仿生巨噬细胞Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>@PLGA颗粒触发智能催化技术杀灭多重耐药大肠杆菌

工程（英文） ›› 2024, Vol. 34 ›› Issue (3) : 182 -196. DOI: 10.1016/j.eng.2023.05.022

研究论文

仿生巨噬细胞Fe₃O₄@PLGA颗粒触发智能催化技术杀灭多重耐药大肠杆菌

Fu Jieni ^a^,^b ,
Liu Xiangmei ^c ,
Li Zhaoyang ^a ,
Yufeng Zheng ^b ,
Yu Zhang ^d ,
Hui Jiang ^a ,
Yanqin Liang ^a

作者信息 +

Biomimetic Macrophage-Fe₃O₄@PLGA Particle-Triggered Intelligent Catalysis for Killing Multidrug-Resistant Escherichia coli

Jieni Fu ^a^,^b ,
Xiangmei Liu ^c ,
Zhaoyang Li ^a ,
Yufeng Zheng ^b ,
Yu Zhang ^d ,
Hui Jiang ^a ,
Yanqin Liang ^a ,
Shengli Zhu ^a ,
Zhenduo Cui ^a ,
Shuilin Wu ^a^,^b^,^* ,

Author information +

文章历史 +

Received	Accepted	Published
2022-09-30	2023-05-24
Issue Date
2024-06-12

PDF (19779K)

摘要

由于缺乏安全的抗生素以及抗感染治疗下的高死亡率，多重耐药（MRD）革兰氏阴性菌[如MRD大肠杆菌（E. coli）]的感染仍然是一个挑战。本研究提出了一种生物仿生智能催化的形式，灵感来自巨噬细胞的选择性生物催化特性，由一个智能控制中心（一种活的巨噬细胞，MΦ）和一种芬顿反应催化剂[Fe₃O₄@聚（乳酸-共聚乙醇酸）（PLGA）纳米颗粒]组成，可以在不伤害正常细胞的情况下杀灭MDR大肠杆菌。MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒（即智能催化颗粒）通过产生H₂O₂和脂滴（LD）对MDR大肠杆菌表现出选择性生物催化活性。根据RNA测序数据分析结果，此过程激活了脂质代谢和多糖生物合成及代谢途径。H₂O₂进一步与Fe₃O₄@PLGA反应生成剧毒的羟基自由基（·OH），而LD含有抗菌肽，可以把MDR大肠杆菌作为目标。高毒性的·OH和抗菌肽被证明可以有效对抗MDR大肠杆菌，使得MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒对MDR大肠杆菌的体外抗菌效率达到了99.29% ± 0.31%。更重要的是，在经过多次使用后，MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒的智能催化功能保持良好。因此，生物仿生智能催化剂的概念在治疗感染以外的其他疾病方面也具有潜力。

Abstract

Infections with multidrug-resistant (MDR) Gram-negative bacteria, such as MDR Escherichia coli (E. coli), remain a challenge due to the lack of safe antibiotics and high fatality rates under anti-infection therapies. This work presents a form of biomimetic intelligent catalysis inspired by the selective biocatalytic property of macrophages (MΦs), consisting of an intelligent controlling center (a living MΦ) and a Fenton reaction catalyst (Fe₃O₄@poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles) for killing MDR E. coli without harming normal cells. The MΦ-Fe₃O₄@PLGA particles (i.e., the intelligent catalysis particles) exhibit selective biocatalysis activity toward MDR E. coli by producing H₂O₂ and lipid droplets (LDs). This process activates the lipid metabolism and glycan biosynthesis and metabolism pathways based on the result of RNA sequencing data analysis. The H₂O₂ further reacts with Fe₃O₄@PLGA to form highly toxic hydroxyl radicals (·OH), while the LDs contain antimicrobial peptides and can target MDR E. coli. The highly toxic ·OH and antimicrobial peptides are shown to combat with MDR E. coli, such that the antibacterial efficiency of the MΦ-Fe₃O₄@PLGA particles against MDR E. coli is 99.29% ± 0.31% in vitro. More importantly, after several passages, the intelligent catalysis function of the MΦ-Fe₃O₄@PLGA particles is well maintained. Hence, the concept of biomimetic intelligent catalysts displays potential for treating diseases other than infections.

关键词

多重耐药大肠杆菌 / 巨噬细胞——Fe₃O₄@PLGA颗粒 / 仿生智能催化

Key words

Multidrug-resistant Escherichia coli / Macrophage-Fe₃O₄@PLGA particles / Biomimetic intelligent catalysis

引用本文

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Fu Jieni,Liu Xiangmei,Li Zhaoyang,Yufeng Zheng,Yu Zhang,Hui Jiang,Yanqin Liang. 仿生巨噬细胞Fe₃O₄@PLGA颗粒触发智能催化技术杀灭多重耐药大肠杆菌[J]. 工程（英文）, 2024, 34(3): 182-196 DOI:10.1016/j.eng.2023.05.022

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1 引言

多重耐药（MDR）大肠杆菌（E. coli）感染对全球公共健康构成了相当大的威胁，对患者的健康造成了严重影响[1]。由于细菌具有两层膜（内膜和外膜）[2‒3]且细菌产生β-内酰胺酶[4]，MDR革兰氏阴性菌感染有可能使当前的抗生素治疗失效。不幸的是，新抗生素的发现周期长达6~10年，而细菌在实验室条件下，可以在不到两周的时间内进化到对抗生素浓度比它们野生型祖先高1000倍的耐药性[5‒6]。更重要的是，最近的研究报告显示，MDR大肠杆菌对最后的抗菌黏菌素也表现出耐药性[7‒9]。到2050年，每年将有1000万人因缺乏有效抗生素而死亡[10]。因此，开发一种有效且安全的治疗MDR大肠杆菌的替代策略迫在眉睫。

