具有生物降解性的抗细菌黏附-抗菌壳聚糖磺基甜菜碱膜的制备与性能研究

殷茂力 ,  王英沣 ,  任学宏 ,  黄东时

工程（英文） ›› 2024, Vol. 35 ›› Issue (4) : 95 -103.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 35 ›› Issue (4) : 95 -103. DOI: 10.1016/j.eng.2023.06.020
研究论文

具有生物降解性的抗细菌黏附-抗菌壳聚糖磺基甜菜碱膜的制备与性能研究

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Development of a Biodegradable, Cytocompatible, Antibacterial, and Biofilm-Controlling Chitosan Sulfobetaine Derivative Film as a Biological Material

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摘要

本研究旨在通过溶液浇铸法开发一种可降解的生物医用抗菌材料——壳聚糖磺基甜菜碱（CS-SNCC）膜。以壳聚糖和一氯三嗪磺基甜菜碱为原料制备CS-SNCC，并利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）、能量色散X射线光谱（EDX）和X射线光电子能谱（XPS）对合成的CS-SNCC的结构进行表征和分析。研究CS-SNCC膜的溶胀性、热稳定性、生物降解性、细胞相容性和抗菌性，并与壳聚糖膜进行比较。膜的酶生物降解性测试表明，CS-SNCC膜在溶酶菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中放置21天后重量下降45.54%。另外，CS-SNCC膜能有效抵抗细菌黏附，控制细菌生物被膜的形成，且具有很高的抗菌活性，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的灭活率分别为93.43%和91.00%。细胞毒性测试表明，CS-SNCC膜具有良好的细胞相容性。研究所制备的可生物降解、细胞相容、抗菌和生物被膜控制功能的CS-SNCC膜具有巨大的生物医学应用潜力。

Abstract

The purpose of this research was to develop a chitosan sulfobetaine (CS-SNCC) film via the solution-casting method as a biodegradable antibacterial material for biomedical applications. Chitosan and monochloro-triazine sulfobetaine were used as the raw materials for CS-SNCC preparation, and Fourier-transform infrared (FTIR), ultraviolet-visible (UV-Vis), energy-dispersive X-ray (EDX), and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) spectra were used to characterize and analyze the structure of the synthesized CS-SNCC. Furthermore, the swelling property, thermal stability, biodegradability, cytocompatibility, and antibacterial properties of the CS-SNCC film were comprehensively investigated and compared with those of the chitosan film. The results for the film’s enzymatic biodegradation behavior show that the CS-SNCC film undergoes a weight loss of 45.54% after 21 days of incubation. In addition, the CS-SNCC film effectively resists bacterial adhesion, prevents the formation of bacteria biofilms, and exhibits high antibacterial activity, with inactivation rates of 93.43% for Escherichia coli and 91.00% for Staphylococcus aureus. Moreover, the CS-SNCC film shows good cellular activity and cytocompatibility according to the cytotoxicity results. Therefore, the prepared biodegradable, cytocompatible, antibacterial, and biofilm-controlling CS-SNCC film has potential for biomedical applications.

关键词

壳聚糖 / 磺基甜菜碱 / 抗菌性 / 生物膜控制 / 膜

Key words

Chitosan / Sulfobetaine / Antibacterial / Biofilm-controlling / Film

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殷茂力,王英沣,任学宏,黄东时. 具有生物降解性的抗细菌黏附-抗菌壳聚糖磺基甜菜碱膜的制备与性能研究[J]. 工程（英文）, 2024, 35(4): 95-103 DOI:10.1016/j.eng.2023.06.020

