双层多糖水凝胶增强益生菌肠道靶向口服给药效果

工程（英文） ›› 2024, Vol. 34 ›› Issue (3) : 197 -204. DOI: 10.1016/j.eng.2023.05.024

研究论文

Huang Wen-Can ^a^,^c^,^d ,
Wenjie Wang ^a^,^c^,^d ,
Wei Wang ^a^,^c^,^d ,
Yanan Hao ^a^,^c^,^d ,
Changhu Xue ^a^,^b

作者信息 +

A Double-Layer Polysaccharide Hydrogel (DPH) for the Enhanced Intestine-Targeted Oral Delivery of Probiotics

Wen-Can Huang ^a^,^c^,^d^,^# ,
Wenjie Wang ^a^,^c^,^d^,^# ,
Wei Wang ^a^,^c^,^d ,
Yanan Hao ^a^,^c^,^d ,
Changhu Xue ^a^,^b^,^* ,
Xiangzhao Mao ^a^,^b^,^c^,^d^,^* ,

Author information +

文章历史 +

Received	Accepted	Published
2023-02-13	2023-05-19
Issue Date
2024-06-12

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摘要

通过肠道移植益生菌，可以正向调节肠道微生物群，从而增强免疫系统和治疗各种疾病。然而，由于恶劣的胃肠道环境以及较短的胃肠道停留时间，益生菌的生物利用度和肠道定植受到极大限制。因此，本研究提出了一种双层多糖水凝胶（DPH）。该物质具有双层结构，内层为羧甲基纤维素（CMCL）超分子，外层为海藻酸二醛（DAA）交联羧甲基壳聚糖（CMCS）。这种双层结构使DPH能够包埋并在体内靶向递送益生菌。在胃中，DPH呈封闭笼状结构，其外层吸收周围液体，形成一道屏障，从而保护益生菌不受胃液影响；在肠道中，该笼状结构打开并分解，释放出益生菌。因此，DPH能够提高益生菌的肠道靶向递送能力、口服生物利用度、胃肠道耐受性和黏附能力。释放前，包埋益生菌在胃肠道中的生物活性几乎保持不变，口服给药效果也有所改善。特别是在动物模型中，DPH包埋益生菌在治疗后48 h内的生物利用度是游离益生菌的100.1倍，同时黏附能力是游离益生菌的10.6倍。此外，DPH包埋益生菌在肠道中的存活和滞留能力极强，在体外和体内都能很好地抵御病原体。值得注意的是，DAA介导的动态交联不仅能保持水凝胶的整体完整性，还能控制益生菌的释放时间。因此，通过控制动态共价交联，DPH有望将包埋物质（益生菌、蛋白质等）递送到肠道特定部位。

Abstract

Transplantation of probiotics to the intestine can positively regulate the gut microbiota, thereby promoting the immune system and treating various diseases. However, the harsh gastrointestinal environment and short retention time in the gastrointestinal tract significantly limit the bioavailability and intestinal colonization of probiotics. Herein, we present a double-layer polysaccharide hydrogel (DPH) in the form of a double-layer structure composed of a carboxymethyl cellulose (CMCL) supramolecular inner layer and a dialdehyde alginate (DAA) cross-linked carboxymethyl chitosan (CMCS) outer layer. This double-layer structure allows DPH to encapsulate and deliver probiotics in a targeted manner within the body. In the stomach, the cage structure of the DPH is closed, and the outer layer absorbs surrounding liquids to form a barrier to protect the probiotics from gastric fluids. In the intestine, the cage structure opens and disintegrates, releasing the probiotics. Thus, DPH endows probiotics with excellent intestine-targeted delivery, improved oral bioavailability, enhanced gastrointestinal tract tolerance, and robust mucoadhesion capacity. The encapsulated probiotics exhibit almost unchanged bioactivity in the gastrointestinal tract before release, as well as improved oral delivery. In particular, probiotics encapsulated by DPH exhibit 100.1 times higher bioavailability and 10.6 times higher mucoadhesion than free probiotics in an animal model 48 h post-treatment. In addition, with a remarkable ability to survive and be retained in the intestine, probiotics encapsulated by DPH show excellent in vitro and in vivo competition with pathogens. Notably, DAA-mediated dynamic crosslinking not only maintains the overall integrity of the hydrogels but also controls the release timing of the probiotics. Thus, it is expected that encapsulated substances (probiotics, proteins, etc.) can be delivered to specific sites of the intestinal tract by means of DPH, by controlling the dynamic covalent crosslinking.