为了解决这一问题，研究人员已经尝试了很多策略，如光激发量子点[11]、基于益生菌的纳米颗粒（NP）[12]和微波响应的藤黄属纳米颗粒[13]。这些抗菌策略主要与热量、活性氧（ROS）或抗菌肽的生成有关。但是，这些策略在临床应用之前还有很长的路要走。一个理想的策略是利用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的材料，选择性地杀灭病原体，同时不损伤正常细胞。作为重要的先天免疫细胞之一，巨噬细胞（MΦ）通过生物催化过程产生的ROS在防止微生物入侵方面发挥着至关重要的作用[14‒16]。重要的是，由于细胞膜上的受体，MΦ只能清除病原体或凋亡细胞，不攻击正常细胞。考虑到它们对正常细胞和病原体的选择性，MΦ具有安全治疗MDR大肠杆菌感染的潜力。但是，它们的生理H₂O₂浓度（50~100 μmol∙L^-1）对抗菌活性来说太低了。幸运的是，由于它们的可塑表型，MΦ可通过外部刺激进行程序化[17,18]。病原体和纳米颗粒，如铁氧化物纳米颗粒[19]、硫化铜纳米颗粒[20]以及Fe₃O₄@C/MnO₂-PGEA [PGEA代表乙醇胺功能化聚（甲基丙烯酸）缩水甘油酯的简称[21]]可以刺激MΦ产生H₂O₂。其中，纳米氧化铁和其他铁氧化物纳米颗粒已获得FDA的批准[19]。聚（乳酸-共聚乙醇酸）（PLGA）也已获得FDA的批准[22]。此外，铁氧化物纳米颗粒在体外和在体内均表现出类似酶的双重活性，因为它们可以与H₂O₂在酸性环境中反应，形成剧毒的ROS，即羟基自由基（·OH）[23]。细菌感染的微环境具有较低的pH值（即酸性）[24]。因此，载有巨噬细胞的Fe₃O₄@PLGA（MΦ-Fe₃O₄@PLGA）颗粒表现出智能催化行为，可以通过芬顿反应杀灭病原体，但不会损害正常细胞。

在这里，我们介绍一种智能催化颗粒，其通过集成智能控制中心和芬顿反应催化剂，在不损害正常细胞的情况下，以一种可控的方法杀灭MDR肠杆菌。如图1所示，这个平台利用MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒的优势，在MDR大肠杆菌的刺激下产生H₂O₂和脂滴（LD）。这些过程触发了能量代谢、传染病（细菌性）、多糖生物合成和代谢以及脂类代谢途径。此外，产生的H₂O₂进一步与Fe₃O₄纳米颗粒反应，产生剧毒的·OH。而且，LD含有很多抗病原蛋白，可以靶向杀灭MDR大肠杆菌。体外实验表明，MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒对MDR大肠杆菌的抗菌效率达到了99.29% ± 0.31%。MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒在体内也被激活，并对腹膜炎具有极好的治疗效果。

2 材料与方法

2.1 化学品

六水三氯化铁（FeCl₃）、二甲基亚砜（DMSO）、无水乙醇（CH₃CH₂OH）、乙二醇[(CH₂OH)₂]和乙酸钠（CH₃COONa）均从中国国药集团化学试剂有限公司获得。柠檬酸钠（C₆H₅Na₃O₇）、β-甘油磷酸酯、地塞米松、L-抗坏血酸、3-[4,5-二甲基噻唑-2]-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）和聚乳酸甘油醚（PLGA）[乳酸∶甘油醚（50∶50），分子量为30 000~60 000]均从美国的Sigma化学公司获得。胰蛋白酶-EDTA、青霉素和链霉素、荧光素-5-异硫氰酸酯（FITC）共轭鬼笔环肽（肌动蛋白）、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）均从中国翌圣生物科技有限公司获得。胎牛血清（FBS）从美国Gibco公司获得。碱性磷酸酶（AKP）检测试剂盒（微孔板检测试剂盒）从南京建成生物工程研究所购得。BCA蛋白检测试剂盒从中国索莱宝科技有限公司购得。2′,7′-二氯荧光乙酰乙酸盐（DCFH-DA）从中国碧云天生物技术研究所购得。PrimeScript RT Master Mix 和2 × SYBR Premix Ex Taq II从中国宝日医生物技术有限公司获得。

2.2 细胞和细菌

原始264.7、L929、NIH3T3、A549、MC3T3-E1和骨髓间充质干细胞（BMSC，两次传代）均从南开大学获得，并在生长培养基中培养。L929、NIH3T3、A549、MC3T3-E1和BMSC均在含有89% (V/V)基础培养基、10% (V/V) FBS（OriCell）以及1% (V/V)青霉素-链霉素（10 000 U·mL^‒1, Gibco）的培养基中培养。对于L929和NIH3T3细胞，基础培养基为Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM, Biosharp，中国）。对于A549细胞和BMSC，基础培养基分别为DMEM/营养混合物F-12和α-最低必需培养基（α-MEM）。MC3T3-E1也使用α-MEM作为基础培养基。原始264.7细胞、巨噬细胞或MΦ的生长培养基为90% (V/V) DMEM和10% (V/V) FBS。

MDR大肠杆菌[中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），10663]在37 ℃的Luria-Bertani (LB)肉汤中培养。MDR大肠杆菌对以下抗生素具有抗药性：庆大霉素β-内酰胺类抗生素、头孢曲松类抗生素、磺胺异𫫇唑类抗生素、甲氧苄氨嘧啶类抗生素、四环素类抗生素和阿莫西林类抗生素。