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1 引言

由于机械创伤、外科手术、烧伤、溃疡或日常活动都会产生各种皮肤伤口。这些伤口易引发细菌感染，形成伤口渗出物和炎症，阻碍伤口的修复[1‒2]。为此，研究人员开发了诸多生物医学材料，如纳米纤维、海绵、水凝胶、薄膜和涂层等，以保护伤口、抑制细菌入侵并促进伤口愈合[3‒8]。聚合物膜材料因制造工艺简单、结构均匀透明（可观察伤口变化）以及与伤口紧密黏附等特点备受关注[6,9]。另外，基于天然生物聚合物的膜材料因具有生物相容性和生物可降解性以及天然聚合物分子的亲水性而受到关注。这类生物基膜材料容易从伤口移除，可避免二次损伤，还能湿润伤口环境，促进伤口恢复[9‒11]。

壳聚糖是一种可生物降解的阳离子多糖，由葡糖胺和随机分布的N-乙酰葡糖胺单体通过β-1,4-糖苷键连接而成[3]。在过去几年里，壳聚糖因其固有的抗菌特性、良好成膜能力、生物相容性、无抗原性、多种生物活性以及镇痛和止血活性，成为备受关注的生物材料[12‒13]。其中，壳聚糖基抗菌生物活性膜材料已被广泛研究。然而，壳聚糖的抗菌活性一般，这可能会限制其应用。所以，许多研究人员致力于通过改性、接枝和复合等方法提高壳聚糖的抗菌性能[14]，如壳聚糖季铵盐[15]、烷基和芳香族壳聚糖[16]、氨基酸和抗菌肽接枝壳聚糖[17]以及壳聚糖/无机纳米材料等衍生物[18‒19]。

甜菜碱是一类在分子片段上同时含有阳离子和阴离子的化合物，能有效促进伤口愈合[20‒21]。这类材料具有良好的生物降解性、生物相容性、亲水性和抗菌活性，能有效防止非特异性蛋白质吸附污染，在提高材料的抗黏附性方面潜力巨大[22‒24]。磺基甜菜碱同时含有阴离子磺酸基和阳离子三甲基铵基，因其易于合成和纯化以及具有生物仿生能力，成为生物材料中最具吸引力的两性离子化合物之一[23]。添加磺基甜菜碱可显著提高壳聚糖的抗菌性能[22]。然而，基于壳聚糖磺基甜菜碱衍生物的生物基膜材料的研究却鲜有报道。

本研究中合成了一种新型三嗪两性离子磺基甜菜碱（SNCC），并用于壳聚糖的改性。对制备的壳聚糖磺基甜菜碱（CS-SNCC）膜进行测试，以评估其在生物医用材料中的应用。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振光谱（NMR）、紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）、能量色散X射线光谱（EDX）和X射线光电子能谱（XPS）对合成的CS-SNCC衍生物进行了系统研究和分析。研究了CS-SNCC的晶体结构并进行热分析。另外，研究了CS-SNCC膜的溶胀性、生物降解性、细胞相容性、抗菌性和生物膜控制特性，并评估了该膜材料在伤口敷料领域的适用性。

2 材料和方法

2.1 材料

壳聚糖（黏度平均分子量M v =50 kDa，90%脱乙酰化）购自浙江澳兴生物有限公司。N,N-二甲基乙醇胺、1,3-丙烷磺内酯、2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪购自中国百灵威科技有限公司。碳酸钠、冰醋酸和丙酮购自上海国药化学试剂有限公司。化学试剂根据购买时的质量直接使用，无需额外纯化。溶菌酶（取自鸡蛋白）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。使用的金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）O157:H7分别为美国典型培养物保藏中心（ATCC）6538和ATCC43895。表达绿色荧光蛋白（GFP）的NIH-3T3成纤维细胞由中国科学院细胞库（上海）提供。