关键词

多糖 / 壳聚糖 / 水凝胶 / 口服 / 肠道靶向

Key words

Polysaccharides / Chitosan / Hydrogels / Oral delivery / Intestine-targeted

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Huang Wen-Can,Wenjie Wang,Wei Wang,Yanan Hao,Changhu Xue. 双层多糖水凝胶增强益生菌肠道靶向口服给药效果[J]. 工程（英文）, 2024, 34(3): 197-204 DOI:10.1016/j.eng.2023.05.024

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1 引言

肠道微生物群在维护健康方面发挥着至关重要的作用[1‒2]。通过竞争营养物质、占据生态结合位点和产生抗菌物质，它们成为抵御病原体的屏障[3‒5]。肠道微生物群紊乱会导致病原体入侵或代谢异常，从而引发多种疾病[6]。补充益生菌是调节肠道微生物群平衡的有效方法[7]。因此，肠道靶向口服益生菌具有极大的医学和学术意义，特别是它为侵入性方法提供了一种无创替代方案[8]。然而，胃肠道中的胃酸、消化酶和肠道胆盐限制了益生菌的生物利用度和肠道定植[9‒11]。因此，研究人员认为包埋是保护益生菌免受胃肠道恶劣环境影响的有效方法[12]。虽然研究人员为提高益生菌的存活率做了很多尝试，但由于益生菌的生物利用度较低，且在肠道中的滞留率较低，益生菌的利用在很大程度上受到了阻碍[10]。因此，当下迫切需要开发一种能够提高益生菌胃肠液耐性、肠道靶向释放能力和黏附特性的新型口服给药系统。

多糖具有理想的成膜特性、生物相容性和可持续性，因此受到广泛关注[13‒14]。然而，使用多糖直接制备的给药系统缺乏交联所需的活性官能团，且在胃内机械消化过程中难以保持其结构完整性。与其他多糖不同，壳聚糖是一种几丁质脱乙酰衍生物，其结构中含有氨基[15‒16]。借助这种独特的化学成分，壳聚糖比其他多糖更容易通过分子修饰实现结构改性和更优秀的机械性能。然而，由于壳聚糖具有抗菌活性[17]，直接使用壳聚糖基材料包埋会导致益生菌死亡。基于这些特性，壳聚糖目前广泛应用于食品工业，但很少应用于益生菌递送领域。因此，突破壳聚糖类益生菌递送系统瓶颈的关键在于如何保留壳聚糖的优点，同时避免壳聚糖对益生菌的抗菌性。

基于上述现状，本研究开发了一种双层多糖水凝胶（DPH），用于益生菌的肠道靶向口服给药。DPH为双层网络结构，超分子外层由羧甲基纤维素（CMCL）分子通过氢键交联形成，内层由羧甲基壳聚糖（CMCS）分子通过海藻酸二醛（DAA）共价交联形成。益生菌包埋在纤维素内层中，与壳聚糖外层分离（图1）。本研究验证了DPH的结构、形态、生物相容性、控释特性、生物利用度、黏附特性和细菌竞争能力。

2 方法

2.1 DAA制备

在1 L水中加入海藻酸（20 g），然后在海藻酸溶液中加入NaIO₄（17 g）。将所得溶液在30 ℃下培养12 h。加入乙二醇，使反应淬灭2 h。

2.2 DPH制备

本研究使用植物乳杆菌作为益生菌模型。将植物乳杆菌与CMCL混合，然后加入到CMCS和DAA的混合物中。

2.3 定性

通过傅里叶变换红外（FI-IR）光谱（Nicolet iS10；Thermo Fisher Scientific，美国）和¹H核磁共振（NMR）光谱（Avance III；布鲁克，美国）证实了CMCS和DAA的分子结构。使用扫描电子显微镜（SEM；Regulus8100；日立，日本）和透射电子显微镜（TEM；HT7700；日立，日本）观察样品的形态。

