宏基因组学揭示全规模焦化废水处理系统的微生物结构与功能——基于基因水平的脱氮机制

马佳莹; 王帆; 樊海枫; 李恩超; 褚华强; 周雪飞; 张亚雷

doi:10.1016/j.eng.2023.06.019

工程（英文） ›› 2024, Vol. 36 ›› Issue (5) : 76 -89. DOI: 10.1016/j.eng.2023.06.019

研究论文

宏基因组学揭示全规模焦化废水处理系统的微生物结构与功能——基于基因水平的脱氮机制

马佳莹 ^a ,
王帆 ^a ,
樊海枫 ^a ,
李恩超 ^c ,
褚华强 ^a^,^b ,
周雪飞 ^a^,^b ,
张亚雷 ^a^,^b

作者信息 +

Metagenomic Insight Reveals the Microbial Structure and Function of the Full-Scale Coking Wastewater Treatment System: Gene-Based Nitrogen Removal

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摘要

在焦化废水（CWW）生物处理系统中，微生物群落在污染物去除和系统稳定性维持方面起关键作用，但目前对其结构和功能的了解仍然不足。本研究在中国某全规模焦化废水处理系统中，对四个连续生物反应池，即缺氧1/好氧1/缺氧2/好氧2（A1/O1/A2/O2）进行了为期五个月的调查，以阐明其运行性能和微生物特征。结果表明，A1/O1/A2/O2在脱氮方面表现出色且稳定。最终生物出水中的总氮[TN; (17.38 ± 6.89) mg·L^-1]和氨氮[NH₄ ⁺-N; (2.10 ± 1.34) mg·L^-1]均符合国家标准。16S核糖体RNA（rRNA）测序和宏基因组测序的综合分析显示，A1和O1的细菌群落和基因功能特征相似，而A2的细菌群落结构与其他生物反应器显著不同（p < 0.05）。结果表明，微生物活性与活性污泥功能密切相关。Nitrospira、Nitrosomonas和SM1A02在初级缺氧-好氧（A1/O1）阶段参与硝化过程，Azoarcus和Thauera在A2中是重要的反硝化菌。A1/O1/A2/O2系统中的氮转化相关酶和基因在脱氮过程中发挥重要作用。催化羟化脱q氢酶（EC 1.7.2.6）基因hao和硝化还原酶（EC 1.9.6.1）基因napA和napB在初级A1/O1和二级A2/O2阶段的硝化和反硝化过程中起重要作用。混合液悬浮固体（MLSS）/总固体（TS）、总氮（TN）去除率（RR）、总有机碳（TOC）去除率和氨氮（NH₄ ⁺-N）去除率是影响细菌群落结构和氮转化基因的重要环境因素。Proteobacteria是A1/O1/A2/O2系统中参与氮代谢的主要参与者。本研究在基因水平上提供了对微生物群落及其功能的全面理解，对于全规模焦化废水生物处理过程的高效和稳定运行至关重要。

Graphical abstract

关键词

焦化废水 / 全规模 / 微生物群落 / 宏基因组测序 / 氮转化功能基因 / 环境因子

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马佳莹,王帆,樊海枫,李恩超,褚华强,周雪飞,张亚雷. 宏基因组学揭示全规模焦化废水处理系统的微生物结构与功能——基于基因水平的脱氮机制[J]. 工程（英文）, 2024, 36(5): 76-89 DOI:10.1016/j.eng.2023.06.019

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1 引言

钢铁工业已成为中国经济的支柱产业之一[1‒2]。2021年，中国的粗钢产量达到10.328亿吨，占全球总产量的52.95%。随着粗钢产量的增加，焦炭需求不断增长，导致焦化废水排放量持续增加[3‒4]。焦化废水（CWW）含有高浓度难降解的污染物，如酚类化合物、杂环芳烃、多环芳烃（PAHs）和氨氮等，是中国最难处理的工业废水之一[5‒7]。据报道，缺氧（A）/好氧（O）、A/A/O和A/O/O等生物处理工艺已被广泛应用于处理焦化废水[4]。此外，Wei等[8]应用了一种新型的O/水解（H）/O工艺处理CWW，并实现了较高的有机负荷（1.6~2.0 kg COD·m^-3·d^-1，COD为化学需氧量）。活性污泥技术依赖于复杂的微生物群落，广泛应用于焦化废水处理的生物系统[7,9]。微生物活动负责污水处理厂生物系统中的有机物、有毒污染物和营养物质的去除[10‒11]。此外，污水处理厂已成为重要的微生物生态系统，有助于揭示物质循环和转化[12]。迄今为止，微生物群落演替主要在市政污水处理系统中进行研究，而对焦化废水处理过程的微生物群落结构和功能了解甚少[13]。

