补虚通瘀颗粒通过激活血管平滑肌细胞可溶性鸟苷酸环化酶抑制异常血管舒缩缓解心肌缺血

工程（英文） ›› 2024, Vol. 38 ›› Issue (7) : 152 -162. DOI: 10.1016/j.eng.2023.06.009

研究论文

杨爽 ^a^,^b ,
赵一秀 ^a^,^b ,
程小玲 ^c ,
詹婷婷 ^a^,^b ,
田佳颖 ^a^,^b ,
刘学 ^a^,^b ,
马春月 ^a^,^b ,
王芷琪 ^a^,^b ,
靳璐滢 ^a^,^b ,
刘茜 ^a^,^b ,
王雁丽 ^c ,
黄健 ^c ,
王金辉 ^c ,
张妍 ^a^,^b ,
杨宝峰 ^a^,^b^,^d

作者信息 +

Buxu Tongyu Granule Alleviates Myocardial Ischemia by Activating Vascular Smooth Muscle Cell Soluble Guanylate Cyclase to Inhibit Abnormal Vasomotion

Shuang Yang ^a^,^b^,^# ,
Yixiu Zhao ^a^,^b^,^# ,
Xiaoling Cheng ^c ,
Tingting Zhan ^a^,^b ,
Jiaying Tian ^a^,^b ,
Xue Liu ^a^,^b ,
Chunyue Ma ^a^,^b ,
Zhiqi Wang ^a^,^b ,
Luying Jin ^a^,^b ,
Qian Liu ^a^,^b ,
Yanli Wang ^c ,
Jian Huang ^c ,
Jinhui Wang ^c ,
Yan Zhang ^a^,^b^,^* ,
Baofeng Yang ^a^,^b^,^d^,^* ,

Author information +

文章历史 +

Received	Accepted	Published
2022-10-24	2023-06-25
Issue Date
2024-06-14

PDF (3664K)

摘要

心肌缺血严重威胁人体健康，其主要病因是血管功能障碍。补虚通瘀颗粒（BXTY）是治疗心肌缺血的有效中药。然而，BXTY发挥抗心肌缺血作用的潜在机制尚不清楚。在这项研究中，我们证明了BXTY通过激活血管平滑肌细胞（VSMCs）中的可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）-3′,5′-环鸟苷单磷酸（cGMP）-蛋白激酶G（PKG）信号通路扩张动脉血管，改善心肌缺血。本研究中，我们使用昆明小鼠连续灌胃BXTY 10 d后，腹腔注射垂体后叶素建立小鼠急性心肌缺血动物模型。结果显示，BXTY能减轻垂体后叶素所致小鼠心肌缺血症状，包括心电图异常和血浆酶的改变。此外，BXTY舒张预收缩的肠系膜上动脉血管，抑制肠系膜上动脉血管收缩，且这两种作用均呈剂量依赖性，但不具内皮依赖性。使用sGC抑制剂NS 2028/ODQ、PKG抑制剂KT 5823处理血管可以抑制BXTY对血管舒缩的影响。此外，在小鼠主动脉血管平滑肌细胞（MOVAs）中，BXTY增加sGC-β₁蛋白表达及细胞内第二信使cGMP水平，NS 2028/ODQ逆转了这些现象。BXTY孵育MOVAs后，cGMP下游效应蛋白PKG-1表达水平升高，然而，NS 2028/ODQ或KT 5823处理细胞能部分逆转BXTY对sGC-β₁、cGMP和PKG-1水平的影响。综上所述，BXTY通过激活VSMCs中sGC-cGMP-PKG通路诱导血管舒张改善小鼠急性心肌缺血症状。