2.3 Fe₃O₄纳米颗粒的合成

首先，将1.62 g FeCl₃和7.2 g无水乙酸钠（CH₃COONa）溶解在100 mL (CH₂OH)₂中，并进行磁力搅拌3 h。接下来，将溶液密封在Teflon衬里的不锈钢容器中，置于200 ℃条件下8 h，得到固体颗粒。在此之后，用CH₃CH₂OH将黑色固体颗粒洗涤三次（7000 r∙min^-1, 3 min），然后在60 ℃的真空中干燥24 h。这些颗粒在本文中被称为Fe₃O₄纳米颗粒。

2.4 Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒的合成

Fe₃O₄/PLGA纳米颗粒的合成包括以下几个步骤。首先，将PLGA溶解在DMSO中，制备成1% (w/V)的PLGA溶液。其次，在超声辅助下，将PLGA溶液与Fe₃O₄溶液（在去离子水中浓度为0.5 mg∙mL^‒1）按体积比1∶100混合，并在以7000 r∙min^-1的转速离心5 min后用CH₃CH₂OH清洗。最终得到的样本在本文中称为Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒。

2.5 MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒的合成

为制备MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒，首先将2 mg的Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒与1 mL的原始264.7细胞（MΦ，DMEM培养基浓度为1 × 10⁶个细胞·mL^-1）在4 ℃条件下共培养1 h，使MΦ摄取Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒，形成MΦ-Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒。最后，将MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒用DMEM洗涤三次。

2.6 FITC-Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒的合成

通过改进的方法合成FITC-Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒。首先，将1 mL的FITC (0.1 μmol∙L^-1)溶解在甲醇中，然后将10 mg的Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒分散在4 mL的甲醇中。接着，通过超声波将这些溶液充分混合。接下来，将混合物逐滴加入到纯1-十四醇中。在90 ℃条件下搅拌2 h后，甲醇蒸发。接下来，将混合物以10 000 r∙min^-1的转速离心3 min，并用超纯水洗涤三次，获得FITC-Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒。

2.7 Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒的表征

使用Cu Kα辐射的X射线衍射仪（XRD; D8 Advanced, Bruker, Germany）测定Fe₃O₄纳米颗粒和Fe₃O₄/PLGA纳米颗粒的晶体结构。使用傅里叶转换红外光谱（FTIR; Nicolet IS 10, Thermo Fisher Scientific, USA）分析不同涂层的成分。使用扫描电子显微镜（SEM; S4800 Hitachi High-Technologies Corporation, Japan）表征不同样本的形貌。使用透射电子显微镜（TEM；FEI-Tecnai G2 Spirit TWIN and FEI-Talos F200X, FEI, USA）获取样本的图像。

2.8 ROS检测

2.8.1 细胞产生ROS

收集不同组的培养基（单独的MΦ、与MDR大肠杆菌共培养的MΦ、MΦ‒Fe₃O₄@PLGA粒子以及与MDR大肠杆菌共培养的MΦ‒Fe₃O₄@PLGA粒子）用于ROS检测。在37 ℃条件下，通过3′-（对羟基苯基）荧光素（HPF; 10 mmol∙L^-1）对羟基自由基表征30 min。最终，使用515 nm的发射波长（激发波长：490 nm）获得光密度。使用一种过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒（可见光，南京健成生物工程研究所）测量H₂O₂。

2.8.2 细胞内ROS检测

使用细胞可渗过性荧光探针DCFH-DA (10  μmol∙L^-1)来测定细胞内ROS的含量。在DCFH-DA扩散进入细胞之后，细胞酯酶将DCFH-DA去乙酰化为非荧光的DCFH。然后，在ROS存在的条件下，DCFH被氧化生成荧光素2′,7′-二氯荧光素。首先，将细菌溶液[10⁶个菌落形成单位（CFU）∙mL^‒1]加入到MΦ-Fe₃O₄@PLGA组中，并在37 ℃下培养4 h。接下来，将DCFH-DA加入到不同样本（MΦ、MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒以及经大肠杆菌处理的MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒）中，并在37 ℃下培养30 min。最后，使用倒置荧光显微镜（IFM; Olympus, IX73, Olympus, Japan）获得图像。

2.9 线粒体膜电位和5′-三磷酸腺苷（ATP）检测

使用一种线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1；南京森贝伽生物科技有限公司）来测定MΦ的线粒体膜电位。ATP活性数据则使用ATP检测试剂盒（Beyotime）获取。

2.10 体外抗菌检测

用DMEM（pH = 6.0）将每个孔中的细菌细胞稀释至2 × 10⁶ mL^‒1。与不同样本共培养4 h后，取20 μL液体涂布在琼脂板上。接下来，使用玻璃涂布器将稀释液涂布在琼脂表面。最后，计算CFU的数量，单位为CFU∙mL^‒1。

为了测定Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒的抗菌浓度，分别将不同浓度的Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒（1 mg·mL^‒1、2 mg·mL^‒1、4 mg·mL^‒1和8 mg·mL^‒1）与2 × 10⁶ CFU∙mL^‒1的细菌培养4 h。最后，通过涂布平板法评估细菌的数量。

2.11 体外生物学性能评估

对于transwell实验，采用70 μm微孔膜的双室transwell系统对MC3T3-E1细胞和不同组（对照组，Fe₃O₄/PLGA纳米颗粒组、MΦ和MΦ-Fe₃O₄@PLGA组）进行共培养。共培养16 h后，对这些细胞进行MTT分析；详细步骤请参考我们之前的工作[25]。

为了测定LD对各种正常细胞（Raw 264.7、L929、NIH3T3、A549和BMSC）的毒性，使用脂多糖类（LPS; 500 ng∙mL^‒1）处理了这些细胞。共培养16 h后，对这些细胞进行MTT分析；详细步骤请参考我们之前的工作[25]。