2.4 实验组

在本研究中，DPH包埋益生菌为DPH组，未包埋益生菌（UEP）为UEP组，用沙门氏菌处理的样品为沙门氏菌组，未处理样品为对照组。

2.5 细胞活性试验

通过细胞计数试剂盒（CCK）-8检测法测定细胞活性。制备样品条件培养基，将1 g样品稀释在10 mL的杜氏改良Eagle培养基中。将20 μL条件培养基与L929成纤维细胞一起接种到96孔板中，在37 ℃下培养24 h。向每个孔中加入CCK-8溶液，在450 nm波长下测量光密度（OD）/吸光度值。通过活/死细胞活性试验进一步检测细胞相容性。使用活/死BacLight细菌活力试剂盒对L929成纤维细胞进行染色，使用共聚焦显微镜（A1R HD25；尼康，日本）进行荧光成像。

2.6 血液学指标评估

使用C57BL/6JNifdc作为血液学试验的动物模型。用含乙二胺四乙酸（EDTA）的试管采集血液，使用血液分析仪评估红细胞（RBC）、白细胞（WBC）和血小板（PLT）计数及血红蛋白（HGB）水平。

2.7 胃肠道益生菌分布

使用体内成像系统（IVIS Lumina XRMS，珀金埃尔默，美国）检测益生菌的胃肠道分布情况。简而言之，用SYTO 64标记的样品喂养模型动物。给药后1、2、4、24和48 h，各组C57BL/6JNifdc分别吸入二氧化碳安乐死，收集胃肠道进行体内成像。

2.8 体外耐药性评估

将样品[每毫升1 × 10⁷菌落形成单位（CFUs∙mL^-1），1 mL]悬浮于10 mL人工胃液（SGF），放置2 h。收集经SGF处理的细菌并将其重新悬浮于10 mL模拟肠道液（SIF），放置2 h。随后，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗益生菌，将其涂在De Man、Rogosa和Sharpe（MRS）琼脂平板上，在37 ℃培养48 h后，计算菌落数。在每个时间点提取细菌悬浮液进行SEM和TEM观察。

2.9 DPH控释特性

在人工胃液和模拟肠道液中测试了DPH对益生菌的控释特性。将样品（1 × 10⁷ CFUs∙mL^-1, 1 mL）在37 ℃的人工胃液（9 mL）中培养2 h，搅拌速度为200 r·min^-1。将样品从人工胃液转移到模拟肠道液。测量益生菌的存活率和释放率。

2.10 流式细胞术

在1 mL的人工胃液（10 g∙L^-1胃蛋白酶，HCl，pH 1.2）和模拟肠道液（10 g∙L^-1胰蛋白酶-KH₂PO₄溶液，NaOH，pH 7.4）中加入SYTO 8和碘化丙啶标记的包埋益生菌，37 ℃培养。在预定的时间点取样并通过流式细胞术进行评估。

2.11 体外黏附试验

将Caco-2细胞接种在12孔板中，在12孔板中加入不同组别的益生菌。在5%二氧化碳环境中于37 ℃下贴附细胞4 h。用PBS冲洗单层细胞，去除未黏附的益生菌。用胰蛋白酶处理Caco-2单层细胞。将所得样品离心，将沉积物重悬于PBS。黏附率计算公式如下：

黏附率= [结合益生菌 /（结合益生菌 + 未结合益生菌）] × 100%

2.12 动物研究

所有动物护理和实验均经中国海洋大学动物实验伦理委员会批准（SPXY2022041803）。

2.13 益生菌黏附特性和口服生物利用度

C57BL/6JNifdc以口腔灌胃的方式喂食益生菌（2 × 10⁷ CFUs）。将喂食未包埋益生菌的动物作为对照。通过吸入二氧化碳对动物实施安乐死，并在第12、48和120 h收集肠道样品。为了评估益生菌的生物利用度和黏附能力，收集了肠组织、肠内容物和粪便。收集的组织经研磨后用生理盐水稀释，而肠内容物和粪便则浸泡在生理盐水中。从组织、肠内容物和粪便中提取悬浮液，涂抹在MRS琼脂平板上进行计数。