Abstract

Myocardial ischemia is a serious threat to human health, and vascular dysfunction is its main cause. Buxu Tongyu (BXTY) Granule is an effective traditional Chinese medicine (TCM) for treating myocardial ischemia. However, the underlying mechanism of BXTY is still unclear. In this study, we demonstrate that BXTY ameliorates myocardial ischemia by activating the soluble guanylate cyclase (sGC)-3′,5′-cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-protein kinase G (PKG) signaling pathway in vascular smooth muscle cells (VSMCs) to dilate the arteries. BXTY was given by gavage for ten consecutive days before establishing an animal model of acute myocardial ischemia in mice via the intraperitoneal injection of pituitrin. The results showed that BXTY alleviated the symptoms of myocardial ischemia induced by pituitrin in mice, including electrocardiogram abnormalities and changes in plasma enzymes. In addition, BXTY dilated pre-constricted blood vessels and inhibited the vasoconstriction of the superior mesenteric artery in a dose-dependent but endothelial-independent manner. These effects were eliminated by pre-incubating vascular rings with the sGC inhibitors NS 2028 or ODQ, or with the PKG inhibitor KT 5823. Moreover, BXTY increased the protein expression of sGC-β₁ and the intracellular second messenger cGMP level in mouse aortic vascular smooth muscle cells (MOVAs). NS 2028 or ODQ reversed these effects of BXTY. The expression level of the cGMP downstream effector protein PKG-1 increased after treating MOVAs with BXTY. NS 2028, ODQ, or KT 5823 also reversed this effect of BXTY. In conclusion, BXTY can improve the symptoms of acute myocardial ischemia in mice, and activating the sGC-cGMP-PKG pathway in VSMCs to induce vasodilation is its key pharmacodynamic mechanism.

关键词

心肌缺血 / 血管舒缩 / 可溶性鸟苷酸环化酶 / 补虚通瘀颗粒

Key words

Myocardial ischemia / Vasomotion / Soluble guanylate cyclase / Buxu Tongyu Granule

引用本文

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Shuang Yang,Yixiu Zhao,Xiaoling Cheng,Tingting Zhan,Jiaying Tian,Xue Liu,Chunyue Ma,Zhiqi Wang,Luying Jin,Qian Liu,Yanli Wang,Jian Huang,Jinhui Wang,Yan Zhang,Baofeng Yang,杨爽,赵一秀,程小玲,詹婷婷,田佳颖,刘学,马春月,王芷琪,靳璐滢,刘茜,王雁丽,黄健,王金辉,张妍,杨宝峰. 补虚通瘀颗粒通过激活血管平滑肌细胞可溶性鸟苷酸环化酶抑制异常血管舒缩缓解心肌缺血[J]. 工程（英文）, 2024, 38(7): 152-162 DOI:10.1016/j.eng.2023.06.009

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1 背景介绍

心肌缺血的特点是冠状动脉供血不能满足心肌的耗氧量[1]。多种原因造成心肌缺血缺氧，包括冠状动脉痉挛、动脉粥样硬化、心肌细胞肥大和心肌病[2]。缺血性心脏病是全球范围心脏病患者发病和死亡的主要原因之一，根据《2019年全球疾病负担研究》，2019年全球有1.97亿缺血性心脏病患者[3]。因此，心肌缺血严重威胁健康，造成严重的经济负担。

血管舒张和收缩反应是维持心肌血液供应的先决条件。非阻塞性冠状动脉疾病、冠状微血管扩张反应失调、冠状血管舒张性障碍、血管外压缩力和冠状微血管功能障碍等与冠状微血管功能障碍密切相关，是导致慢性和急性心肌缺血症状的重要因素[4‒5]。血管平滑肌细胞（VSMCs）的高反应性是冠状动脉功能障碍的主要原因[6]。然而，心肌缺血的治疗通常针对阻塞性的冠状动脉疾病，而忽视了冠状动脉舒缩障碍和冠状微血管功能障碍的重要性[7]。因此，研发缓解VSMC高反应性的药物刻不容缓。

B补虚通瘀颗粒（BXTY）是一种中药复方制剂，含有红参、黄芪、刺五加、赤芍、丹参、桂枝等，用于治疗冠心病和气虚血瘀所致的动脉粥样硬化，此外，具有益气补虚、活血通络、疏通经络功效。然而，BXTY对心血管保护作用的分子机制尚不清楚。本研究旨在证实BXTY对心肌缺血的保护作用，并阐明其作用机制。

2 材料与方法

2.1 化学品、试剂和样品

BXTY由中国葵花医药集团有限公司提供。标准化合物芍药苷、原儿茶酸、丹酚酸A、丹酚酸B购于中国食品药品检定研究院。色谱级甲醇购自德山药品工业株式会社（韩国）。质谱级甲醇购自赛默飞世尔科技有限公司（中国）。色谱级磷酸由天津市富宇精细化工有限公司（中国）提供。垂体后叶素购于南京新百药业有限公司（中国）。硝酸甘油购自广州白云山明兴药业有限公司（中国）。3′,5′-环鸟苷单磷酸（cGMP）活性测定试剂盒购自Elabscience生物技术有限公司（中国）。可溶性鸟甘酸环化酶（sGC）-β₁和蛋白激酶G（PKG）-1分别购自Sigma-Aldrich（美国）和Cell Signaling Technology（美国）。NS 2028、ODQ和KT 5823购自碧云天生物技术有限公司（中国）。苯肾上腺素（PE）购自上海阿拉丁生化科技有限公司。双辛可宁酸蛋白检测（BCA）试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。Tris缓冲盐水（TBS; NaCl 16.0 g, Tris-HCl 4.841 g，溶解于2000 mL去离子水）购于博斯特生物科技有限公司（中国）。