由于焦化废水中含有高浓度的氨氮，使得生物处理出水中的氨氮和总氮难以达到中国日益严格的排放标准[14]。生物脱氮是一个复杂的过程，探讨焦化废水处理过程中的氮转化至关重要[15‒16]。此外，全规模焦化废水系统中的生物脱氮过程主要包括两个步骤：在好氧条件下的硝化和在缺氧条件下的反硝化，这主要由微生物群落的活动来完成[17‒18]。据报道，A/O/A/O工艺包括一个额外的缺氧阶段，有利于脱氮[4,19]。Thiobacillus、Pseudomonas、Thaurea和Nitrospira对焦化废水中的氮和有机物降解起着至关重要的作用[20]。此外，在我们以往的研究中，发现Nitrospira和Azoarcus在焦化废水处理的A/O/A/O系统中参与脱氮过程[19]。驱动氮循环的微生物和功能基因在地球生态系统中被广泛识别，但仍然缺乏在废水，特别是钢铁工业废水处理中的氮转化研究[21‒22]。

在焦化废水生物处理过程中，微生物群落结构与功能可能与pH值、温度和有机负荷率等环境条件密切相关[20,23‒24]。以往的研究中尚未探讨进水特征的季节变化是否会影响焦化废水处理系统中不同生物反应池中的微生物群落和功能[19,25‒27]。因此，阐明微生物群落组成、氮代谢过程及其与环境因子在空间和时间上的联系，对于监测和提高全规模A/O/A/O系统的效率和稳定性至关重要。宏基因组技术和生物信息学分析的最新进展为揭示各种环境中的复杂微生物结构和功能特性提供了新的机会[28]。因此，采用宏基因组和16S rRNA测序分析以评估微生物群落及其对环境变化的功能响应非常重要[11]。此外，与实验室规模的研究相比，全规模处理系统的调查可对微生物功能提供更准确的见解。据我们所知，尚无基于宏基因组学的全规模A/O/A/O焦化废水处理系统中微生物代谢和氮转化功能特征的研究。

在本研究中，在由四个连续生物反应池（A1/O1/A2/O2）组成的全规模焦化废水处理系统中进行了长期季节性调查。在五个月的时间里，从四个生物反应池中收集活性污泥进行16S rRNA测序和宏基因组测序，以实现以下目标：①评估全规模A1/O1/A2/O2系统处理焦化废水的长期运行性能和稳定性；②识别关键微生物群落和潜在的污染物去除代谢途径；③揭示氮转化代谢过程、关键酶和功能基因；④揭示氮转化过程的功能微生物及其对环境因子的响应。据我们所知，本研究是首次通过宏基因组分析来识别全规模A1/O1/A2/O2焦化废水系统中氮转化过程的综合功能特征和关键因素。此外，本研究将对焦化废水处理过程应对环境变化时提高系统性能和管理效率至关重要。

2 材料与方法

2.1 全规模焦化废水处理系统

本文研究的全规模焦化废水生物处理系统（A1/O1/A2/O2, 80~100 m³·d^-1）位于中国上海某钢铁工业厂内。焦化废水原水经溶剂脱酚和蒸氨工艺组成的预处理系统处理，再经生物处理系统，出水进入由混凝和终沉组成的三级处理系统（图1）。表1概述了焦化废水原水、经溶剂脱酚处理的蒸氨原水和经蒸氨处理的生物进水的特性。焦化废水原水中COD、总有机碳（TOC）、总氮（TN）和氨氮（NH₄ ⁺-N）的平均浓度分别为(5959.56 ± 589.74)、(1338.10 ± 125.62)、(5760.44 ± 297.39)和(3217.03 ± 194.60) mg·L^-1。初级AO阶段包括缺氧生物反应池（A1）和好氧生物反应池（O1），二级AO阶段包括缺氧生物反应池（A2）和好氧生物反应池（O2），构成A1/O1/A2/O2系统。初级和二级AO的污泥回流比均接近100%，硝化液回流比为300%。A1/O1/A2/O2系统水力停留时间为108~135 h，污泥停留时间为50~70 d，有机负荷率为0.62~0.77 kg COD·m^-3·d^-1（附录A表S1）。在A2生物反应池中添加碳源（甲醇∶乙酸钠= 2∶1，质量比），以达到较高的脱氮效率，添加碳源与硝酸盐的质量比为3∶1。A2池中的生物膜载体为直径为150 mm的聚乙烯介质，均匀负载维纶纤维，填充率约为50%。在约五个月的时间里，对A1/O1/A2/O2系统的四个生物反应池的进水和出水每周取样两次。采样日的空气温度和环境湿度见附录A图S1。