新西兰白兔以口腔灌胃的方式给予不同组别的益生菌（1 × 10⁹ CFUs）。将未给予益生菌的兔子作为对照。分别在12、24、48、72、96和120 h收集粪便，以确定细菌在体内的滞留情况。在37 ℃下培养12 h，进行平板计数。在用药两天后收集肠道样品，包括十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠。将收集的组织研磨并用生理盐水稀释，将悬浮液涂抹在MRS琼脂平板上进行计数。对主要器官和肠道进行组织学分析。

2.14 鼠伤寒沙门氏菌定植处理

C57BL/6JNifdc接种1 × 10⁷ CFUs鼠伤寒沙门氏菌。给予不同组别的益生菌（1 × 10⁷ CFUs），共处理7天。游离益生菌作为对照。治疗后第1、3和5天，收集粪便并用生理盐水稀释。将悬浮液涂抹在沙门氏菌显色培养基平板上，在37 ℃培养箱中孵化，进行计数。在第7天处死动物，收集肠道组织用于益生菌计数，并进行苏木精-伊红（H&E）染色、阿尔新蓝-过碘酸-雪夫（AB-PAS）染色、免疫组化分析和细胞因子检测。

3 结果

3.1 DPH制备

CMCS和DAA的制备过程见附录A中图S1。通过FT-IR和¹H NMR光谱确认制备分子的化学结构（附录A中图S2和S3）。

3.2 生物相容性试验

通过活/死细胞活性试验评估细胞活性。如图2（a）所示，在存活率上，原始培养基培养的L929成纤维细胞与暴露于DPH的培养基培养1~3天的细胞没有明显差异。通过CCK-8试验评估样品的细胞相容性。DPH条件溶液没有明显的细胞毒性[图2（b）]。

通过对主要器官和结肠进行组织学分析，测试体内生物相容性[图2（c）]。在H&E染色图像中没有检测到组织学损伤，并且在给药后5天，肠组织没有出现与口服给药相关的形态变化或炎症反应，这表明DPH是一种安全的益生菌口服给药系统。此外，RBC、WBC和PLT计数以及HGB水平等血液学指标均在正常范围内[图2（d）]。这些实验结果表明，DPH具有良好的细胞相容性，不会产生长期不良影响。

3.3 DPH对人工胃肠液的体外耐性

上胃肠道中pH值很低，而且有多种消化酶，因此口服益生菌的最大挑战是确保益生菌在上胃肠道环境中存活[11,18]。为了评估DPH的保护作用，将包埋益生菌浸入人工胃液中，然后连续转移到模拟肠道液中[图3（a）]。在预定的时间点测量培养后的定量存活率。在DPH存在的情况下，益生菌对人工胃液表现出明显的耐性。当暴露时间从1 h延长到4h，益生菌存活率仅下降了14.2%。相比之下，UEP组的益生菌在接触人工胃液仅2 h后就完全死亡，这表明DPH在酸性和酶胃环境中具有显著保护作用。

使用人工胃液和模拟肠道液在体外测试DPH对益生菌的肠道靶向释放和保护作用[图3（b）]。将样品在人工胃液中孵育（2 h），然后转移到模拟肠道液中（4 h），模拟益生菌的释放。在人工胃液中暴露2 h后，没有观察到益生菌释放，所有益生菌都留在DPH中。转移到模拟肠道液后，益生菌开始释放。在转移初期，益生菌释放并不明显；转移3 h后，随着暴露时间的增加，益生菌的释放比例显著增加，6 h后达到90.0%。

为了证实DPH是导致耐受性增强的原因，使用SEM和TEM检查益生菌在人工胃液和模拟肠道液中培养后的形态完整性。如图3（c）和（d）所示，未包埋益生菌的结构完整性遭到破坏，细胞表面变得模糊不清。这是因为胃内pH值和消化酶会迅速增加益生菌细胞壁的渗透性，从而通过扩散作用使益生菌失活。相比之下，DPH能有效阻止人工胃肠液的渗透，保护益生菌不受酸、酶和盐的浸润影响。即使在人工胃液和模拟肠道液中连续培养4 h后，DPH仍保持完好。这些结果表明，DPH是益生菌抵抗环境影响的关键因素。

