I型椎间盘模型中，CD31并非最佳的血管生成相关标志物，而是胶原IV；VWF、MECA-32和内皮黏蛋白抗体在该模型中常不能染色新生血管。这些结果说明了体外实验（如免疫组化）的不稳定性和局限性，同时证明了体内实验的可靠性。最后，我们发现免疫组化统计数据的方差很大，这也是两组之间未能统计显著差异的主要原因之一。然而，一些标志物表达水平的均值似乎非常不同。总之，血管生成相关标志物的免疫组化分析结果受到多种因素的影响，显示出很大的不确定性。这表明，当同时具备体内和体外实验时，首先进行体内实验是更为优选的。因此，更倾向使用多个标志物代替单一标志物染色，以全面分析结果并获取更全面的信息。

最后，我们基于SWIR荧光成像中的损伤后时间和相对灌注率，应用回归方程计算了坏死面积比。由于这项研究中，我们通过暴露皮肤来观察骨骼肌，因此很难直接评估术后坏死面积比，因为骨骼肌被皮肤覆盖。然而，在临床实践中，侵入性暴露无法被用来直接评估骨骼肌损伤，因此通常需要使用磁共振成像（MRI）和计算机断层扫描（CT）等成像方法来评估[37‒38]。与后两种方法相比，SWIR荧光成像通过间接评估骨骼肌质量的血管情况，可以避免价格昂贵、辐射、长时间预约和成像等问题，并有助于医生在诊室中实现实时、快速和低成本的诊断。根据该方程，可以利用损伤后时间和测得的相对灌注率计算坏死面积比，以确定骨骼肌的修复情况。总之，这项研究不仅证明了M2Mø植入治疗骨骼肌损伤的有效性，还利用SWIR荧光成像评估骨骼肌血管情况，有助于评估骨骼肌再生质量。这为治疗和评估骨骼肌再生的新方法铺平了道路。

5 结论

在损伤后第3天植入的M2Mø在损伤区域聚集达14天。这些植入的细胞促进血管生成并加速再生过程，改善骨骼肌再生的程度。损伤后时间、相对血液灌注和IHC上VWF阳性H-score是骨骼肌再生的重要预测指标。该研究提供了一种新的方法，用于体内监测和评估植入的M2Mø，以改善骨骼肌再生。这将为未来M2Mø在骨骼肌疾病治疗中的研究和应用铺平道路，并且通过设备和探针的进一步优化，可以进一步扩展生物医学应用的范围。

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