2.2 污泥样品与DNA提取

分别在夏季（SUM）、秋季（AUT）和冬季（WIN）三个季节，从生物反应池A1、O1、A2和O2中共采集了36个污泥样本，命名为含季节和反应器标签的SUM-A1、SUM-O1、SUM-A2和SUM-O2等。为确保样本具有代表性，每个污泥样本由来自相应生物反应池的三个独立样本组成，并充分混合以获得均匀样本。此外，每个样本包含三个平行样。污泥样本在送至上海派森诺生物科技股份有限公司（中国）进行DNA提取和后续测序前，存于-80 ℃。采用DNA提取试剂盒（Omega，美国）从污泥样本中提取DNA。通过凝胶电泳分析DNA完整性，并使用QUBIT 4.0（Thermo Fisher Scientific，美国）定量分析DNA。

2.3 16S rRNA基因测序分析

采用16S rRNA基因V3‒V4可变区的引物组（338F, 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'; 806R, 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对提取的DNA进行扩增。扩增子文库在Illumina NovaSeq平台上进行双端测序。原始序列使用QIIME 2软件进行处理[29]，代表性序列的分类信息注释采用基于classify-sklearn的SILVA数据库[30]。

2.4 宏基因组测序分析

宏基因组测序在Illumina NovaSeq平台上进行，采用双端测序[2×150碱基对（bp）]。通过使用fastp软件（版本0.20.0）修剪和去除低质量的原始序列（包括短于50 bp和含有N碱基的序列）以获得优化序列[31]。随后，使用MEGAHIT软件将获得的优化序列组装成contigs，参数为“--k_list 33,55,77,99,12”[32]。选择大于300 bp的contigs进行进一步分析。此外，采用多对多序列搜索2（MMseqs2）将蛋白质序列与京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库进行比对，进一步获得对应基因的KEGG功能和KEGG本体（KO）丰度[33]。

2.5 理化分析方法

通过在生物反应池中记录仪器原位测量水温和溶解氧（DO）。pH值和电导率（EC）分别通过pH计（6010 M；JENCO，美国）和电导率仪（3200C；Agilent，美国）进行分析。根据标准方法测量COD、NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N和亚硝酸盐氮（NO₂ ^--N）、混合液悬浮固体（MLSS）、混合液挥发性悬浮固体（MLVSS）、总固体（TS）和挥发性固体（VS）[34]。总有机碳和总氮使用TOC/TN分析仪（TOC-LCPH/CPN；岛津，日本）测量。酚类化合物、含氮杂环化合物（NHCs）和多环芳烃化合物通过气相色谱（GC）× GC飞行时间质谱仪（Pegasus BT 4D；LECO，美国）研究。

2.6 统计分析与数据处理

统计分析包括单因素方差分析（ANOVA）和相关性分析，使用SPSS 23（IBM，美国）进行。所有实验均进行三次重复。通过pheatmap R包在R（版本4.2.1）中进行热图可视化。冗余分析（RDA）使用rdacca.hp R包进行[35]。主要坐标分析（PCoA）使用vegan R包进行。iCAMP R包根据Ning等[36]报道的方法在R中实施，以量化不同生物反应器中生态过程的相对重要性。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和Mantel检验分别通过mixOmics R包和ggcor R包进行。细菌属的相对丰度之间的相关性基于Spearman秩相关系数矩阵使用R计算。此外，共现网络使用Gephi 0.9.2进行可视化。

3 结果与讨论

3.1 A1/O1/A2/O2系统的运行参数

A1/O1/A2/O2系统的pH值、EC、DO和水温如附录A中图S2和图S3所示。A1、O1和O2出水的pH值分别为6.88~7.71、6.80~7.81和7.11~8.03[附录A图S2（a）]。A2出水的pH值为7.12~8.87，显著高于A1、O1和O2出水[附录A图S2（a）和表S2，p < 0.001]。四个生物反应池出水的EC范围为5.07~9.74 mS·cm^-1 [图S2（b）]。O1和O2生物反应池的DO含量分别为3.17~7.79 mg·L^-1和5.1~7.09 mg·L^-1 [图S2（c）]。四个生物反应池的水温（33.4~41.5 ℃）在监测期内（SUM、AUT、WIN）无显著差异[附录A图S2（d）和表S3]。四个生物反应池中安装了温度调节器，使SUM、AUT和WIN的水温波动保持相对稳定[图S2（d）]。A1、O1和O2生物反应池中的MLSS浓度分别为1720~3380、1632~3872和1728~3734 mg·L^-1，A1、O1和O2生物反应器中的MLVSS值分别为810~2100、744~2122和630~2232 mg·L^-1 [附录A图S3（a）]。A2中的活性污泥黏附于填料载体，载体上活性污泥的TS值为20.7~28.6 g·L^-1，VS值为20.6~28.5 g·L^-1 [附录A图S3（b）]。

