应对可转移多黏菌素耐药性——饲料添加剂来源的白屈菜红碱具有双重效应

工程（英文） ›› 2024, Vol. 32 ›› Issue (1) : 175 -186. DOI: 10.1016/j.eng.2023.06.012

研究论文

宋黄威 ^a^,^b ,
王雪杨 ^a^,^b ,
张慕琛 ^a^,^b ,
邹之宇 ^a^,^b ,
杨思源 ^a^,^b ,
易甜 ^a^,^b ,
王建峰 ^c ,
刘德俊 ^a^,^b ,
沈应博 ^a^,^b ,
代重山 ^a^,^b ,
刘志海 ^d ,
Timothy R. Walsh ^e ,
沈建忠 ^a^,^b ,
吴聪明 ^a^,^b ,
汪洋 ^a^,^b

作者信息 +

Dual Effects of Feed-Additive-Derived Chelerythrine in Combating Mobile Colistin Resistance

Huangwei Song ^a^,^b^,^- ,
Xueyang Wang ^a^,^b^,^- ,
Muchen Zhang ^a^,^b ,
Zhiyu Zou ^a^,^b ,
Siyuan Yang ^a^,^b ,
Tian Yi ^a^,^b ,
Jianfeng Wang ^c ,
Dejun Liu ^a^,^b ,
Yingbo Shen ^a^,^b ,
Chongshan Dai ^a^,^b ,
Zhihai Liu ^d ,
Timothy R. Walsh ^e ,
Jianzhong Shen ^a^,^b ,
Congming Wu ^a^,^b^,^* ,
Yang Wang ^a^,^b^,^* ,

Author information +

文章历史 +

Received	Accepted	Published
2022-11-03	2023-06-15
Issue Date
2024-06-12

PDF (2287K)

摘要

可转移多黏菌素耐药基因mcr-1及其变异体的出现、蔓延严重威胁了多黏菌素作为临床治疗多重耐药革兰阴性菌感染最后一道防线药物的药效。寻找抗生素佐剂是恢复多黏菌素对其耐药菌敏感性的有效策略。然而，鲜有研究探索抗生素佐剂对多黏菌素耐药基因传播的影响。本研究发现，来源于饲料添加剂博落回散中的白屈菜红碱（4 mg∙L^-1）在体外抑菌试验能使多黏菌素对mcr-1阳性大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）降低16倍（由2.000 mg∙L^-1至0.125 mg∙L^-1），且在肠道感染模型中与对照组相比，能降低约10⁴个菌落形成单位（CFU）的mcr-1阳性大肠杆菌菌载量。同时，白屈菜红碱在体外试验中能降低mcr-1阳性质粒的接合转移频率（超过100倍），且在体内肠道接合转移模型中能显著降低该质粒的接合转移频率（5倍）。机制研究发现，白屈菜红碱通过靶向细菌细胞膜上的磷脂成分，增大细胞膜的流动性，抑制了细菌呼吸作用，扰乱质子动势（proton motive force, PMF），产生活性氧（reactive oxygen species, ROS），造成细菌胞内三磷酸腺苷（ATP）耗竭，下调了mcr-1及接合转移相关基因的转录水平，从而实现既能增强多黏菌素对抗耐药菌作用，又能抑制耐药质粒接合转移的双重作用。白屈菜红碱的双重作用拓展了抗生素佐剂的应用范围，并提供了应对多黏菌素耐药的新思路。

Abstract

The emergence and spread of the mobile colistin-resistance gene, mcr-1, and its variants pose a challenge to the use of colistin, a last-resort antibiotic used to treat severe infections caused by extensively drug-resistant (XDR) Gram-negative pathogens. Antibiotic adjuvants are a promising strategy to enhance the efficacy of colistin against colistin-resistant pathogens; however, few studies have considered the effects of adjuvants on limiting resistance-gene transmission. We found that chelerythrine (4 mg∙L ⁻¹) derived from Macleaya cordata extract, which is used as an animal feed additive, reduced the minimal inhibitory concentration (MIC) of colistin against an mcr-1 positive Escherichia coli (E. coli) strain by 16-fold (from 2.000 to 0.125 mg∙L⁻¹), eliminated approximately 10⁴ colony-forming units (CFUs) of an mcr-1 -carrying strain in a murine intestinal infection model, and inhibited the conjugation of an mcr-1-bearing plasmid in vitro (by > 100-fold) and in a mouse model (by up to 5-fold). A detailed analysis revealed that chelerythrine binds to phospholipids on bacterial membranes and increases cytoplasmic membrane fluidity, thereby impairing respiration, disrupting proton motive force (PMF), generating reactive oxygen species (ROS), and decreasing intracellular adenosine triphosphate (ATP) levels, which subsequently downregulates mcr-1 and conjugation-associated genes. These dual effects of chelerythrine can expand the use of antibiotic adjuvants and may provide a new strategy for circumventing mobile colistin resistance.