2.2 对照品及样品制备

2.2.1 对照品溶液

取各对照品精密称量后，以纯甲醇定容，混合后得原儿茶酸22 μg∙mL^-1、芍药苷350 μg∙mL^-1、丹酚酸A 40.5 μg∙mL^-1、丹酚酸B 150 μg∙mL^-1的混合对照品溶液，4 ℃保存，备用。

2.2.2 样品溶液

精确称取5.00 g BXTY放入带塞的50 mL锥形烧瓶中，加入20 mL 70%甲醇。混匀后超声处理15 min，10 000 r∙min^-1离心3 min。取上清，一份用于高效液相色谱-二极管阵列（HPLC-DAD）检测，通过0.22 μm过滤膜后装入自动进样瓶，备用。另一份通过固相萃取（SPE）柱（甲醇5 mL活化SPE柱，水平衡5 mL柱）后，过0.22 μm过滤膜后装入自动进样瓶，用于超高液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS^E）分析。

SD大鼠适应性喂养7 d，禁食12 h后灌胃BXTY，于0、1 h、3 h、5 h从眼静脉丛采血至Eppendorf（EP）管中。每个时间点采血0.6 mL。血样在4 ℃下以3000 r∙min^-1离心10 min，取50 μL上清液。然后，向上清液加入5 μL抗坏血酸溶液和5 μL甲酸，混合均匀后加入300 μL的冰甲醇，涡旋混匀，12 000 r∙min^-1离心5 min。上清液通过0.22 μm过滤膜进入自动进样瓶，备用。

2.3 HPLC-DAD和UPLC-Q-TOF-MS^E分析

采用Waters 2690系列高效液相色谱仪（WatersTM, USA），在190~600 nm范围内进行含量测定。色谱柱为Kromasil C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）。色谱分离时，采用甲醇和0.3%磷酸水溶液进行梯度洗脱。梯度洗脱条件：2%甲醇0~33 min；2%~22%甲醇33~38 min；22%甲醇38~65 min；22%~50%甲醇65~120 min；50%~98%甲醇120~125 min。流速为1 mL∙min^-1，柱温为30 ℃，进样量为5 μL。使用Synapt G2-Si UPLC-Q-TOF-MS^E（Waters）对化学成分进行分析。色谱柱为Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm），进样量3 μL，流速为0.3 mL∙min^-1，柱温为30 ℃。用甲醇和0.1%甲酸水溶液进行梯度洗脱。洗脱条件：2%甲醇0~1.5 min；2%~40%甲醇1.5~11 min；40%~98%甲醇11~13.5 min。UPLC-Q-TOF-MS^E采集采用MS^E模式，以电喷雾电离（ESI）离子源在正离子和负离子模式进行采集。亮氨酸-脑啡肽（正离子m/z：556.2771；负离子m/z：554.2615）作为校正液。正离子和负离子检测模式的质谱条件：毛细管电压2.5 kV；离子源温度100 ℃；脱溶剂温度250 ℃；质量扫描范围m/z 50~1200；碰撞气体为氩气；低能量扫描时trap电压0 eV；高能量扫描时trap电压为40 V；锥孔气流量6.5 L∙h^-1；溶解气流量800 L∙h^-1。MassLynx 4.2软件用于数据采集。利用中国知网（CNKI）、PubMed、Web of Science、ChemSpider等检索数据库对六种中药的化合物进行了分类。使用UniFi软件生成化合物自建库，包括化合物名称、分子式、化学结构等，并对质谱（MS）数据进行处理和分析。自动匹配片段信息，生成了UniFi软件预测的化合物的一些结构片段，并允许对鉴定的化合物误差在10 ppm。我们的研究选择了正加合物包括H⁺、Na⁺和NH₄ ⁺，负加合物包括HCOO^-和H^-，允许交叉加合物组合。