3.2 污染物的生物转化和脱氮效率

生物进水、初级AO出水和二级AO出水中COD和TOC的平均浓度如图2（a）所示。生物进水COD值为743.00~1653.50 mg·L^-1，平均浓度为(1155.47 ± 223.55) mg·L^-1。初级AO阶段和整个A1/O1/A2/O2系统的COD平均去除率分别约为77.4%和78.1%。此外，还研究了A1/O1/A2/O2系统中TOC的降解过程，在初级AO阶段和整个A1/O1/A2/O2系统中TOC的平均去除率分别为82.5%和81.3%。结果表明，大部分COD和TOC在初级AO阶段被降解，但难降解的COD和TOC以难降解有机物的形式留在生物出水中。

生物进水、初级AO出水和二级AO出水中TN、NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N浓度的变化如图2（b）所示。生物进水TN平均浓度为(227.78 ± 56.18) mg·L^-1。初级AO阶段和A1/O1/A2/O2系统对TN的去除率分别为46.6%和92.4%，初级AO出水和二级AO出水的TN浓度分别为(121.69 ± 29.54) mg·L^-1和(17.38 ± 6.89) mg·L^-1。生物进水NH₄ ⁺-N浓度为(81.56 ± 30.83) mg·L^-1，初级AO阶段和整体A1/O1/A2/O2的出水NH₄ ⁺-N浓度分别降至(2.89 ± 2.41) mg·L^-1和(2.10 ± 1.34) mg·L^-1，去除率分别为96.5%和97.4%。此外，生物进水中的NO₃ ^--N浓度为(67.99 ± 10.54) mg·L^-1，在初级AO出水中增至(94.42 ± 25.47) mg·L^-1，二级AO出水的NO₃ ^--N浓度为(10.03 ± 6.48) mg·L^-1，A1/O1/A2/O2的总去除率为89.4%。这证实了在初级AO阶段，O1发生了硝化过程，而在二级AO阶段，A2发生了反硝化过程。初级AO出水和二级AO出水的NO₂ ^--N浓度较低（附录A，图S4）。最终生物出水的TN和NH₄ ⁺-N浓度均满足中国国家标准（GB 16171‒2012，TN < 20 mg·L^-1 和 NH₄ ⁺-N < 10 mg·L^-1）[37]，这表明A1/O1/A2/O2系统具有高效的脱氮效率。先前的研究[4,38]报道的全规模焦化废水生物系统A/A/O和A/O/O的出水TN浓度分别为25.00 mg·L^-1和300.60 mg·L^-1。因此，结果表明A1/O1/A2/O2工艺具有较好的脱氮效果。

图2（c）显示了不同采样时段内A1/O1/A2/O2对COD、TOC、TN和NH₄ ⁺-N的去除率。SUM、AUT和WIN时段内A1/O1/A2/O2对COD的平均去除率分别为77.7%、81.1%和73.9%。AUT的COD去除率明显高于SUM和WIN（附录A，表S4，p < 0.05），这可能是由于AUT生物进水中的COD值最低（平均为1008.71 mg·L^-1）。SUM、AUT和WIN时段内A1/O1/A2/O2对TOC的平均去除率分别为76.8%、82.3%和82.2%。此外，在不同采样时段，TN和NH₄ ⁺-N的平均去除率分别为91.3%~92.8%和96.8%~98.0%。各生物反应池对A1/O1/A2/O2工艺去除COD、TOC、TN和NH₄ ⁺-N总量的贡献见图2（d），计算公式见附录A中补充文本S1。在四个生物反应池中，O1对A1/O1/A2/O2过程中COD去除率的贡献最高，平均值为88.86%。A1和A2对总COD去除的贡献率分别为-4.42%和-39.71%，这表明A1和A2出水中的COD值分别比A1和A2进水中的COD值有所增加，O2对COD的去除的贡献率为29.72%。此外，A1、O1、A2和O2对TOC总去除率的贡献率分别为33.48%、56.75%、-46.24%和47.94%。两个好氧生物反应池的COD去除率和TOC去除率均为正值，这可能归功于好氧氧化作用[8]。A2对COD和TOC去除的显著负贡献可能是由于用于反硝化碳源的添加。A1、O1、A2和O2对TN总去除率的贡献率分别为14.03%、1.94%、43.45%和1.44%。结果表明，缺氧生物反应池（包括A1和A2）中，TN的去除主要是通过反硝化作用实现的[8,39]。在NH₄ ⁺-N总去除率方面，A1、O1、A2和O2生物反应池的对NH₄ ⁺-N总去除率的贡献率分别为-60.16%、158.87%、-6.15%和10.10%。A1对NH₄ ⁺-N总去除率的负贡献表明，NH₄ ⁺-N是由有机氮氨化产生的。此外，O1对NH₄ ⁺-N的去除贡献最大，表明发生了硝化作用。