关键词

白屈菜红碱 / 抗生素佐剂 / 接合转移抑制剂 / 多黏菌素 / 双重作用

Key words

Chelerythrine / Antibiotic adjuvant / Conjugation inhibitor / Colistin / mcr-1 / Dual effects

引用本文

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宋黄威,王雪杨,张慕琛,邹之宇,杨思源,易甜,王建峰,刘德俊,沈应博,代重山,刘志海,Timothy R. Walsh,沈建忠,吴聪明,汪洋. 应对可转移多黏菌素耐药性——饲料添加剂来源的白屈菜红碱具有双重效应[J]. 工程（英文）, 2024, 32(1): 175-186 DOI:10.1016/j.eng.2023.06.012

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1 引言

抗生素的成功应用延长了人类寿命，促进了畜牧业的发展，对全球公共健康有重要影响。作为一种阳离子多肽类抗生素，多黏菌素是治疗碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌为数不多的有效药物。由于具备促生长效果，多黏菌素在过去60多年里被大量用作饲料添加剂[1‒2]。长期广泛的应用加速了多黏菌素耐药基因mcr-1及其变异体的出现与传播[3‒4]。MCR-1蛋白通过对革兰阴性菌脂多糖（LPS）中脂质A上的磷酸基团进行磷酸乙醇胺修饰，降低其所带负电荷，从而介导细菌对多黏菌素耐药[3,5‒6]。此外，有研究发现多黏菌素能促进携带mcr-1基因质粒的水平传播[7]，进一步加速mcr-1基因在全球范围内流行[4]。携带mcr-1基因的病原菌在动物、食品以及环境中的传播最终将危害人类健康[8‒9]。同时，人肠道内mcr-1基因的高检出率严重威胁了多黏菌素的临床疗效[10]。因此，亟需寻找应对携带mcr-1基因多黏菌素耐药菌的新策略。

抗菌药物化疗仍是治疗细菌感染的主要手段。然而，传统的抗菌药物开发面临着耗时长、经济负担大等困境[11‒12]。目前临床使用的大部分抗菌药物依旧是1950—1980年间发现的抗生素或是基于其骨架进行优化的抗菌药物[13]。由于新型抗菌药物研发的速度落后于耐药性产生和传播的速度，最终造成了目前的耐药性危机。具有协同抗菌作用的药物联用可有效遏制耐药性的产生和传播[14‒15]。但由于泛耐药菌的广泛流行，传统抗菌药物的联用疗法存在失效的风险。受到抗生素佐剂概念和相关研究的启发[16‒17]，研发具有新型作用靶点的抗菌药物佐剂是遏制耐药性进一步恶化的关键策略。

天然化合物是抗生素和抗生素佐剂的主要来源[18‒19]。例如，α-倒捻子素和紫檀芪分别通过靶向细菌细胞膜磷脂成分和MCR-1蛋白，恢复了携带mcr-1基因大肠杆菌对多黏菌素的敏感性[20‒21]。然而，由质粒介导的mcr-1基因可持续地在病原菌间传播，增大了治疗难度[22]。因此，理想的抗生素佐剂不仅能增强抗菌药物的药效，还能抑制耐药基因的传播。本研究通过高通量筛选具有双重作用的天然化合物，发现来源于饲料添加剂博落回散中的关键活性成分白屈菜红碱不仅能增强多黏菌素的抗菌作用，还能抑制携带mcr-1基因质粒的水平传播。

2 材料与方法

2.1 试剂与菌株

天然化合物库购自陶术生物科技有限公司（货号：L6000，纯度高于95%；美国），包含从植物、动物和微生物来源的2592种天然化合物。将携带mcr-1基因的IncI2质粒转化至大肠杆菌BW25113中（BW25113::IncI2-mcr-1），作为高通量筛选多黏菌素佐剂的受试菌以及质粒接合转移的供体菌。大肠杆菌J53作为质粒接合转移抑制剂筛选的受体菌。实验室保存的mcr-1基因阳性大肠杆菌ZJ807作为药敏试验以及机制研究的受试菌[10]。

2.2 基于细胞水平的多黏菌素佐剂筛选

将100 μmol·L^-1的天然化合物与0.5 μg∙mL^-1（1/4× MIC）的多黏菌素联合作用于大肠杆菌BW25113::IncI2-mcr-1。筛选方案根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）指南（版本：M45-A2）进行，详情请见附录A。

2.3 部分抑菌浓度指数测定试验

部分抑菌浓度（FIC）指数根据CLSI指南（版本：M45-A2）采用棋盘法试验测定。将每种化合物在阳离子调节肉汤CAMHB中进行倍比稀释，以形成最终体积为100 μL的8 × 8矩阵。将过夜培养的mcr阳性或阴性菌株1∶100稀释至新鲜Mueller-Hinton肉汤中（MHB），并在37 °C下培养4~6 h。将对数期菌液调整至0.5麦氏浊度，随后用CAMHB稀释100倍。将100 μL稀释好的菌悬液添加至8 × 8矩阵的各个孔中，在37 °C条件下孵育18 h。使用Infinite M200酶标仪（Tecan，瑞士）测定每个孔的OD₆₀₀值。每个组合至少重复两次。FIC值根据下面公式计算得出：