2.4 动物

昆明（KM）小鼠（雄性，20~30 g，SPF级）和Sptague-Dawley（SD）大鼠（雄性，150~200 g，SPF级）购自哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物中心。实验环境为(23 ± 2) ℃，湿度为55% ± 5%，光照/黑暗循环12 h，动物可自由获取食物和水。

2.5 小鼠急性心肌缺血模型

动物实验遵循赫尔辛基动物实验宣言。动物适应性喂养1周后，按体重随机分为7组，分别为对照组、急性心肌缺血模型组、硝酸甘油组和BXTY治疗组（BXTY-0.5 g∙kg^-1∙d^-1、BXTY-2.0 g∙kg^-1∙d^-1、BXTY-8.0 g∙kg^-1∙d^-1、BXTY-16.0 g∙kg^-1∙d^-1）。BXTY组动物分别口服0.5、2.0、8.0、16.0 g∙kg^-1∙d^-1，连续10 d。对照组、模型组和硝酸甘油组给予等量去离子水处理。10 d后，除对照组外，其余各组小鼠均腹腔注射垂体后叶素建立急性心肌缺血模型。硝酸甘油组小鼠在垂体后叶素注射后立即注射硝酸甘油（0.002 mg∙g^-1）。用BL420生物功能实验仪记录心电图（ECGs）10 min。

2.6 血管舒缩反应

血管舒缩反应检测采用Multi Myograph System-DMT 620M（Danish Myo Technology A/S，丹麦）。将SD大鼠肠系膜上动脉置于预冷的充氧生理盐溶液[PSS：130 mmol∙L^-1 NaCl、4.7 mmol∙L^-1 KCl、1.18 mmol∙L^-1 KH₂PH₄、1.17 mmol∙L^-1 MgSO₄·7H₂O、14.9 mmol∙L^-1 NaHCO₃、5.5 mmol∙L^-1葡萄糖、0.026 mmol∙L^-1乙二胺四乙酸（EDTA）和1.16 mmol∙L^-1 CaCl₂ ]。去除血管周围的结缔组织，将血管制备为长度为2~3 mm的血管环。分离的动脉环用两个钢针固定。用95% O₂和5% CO₂对水槽中的PSS进行充气，加热至37 ℃。通过血管标准化程序测量被动直径-张力应答，确定最佳初始微血管张力。标准化的动脉环被认为具有13.3 kPa的跨壁压力。接下来，用1 µmol∙L^-1 PE诱导血管预收缩，然后用1 mmol∙L^-1卡巴胆碱（CCh）舒张，验证内皮完整性。内皮完整性大于60%的动脉环被认为是内皮完整的，内皮完整性小于30%的环为内皮缺少的。

2.7 细胞培养和处理

小鼠主动脉血管平滑肌细胞（MOVAs）购自北纳生物（中国）。细胞在含有10% 胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的高糖培养基中，在含5% CO₂的湿化空气中37 ℃培养。融合度达到80%~90%后，分别用10 µg∙mL^-1 BXTY浸膏孵育细胞3、6、9 min或硝酸甘油3 min，同时使用或不使用20 µmol∙L^-1 NS 2028、100 µmol∙L^-1 ODQ或2 µmol∙L^-1 KT 5823孵育细胞。

2.8 cGMP释放量测定

根据说明书，通过cGMP酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测MOVA的cGMP浓度。将cGMP浓度与蛋白质浓度归一化。

2.9 免疫印迹

免疫印证（western blot）半定量分析蛋白表达。细胞样品在含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀（RIPA）缓冲液中裂解。用BCA试剂盒测定蛋白浓度。从每个处理组中提取35 µg蛋白样品，在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上进行负载和分离，并转移到硝化纤维素膜上。在5%脱脂牛奶中封闭2.5 h后，将硝化纤维素膜与sGC-β₁和PKG1一抗在4 ℃下孵育过夜。然后，与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗在室温避光下孵育1 h。使用红外荧光扫描系统收集信号，利用Odyssey1.3软件分析蛋白质条带的灰度值。

2.10 统计分析

所有结果至少重复三次，并以平均值±平均值的标准误差（SEM）表示。两组比较采用配对和非配对Student t检验（^* P < 0.05，^** P < 0.01，^*** P < 0.001）。