为了评估Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒浓度对细胞活力的影响，分别将不同浓度的Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒（1 mg·mL^‒1、2 mg·mL^‒1、4 mg·mL^‒1、8 mg·mL^‒1、16 mg·mL^‒1和32 mg∙mL^‒1）与每孔10⁴个细胞共培养24 h。最后，通过MTT检测法分析细胞活力。

2.12 体外细胞荧光检测

为了细胞活/死染色，将200 mL的溶液（2 mg·mL^‒1的Fe₃O₄纳米颗粒或2 mg·mL^‒1的Fe₃O₄/PLGA纳米颗粒分别与10⁶ mL^‒1的细胞混合）在4 ℃下共培养1 h。接下来，移除培养基，加入200 mL含有荧光染料[1 μmol∙L^-1的钙黄绿素（Ca-AM）和10 μg·mL^‒1的碘化丙啶（PI）]的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。然后，在培养30 min后，用PBS洗涤MΦ三次。最后，使用荧光显微镜（IFM）获取图像。

为了测定Fe₃O₄/PLGA纳米颗粒在MΦ-Fe₃O₄@PLGA中的分布，以2000 r∙min^-1的转速离心3 min收集原始264.7（10⁶个细胞）。然后，将获得的原始264.7与2 mg的FITC-Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒在4 ℃下共培养1 h。接下来，将混合物以2000 r∙min^-1的转速离心3 min，然后用DMEM洗涤三次。然后，将MΦ-FITC-Fe₃O₄@PLGA固定在4%甲醛溶液中。在用PBS溶液洗涤三次之后，用四甲基罗丹明（TRITC）共轭鬼笔环肽对肌动蛋白进行染色。最后，通过激光扫描共聚焦显微镜（Nikon A1R+, Nikon, Japan）获取图像。

对于溶酶体染色，以2000 r∙min^-1的转速离心3 min来收集原始264.7（10⁶个细胞）。然后，将原始264.7与2 mg的FITC-Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒在4 ℃下共培养1 h。接下来，使用LysoTracker Red培养溶酶体20 min。然后，移除培养基，并加入新鲜的生长培养基。最后，通过激光扫描共聚焦显微镜获取图像。

2.13 RNA-序列分析

使用TRIzol试剂（Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc., USA）提取总RNA。使用Nanodrop 2000和琼脂糖凝胶电泳测定RNA的浓度和纯度，并评估RNA的完整性。在Majorbio Cloud平台上进行数据分析。

2.14 多种分析

使用RSEM（版本1.3.1）评估这些样本之间的关系。采用假发现率方法校正P值。使用DESeq2、DEGseq和edgeR获得基因差异表达分析，进一步应用于基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。GO和KEGG通路分析采用Fisher精确检验和χ ²检验进行处理。

2.15 体内抗菌检测

采用腹膜炎模型，使用BALb/c小鼠进行体内抗菌实验。动物试验遵循美国国立卫生研究院《实验动物管理与使用指南》。中国医学科学院放射医学研究所实验动物伦理委员会（AEWC）批准了实验的伦理部分。共计48只体重约20 g的雄性BALb/c小鼠被分成四组。DMEM、MΦ、Fe₃O₄@PLGA和MΦ-Fe₃O₄@PLGA组分别注射了100 μL含10⁸ CFU大肠杆菌的DMEM溶液、100 μL含2 × 10⁶个MΦ细胞和10⁸ CFU大肠杆菌的DMEM溶液、100 μL含2 mg Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒和10⁸ CFU大肠杆菌的DMEM溶液或100 μL含100 μL MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒（2 × 10⁶个细胞——2 mg Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒）和10⁸ CFU大肠杆菌的DMEM溶液。最后，在适当的时间进行了组织病理学检查和血液常规检查。

2.16 体内流式细胞术

腹腔灌洗液用冷PBS溶液收集。使用70 μm的尼龙过滤器制备单细胞悬浮液。然后，使用在含有Zombie-Aqua可固定活力染料的PBS中以1∶10的比例稀释的Fc受体结合抑制剂，与细胞在冰上共培养15 min，来排除死细胞。然后，根据制造商的说明，使用荧光标记的初级单克隆抗体稀释物对细胞进行培养。使用的抗体如下：PerCP/Cyanine5.5抗小鼠CD11c和PE抗小鼠CD206抗体。数据通过Agilent流式细胞仪（NovoCyte 2000, ACEA Biosciences Inc., USA）获取。