FIC index = MIC_ab/MIC_a + MIC_ba/MIC_b = FIC_a + FIC_b

式中，MIC_a/b是化合物A/B各自的MIC；MIC_ab则是化合物A与化合物B联用时的MIC；MIC_ba则是化合物B与化合物A联用时的MIC。FIC_a/b是化合物A/B的FIC。协同效应定义为FIC值≤0.5。

2.4 细菌三磷酸腺苷水平测定试验

使用增强型三磷酸腺苷（ATP）检测试剂盒（货号：S0027；碧云天生物技术股份有限公司，中国）测定大肠杆菌ZJ807的细胞内ATP水平。将过夜培养的ZJ807菌液在新鲜Luria-Bertani（LB）肉汤中以1∶100比例进行稀释，并在37 °C下培养4~6 h。然后，通过离心（4000 r·min^-1）收集菌体，并将其重悬于0.1 mol∙L^-1磷酸盐缓冲液（PBS；pH =7.4）中，调整OD₆₀₀为0.5。使用不同浓度（0、1×、2×或4× MIC）的白屈菜红碱处理30 min，再离心（12 000 r·min^-1，5 min，4 °C）收集菌体。利用含1 mg∙mL^-1溶菌酶的Tris-乙二胺四乙酸（EDTA-TE）缓冲液裂解菌体，并再次离心，其上清液用于测定细胞内ATP水平。将检测试剂添加至96孔板中，在室温下孵育5 min。然后将上清液加入检测液中并迅速混合，用Infinite M200酶标仪测量各体系发光值。

2.5 电子传递链活性测定试验

将过夜培养的大肠杆菌ZJ807在新鲜的LB肉汤中以1∶100的比例稀释，并在37 °C下培养4~6 h，以达到对数生长期。再清洗并重悬于PBS（pH = 7.4，0.1 mol·L^-1）中使OD₆₀₀值到达0.3后，将菌悬液置于冰上。在玻璃试管中，将白屈菜红碱（0、1/2×、1× 或2× MIC）加入含有1 mmol∙L^-1碘硝基四氮唑氯化物（INT）的菌悬液中，剧烈混合，并在30 °C下孵育。利用酶标仪每隔10 min读取体系在490 nm处的吸光值。

2.6 质子动势测定试验

质子动势（proton motive force, PMF）由ΔpH（pH梯度）和ΔΨ（膜电位）组成。使用膜电位敏感的荧光染料DiSC₃(5)（货号：D131315；阿拉丁生化科技股份有限公司，中国）测定白屈菜红碱对大肠杆菌ZJ807ΔΨ的影响。使用另一种pH值敏感的荧光探针BCECF-AM（货号：S1006；碧云天生物技术股份有限公司，中国）测定CHE处理后ZJ807 ΔpH的变化。详细方法见附录A。

2.7 膜流动性检测试验

参考相关研究[23]，利用荧光染料Laurdan测定白屈菜红碱对大肠杆菌ZJ807细胞质膜流动性的影响。首先，制备ZJ807的原生质体[24]。将过夜培养的ZJ807菌液离心并清洗两次，重悬于CAMHB中，制备成9 mL含10⁸个菌落形成单位（CFU）的CAMHB菌悬液。孵育2 h后，将菌株离心、洗涤两次（4 °C，20 min，3273g）。第一次将其重悬于10 mL Tris缓冲液（0.03 mol∙L^-1，pH = 8.0）中，第二次则重悬于含有20%蔗糖的Tris缓冲液（pH = 8.0，0.03 mol∙L^-1）中。然后分别加入1 mL溶菌酶（10 mg∙mL^-1）和250 μL乙二胺四乙酸EDTA，10 mg∙mL^-1），分别去除细胞壁和外膜。将菌悬液在30 °C下孵育1 h。然后加入500 µL胰蛋白酶（10 mg∙mL^‒1)，在30 °C下继续孵育15 min。离心（4 °C，20 min，2000g）收集原生质体。然后加入终浓度为10 μmol·L^‒1的Laurdan，室温下避光温和震荡孵育10 min。随后，用1/2×、1×或2× MIC浓度的白屈菜红碱或苄醇（benzyl alcohol；10 mmol∙L^-1）处理35 min。最后，以350 nm波长为激发光，分别测定各体系在435 nm和490 nm波长处发射光的荧光强度。Laurdan GP使用以下公式计算：

GP = (I435 ‒ I490)/(I435 + I490)