经预处理系统后，酚类化合物和含氮杂环化合物（喹啉、异喹啉和吲哚）是焦化废水生物进水中的特征毒性污染物。在SUM、AUT和WIN，A1/O1/A2/O2对总酚类化合物的去除率分别为99.9%、99.7%和98.9% [图3（a）]。此外，大多数酚类化合物在A1中降解，酚类化合物在厌氧环境中可生物降解为CH₄和CO₂ [40]。含氮杂环化合物是焦化废水中的特征污染物，据报道对微生物具有毒性[30,41‒42]。在整个生物处理过程中，喹啉、异喹啉和吲哚的去除率分别为99.91%~99.96%、99.80%~99.91%和99.83%~99.99% [图3（b）]。结果表明，A1/O1/A2/O2系统高效降解喹啉、异喹啉和吲哚，其中大部分化合物在初级AO阶段被去除。多环芳烃也被认为是在焦化废水中的特征污染物[43]。如表1所示，预处理工艺去除了大部分多环芳烃，生物进水中的多环芳烃浓度降至较低水平。在A1出水中，SUM、AUT和WIN的总多环芳烃平均浓度降至(3.71 ± 1.97) μg·L^-1，表明残留的多环芳烃在A1中得到了有效去除（附录A图S5）。

3.3 细菌群落结构和关键驱动因素

采用16S rRNA基因测序，以确定不同采样期A1/O1/A2/O2过程中细菌群落的演变特征。计算了α多样性指数，以评估细菌群落的多样性[图4（a）]。各样本测序的稀疏曲线显示，所有样本的Chao1、Shannon和Simpson指数都达到稳定（附录A，图S6）。此外，Good覆盖率在97.6%~99.0%之间，表明各污泥样品的测序深度足够。污泥样本的丰富度指数在A1、O1、A2和O2中的平均值分别为3219.87、2988.19、2734.08和3513.72。在A1、O1、A2和O2中，Shannon指数的平均值分别为7.24、7.08、6.63和7.35，Simpson指数的平均值分别为0.9710、0.9729、0.9426和0.9643。四个生物反应池的α多样性指数无明显差异（附录A，表S5）。

A1/O1/A2/O2处理系统中，Proteobacteria，Bacteroidetes和Chloroflexi是三个优势菌门[图4（b）]，这些菌在污水处理厂和其他焦化废水处理系统的污泥中普遍存在[38,44]。A1/O1/A2/O2处理系统中，Proteobacteria的相对丰度最高，在A1、O1、A2和O2中分别占49.8%、51.3%、57.5%和45.3%。Proteobacteria主要负责有机化合物去除和碳矿化[6,45]。此外，Bacteroidetes和Chloroflexi也被认为能够降解大分子有机物[46]。在A1、O1、A2和O2中，Bacteroidetes的平均相对丰度分别为9.4%、9.4%、14.8%和6.2%，Chloroflexi的平均相对丰度分别为5.0%、5.9%、15.6%和10.5%。Acidobacteria在初级AO阶段的平均丰度较高（A1为13.5%，O1为11.4%，A2为0.5%，O2为5.6%），能够降解极高浓度的污染物[47]。Nitrospirae是典型的亚硝酸盐氧化细菌[48]。值得注意的是，Nitrospirae在初级AO阶段的相对丰度较高（A1为9.4%，O1为7.9%），而在二级AO阶段则明显较低（A2为0.2%，O2为3.8%）（附录A表S6，p < 0.05）。结果表明，Nitrospirae对初级AO阶段的硝化作用至关重要。

属水平细菌群落前25的分类组成如图4（c）所示。A1/O1/A2/O2处理系统中，主要细菌属是Thauera、Thiobacillus、SM1A02、SBR1031、Nitrospira、Hyphomicrobium和NS9_marine_group。Thauera参与焦化废水处理系统中几种芳香族化合物的去除和反硝化过程[26,49]。其在A1、O1和A2中的平均相对丰度分别为14.2%、12.3%和27.5%，但在O2中仅为3.5%。此外，Thiobacillus在初级AO阶段的平均相对丰度（A1为11.7%，O1为12.3%）高于二级AO阶段（A2为0.3%，O2为3.6%）。Thiobacillus在焦化废水处理过程中降解硫化物、氨氮和硫氰酸盐，并具有反硝化能力[25,50]。Alicycliphilus是在初级AO阶段参与难降解有机污染物，具有脱碳/解毒的功能的微生物（A1和O1分别为3.4%和4.3%，A2和O2分别为0.1%和0.8%；附录A，表S7，p < 0.001）[38]。硝化作用在脱氮过程中起着关键作用，它为反硝化作用提供NO _x [51]。Nitrospira和Nitrosomonas是氨氧化细菌中的两大类[52]。Nitrospira是初级AO阶段氮转化过程氨化和硝化过程中最重要的参与者[53]，在A1和O1中的相对丰度分别为9.4%和7.9%。Nitrosomonas在A1、O1、A2和O2中的平均相对丰度分别为0.63%、0.67%、0.03%和0.32%。此外，除Nitrospira和Nitrosomonas外，SM1A02也是一种与氨转化有关的硝化细菌[54,55]，其在A1和O1中的平均丰度分别为5.9%和6.5%。值得注意的是，Azoarcus在A2中的平均相对丰度高达2.2%（表S7，p < 0.05）。Azoarcus和Thauera作为重要的反硝化菌，在缺氧和好氧环境的反硝化过程中发挥协同作用[25,49]。如上所述，细菌群落与典型污染物和脱氮密切相关。在初级AO阶段，Thauera、Thiobacillus和Alicycliphilus负责酚类化合物、含氮杂环化合物和多环芳烃的脱碳/解毒。此外，Nitrospira、Nitrosomonas和SM1A02是初级AO阶段的主要硝化细菌。Azoarcus和Thauera在生物反应池A2中将NO₃ ^--N转化为氮气的反硝化作用中发挥了重要作用。微生物活动在A1/O1/A2/O2系统的污染物转化和脱氮过程中发挥了重要作用。