通过流式细胞术，使用SYTO 8和碘化丙啶双重染色，确定人工胃肠液处理后的细胞状态。如图3（e）所示，在人工胃液和模拟肠道液中连续培养4 h后，几乎所有DPH包埋益生菌均存活，而大多数未包埋益生菌在暴露于人工胃液后都失去了活性。

3.4 体外黏附试验

Caco-2细胞通常用作评估肠道吸收的体外模型[19]。为了评估DPH的肠道滞留率，我们用 Caco-2细胞进行了黏附试验。如附录A中图S4所示，对照组、UEP组和DPH组的Caco-2细胞结合率分别为12.4%、7.1%和11.1%。DPH组的结合能力明显高于UEP组和对照组。

3.5 动物模型中的口服生物利用度和黏附能力

我们评估了小鼠模型的口服生物利用度和肠道定植情况。在预定的时间点对肠道和粪便中的益生菌数量进行计数。如图4（a）所示，DPH组的益生菌数量远远超过对照组和UEP组。具有代表性的是，口腔灌胃12 h后，DPH组在肠道、肠内容物和粪便中的益生菌数量分别是对照组的252.2倍、13 157.9倍和7549.0倍以及UEP组的10.6倍、190.8倍和157.2倍。即使时间增加到48 h，相较于对照组和UEP组，DPH组的益生菌生物利用度和定植数量也有显著提高。灌胃后48 h内，DPH组在肠道、肠内容物和粪便中的益生菌总数分别是对照组的239.5倍、4982.5倍和3817.3倍以及UEP组的10.2倍、147.9倍和124.1倍。这些结果表明，DPH包埋可显著提高益生菌的口服生物利用度和黏附能力。

在兔子模型中进一步评估了增强的生物利用度和黏附特性[图4（b）]。结果发现，DPH组肠道和粪便中的益生菌数量显著高于对照组和UEP组。DPH组的整体益生菌定植数量达到33 641.7 CFUs∙mL^-1，而对照组（175.8 CFUs∙mL^-1）几乎可以忽略不计。为了评估益生菌的存活率，对口腔灌胃后肠内容物和粪便中的益生菌进行了定量分析。DPH组肠内容物和粪便中的益生菌数量分别是对照组的2 707.4倍和3 387.9倍以及UEP组的188.4倍和134.3倍。该模型的实验结果进一步证实，DPH可以改善口服益生菌的生物利用度和黏附特性。

革兰氏染色进一步证实了DPH包埋增强益生菌在肠黏膜中的定植能力[图4（c）和（d）]。相比之下，对照组和UEP组的益生菌定植几乎可以忽略不计。

3.6 DPH对胃肠道环境的体内耐性

为了进一步确定DPH对体内胃肠道环境的耐受性，在给药后4、24和48 h，通过动物成像系统进行肠道转运试验，观察益生菌的滞留情况。如图4（e）所示，游离益生菌在肠道中滞留了4 h，24 h后完全消失。值得注意的是，DPH组在48 h后仍能观察到荧光，这表明DPH包埋益生菌在肠道中的滞留和黏附能力得到了改善。这一结果表明，DPH在胃肠液中较为稳定，可在肠道中滞留较长时间。

3.7 沙门氏菌诱导结肠炎处理

沙门氏菌是一种常见的严重病原体，可在肠道定植，导致许多传染病[20]。益生菌可以通过竞争营养物质、占据生态结合位点和产生抗菌物质来治疗沙门氏菌相关疾病。我们进行了一项体内对照实验，以评估DPH包埋益生菌对沙门氏菌感染动物模型的治疗效果。我们测试了DPH包埋益生菌抑制沙门氏菌生长和治疗沙门氏菌诱导结肠炎的效果[图5（a）]。在预定的时间点对肠道和粪便中排除的沙门氏菌进行计数。正如预期，DPH组对沙门氏菌有很强的抑制能力，DPH处理后沙门氏菌数量显著减少，两天后DPH组肠道中沙门氏菌的减少量是UEP组的22.5倍。此外，DPH组在给药后1天内粪便中的沙门氏菌数量恢复到正常水平。因此，从结肠长度、胸腺指数和脾脏指数[图5（b）]可以看出，DPH的抑制作用减轻了结肠炎相关症状。