所有试验均重复至少三次。

2.8 不同脂质对白屈菜红碱抗菌活性的影响

为了评估不同脂质对白屈菜红碱抗菌活性的影响，将白屈菜红碱（1000 µg∙mL^-1）分别与25 mmol的LPS、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）或心磷脂（CL）混合。将混合物在37 °C下孵育30 min，然后加入空白药敏纸片。干燥后，将药敏纸片贴于含有大肠杆菌25922的Mueller-Hinton琼脂（MHA）平板上。在37 °C下培养16~18 h后，测量各处理组抑菌圈的直径。

**2.9 mcr-1基因转录水平测定**

使用EASYspin Plus试剂盒（货号：RN0801；Aidlab，中国）提取细菌总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒（货号：RR047A；Takara，日本）将1 µg RNA进行反转录。通过使用SYBR Premix Ex Taq qPCR试剂盒（货号：RR820A；TaKaRa，日本）测定mcr-1相对于对照基因（16S核糖体RNA49）的转录水平。反逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）在ABI QuantStudio 7（Applied Biosystems，美国）上进行。基因表达的倍数变化使用2^-ΔΔ ^C ^t方法进行测定。

2.10 MCR-1表达量测定

将N端带有6× His标记的大肠杆菌菌株BL21(DE3)::pET28a-mcr-1过夜培养，并用新鲜LB肉汤进行1∶100稀释，在37 °C下培养4 h。然后，在菌液中分别加入不同终浓度（0 µg∙mL^-1、16 µg∙mL^-1、32 µg∙mL^-1或64 µg∙mL^-1）的白屈菜红碱和0.4 mmol∙L^-1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），继续培养4 h。离心收集菌体，加入6×上样缓冲液并煮沸变性。每个样品取10 µg进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。然后转移到聚偏二氟乙烯膜上，并用抗体[His-Tag兔单克隆抗体，货号：12698；Cell Signaling Technology，美国；针对GAPDH的鼠标单克隆抗体[GA1R]，货号：ab125247；Abcam，英国；HRP标记的山羊抗兔IgG(H+L)，货号：A0208；Beyotime；HRP标记的山羊抗鼠IgG(H+L)，货号：A0216; Beyotime]封闭和涂布。然后使用Western印迹示踪剂（Tanon-5200;Bio-Tanon，英国）观察印迹。

2.11 接合转移抑制试验

将供体菌（携带mcr-1基因IncI2质粒的大肠杆菌BW25113）和受体菌（大肠杆菌J53）在含有相应抗生素的脑心浸液（BHI）肉汤中，于37 °C、200 r·min^-1条件下过夜培养16 h。将过夜培养物稀释10倍至2 mL BHI无药肉汤中，37 °C继续培养4 h。随后，将供体和受体菌的OD₆₀₀调整至一致（为10⁸~10⁹ CFU∙mL^-1）。将供体和受体菌以1∶1的比例混合，并以4000 r·min^-1离心5 min，收集菌体，将其重悬于含有不同浓度化合物的2 mL BHI肉汤中，以无药BHI肉汤组作为对照，在37 °C下静置培养16 h。随后，将100 μL菌悬液分别涂布到含有叠氮化钠和多黏菌素的HI琼脂平板上，继续培养24 h。分别计算接合子和受体菌的数量。接合转移频率为接合子的数量除以受体菌的数量。所有的接合转移试验都至少进行了三次生物学重复。

2.12 小鼠肠道感染模型治疗试验

为了破坏小鼠肠道菌群的定殖抗性使大肠杆菌ZJ807成功定殖，所有小鼠（n = 28）每24 h灌胃给予氨苄青霉素（1.0 mg∙mL^-1）、万古霉素（0.5 mg∙mL^-1）、克林霉素（0.5 mg∙mL^-1）和甲硝唑（1.0 mg∙mL^-1），连续处理三天。每只小鼠通过灌胃法攻毒6 × 10⁷个CFU的ZJ807，并将小鼠随机分配到7个处理组，每组4只小鼠。攻毒4 h后，分别给小鼠灌胃PBS、多黏菌素（2 mg∙kg^-1或4 mg∙kg^-1）、白屈菜红碱（64 mg∙kg^-1或128 mg∙kg^-1）或多黏菌素+白屈菜红碱（2 mg∙kg^-1 + 64 mg∙kg^-1或4 mg∙kg^-1 + 128 mg∙kg^-1）。收集小鼠粪便样本，称重、均质化、稀释，并用含2 μg∙mL^-1多黏菌素的中国蓝琼脂（CBA，货号：CM903；陆桥技术股份有限公司，中国）检测ZJ807在粪便中的载量。