2.17 统计分析

数据以均值±标准偏差（SD）表示。在统计分析中使用了配对或非配对t-检验、单因素方差分析（ANOVA）和双因素方差分析。P < 0.05视为有统计学意义。

3 结果与讨论

3.1 MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒的表征及其对细菌和细胞的智能识别

MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒的设计依赖于MΦ对Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒的吞噬作用。其制备过程如图2（a）所示。首先，使用0.01% (w/V)的PLGA溶液对Fe₃O₄纳米颗粒进行改性，形成Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒。接下来，使用胰蛋白酶收集MΦ，并将其与Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒在4 ℃的DMEM培养基中共培养1 h。随后，使用DMEM洗涤上述颗粒三次，以去除未结合的细胞。从而形成了MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒。使用SEM表征Fe₃O₄纳米颗粒和Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒的形态（附录A中的图S1和图S2）。Fe₃O₄纳米颗粒呈球形，直径约为(318.00 ± 100.66) nm（图S1）。对于Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒，PLGA并没有改变Fe₃O₄纳米颗粒的形态（图S2，左图）。元素映射图像显示，碳元素均匀分布在Fe₃O₄纳米颗粒上，进一步证明了PLGA被包覆在Fe₃O₄纳米颗粒表面上（图S2，右图）。通过XRD图可以确定Fe₃O₄和Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒的晶体结构[图2（b）]。（220）、（311）、（400）、（422）、（511）、（440）和（533）处的各峰为Fe₃O₄纳米颗粒的特征衍射峰[16, 26]。进一步使用FTIR表征PLGA，发现2966 cm^‒1、2937 cm^‒1、1748 cm^‒1和1078 cm^‒1处的强吸收峰分别归因于CH₂的C‒H拉伸、‒C‒H‒的C‒H拉伸、C=O的拉伸振动以及C‒O拉伸[图2（c）]。这些峰是PLGA分子的特征峰[27]。结果表明，成功形成了Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒。接下来，按照图2（a）所示的方法形成了MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒。图2（d）显示了MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒的图像，其中MΦ和Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒分别为蓝色和桃红色。图2（d）（左图）显示一些Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒结合在MΦ表面。附录A中的图S3也证明了类似的现象。图2（d）（右图）进一步证明，在MΦ表面上，Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒的形态没有发生改变。另外使用TEM图像评估了MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒中Fe₃O₄@PLGA的分布情况；图像显示，Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒（用蓝色箭头标记）在细胞外和细胞内均与MΦ有关[图2（e），左图]。高分辨透射电子显微镜（HRTEM）图像[图2（e），右图]显示，相邻晶格间隙约为0.48 nm，对应于具有立方反尖晶石结构的Fe₃O₄纳米颗粒的[111]平面[28]。

测量了不同样本的ζ电位，发现MΦ、Fe₃O₄纳米颗粒、Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒和MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒的ζ电位分别为-24.93 mV、-3.37 mV、-0.31 mV和-10.43 mV [图2（f）]。细胞膜由于磷脂双层结构而带有负电荷。带负电荷的超顺磁性颗粒已被证明对细胞膜具有高但非特异性的亲和力[29]。一些Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒分布在细胞膜表面，并且ζ电位从-24.93 mV增加到-10.43 mV。这些结果表明，Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒成功地与MΦ连接在一起。

Ca-AM（绿色）和PI（红色）被用来对活细胞和死细胞进行染色。如图2（g）所示，将Fe₃O₄纳米颗粒与MΦ在4 ℃条件下共培养1 h后，细胞呈红色。相比之下，与Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒共培养后，细胞呈绿色。这些结果表明，在MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒的合成过程中，PLGA对MΦ具有显著的保护作用。在以前，已经证明Fe₃O₄纳米颗粒可以增加MΦ的炎症反应[30]。此外，未包覆的超顺磁性氧化铁纳米颗粒被发现具有明显的细胞毒性[31,32]。PLGA引起免疫反应的可能性较低，并且对细胞没有毒性[30,31]。Fe₃O₄纳米颗粒被PLGA包覆后，其毒性降低，对细胞功能和活力影响很小或几乎没有影响[33]。需要注意的是，低温实验环境可能上调促炎基因的表达[34]，并限制MΦ的吞噬行为。

三磷酸腺苷（ATP）通常被认为是细胞的“能量货币”[35]。通过MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒中的MΦ产生的ATP显然比MΦ单独产生的更多[图2（h）]。当MΦ被激活为M1型MΦ时，它们的代谢从氧化磷酸化转变为有氧糖酵解——这种变化与ROS的生成有关[36,37]。增强的有氧糖酵解可以从葡萄糖中快速提供ATP，从而增强ATP活性。结果表明，合成过程并没有损害MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒的活力和功能，并且Fe₃O₄@PLGA具有诱导MΦ转化为M1表型的潜力。

对MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒对正常细胞的细胞毒性做了进一步评估，如图2（i）所示，选择MC3T3-E1作为模型细胞。与使用DMEM培养的MC3T3-E1的细胞活力相比，MΦ-Fe₃O₄@PLGA和Fe₃O₄@PLGA组培养的MC3T3-E1显示出略高的细胞活力。这些结果表明，Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒和MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒与MC3T3-E1具有极好的生物相容性。为进一步研究MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒对MDR大肠杆菌活力的影响，评估了不同样本（DMEM、MΦ、Fe₃O₄@PLGA和MΦ-Fe₃O₄@PLGA）的抗菌活性[图2（j）和（k）]。通过MTT和抗菌检测，发现浓度为4 mg∙mL^‒1的Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒对细菌具有致命作用，而不会损害MΦ（附录A中的图S4和图S5）。与用DMEM处理的MDR大肠杆菌的CFU相比，MΦ、Fe₃O₄@PLGA和MΦ-Fe₃O₄@PLGA中MDR大肠杆菌的CFU分别减少了1.37-log、0.75-log和2.33-log。研究发现，MΦ、Fe₃O₄@PLGA和MΦ-Fe₃O₄@PLGA对MDR大肠杆菌的抗菌效率分别为95.74% ± 0.44%、82.22% ± 0.95%和99.29% ± 0.31% [图2（j）和（k）]。这些结果表明，MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒能够选择性地杀灭MDR大肠杆菌，而不损害正常细胞。