3 结果

3.1 BXTY多组分含量的测定

采用HPLC-DAD对BXTY的成分进行了深入研究。图1（a）为芍药苷、丹酚酸A、原儿茶酸、丹酚酸B的化学结构。图1（b）为对照品与BXTY样品溶液色谱峰的对比。结果表明，BXTY浸膏中含量最高的化合物为芍药苷（607.21 µg∙mL^-1），其次为丹酚酸B（176.74 µg∙mL^-1）、丹酚酸A（38.6 µg∙mL^-1）和原儿茶酸（8.48 µg∙mL^-1）。

本研究同时采用UPLC-Q-TOF-MS^E联合UniFi天然产物分析平台对BXTY的化学成分和入血成分进行鉴定。数据导入UniFi分析平台，与自建数据库自动匹配。接下来，进行了人工检查，以确定裂解过程是否符合该化合物的裂解规律。在BXTY中共鉴定出106种化合物，其中95种作为原型进入血（见附录A中的表S1）。图1（c）~（f）为正离子和负离子模式下获得的BXTY和溶剂的总离子流图。图1（g）~（h）为正离子和负离子模式下获得的BXTY入血成分的总离子流色谱图。根据鉴定结果我们推测BXTY的大部分成分是作为原型出现在血液中的。因此，我们使用BXTY提取物进行后续实验。

3.2 BXTY减轻垂体后叶素所致小鼠急性心肌缺血

BXTY的主要临床适应症为冠心病。有报道称，BXTY的主要成分如芍药苷、丹酚酸B、丹酚酸A、原儿茶酸等对冠心病具有防护作用[8‒11]。本实验采用垂体后叶素构建小鼠急性心肌缺血模型，评价BXTY的药理作用。BXTY灌胃给药10 d后使用垂体后叶素腹腔注射诱导小鼠急性心肌缺血。图2（a）为腹腔注射垂体后叶素（0.15 U∙g^-1）10 min后的代表性心电图轨迹。与对照组相比，模型小鼠的T波振幅显著增加[图2（b）]，心率显著降低[图2（c）]。上述结果表明小鼠急性心肌缺血模型建立成功。与模型组相比，BXTY-0.5 g∙kg^-1∙d^-1、BXTY-2.0 g∙kg^-1∙d^-1、BXTY-8.0 g∙kg^-1∙d^-1、BXTY-16.0 g∙kg^-1∙d^-1组以及硝酸甘油组的T波振幅均显著降低[图2（b）]， BXTY-0.5 g∙kg^-1∙d^-1、BXTY-2.0 g∙kg^-1∙d^-1、BXTY-8.0 g∙kg^-1∙d^-1、BXTY-16.0 g∙kg^-1∙d^-1和硝酸甘油组的心率均显著升高[图2（c）]。缺血和缺氧可引起心肌损伤和心肌酶释放到血液中，并显著增加血液中肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）等心肌酶的水平。同时，心肌缺血引起的自由基损伤使膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）升高。如图2（d）~（f）所示，与正常小鼠相比，模型小鼠血浆LDH、CK、MDA水平明显升高。BXTY呈剂量依赖性降低血浆LDH和CK水平，下调血浆MDA浓度。上述结果表明BXTY减轻垂体后叶素所致小鼠急性心肌缺血的症状。

3.3 BXTY舒张PE预收缩的肠系膜动脉，抑制PE诱导的肠系膜动脉血管收缩

冠状动脉痉挛是引起心肌缺血的重要原因。根据其临床适应症和成分，我们预测BXTY可能具有血管舒张作用和血管收缩抑制作用。取SD大鼠肠系膜上动脉，观察BXTY对血管舒缩的影响。结果表明，PSS（12.5 μL、20.0 μL、50.0 μL或100.0 μL）对PE预收缩的内皮完整大鼠肠系膜动脉张力无影响[图3（a）]，BXTY（2.5 μg∙mL^-1、5.0 μg∙mL^-1、10.0 μg∙mL^-1或20.0 μg∙mL^-1）以剂量依赖的方式舒张经PE预处理的内皮完整血管环[图3（b）]和内皮缺失血管环[图3（c）]。统计结果证实，与PSS处理组相比，BXTY（2.5 μg∙mL^-1、5.0 μg∙mL^-1、10.0 μg∙mL^-1或20.0 μg∙mL^-1）以剂量依赖的方式舒张内皮完整[图3（d）]和内皮缺失[图3（e）]的PE预收缩血管环。同样，在内皮完整[图3（f）~（g）]/内皮缺失[图3（h）~（i）]的肠系膜上动脉血管中，BXTY预处理均以剂量依赖的方式抑制PE诱导的血管收缩。上述结果表明，BXTY的血管舒张作用不依赖于血管内皮，因此我们使用内皮缺失的肠系膜上动脉进行后续实验。