2.13 肠道接合转移抑制试验

小鼠用四种抗生素进行预处理以消除定殖抗性，包括氨苄青霉素（1.0 mg∙mL^-1）、万古霉素（0.5 mg∙mL^-1）、克林霉素（0.5 mg∙mL^-1）和甲硝唑（1.0 mg∙mL^-1），连续处理三天。随后，每组设置6只小鼠，每只小鼠分别灌胃约10⁸个CFU受体菌J53，24 h后再灌胃约10⁸个CFU供体菌ZJ807。每天通过灌胃给药白屈菜红碱（10 mg∙kg^-1）或PBS。收集小鼠粪便，并用1 mL PBS重悬、稀释、涂板。在含有不同药物的CBA平板上分别测定接合子和受体菌的数量。用含多黏菌素（2 μg∙mL^-1）+ NaN₃（150 μg∙mL^-1）的CBA平板筛选接合子；用含NaN₃（150 μg∙mL^-1）的CBA平板筛选受体菌。最终的接合转移频率为接合子数除以受体菌数。

2.14 数据处理

本研究利用GraphPad Prism 9软件进行数据处理。所有数据均以平均值±标准差的形式呈现。对于体外研究，使用Dunnett多重比较的单因素方差分析（ANOVA）计算P值。对于体内研究，n代表每组动物的数量，并通过Mann-Whitney U检验确定统计学显著性。P < 0.05的差异被认为具有显著性差异。

3 结果

3.1 白屈菜红碱在体内外对多黏菌素均具有协同抗菌作用

本研究高通量筛选了来源于植物、动物、微生物的2592种天然化合物与多黏菌素的联合抗菌效果[图1（a）]。以90%生长抑制率为折点值，本研究发现包括黄酮类、生物碱类等120种天然化合物与多黏菌素具有协同抑菌效果[见图1（b）及附录A中的图S1（a）]。由于前期研究发现黄酮类化合物与多黏菌素具有协同抗菌效果[20]，本研究专注于生物碱类与多黏菌素的联用效果。以大肠杆菌ZJ807（mcr-1基因阳性）、肺炎克雷伯菌91（mcr-8基因阳性）以及鼠伤寒沙门菌（mcr-9基因阳性）为受试菌株，本研究发现白屈菜红碱与多黏菌素联用具有协同抗菌效果[见图1（c）及附录A中的图S1（b）、（c）]，且提示白屈菜红碱为MCR-1蛋白的非特异性抑制剂。此外，白屈菜红碱与多黏菌素联用对不携带mcr基因的大肠杆菌工程菌株BW25113也具有协同抗菌作用[见附录A中的图S1（d）]，说明白屈菜红碱对多黏菌素的增效作用机制不完全依赖于mcr基因。通过杀菌曲线，单独使用白屈菜红碱或多黏菌素24 h后均无明显杀菌作用，而白屈菜红碱与多黏菌素联用则能降低4-log₁₀的CFU ZJ807 [图1（d）]。进一步通过肠道感染模型验证白屈菜红碱与多黏菌素的体内联用抗菌效果，发现单独使用白屈菜红碱或多黏菌素组小鼠粪便中mcr-1阳性大肠杆菌的菌载量与未用药处理对照组无显著差异。而白屈菜红碱与多黏菌素联用组小鼠粪便中mcr-1阳性大肠杆菌的菌载量则低于检测限（＜100 CFU）[图1（f）]。以上结果证明白屈菜红碱在体内外均能增强多黏菌素的抗菌效果。

3.2 白屈菜红碱通过干扰细菌能量代谢发挥抗菌效果

为阐明白屈菜红碱对多黏菌素的增效机制，本研究首先对白屈菜红碱的抗菌机制进行了探索。经不同浓度的白屈菜红碱处理30 min后，ZJ807胞内外ATP水平均呈浓度依赖性的下降[见图2（a）及附录A中的图S2（a）]，提示受试菌株胞内外ATP水平的下降不是因为白屈菜红碱增大了细胞膜的通透性。本研究利用荧光染料碘化丙锭（PI）进一步测定白屈菜红碱对细菌细胞膜通透性的影响，发现白屈菜红碱能导致PI的荧光淬灭[见附录A中的图S2（b）]。由于正常细菌胞外无β-半乳糖甘酶活性，本研究测定了不同浓度白屈菜红碱处理后细菌胞外β-半乳糖甘酶的活性，发现不同浓度白屈菜红碱处理组细菌胞外的β-半乳糖甘酶活性与空白对照组无显著差异[见附录A中的图S2（c）]，证明白屈菜红碱导致细菌胞内ATP水平下降的原因不是其能增大细菌细胞膜通透性。由于ATP的合成主要依赖于PMF，PMF由ΔpH 和ΔΨ组成。本研究分别测定了白屈菜红碱对ΔpH和ΔΨ的影响，发现白屈菜红碱能呈浓度依赖性地降低ΔpH [图2（b）]，并升高ΔΨ [图2（c）]。卡那霉素进入细菌胞内主要依赖ΔΨ，而多西环素则依赖于ΔpH。本研究发现，白屈菜红碱与卡那霉素表现为协同作用，与多西环素则表现为拮抗作用[见附录A中的图S2（d）]，进一步证明白屈菜红碱能扰乱细菌的PMF。