3.2 MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒智能催化性能的体外表征

如前面章节关于MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒的智能杀伤行为部分所述，选择MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒进行体外研究。接下来，我们进一步分析了MDR大肠杆菌对MΦ-Fe₃O₄@PLGA或MΦ中MΦ命运的影响。通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）表征了MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒中MΦ的极化表型[图3（a）]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素（IL）-10分别被选择作为经典的M1标志物[38]和M2标志物[39]。如图3（a）所示，与单独的MΦ相比，MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒中的MΦ表达了相似的IL-10和TNF-α细胞因子，表明Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒未引起MΦ极化。在用大肠杆菌处理的MΦ中，TNF-α的产生增加，但IL-10的产生并不显著，这表明大肠杆菌能促使MΦ进入M1表型。意外的是，在将大肠杆菌与MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒共培养后，TNF-α的浓度甚至更高。这一结果表明，大肠杆菌促进了M1型MΦ的极化。进一步进行了荧光激活细胞分选（FACS），分析了MDR大肠杆菌对MΦ-Fe₃O₄@PLGA极化表型的影响[图3（b）和（c）]。与未处理的MΦ相比，MΦ-Fe₃O₄@PLGA和经大肠杆菌处理的MΦ-Fe₃O₄@PLGA分别有2.63%和3.55%的MΦ对M1标志物（CD11c）作出反应，分别有1.31%和0.60%的MΦ对M2标志物（CD206）作出反应[38]。MΦ-Fe₃O₄@PLGA和经大肠杆菌处理的MΦ-Fe₃O₄@PLGA培养组中M1和M2之间的比例分别为2.01和5.92，这表明大肠杆菌进一步诱导了MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒中的M1型MΦ极化。这些结果表明，MΦ-Fe₃O₄@PLGA在经过MDR大肠杆菌处理后能够极化成M1型MΦ。

众所周知，M1型MΦ会释放H₂O₂[40]。H₂O₂是芬顿反应的重要组成部分，在铁存在下能产生剧毒的羟基自由基[19]。为进一步评估芬顿反应发生的可能性，外部供应了H₂O₂，以评估Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒是否能与H₂O₂反应产生羟基自由基。使用HPF检测试剂盒来检测羟基自由基。如图3（d）所示，产生的羟基自由基与所供应H₂O₂的浓度（0、2 mmol∙L^-1、8 mmol∙L^-1、32 mmol∙L^-1、128 mmol∙L^-1）正相关。因此，Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒与供应的H₂O₂反应生成了羟基自由基。此外，与单独的MΦ（51.74 mmol∙L^-1 H₂O₂; P < 0.0001）[图3（e）]相比，MDR大肠杆菌与MΦ-Fe₃O₄@PLGA的共培养产生了138.39 mmol∙L^-1的H₂O₂，与MΦ相比，羟基自由基增加了4.80倍（P < 0.0001）[图3（f）]。

接下来，我们研究了MDR大肠杆菌共培养是否能增强可溶性铁物种的细胞内积累。通过电感耦合等离子体（ICP）检测了不同样本细胞内可溶性铁的积累情况，如图3（g）所示。与MΦ组相比，Fe₃O₄@PLGA颗粒中细胞内可溶性铁的水平显著更高，这主要是由于Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒的存在。此外，加入MDR大肠杆菌进一步增加了铁的浓度。这一现象表明，MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒对MDR大肠杆菌作出反应时产生了可溶性铁。采用TEM图像展示了不同样本（MΦ、MΦ-Fe₃O₄@PLGA和经大肠杆菌处理的MΦ-Fe₃O₄@PLGA）中LD的存在[附录A中的图S6；图3（h）和（i）]。与MΦ相比，MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒中不存在LD。在与MDR大肠杆菌共培养后，细胞中出现了一些LD（红色箭头）和MDR大肠杆菌（绿色箭头）。一些LD位于MDR大肠杆菌周围（绿色箭头），表明LD可以靶向结合MDR大肠杆菌。LD是真核细胞的主要脂质存储细胞器；它们含有参与抗菌过程的抗菌蛋白[41]。众所周知，LD具有蛋白介导的抗菌能力，并且感染可以增加LD的生成。这一结果表明，经MDR大肠杆菌处理之后，MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒中形成了LD。众所周知，LPS可以诱导细胞中LD的形成[41]。使用LPS处理原始264.7、L929、A549、NIH3T3和BMSC 16 h。如附录A中的图S7所示，LPS对这些细胞没有毒性作用。结果表明LD不会杀死正常细胞。

通过DCFH-DA检测了细胞内ROS的含量[42‒43]。MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒的绿色荧光强度高于MΦ，表明细胞内ROS的含量随着Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒的加入而增加。在加入MDR大肠杆菌后，绿色荧光强度进一步增强，表明MDR大肠杆菌促进了细胞内ROS含量的增加[图3（j）]。相应的定量分析显示了类似的趋势[图3（k）]。这些结果进一步证实，MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒在对MDR大肠杆菌作出反应时产生了更多的ROS。进一步使用活细胞成像表征了ROS的位置。细胞膜、溶酶体、细胞内ROS和细胞核分别用DiR、LysoTracker Red、DCFH-DA探针和Hoechst 33342进行染色。如附录A中的图S8所示，绿色荧光似乎与红色荧光重叠，并且在其他区域也存在，表明除溶酶体外，细胞的其他部分也产生ROS。附录A中的图S9进一步表明，ROS不仅在细胞内产生，也在环境中产生。使用FITC标记Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒，并使用TRITC标记的鬼笔环肽对MΦ的肌动蛋白进行染色。如图3（l）所示，Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒分布在MΦ的细胞膜上和细胞内系统中。进一步进行了溶酶体染色，以评估Fe₃O₄@PLGA是否能够进入溶酶体。如图3（m）所示，一些Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒分布在溶酶体内。这一结果表明，一些Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒被溶酶体吞噬。PLGA带负电荷，带负电荷的纳米颗粒倾向于与核内体和溶酶体共定位[44]。这些结果表明，MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒具有智能催化能力，能够在溶酶体和感染的微环境中激活选择性芬顿反应以应对MDR大肠杆菌。