3.4 BXTY通过激活sGC，舒张PE预收缩的肠系膜动脉环，抑制PE诱导的肠系膜动脉环收缩

sGC是一氧化氮（NO）信号通路中的关键酶，sGC的激活增加了MOVAs中第二信使cGMP的含量，激活cGMP依赖性蛋白激酶，减少细胞内Ca²⁺释放和细胞外Ca²⁺内流，从而舒张血管平滑肌。作为治疗心血管疾病的靶点，sGC迅速引起了广泛关注，成为该领域的研究热点。图4（a）为BXTY（10.0 μg∙mL^-1）舒张PE预收缩的内皮缺失血管环代表图。图4（b）是NS2028（sGC抑制剂：20 μmol∙L^-1）抑制BXTY诱导的预收缩血管舒张的代表图。图4（c）为ODQ（sGC抑制剂：100 nmol∙L^-1）抑制BXTY诱导的预收缩血管舒张的代表图。统计结果表明，BXTY（10.0 μg∙mL^-1）舒张PE预收缩的内皮缺失动脉血管[图4（d）]。此外，用sGC抑制剂NS 2028或ODQ预先孵育内皮缺失的血管环，部分消除了BXTY对动脉血管的舒张作用[图4（d）]。图4（e）为BXTY（10.0 μg∙mL^-1）预处理内皮缺失大鼠肠系膜动脉抑制动脉收缩的代表图。图4（f）为NS 2028（20 μmol∙L^-1）预处理部分阻断BXTY预处理抑制动脉血管收缩的代表图。图4（g）为ODQ（100 nmol∙L^-1）预处理部分阻断BXTY预处理抑制动脉血管收缩的代表图。图4（g）和（i）表明20 μmol∙L^-1 NS 2028和100 nmol∙L^-1 ODQ预处理对PE诱导的内皮缺失血管环的血管收缩没有影响。统计结果证实[图4（j）]，BXTY预处理可以抑制PE诱导的内皮缺失动脉血管收缩，NS 2028和ODQ部分阻断BXTY对血管收缩的抑制作用。这些结果表明，BXTY通过激活sGC舒张预收缩的内皮缺失动脉血管，并抑制内皮缺失动脉的收缩。

为了进一步证实sGC在BXTY调控血管舒缩中的重要作用，我们使用BXTY分别孵育MOVAs 3 min、6 min、9 min，检测sGC蛋白表达情况，使用硝酸甘油为阳性对照。结果表明，BXTY孵育6 min，sGC蛋白水平的增幅最大[图4（k）]。因此，选择BXTY孵育6 min进行后续实验。先用20 μmol∙L^-1 NS 2028或100 μmol∙L^-1 ODQ处理MOVAs 24 h，再用BXTY孵育6 min，结果如图4（l）所示，NS 2028或ODQ预处理部分逆转了BXTY诱导的sGC蛋白表达升高。上述结果表明，BXTY通过激活sGC舒张预收缩动脉，抑制动脉收缩。

3.5 BXTY通过上调cGMP和PKG水平抑制肠系膜动脉血管舒缩

cGMP是MOVAs中重要的第二信使，可以激活cGMP依赖性蛋白激酶，负调控细胞内Ca²⁺释放和细胞外Ca²⁺内流，促进肌球蛋白轻链的去磷酸化，从而舒张血管平滑肌。因此，我们研究了cGMP在BXTY调节血管张力中的作用。使用BXTY孵育MOVAs 3、6、9 min，用ELISA试剂盒测定细胞上清液中cGMP的浓度。以硝酸甘油为阳性对照。结果表明，BXTY或硝酸甘油均能增加cGMP的含量，且BXTY时间依赖性地增加细胞上清液中cGMP的含量[图5（a）]。首先用sGC抑制剂（20 μmol∙L^-1 NS 2028或100 nmol∙L^-1 ODQ）处理MOVAs 24 h，然后用BXTY孵育9 min。结果如预期，NS 2028或ODQ处理抑制了BXTY诱导的cGMP释放[图5（b）]。在MOVAs中，PKG是cGMP依赖性蛋白激酶，可调节血管张力。为了证实PKG在BXTY介导的血管舒张中的作用，我们使用了选择性PKG抑制剂KT 5823抑制血管组织和MOVAs中的PKG活性。结果表明，2 μmol∙L^-1 KT 5823预孵育内皮缺失动脉血管环5 min，部分消除了BXTY抑制PE介导的血管收缩的作用[图5（c）~（e）]。同样，2 μmol∙L^-1 KT 5823部分阻断了BXTY对PE诱导的血管收缩的抑制作用[图5（f）~（g）]，而用2 μmol∙L^-1 KT 5823单独预孵育内皮缺失的动脉血管环对血管张力没有影响[图5（h）]。统计结果进一步证实了这些结果[图5（i）]。