根据iCAMP分析，对四个生物反应池中不同生态过程的相对重要性进行了分析。同质性选择（HoS）是所有生物反应池中最重要的确定性过程，相对占比为46.47%~62.67%（附录A图S7）。此外，漂移（DR）是所有生物反应池中最重要的随机过程，相对占比为18.57%~37.18%（附录A图S7）。此外，在A1、O1和A2中，异质性选择（HeS）和HoS的总相对占比大于50%，这表明群落组装是由确定性过程决定的。在O2中，同质化扩散（HD）、DR和扩散限制（DL）的总相对占比大于50%，表明群落组装是由随机过程决定的。β多样性分析对于明确微生物群落结构特性至关重要[11,56]。PCoA用于评估细菌群落整体结构的变化。PCoA结果表明，A1、O1、A2和O2的细菌群落存在明显差异（图5，p < 0.05）。A1和O1的细菌群落聚集在一起，表明初级AO阶段具有相似的功能结构。这种现象可能是由于硝化液回流（300%）与活性污泥从生物反应池O1到生物反应池A1导致初级AO阶段微生物的均匀混合，这与之前的研究一致[4,38]。A2池细菌群落与其他生物反应池明显分离，这表明A2的细菌群落与其他生物反应器的细菌群落存在显著区别。

3.4 氮转化途径的代谢特征

从36个污泥样本中总共收集了27.1亿个原始宏基因组序列，平均每个样本有7538万个序列（附录A表S8）。剔除低质量序列后，优化序列的平均百分比为99.24%（附录A表S9）。组装后，共获得了1003万个长度超过200 bp的contigs（附录A表S10）。通过KEGG功能分类分析确定了不同样本中微生物群落的代谢特征。PLS-DA表明来自四个不同生物反应池的污泥样品存在显著区别[图6（a）]。结果表明，微生物群落的代谢特征与不同生物反应池中污泥相关，这与相应的微生物群落特征一致。因此，A1/O1/A2/O2系统中，细菌群落结构和代谢特征与活性污泥的功能密切相关。

附录A中图S8和S9显示了基于KEGG数据库的一级和二级代谢途径。图6（b）显示了主要的三级代谢途径，进一步阐明微生物群落的代谢特征。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成（2.3%~2.9%）、酮体的合成与分解（1.4%~2.5%）以及氨酰转移RNA（tRNA）生物合成（1.6%~2.3%）是不同污泥样本中最主要的功能。此外，单因素方差分析表明，共有20种代谢途径在A2中显著富集，4种代谢途径在A2中显著低于其他生物反应池（附录A表S11，p < 0.05）。为了适应环境变化，不同功能的生物反应池中的微生物能够调节其代谢过程[33]。在生物反应池A1、O1、A2和O2中，氮代谢的平均相对丰度分别为0.99%、0.95%、1.01%和0.87% [图6（b）]。