由于ΔpH由电子传递链产生，本研究利用碘硝基四唑紫测定了白屈菜红碱对细菌电子传递活性的影响[25]，发现白屈菜红碱能呈浓度依赖性地降低细菌电子传递链的活性[图2（d）]。进一步，本研究发现经白屈菜红碱处理后，NADH/NAD⁺比值最高升高了三倍[图2（e）]，进一步证实白屈菜红碱通过抑制电子传递链活性降低了细菌胞内ATP的水平[26]。与前人研究[27]类似，高NADH/NAD⁺比值往往伴随着活性氧（ROS）的产生[图2（f）]。值得一提的是，ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC, 6 mmol∙L^-1）可显著抑制由白屈菜红碱造成的ATP水平下降[见附录A中的图S2（e）]，说明产生ROS是造成ATP水平下降的因素之一。进一步，本研究发现ROS清除剂硫脲可部分抑制白屈菜红碱的杀菌能力[见附录A中的图S2（f）]，说明产生ROS在白屈菜红碱的抗菌作用具有一定程度的贡献。上述结果证明，白屈菜红碱通过降低细菌电子传递链的活性，扰乱PMF，产生ROS，从而造成细菌胞内ATP水平耗竭。

3.3 白屈菜靶向细菌内膜并增大膜的流动性

膜流动性的改变会造成位于膜上呼吸复合体的离域（delocalization），从而削弱电子传递链活性[23,28]。本研究利用荧光染料Laurdan测定不同浓度的白屈菜红碱对ZJ807细胞膜流动性的影响[29]，发现白屈菜红碱能呈浓度依赖性地增大膜的流动性[图2（g）]。为验证细胞膜上的磷脂成分是否为白屈菜红碱的作用靶点，本研究测定了不同的磷脂成分对白屈菜红碱抗菌作用的影响，发现PG和CL能显著抑制白屈菜红碱的抗菌活性[图2（h）]。进一步，本研究对白屈菜红碱与细菌细胞膜磷脂双分子层的互作进行了分子动态模拟[23,30]。首先，白屈菜红碱A环上的亚甲氧二基开始与磷脂亲水的头部进行接触；约10 ns后，白屈菜红碱开始以或垂直、或倾斜的角度进入膜的内部，使白屈菜红碱非极性的苯环与磷脂疏水的尾部实现最大限度的接触；在45 ns后，白屈菜红碱完全进入脂质双分子内部[图2（i）]。该模拟结果展示，白屈菜红碱的亚甲二氧基基团和疏水的核心分子骨架环对细胞膜吸附并进入细菌脂质双分子内部发挥了重要作用。

**3.4 白屈菜红碱通过抑制mcr-1以及外排泵的功能实现对多黏菌素的增效**

由于外排泵和mcr-1及其变异体是介导细菌对多黏菌素耐药的主要因素[3,31‒32]，又因白屈菜红碱能显著抑制细菌的能量代谢，本研究猜测白屈菜红碱可能通过抑制上述耐药因子发挥功能从而实现对多黏菌素的增效作用。首先，本研究通过荧光染料溴化乙锭（EB）测定了白屈菜红碱对细菌外排泵功能的影响，发现白屈菜红碱能呈浓度依赖性降低外排泵对EB的外排作用[图3（a）]。然后，本研究发现白屈菜红碱能呈浓度依赖性抑制mcr-1基因的转录和翻译过程[图3（b）、（c）]。进一步，白屈菜红碱处理能显著降低修饰/未修饰脂质A的比例[图3（d）]。此外，本研究发现白屈菜红碱能显著增加多黏菌素的胞内含量[图3（e）]。上述结果证明，白屈菜红碱通过抑制细菌LPS中脂质A的修饰以及外排泵的活性从而增大了细菌胞内多黏菌素的药物含量，实现了对多黏菌素的增效效果。

**3.5 白屈菜红碱在体内外均能抑制携带mcr-1基因IncI2质粒的接合转移**

本研究以携带mcr-1基因的IncI2质粒为研究对象，测定白屈菜红碱对其接合转移的影响。首先，本研究发现2 μg∙mL^-1、4 μg∙mL^-1和8 μg∙mL^-1的白屈菜红碱对供/受体菌的生长均无显著影响[图4（a）]。因此，这些浓度可用于后续接合转移抑制试验。结果发现，与无药对照组相比，白屈菜红碱能呈浓度依赖性地降低携带mcr-1基因IncI2质粒的接合转移频率[图4（b）]。当白屈菜红碱为8 μg∙mL^-1，接合转移频率下降了超过125倍[图4（b）]。进一步，本研究利用小鼠肠道接合转移模型评估白屈菜红碱在体内对携带mcr-1基因的IncI2质粒接合转移的影响。结果发现，肠道内IncI2质粒的接合转移频率与体外接近（10^‒3~10^‒1）；而白屈菜红碱处理组的接合转移频率比空白对照组的低5倍[图4（d）]。尽管随后几天小鼠肠道中受体细菌和接合子的减少可能导致接合转移频率逐渐增加，但整体上白屈菜红碱处理组的接合转移频率抑制效果大约是对照组的两倍[图4（d）]。