为了进一步证实PKG在BXTY调节血管张力中的作用，我们使用BXTY孵育MOVAs 3、6、9 min，然后检测PKG1的蛋白表达，以硝酸甘油为阳性对照。结果表明，与BXTY孵育6 min，PKG1蛋白表达水平增幅最大[图5（j）]。此外，先用2 μmol∙L^-1 KT 5823、20 μmol∙L^-1 NS 2028或100 nmol∙L^-1 ODQ处理MOVAs 24 h，继而使用BXTY孵育6 min。如图5（k）所示，KT 5823、NS 2028或ODQ预处理逆转了BXTY诱导的PKG1蛋白表达升高。上述结果表明，BXTY可以通过激活sGC-cGMP-PKG通路舒张动脉血管，抑制动脉血管收缩。

4 讨论

本研究结果证实，BXTY可以缓解垂体后叶素所致小鼠心肌缺血的症状，包括心电图异常和血浆酶的改变。BXTY剂量依赖性舒张肠系膜上动脉血管，抑制异常血管收缩，且该作用不依赖于血管内皮。此外，用sGC抑制剂NS 2028/ODQ或PKG抑制剂KT 5823预处理肠系膜上动脉，可以逆转BXTY的血管扩张作用。此外，BXTY增加了MOVAs中sGC-β₁蛋白、cGMP和PKG1蛋白的表达水平，而NS 2028、ODQ或KT 5823可以抑制这些作用。这些发现表明，BXTY通过sGC-cGMP-PKG通路调节VSMCs血管舒张和收缩，从而改善心肌缺血。

心肌缺血的根本问题是冠状动脉供血和心肌需氧量之间的失衡。冠状动脉功能障碍是心肌缺血的重要原因[12]，包括心外膜血管痉挛/微血管痉挛、冠状动脉舒张功能受损以及血管收缩增强[13]。因此，预防血管痉挛、避免血管异常收缩以及改善心肌供血是治疗心肌缺血的有效策略。

本研究采用垂体后叶素建立小鼠心肌缺血模型。垂体后叶素是由下丘脑神经元合成的一种神经激素，通过引起冠状动脉痉挛诱导心肌缺血，垂体后叶素引起小鼠心肌缺血的症状与人冠状动脉痉挛引起的症状相似。

大多数血管由内膜、中膜和外膜组成。位于血管中膜的VSMC是维持血管结构不可缺少的组成部分[14]。根据Poiseuille定律，管腔直径是血管阻力的最重要因素。血管舒缩取决于VSMC的收缩[15]，因此，正常的VSMC功能在血管张力和血液运输中起着重要作用。BXTY的生物活性组分，如芍药苷[16]、丹酚酸B [17]、丹酚酸A [18]和原儿茶酸[19]，已被报道具有血管扩张作用。我们通过血管环实验验证了BXTY对血管张力的影响。PE是一种拟交感神经胺，主要作用于α-肾上腺素能受体，可以增加收缩压、舒张压以及外周阻力，因此，采用PE诱导肠系膜上动脉血管急性收缩，模拟急性心肌缺血时血管收缩情况。结果表明，BXTY剂量依赖性地舒张PE预收缩的肠系膜上动脉血管。BXTY预孵育处理也能抑制PE诱导的血管收缩作用，且呈剂量依赖性。此外，BXTY预孵育剂量依赖性舒张了氯化钾收缩的肠系膜上动脉（附录A图S1）。这些结果表明，BXTY通过抑制血管收缩、舒张急性收缩的血管来减轻冠状动脉痉挛引起的急性心肌缺血。此外，BXTY对血管张力的影响不依赖于血管内皮。因此，我们后续的机制研究主要集中在VSMC上。