为了解A1/O1/A2/O2系统氮转化的特征，根据KEGG数据库确定了关键酶（附录A表S12）。氮转化的核心反应过程由酶网络驱动[57]，如图7（a）和（b）所示。在硝化途径中，氨单氧酶（EC 1.14.99.39）、羟胺脱氢酶（EC 1.7.2.6）和亚硝酸盐氧化还原酶（NxrAB）参与其中。NxrAB参与将NO₂ ^--N氧化为NO₃ ^--N [图7（a）]。值得注意的是，A1（0.17%）和O1（0.15%）中NxrAB的平均相对丰度显著高于A2（0.08%）和O2（0.12%）[图7（b），附录A表S13，p < 0.05 ]，证实硝化过程主要发生在初级AO阶段。如图7（a）所示，固氮酶（EC 1.18.6.1）驱动固氮过程，将N₂还原为NH₄ ⁺-N。A2中EC 1.18.6.1的平均相对丰度为0.04%，显著高于A1、O1和O2（p < 0.001）。硝酸还原酶（EC 1.7.5.1和EC 1.9.6.1）参与反硝化过程。EC 1.7.5.1在A2池中的相对丰度很低（0.09%, p < 0.05）。相比之下，EC 1.9.6.1在A2池中的相对丰度显著高于其他生物反应池（0.05%, p < 0.01）。结果表明，EC 1.9.6.1在反硝化过程中的异化硝酸盐还原过程中发挥了重要作用。此外，O2池中的氧化亚氮还原酶（EC 1.7.2.4）显著低于其他生物反应池。在异化硝酸盐还原过程，A2系统中亚硝酸盐还原酶（EC 1.7.1.15和EC 1.7.2.2）的平均相对丰度（分别为0.03%和0.04%）显著高于初级AO系统（p < 0.05）。结果表明，亚硝酸盐还原过程（NO₂ ^--N转化为NH₄ ⁺-N）在A2池中十分活跃，而NH₄ ⁺-N并未在A2出水中积累。

如图7（c）所示，分析了四个生物反应池中的氮转化功能基因。amoA、amoB、amoC、hao、narG和narH是参与硝化过程的关键基因。在A1和O1池中，驱动NH₂OH氧化为NO₂ ^--N的hao基因的平均相对丰度较高。在反硝化和异化硝酸盐还原过程中，narG、narH、narI、napA和napB都是将NO₃ ^--N还原为NO₂ ^--N的关键功能基因。在A1和O1池中，narG和narH的丰度更高，而在A2池中，napA和napB的平均相对丰度显著更高（附录A表S14，p < 0.05）。nirK和nirS参与将NO₂ ^--N还原为NO，norB和norC参与将NO转化成N₂O。此外，nosZ负责将N₂O还原成N₂。驱动异化亚硝酸盐还原酶的基因中，nrfA和nrfH在A2池的丰度显著高于其他生物反应池（p < 0.05），平均相对丰度分别为0.02%和0.01%。在固氮途径中，催化EC 1.18.6.1将N₂还原为NH₄ ⁺-N的nifH、nifD和nifK在A2池中的平均相对丰度也显著高于其他系统（p < 0.01）。结果表明，A2池在监测期间具有良好的固氮能力。结果揭示了生物系统在焦化废水处理过程中氮代谢途径的功能特征。在A1/O1/A2/O2处理系统中，与氮转化相关的关键酶和基因协同工作。此外，在初级AO阶段，催化羟化脱氢酶的hao基因在硝化过程中发挥了重要作用。在二级AO阶段，催化硝酸还原酶（EC 1.9.6.1）的napA和napB基因在反硝化过程中起重要作用。

3.5 环境因子与细菌群落和氮转化基因的相关性

如上所述，在四个不同的生物反应池中，细菌群落和功能代谢特征显著不同。Jiang等[23]的研究表明，环境因素对微生物群落结构具有重要影响。为进一步探究环境因素、细菌群落和氮转化相关基因之间的潜在关系，进行了RDA分析[图8（a）和（c）]。图8（b）显示了关键环境因子对核心细菌群落结构差异的影响。RDA1和RDA2对核心细菌群落结构变化的总解释度为70.60%（p < 0.001, R ² = 0.8719, R ² adjust = 0.7652）[图8（a）]。雷达图表明，MLSS/TS、TN去除率和NH₄ ⁺-N去除率是最主要的环境因子，其个体解释度分别为25.54%、23.95%和21.15%（相对于总R ² adjust）[图8（b）]。此外，NH₄ ⁺-N去除率和TOC去除率均与Thiobacillus、Nitrospira、NS9_marine_group和Alicycliphilus相关，表明这些菌属在初级AO阶段负责参与硝化过程和主要污染物的去除[图8（a）]。其中，Nitrospira与NH₄ ⁺-N去除率呈正相关，表明Nitrospira负责NH₄ ⁺-N转化[58]。Thauera与TN去除率呈正相关，并与反硝化作用有关[38]。Ignavibacterium、Lentimicrobiaceae和Blvii28_waste water_sludge_ group与MLSS/TS和MLVSS/VS关系密切。此外，MLSS/TS与TN去除率呈正相关，这与之前研究表明MLSS对TN去除率存在显著影响的结果一致[59]。MLSS与微生物的生长和生物系统的抗冲击能力有关[60]。因此，MLSS/TS是评价污泥性能和微生物群落结构变化的重要指标。