3.6 白屈菜红碱限制细菌的能量代谢、抑制了接合转移相关基因的表达

接合转移是一个耗能的生物学过程，涉及DNA的复制和IV分泌系统的组装[33]。本研究测定了低剂量的白屈菜红碱对细菌ATP水平的影响，与对照组相比，2~8 μg∙mL^-1的白屈菜红碱均能显著降低供体菌（73%~88%）、受体菌（52%~76%）胞内的ATP水平[图5（a）]。转录组结果显示，供/受体菌中ATP合成相关基因发生了显著的下调[见图5（b）及附录A中的图S3（a）、表S1、表S2]。由于能量受限会抑制质粒的接合转移[34]，因此本研究认为，由白屈菜红碱造成的ATP水平下降是其抑制质粒接合转移的重要因素。此外，DNA转移和复制（nikB和traC）、接合对形成（virB1-virB11）、IncI2质粒特有的IV菌毛等与接合转移相关基因的转录均发生了显著的下调[见图5（c）及附录A中的表S3]。同时，供体菌中与黏附相关的操纵子相关基因的转录水平也发生了显著的下调[见图5（d）及附录A中的表S4）]。这些操纵子在接合转移过程中的细菌间接触时发挥着关键作用[35]。上述结果证明，白屈菜红碱通过抑制菌毛形成和接合转移相关基因的表达从而抑制质粒的接合转移过程。

3.7 白屈菜红碱不会引起SOS应激或增大细胞膜通透性

由氧化应激造成的SOS应激以及细菌细胞膜通透性增大均会促进接合转移[35‒36]。虽然2 μg∙mL^-1、4 μg∙mL^-1和8 μg∙mL^-1的白屈菜红碱可浓度依赖性地促进ROS的产生[图5（e）]，但在供/受体菌中与ROS产生以及SOS反应相关基因的转录情况均无显著变化[见图5（f）及附录A中的表S5）]。该结果可能是因为白屈菜红碱降低了细菌胞内ATP水平，从而限制了与ROS产生和SOS反应相关基因的表达[34]。此外，2 μg∙mL^-1、4 μg∙mL^-1和8 μg∙mL^-1的白屈菜红碱对细菌细胞膜通透性均无显著改变[见附录A中的图S2（c）]。同时，供/受体菌中与内外膜相关基因的表达均无显著变化[见图5（g）及附录A中的图S3（c）、表S7、表S8]。因此，白屈菜红碱抑制质粒接合转移的过程不受ROS产生、SOS反应以及膜通透性改变的影响。上述结果证明，低剂量的白屈菜红碱通过限制细菌的能量代谢，抑制与接合转移相关基因的表达，从而发挥抑制质粒接合转移的作用。

4 讨论

mcr-1基因自出现后迅速在全球范围内的广泛流行，同时在人和动物肠道内的高定殖率给公共健康造成了巨大威胁[4]。本研究提出了利用植物源天然化合物白屈菜红碱在体内外展现出的双重作用机制应对可转移多黏菌素耐药性的概念。白屈菜红碱不仅能增强多黏菌素对mcr-1基因阳性大肠杆菌的抗菌作用，还能抑制携带mcr-1基因质粒的接合转移。除了具有抗炎[37]、抗肿瘤[38‒39]、抗病毒[40]的生物活性，本研究发现白屈菜红碱通过增大细菌细胞质膜流动性的方式，抑制细菌电子传递链活性，扰乱PMF，降低ATP水平，从而限制了细菌外排泵的功能，并抑制了mcr-1和与接合转移相关基因的表达，最终实现了既能逆转mcr-1基因阳性菌株对多黏菌素的耐药性，又能抑制携带mcr-1基因质粒接合转移的双重作用（图6）。白屈菜红碱的双重作用不仅能延长多黏菌素的使用寿命，同时还具备实现人和动物肠道中mcr-1基因阳性菌株去定殖的潜力。