2.2 SNCC的合成

反应型的三嗪类磺酸甜菜碱主要通过两步完成：①三聚氯氰与N, N-二甲基乙醇胺的取代反应；②1,3-丙烷磺内酯与叔胺的开环反应。SNCC合成的过程图如图1（a）所示，将3.64 g三聚氯氰置于250 mL三口烧瓶中，加入100 mL丙酮置于冰浴中（0~5 ℃）搅拌，直至三聚氯氰完全溶解。另取3.6 g N,N-二甲基乙醇胺溶于50 mL丙酮中，缓慢滴加到上述三聚氯氰溶液中，用20%的碳酸钠维持体系pH在7~8之间反应2 h，然后将混合溶液升温至40 ℃反应4 h。反应完毕后过滤收集滤液，在滤液中加入4.48 g 1,3-丙烷磺内酯并在60 ℃水浴中反应5 h，可观察到大量白色沉淀析出。沉淀进一步用乙酸乙酯洗涤，并置于45 ℃真空干燥箱中干燥24 h得到一氯均三嗪二磺酸甜菜碱，产率为92.16%。

2.3 CS-SNCC的合成

通过将SNCC接枝到壳聚糖氨基上来合成CS-SNCC [图1（a）]。1.61 g (0.01 mol)壳聚糖溶解于100 mL 2%的乙酸水溶液中，将等物质的量的磺酸甜菜碱加入壳聚糖溶液中，90 ℃反应24 h。反应结束后，用旋转蒸发器除去大部分溶剂，浓缩后的溶液在大量丙酮中沉淀。过滤收集沉淀物，并用乙醇和丙酮彻底冲洗。最后将产物（CS-SNCC）在45 ℃下干燥24 h。

2.4 SNCC对壳聚糖取代度的测定

通过能量色散X射线光谱仪测定壳聚糖和磺酸甜菜碱壳聚糖中碳（C）、氧（O）、氮（N）和硫（S）元素的含量。通过元素分析测定壳聚糖和CS-SNCC样品中C、O、N和S的质量分数。根据N、S和C的质量比，分别按式（1）、式（2）计算壳聚糖的脱乙酰度和磺酸甜菜碱壳聚糖中磺酸甜菜碱的取代度[15]：

W N / C = W N W C × n N , C S × n C S + n N , c h i t i n × n c h i t i n n C , C S × n C S + n C , c h i t i n × n c h i t i n
W S / C = W S W C × n S , C S - S N C C × n C S - S N C C n C , C S × n C S + n C , c h i t i n × n c h i t i n + n C , C S - S N C C × n C S - S N C C  

式中，n CS、n chitin和n CS-SNCC分别代表壳聚糖和磺酸甜菜碱壳聚糖中的氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖和磺酸甜菜碱葡萄糖三种单元；n C,CS、n C,chitin、n C,CS-SNCC、n N,CS、n N,chitin和n S,CS-SNCC分别对应各单元碳、氮、硫元素的物质的量；W C、W N和W S分别指碳、氮、硫元素的摩尔质量；W N/C和W S/C分别指样品中氮/碳质量比和硫/碳质量比。

2.5 CS-SNCC膜的制备

采用溶液浇筑法制备壳聚糖和磺酸甜菜碱壳聚糖膜。将一定量的壳聚糖和磺酸甜菜碱壳聚糖分别在1%（体积分数）的乙酸溶液中溶解4 h得到2%（质量分数）的透明溶液，然后取100 mL的上述溶液倒入聚四氟乙烯模具（20 cm×20 cm×0.5 cm）中，置于通风柜中自然风干。将制备的膜在室温下0.5 mol·L-1 NaOH水溶液中浸泡1 h，再用去离子水浸泡并充分洗涤至中性。将所得的两种薄膜进一步干燥并保存在干燥器中待进一步表征和测试。