3.3 MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒智能生物催化行为的机制

为了进一步分析MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒智能催化行为的潜在机制，采用高通量测序技术分析了基因表达谱[25]。进行了RNA序列分析，以研究不同条件下（单独的MΦ、经大肠杆菌处理的MΦ和经大肠杆菌处理的MΦ-Fe₃O₄@PLGA）MΦ的表达差异。共检测到2030个基因：与MΦ相比，在经大肠杆菌处理的MΦ-Fe₃O₄@PLGA中检测到631个基因，与经大肠杆菌处理的MΦ相比，经大肠杆菌处理的MΦ-Fe₃O₄@PLGA中检测到441个基因，与MΦ相比，经大肠杆菌处理的MΦ中检测到52个基因[图4（a）]。主成分分析（PCA）显示了不同样本（MΦ、经大肠杆菌处理的MΦ和经大肠杆菌处理的MΦ-Fe₃O₄@PLGA）之间的距离，表明不同的处理会导致基因表达存在差异[图4（b）]。如图4（c）~（e）所示，火山图显示了不同条件下的基因表达变化情况：与MΦ相比，经大肠杆菌处理的MΦ有273个上调基因和43个下调基因；与MΦ相比，经大肠杆菌处理的MΦ-Fe₃O₄@PLGA有644个上调基因和718个下调基因；与经大肠杆菌处理的MΦ相比，经大肠杆菌处理的MΦ-Fe₃O₄@PLGA有408个上调基因和900个下调基因。这些结果表明，不同的处理会导致基因表达存在显著差异。

进行GO数据库分析，以分析不同基因的表达情况。图4（f）显示了与经大肠杆菌处理的MΦ相比，经大肠杆菌处理的MΦ-Fe₃O₄@PLGA的富集条件，以及与MΦ相比，经大肠杆菌处理的MΦ的富集条件。与MΦ相比，这些基因在经大肠杆菌处理的MΦ上具有丰富的催化活性、刺激反应、生物黏附和免疫系统进程。与经大肠杆菌处理的MΦ相比，这些基因在经大肠杆菌处理的MΦ-Fe₃O₄@PLGA的上具有丰富的催化活性、抗氧化活性、刺激反应、生物黏附和免疫系统进程。根据KEGG通路分析，发现与MΦ相比，经大肠杆菌处理的MΦ中，传染病（细菌性）、免疫系统、脂质代谢以及多糖生物合成和代谢均有上调（附录A的图S10）。与经大肠杆菌处理的MΦ相比，在经大肠杆菌处理的MΦ-Fe₃O₄@PLGA中，传染病（细菌性）、脂质代谢、多糖生物合成与代谢以及能量代谢均有上调（附录A中的图S11）。这些被激活的信号通路和功能导致了M1型MΦ的发展和LD的形成。

从经大肠杆菌处理的MΦ-Fe₃O₄@PLGA、经大肠杆菌处理的MΦ以及MΦ的热图中可以看出，基因趋化因子（C-C基序）配体9（CCL9）[45]、白细胞介素6（IL-6）[46]、补体成分3（C3）[47]、schlafen 4（SLFN4）[48]、含有3的自水解酶域（ABHD3）[49]、含有1的自水解酶域（ABHD1）[50]、分化抗原簇（CD）以及转化生长因子β调节因子4（TBRG4）[51]的表达发生了变化[图4（g）]。IL-6、CCL9、SLFN4和C3基因与MΦ的极化有关。此外，ABHD1、ABHD3和CD的基因与MΦ中LD的形成有关。

线粒体在免疫反应中发挥着重要作用，且在感染的细胞内，LD与线粒体之间的相互作用减少[41]。线粒体膜电位是线粒体活性的一个信号[33]。如附录A中的图S12所示，与MΦ组相比，经大肠杆菌处理的MΦ组中绿/红荧光强度的比值较高，而与经大肠杆菌处理的MΦ相比，经大肠杆菌处理的MΦ-Fe₃O₄@PLGA组的比值较低，表明LD与线粒体之间的相互作用减少，并且更多LD参与了抗菌活性。根据上述结果，通过MΦ-Fe₃O₄@PLGA清除MDR大肠杆菌的完整过程如图4（h）所示。铁氧化物纳米颗粒被MΦ吞噬，然后在溶酶体内降解为铁离子[52]。当MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒与MDR大肠杆菌共培养时，TNF-α、IL-6、CCL9、SLFN4和C3基因的表达上调，而TBRG4基因的表达下调。这些结果表明，MΦ被极化成M1表型。M1型MΦ释放过氧化氢，在铁离子存在下通过芬顿反应产生剧毒的羟基自由基（·OH）[53]。此外，ABHD3、ABHD1和CD基因的表达上调，表明在应对MDR大肠杆菌时，MΦ中形成了LD。

3.4 MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒在体外多次传代后的活力和抗菌能力，以及MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒在体内的生物安全评估

羟基自由基和LD最终导致MDR大肠杆菌死亡。通过Ca-AM/PI染色和抗菌检测进一步评估了MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒的活力和功能[图5（a）和（b）]。MΦ-Fe₃O₄@PLGA组中剩余细胞的数量在经过几次传代后减少[图5（a）]。MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒在第一代和第二代的抗菌效率分别为62.04% ± 3.84%和17.00% ± 5.44% [图5（b）]。这些结果表明，MΦ-Fe₃O₄@PLGA的功能经过几次传代后得以部分保留。

前述的体外研究表明，MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒在病原体和正常细胞之间具有极好的选择性。因此，选择了MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒进行体内研究。进行了荧光成像，以评估MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒是否能在体内保留并在感染部位积累足够的时间[图5（c）~（e）]。该过程使用了MΦ-Fe₃O₄@PLGA-Cyanine-7 (cy7)，并获得了不同时间点的图像来展示这一过程。与预注射组（未经任何处理的小鼠）相比，经MΦ-Fe₃O₄@PLGA-cy7处理的小鼠在0、2 h和6 h显示有显著高的荧光信号。此外，荧光在24 h后消失。这一结果表明，MΦ-Fe₃O₄@PLGA能够在感染部位保持至少6 h。