环境因子与氮代谢功能基因间的关系如图8（c）所示。RDA1和RDA2对氮代谢功能基因变化的总解释度为71.82%（p < 0.001, R ²= 0.8621, R ² adjust = 0.7472）[图8（c）]。雷达图表明，MLSS/TS、TOC去除率和NH₄ ⁺-N去除率的个体解释度最高，分别占氮转化功能基因变化总解释度的38.41%、21.06%和15.34%（相对于总R ² adjust）[图8（d）]。编码硝酸还原酶的narG和narH与NH₄ ⁺-N和TOC去除率密切相关[图8（c）]。此外，napA、napB、nrfA、nrfH、nifH、nifD和nifK均与MLSS/TS相关。MLSS对氮转化相关基因功能和反硝化过程的正向调节至关重要[59]。

Mantel检验结合相关性分析，用于探讨环境因子和运行参数对细菌群落动态演化、氮转化功能基因和氮转化关键酶的影响（图9）。结果表明，在监测期间，除EC、水温、总酚类化合物去除率和总多环芳烃去除率外，环境因子和运行参数对四个不同生物反应池均具有显著影响（Mantel’s p < 0.05）。这与RDA的结果一致，即多种环境因子共同解释微生物群落和氮转化基因与关键酶的变化。此外，相关性分析表明，除EC和水温外，所有运行参数均有较强的相关性（附录A表S15）。

3.6 氮转化过程的功能微生物

为揭示优势细菌属与氮转化功能基因间的相互作用和氮转化过程的功能微生物，本研究进行了网络分析[图10（a）]。在监测期间，50个细菌属与氮转化功能基因通过349个节点连接（Pearson’s r > 0.6, p < 0.05）。前50位的细菌属中，17个细菌属与10个以上的氮转化功能基因存在显著关联，这些细菌属主要属于Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、Firmicutes、Dadabacteria和Nitrospirae。其中，Azoarcus与功能基因的关联节点最多，包括amoB、hao、narG、narH、napA、napB、nirK、nirA、nirB、nirD、nrfA、nrfH、nifH和nifD。因此，Azoarcus作为关联网络中的“枢纽”，在氮转化过程中发挥重要作用[57]。先前的研究也表明，在废水处理系统中，Azoarcus是去除NO₃ ^--N和TN的主要贡献者[61‒62]。另一方面，amoB、narG、narH、napB、nirK、nirA和nifH与细菌群落具有密切的相关性，连接数超过25个，表明这些功能基因与多种细菌相关。此外，氮转化基因间存在63个连接节点（p < 0.01）。

此外，宏基因组分析结果显示了氮转化功能基因的潜在宿主[图10（b）]。在监测期间，多数与氮转化相关的基因均属于Proteobacteria，因此它可能是焦化废水A1/O1/A2/O2处理系统中氮转化过程的主要参与者。这项结果与Proteobacteria是亚热带河口氮转化功能基因最重要的贡献者的研究一致[63]。硝化过程中，仅在Proteobacteria中检测到amoA、amoB和amoC。此外，Nitrospirae是A1、O1和O2中narH的重要来源，但在A2中却没有发现，这表明narH在将NO₂ ^--N转化为NO₃ ^--N的过程中发挥了关键作用。在反硝化过程中，narG、narH和narl广泛分布于A1/O1/A2/O2系统中的Actinobacteria中。napA和napB主要分布于Proteobacteria、Planctomycetes和Verrucomicrobia。此外，nirK广泛来源于Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、Actinobacteria和Candidatus，而nirS则主要来源于Proteobacteria和Chloroflexi。norB、norC和nosZ主要存在于Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi和Planctomycetes。结果表明，Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、Planctomycetes和Actinobacteria在反硝化过程中发挥着重要作用。值得注意的是，属于古菌的Euryarchaeota是nifD、nifK和nifH的重要来源。

4 结论

本研究对中国某A1/O1/A2/O2全规模焦化废水处理系统进行五个月的连续监测，全面了解该系统的运行性能、微生物群落结构和功能特性。A1/O1/A2/O2系统运行高效稳定，脱氮效果极佳，并对酚类化合物、多环芳烃和含氮杂环化合物等典型污染物进行生物转化。细菌群落结构和代谢特性与A1/O1/A2/O2系统中活性污泥的功能密切相关。Nitrospira、Nitrosomonas和SM1A02被认为是初级AO阶段硝化过程的优势菌属，而Azoarcus和Thauera则在二级AO阶段的反硝化过程中发挥重要作用。此外，全面揭示了A1/O1/A2/O2系统中氮转化过程的关键酶和功能基因。细菌群落和氮转化基因的变化与MLSS/TS、TN去除率、NH₄ ⁺-N去除率和TOC去除率密切相关。Proteobacteria是A1/O1/A2/O2焦化废水处理系统氮转化过程的主要参与者。本研究加深了对全规模A1/O1/A2/O2焦化废水处理系统中微生物生态的了解，对于工程师和生态学家在面对环境变化时改善系统运行性能和管理效率具有重要意义。

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