血管张力受血管舒张剂和血管收缩剂的调节[20]。sGC是血管舒张的关键酶，也是研究和开发血管舒张剂的重要靶点。异二聚体sGC由α和β同源亚基组成，是VSMC、内皮细胞和心肌细胞中表达的生物传感器[21]。在血管系统中，sGC通过内源性和外源性信号在调节血管张力中起主要作用。它通过NO协助VSMC与内皮细胞之间的通信[22]。内皮细胞和酶活性调节剂产生的NO可以调节sGC的活性，通过改变sGC的构象、激活sGC的催化位点，将VSMCs中5'-鸟苷三磷酸（GTP）的环化转化为第二信使cGMP [23‒24]，cGMP随后激活PKG，PKG通过抑制细胞外Ca²⁺内流、刺激肌浆网Ca²⁺腺苷三磷酸酶（ATPase）摄取Ca²⁺、降低肌丝Ca²⁺敏感性产生血管舒张作用[25‒26]。

除受NO调控外，sGC刺激剂和sGC激活剂还可直接与sGC结合，增强NO信号传导[27]。sGC刺激剂以不依赖NO的方式增强sGC的酶活性，并具有与内源性NO协同的能力；sGC激活剂与无血红素或氧化型sGC结合[28]。NO-sGC级联信号功能障碍可导致多种病理过程，如心血管疾病、高血压、哮喘和神经退行性疾病[29]。靶向sGC治疗心血管疾病已成为研发新型制剂的热点，riociguat是首创的sGC刺激剂，已被批准用于治疗肺动脉高压和慢性血栓栓塞性肺动脉高压[30,31]；vericiguat是另一种sGC刺激剂，广泛用于治疗心力衰竭，通过直接作用于sGC提高cGMP水平，并通过稳定sGC的结合位点提高sGC对NO的敏感性[32‒33]；sGC激活剂cinaciguat是专为治疗心力衰竭而设计的；ataciguat（HMR1766）是一种用于改善血压和直立耐受性的药物，目前正处于预批准阶段，此外，其他几种针对sGC的药物也处于预批准阶段[34]。因此，靶向sGC是治疗缺血性心血管疾病的一种很有前景的策略。

钙敏感钾通道（K_Ca）、ATP敏感钾通道（K_ATP）、L型钙通道（LTCCs）、Ca²⁺-ATPase（SERCA）和肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP₃R）在血管张力调节中发挥重要作用[35]。为探究BXTY调节血管张力的机制，我们逐一验证了这些通道及受体。分别以12 mmol∙L^-1地尔氮、5 μmol∙L^-1 A23187、100 μmol∙L^-1、2-氨基乙基二苯基硼酸酯（2-APB）和10 μmol∙L^-1毒胡萝卜素预处理内皮缺失血管环，结果发现这些通道及受体抑制剂并不影响BXTY的血管扩张作用，从而排除了LTCCs、Ca²⁺释放、IP₃R和SERCA参与BXTY扩张血管的过程（附录A图S2）。此外，分别用10 μmol∙L^-1格列苯脲或100 μmol∙L^-1四乙基氯化铵（TEA）预处理，不影响BXTY对内皮缺失血管环的扩张作用，这排除了K_ATP和K_Ca的参与BXTY扩张血管的过程（附录A图S3）。

然而，使用sGC抑制剂NS 2028、ODQ或PKG抑制剂KT 5823预孵育后，BXTY的血管扩张作用和对血管收缩的抑制作用明显降低，说明BXTY的抑制血管收缩作用是通过sGC-cGMP-PKG信号通路介导的。此外，BXTY提高了MOVAs裂解物中sGC-β₁、cGMP和PKG1的水平进一步验证了这一结论，而用NS 2028、ODQ或KT 5823预处理MOVAs可逆转这一结果。

5 结论

本文探讨了BXTY对小鼠心肌缺血模型的药理作用。我们的研究结果表明，BXTY可以减轻小鼠急性心肌缺血的症状，并且其作用与硝酸甘油（临床经典抗心肌缺血药物）相当。抑制异常的血管舒缩是其心脏保护作用的潜在机制之一。BXTY通过激活sGC，增加细胞内cGMP含量，增加血管平滑肌细胞中cGMP依赖性PKG的活性（图6）。我们利用现代药理学技术，阐明传统中药的药理作用和作用机制，促进传统医学与现代医疗体系的交流，推动药物研发。

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原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

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