接下来，进一步使用主要器官（如肝脏、肺、心脏、脾脏和肾脏）的荧光图像来分析MΦ-Fe₃O₄@PLGA的代谢行为。主要器官的荧光图像显示，在6 h一些MΦ-Fe₃O₄@PLGA-cy7颗粒小时分布在肝脏和肾脏中。成像数据表明，MΦ-Fe₃O₄@PLGA可以通过肝脏和肾脏代谢。此外，荧光在18 h后消失，表明MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒已完全代谢。然后，进一步分析了MΦ-Fe₃O₄@PLGA在体内的细胞毒性。评估了每组的肝脏和肾脏功能，以测试体内的生物安全性。未发现各组间存在差异，表明MΦ-Fe₃O₄@PLGA对肝脏和肾脏没有毒性[图5（f）和（g）]。对主要器官进行了苏木精-伊红（H&E）染色，进一步表征MΦ-Fe₃O₄@PLGA对主要器官的毒性。对照组和MΦ-Fe₃O₄@PLGA组显示对主要器官没有明显损伤[图5（h）]。这些结果表明，MΦ-Fe₃O₄@PLGA在体内具有极好的生物安全性。

3.5 MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒对MDR大肠杆菌诱导的腹膜炎的体内智能催化治疗性能

为了进一步评估MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒是否能够在体内治疗腹膜炎，通过向小鼠体内注射MDR大肠杆菌构建了腹膜炎模型[图6（a）]。对照组用DMEM进行处理，而其他组分别用MΦ、Fe₃O₄@PLGA和MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒进行处理。感染1 h后，收集不同组的血液进行血液生化和常规分析。选择白细胞（WBC）、淋巴细胞（Lymph#）、单核细胞（Mon#）和粒细胞（Gran#）作为感染的评估指标。这些是参与抵抗疾病和病害的免疫细胞，因此可以用来评估免疫反应[54‒55]。如图6（b）所示，MΦ-Fe₃O₄@PLGA组中WBC、Lymph#、Mon#和Gran#的值低于对照组、MΦ组和Fe₃O₄@PLGA组。另一方面，与对照组相比，MΦ组和Fe₃O₄@PLGA组的值更高。这些结果表明，MΦ颗粒和Fe₃O₄@PLGA颗粒在体内具有一定的抗菌效果，并且MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒在体内具有较强的抗菌效果。对不同组（即对照组、MΦ组、Fe₃O₄@PLGA组和MΦ-Fe₃O₄@PLGA组）主要器官中的细菌数量进行了表征，如图6（c）所示。与对照组相比，MΦ、Fe₃O₄@PLGA和MΦ-Fe₃O₄@PLGA组的CFU值较低。此外，与MΦ组和Fe₃O₄@PLGA组相比，MΦ-Fe₃O₄@PLGA组的CFU值甚至更低。这些现象表明，MΦ-Fe₃O4@PLGA颗粒具有较强的抗菌能力，并且在体内对主要器官具有一定的保护作用。不同组血液中的细菌值显示了类似的结果（附录A中的图S13）。MΦ在腹腔和血液中的表型通过ELISA进行评估[图6（d）和附录A中的图S14]。与对照组相比，MΦ-Fe₃O₄@PLGA组中IL-10（M2标志物）与TNF-α（M1标志物）之间的比值增加。这一结果表明，MΦ-Fe₃O₄@PLGA组具有抗炎性。FACS显示，对照组、MΦ组、Fe₃O₄@PLGA组和MΦ-Fe₃O₄@PLGA组中M1表型（CD11c⁺CD206^-）和M2表型（CD11c^-CD206⁺）的比值分别为8.28、26.16、50.13和55.06 [图6（e）]。这一结果主要是由MΦ-Fe₃O₄@PLGA组中体内细菌负荷的减少导致的。

收集腹膜组织并切片进行免疫组织化学染色（附录A中的图S15）。对照组、MΦ组、Fe₃O₄@PLGA组和MΦ-Fe₃O₄@PLGA组的免疫组织化学染色显示，MΦ-Fe₃O₄@PLGA组中TNF-α的表达下调，IL-10的表达增加（图S15）。接下来，在第2天对对照组、MΦ组、Fe₃O₄@PLGA组和MΦ-Fe₃O₄@PLGA组的主要器官进行H&E染色[图6（f）]。图中，对照组、MΦ组和Fe₃O₄@PLGA组中的炎症细胞用绿色箭头标记。相比之下，MΦ-Fe₃O₄@PLGA组几乎没有炎症细胞。这些结果表明，MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒对MDR大肠杆菌引起的腹膜炎具有较强的治疗效果。

4 结论

总的来说，本文报道了MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒作为生物仿生智能催化剂的开发。MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒通过生物催化和芬顿催化展示了极好的抗菌能力。在MDR大肠杆菌的刺激下，这些颗粒极化为M1表型。M1型MΦ通过生物催化产生H₂O₂和LD。由于溶酶体和感染微环境中存在H₂O₂，所以发生了选择性的芬顿催化作用。LD靶向大肠杆菌并参与抗菌过程。更重要的是，经过多次传代后，细胞的活力、完整性和功能得以保留。PLGA和Fe₃O₄纳米颗粒已经被美国FDA批准用于人类。总的来说，MΦ-Fe₃O₄@PLGA颗粒可能会成为临床应用中的一种“标签外使用”药物。仿生智能催化充分利用了MΦ和Fe₃O₄@PLGA纳米颗粒的特性来治疗感染，并可扩展到其他细胞和纳米颗粒以治疗疾病。尽管如此，活细胞的培养条件还是限制了其临床应用。

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