此外，我们通过酶联免疫吸附试验（ELISA）评估沙门氏菌引起的炎症。促炎性细胞因子[白细胞介素（IL）1β、IL-6和IL-17]的水平降低（附录A图S5），由此可以看出，相比于UEP组，DPH组的炎症反应显著降低。通过H&E和AB-PAS染色进行组织学评估发现，沙门氏菌组和UEP组均有明显损伤[图5（c）和（d）]。相比之下，DPH包埋益生菌可恢复受损黏膜，并且DPH组未发现明显组织学损伤。此外，免疫组化分析发现，沙门氏菌组和UEP组观察到大量F4/80和CD68（主要巨噬细胞标记物）[图5（e）]，而DPH组的F4/80和CD68显著减少。其中，DPH包埋益生菌在肠道中的充分滞留实现了对沙门氏菌的长期有效抑制。

3.8 短链脂肪酸含量

短链脂肪酸（SCFA）是益生菌发酵产生的重要代谢产物[21]。作为信号分子，短链脂肪酸在新陈代谢调节中发挥着重要作用[22]。为了评估递送益生菌的生物利用度，我们测量了肠道中总短链脂肪酸的浓度，包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸（附录A中图S6）。结果发现，未包埋益生菌和包埋益生菌都能提高短链脂肪酸的浓度；然而，与前者相比，包埋益生菌提高短链脂肪酸浓度的效果更好，这表明DPH能保护益生菌免受胃肠道不利环境的影响，从而提高其生物利用度和活性。

4 讨论

为了发挥益生菌的有益作用，应口服益生菌，通过具有低pH值和多种消化酶的胃肠道上段到达小肠，然后在肠黏膜上定植[11]。因此，益生菌口服给药的最大挑战是确保益生菌在上胃肠道存活以及提高其黏附能力[7]。DPH在胃酸中趋于闭合，这是由于羧甲基基团在酸性pH下发生去质子化，导致聚合物链之间的氢键增加[23‒24]。同时，构成DPH外层的共价交联CMCS会迅速吸收周围液体，在DPH表面形成聚合物，即防水层，进一步阻止胃液在DPH上扩散，保护其中的益生菌。肠道中的弱碱性环境会导致羧甲基基团发生去质子化[23]，从而降低外层CMCS之间的氢键，导致带负电荷的聚合物链之间产生静电排斥[23]。此时，包埋益生菌开始在小肠中释放。随着培养时间的增加，动态亚胺键断裂，导致笼形水凝胶完全破坏，包埋益生菌在大肠中迅速释放[图1（b）]。因此，可以通过控制亚胺键的形成来控制益生菌的释放时间。总之，DPH能保护益生菌在口服给药过程中不受胃液的影响，从而显著提高益生菌的生物利用度。此外，通过控制动态共价交联，包埋在DPH中的物质（包括益生菌、蛋白质等）可以得到保护并递送到特定肠道部位。

细胞表面的大分子介导了益生菌与宿主组织的结合，其中包括黏蛋白结合蛋白和菌毛蛋白等蛋白质，以及肽聚糖、胞外多糖和脂肽聚糖酸等非蛋白质成分[25]。研究证明这些成分与肠道结合有关，可延长转运时间并增强屏障完整性[25]。由于其胃酸敏感性，这些大分子在胃酸中很容易失活。DPH可保护这些与定植相关的大分子不受胃肠液的影响，从而增强益生菌的黏附能力，延长益生菌在肠道中的滞留时间。

5 结论

总之，我们报道了一种用于益生菌肠道靶向口服给药的双层DPH。DPH包埋益生菌在胃肠道极端环境下的存活率显著提高，其活力和活性几乎保持不变。此外，DPH还具有出色的黏附能力，能增强益生菌在肠道内的定植能力。总而言之，我们预计DPH可以很好地替代现有的肠道靶向递送载体。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

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