2.6 仪器和表征

使用Nicolet Nexus 470分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司）在4000~500 cm-1范围内对SNCC、CS和CS-SNCC进行傅里叶变换红外光谱分析。使用UNICO UV-2802S（岛津公司，日本）获得SNCC、CS和CS-SNCC的紫外-可见光谱，测试波长为200~800 nm。Avance III 400 MHz数字NMR光谱仪（BrukerAXSGmbH，德国）用于检测SNCC的1HNMR和13CNMR光谱。壳聚糖和改性壳聚糖在Escalab 250 Xi（美国赛默飞世尔科技公司）上进行XPS分析。利用D8 Advance X射线衍射仪（Bruker AXS GmbH）的X射线衍射（XRD）光谱分析壳聚糖和改性壳聚糖在5°~60°范围内的结晶特性。热重分析（TGA）-微商热重法（DTG）是在氮气环境下，用Q500TGA仪器（美国TA仪器公司）以10 ℃·min-1的速度将约5 mg的膜从50 ℃加热到600 ℃进行的。

2.7 溶胀性和酶降解性测试

通过在室温下将脱水的壳聚糖膜（CS膜）和CS-SNCC膜浸泡在磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中24 h，来观察这两种膜的溶胀动力学。在每个预定的时间段后，将膜从溶液中取出，用滤纸吸干膜表面的水分，然后进行称重。每种膜的溶胀度（SD）按照下式进行计算：

S D = W s - W d W d × 100 %

式中，W d为浸泡前膜的重量；W s为预定时间段内溶胀膜的重量。

通过模拟体液环境测定酶降解性来评价CS-SNCC膜的生物降解性能。将膜浸泡在37 ℃的溶菌酶/PBS（1 mg·L-1, 15 mL）溶液中一定时间，通过测量残留膜的重量比来评估CS膜和CS-SNCC膜的酶生物降解，有效期为20天。将处于PBS溶液（15 mL）中的CS和CS-SNCC膜作为对照组。在测试前，测量CS和CS-SNCC膜的重量（W₀）。在每个浸渍期后，从浸渍液中提取三片CS和CS-SNCC膜，并干燥至重量（Wₜ）保持不变。膜相对残留重量（FW）按照式（4）进行计算：

F W = W t W 0 × 100 %

式中，W 0为膜的平均初始干重（t = 0）；W t为浸泡t时间所测膜的干重。所有实验均进行三次平行实验。

2.8 抗菌性能测试

基于修正的AATCC 100-2004试验方法，选用大肠杆菌O157:H7（ATCC 43895，革兰氏阴性菌）和金黄色葡萄球菌（ATCC 6538，革兰氏阳性菌）对CS和CS-SNCC膜进行抗菌性能评价[3]。具体步骤：预先将CS和CS-SNCC膜剪成2.54 cm×2.54 cm大小，并置于紫外灯下灭菌30 min。分别取一块灭菌膜置于培养皿中，在膜中心滴加25 μL预先培养好的一定浓度的细菌悬浮液，然后将另一块膜覆盖在上面，确保两层薄膜与细菌充分接触。分别在接触5 min、10 min、30 min、60 min后，将膜取下转移至装有5 mL PBS溶液的无菌离心管中，涡旋2 min。取0.1 mL上述涡旋液，使用PBS溶液进行梯度稀释并将稀释后菌液滴加进琼脂培养基中，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。待培养完成后，通过数菌落数来评估抗菌效果。

2.9 抗黏附和生物被膜控制测试

通过菌落计数法和扫描电子显微镜（SEM）评估CS-SNCC膜抵抗细菌和防止生物被膜形成的能力[25]。以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为模型菌，传代、培养并悬浮在PBS溶液中，得到一定浓度的细菌悬浮液。将CS和CS-SNCC膜（约1 cm×1 cm）浸泡在10 mL细菌悬浮液中，在37 ℃、60 r·min-1的振荡室中培养30 min。随后将样品取出，用PBS冲洗三次，以去除样品表面接触不紧密的微生物。然后，将膜浸泡在10 mL新鲜营养肉汤中，在37 ℃下培养24 h。在菌落计数法中，将部分上述薄膜浸入10 mL PBS溶液中，浸泡2 min，使附着在薄膜上的细菌分散到PBS溶液中。然后用PBS将细菌悬浮液稀释10倍，并将其滴在TSA平板上进行细菌计数。另外部分样品置于含有3%戊二醛的PBS缓冲溶液中于4 ℃固定后，用酒精/PBS溶液（25%、50%、75%、85%、95%和100%）对膜进行梯度脱水，时间为30 min。然后将固定好的膜真空干燥24 h，再进行扫描电镜观察。