白屈菜红碱是从博落回中提取的主要活性成分之一，该成分最初被记载在16世纪出版的《本草纲目》中，具有长期用于治疗百日咳和慢性支气管炎的历史[41]。近年来，由于抗菌药物作为促生长剂的使用受到限制[2]，博落回提取物（Sangrovit）作为饲料添加剂在中国、美国和欧洲的畜禽养殖中广泛使用，以促进牲畜的生长[42‒44]。自2017年以来，国外市场上的Sangrovit销量逐年增加（每年高达2.41 t），市场涵盖北美、南美、欧洲、日本、中东和非洲等地[45]。2017年至2022年，Sangrovit在中国的累计销量超过400 t，其作用相当于2000多万吨复合饲料。白屈菜红碱在全球畜牧养殖业中的广泛应用可能会增强多黏菌素在兽医临床治疗mcr-1基因阳性病原体引起的肠道感染的疗效。Sangrovit使用量的不断增大会对细菌产生选择压力，最终可能造成细菌对白屈菜红碱产生抗性，以及白屈菜红碱抑制mcr-1基因水平转移能力的削弱。尽管白屈菜红碱对癌细胞具有更强的杀伤能力，但高剂量的白屈菜红碱可能会对正常细胞造成组织特异性损伤[46‒47]，因而限制其用于治疗全身性感染。然而，白屈菜红碱通过口服给药的吸收率和生物利用度较低[48]，意味着白屈菜红碱可能是治疗肠道感染和消除肠道中泛耐药菌株的候选药物。值得注意的是，作为动物饲料添加剂商业应用的白屈菜红碱剂量（0.05 mg∙kg^-1）比本研究用于阻断体内质粒接合转移的剂量（10 mg∙kg^-1）低约200倍，表明需要进行进一步的体内研究，如对白屈菜红碱进行结构修饰或设计适当的剂型，才能将其用于消除人类和动物肠道中定殖的携带mcr-1及其变异体的病原体。

细胞膜对细菌的生存和生长至关重要，因而被认为是开发抗菌药物和佐剂的潜在靶标[20,49‒50]。多黏菌素和SLAP-S25等膜破坏剂，既可作为抗菌剂也可作为佐剂[15,49]。改变膜流动性的能力是抗菌药物发挥抗菌活性的一个关键因素[51‒53]。细菌细胞质膜流动性的自稳态对许多细胞功能至关重要，特别是ATP的产生[54]。本研究证实了白屈菜红碱能与PG和CL相互作用，从而迅速增大细菌细胞质膜的流动性，导致细菌的生理功能障碍，如氧化应激和能量耗竭。由于稳定的ATP水平对生物合成、代谢调节和细胞维持起着至关重要的作用[55‒56]，白屈菜红碱能通过降低细胞内ATP水平，限制MCR-1等耐药蛋白的表达，影响细菌的耐药表型。因此，相较于MCR-1的特异性抑制剂[21,57]，白屈菜红碱具有增强多黏菌素对所有携带mcr-1及其变异体病原体抗菌效果的潜力。此外，细胞内ATP水平的降低限制了质粒接合转移相关基因的转录，从而降低了接合转移频率。研究发现，一些非抗生素类药物，如非甾体抗炎药布洛芬（ibuprofen）和降脂药吉非罗齐（gemﬁbrozil），已被证明可促进携带泛耐药基因质粒的接合转移[58]。然而，关于接合转移抑制剂鲜有报道，且多具有特异性。例如，一些不饱和脂肪酸可以通过与质粒编码T4SS中的TraE结合以抑制接合转移[59]。虽然正常的ATP水平对细菌生长代谢至关重要，但干扰细菌ATP合成却很少被列为抑制接合转移的潜在策略。本研究发现，白屈菜红碱可以降低细菌ATP水平，而不增加膜通透性，也不显著改变SOS反应相关基因的表达。一般认为这些基因表达量的增加与促进接合转移有关。例如，多黏菌素已被证明可通过增加膜通透性来促进耐药基因的水平转移[7]。本研究的结果表明，增加细菌质膜流动性以限制ATP产生但不破坏膜通透性是一种很有前景的对抗耐药性策略。

前有研究认为白屈菜红碱通过增大膜通透性，从而降低细胞内ATP水平[60]。但本研究的结果显示白屈菜红碱对细菌细胞膜的通透性无显著破坏作用。这些相互矛盾的结论可能与药物处理后测量膜通透性的时间有关。为了探究白屈菜红碱的首要作用，本研究在白屈菜红碱处理细菌后的2 h内测量了细菌的所有生理变化。而Qian等[60]在白屈菜红碱处理8 h后才测定细菌膜通透性的变化。由于白屈菜红碱具有抗菌作用，因此Qian等测定膜通透性的体系中可能存在大量死细胞或膜受损的细胞，因而认为白屈菜红碱能增大膜的通透性。此外，本研究在白屈菜红碱处理30 min后观察到ROS的产生，表明白屈菜红碱需要更多时间才能引起膜损伤[61]。因此，本研究认为，白屈菜红碱的抗菌机制为靶向细菌的PG和CL、增加膜流动性和抑制电子传递链活性，从而造成细菌能量耗竭和氧化应激。但白屈菜红碱增加膜流动性与降低细菌传递链活性之间具体的机理仍需进一步探索。

5 结论

本研究发现了来源于饲料添加剂的植物源天然化合物白屈菜红碱通过抑制细菌能量代谢，从而具有既能增强多黏菌素对mcr-1基因阳性病原体的抗菌作用，又能抑制携带mcr-1基因质粒的接合转移的双重作用。研究结果可以为拓展已知抗菌药物遏制耐药性的其他效应提供指导，并为今后抗菌药物和佐剂开发提供参考。

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