2.10 细胞相容性测试

通过噻唑蓝（MTT）法和荧光显微镜观察法来评估膜与NIH-3T3成纤维细胞直接接触培养后细胞的存活率和增殖能力[26]。将膜切成8 mm圆盘，并用紫外线（UV）辐射灭菌30 min，然后在无菌环境中浸入培养基中24 h。将NIH-3T3成纤维细胞悬液加入48孔板中，并置于37 ℃、5%的CO2培养箱中孵育24 h。然后将膜放入孔中与细胞接触，继续培养24 h和48 h。培养完毕后，移除膜，在每个孔内添加MTT溶液，进行MTT测定以确定细胞活力。结果由每个组分相对于对照的吸光度值的百分比确定。以接种在无膜孔上的NIH-3T3成纤维细胞为对照组。使用倒置荧光显微镜观察细胞形态和增殖状况。细胞活力（CV）的计算公式为：

C V = A s A c × 100 %

式中，A s和A c分别是样品组和对照组的吸光度。

3 结果和讨论

3.1 1H NMR、13C NMR、UV-Vis和FTIR测定结构

通过将一氯三嗪磺酸甜菜碱接枝到壳聚糖上制备CS-SNCC。1HNMR和13CNMR被用于确认SNCC的合成。图2（a）、（b）显示了SNCC在D2O中的1HNMR和13CNMR图谱。其中，3.14 ppm (12H)处的化学位移归因于季铵上的氢[3]；4.01 ppm (4H)、3.48~3.53 ppm (8H)、2.94 ppm (4H)、2.21 ppm (2H)处的化学位移值分别来自于磺酸甜菜碱在H1、H2和H4、H5、H6位置的氢原子[22,27]。另外，如图2（b）所示，三嗪磺酸甜菜碱中的碳原子的化学位移为159.21 ppm (C1)、151.68 ppm (C2)、63.60 ppm (C3)、63.42 ppm (C4)、51.40 ppm (C5)、55.33 ppm (C6)、17.95 ppm和47.15 ppm (C6) [27]。核磁共振（1H和13C）分析结果表明，已成功合成一氯三嗪磺酸甜菜碱。

CS、SNCC和CS-SNCC的紫外-可见光谱如图2（c）所示。在SNCC和CS-SNCC的光谱中，228 nm处有一个明显的特征吸收峰，该峰归因于三嗪环结构，而CS的光谱中未发现此特征[28]。CS-SNCC在228 nm处的峰表明三嗪化合物已被接枝到CS上。CS、SNCC和CS-SNCC的傅里叶变换红外光谱见图2（d）。SNCC傅里叶变换红外光谱中，1172 cm-1和1040 cm-1处的峰分别归因于SO3 -基团的不对称和对称伸缩振动[29]；C—S键的对称伸缩振动峰位于600 cm-1处[22]；另外，在1470 cm-1处有一个明显的特征峰，由三甲基季铵的甲基基团产生[15]。CS-SNCC的傅里叶变换红外光谱在1470 cm-1、1172 cm-1和600 cm-1处显示了几个新峰，分别对应于SO3 -基团和季铵基团的官能团峰。此外，CS-SNCC的傅里叶变换红外光谱中还出现了位于764~793 cm-1的三嗪环峰[30]。CS-SNCC的傅里叶变换红外光谱中出现的这些新吸收峰表明SNCC已成功接枝到CS上。

3.2 CS和CS-SNCC的EDX和XPS光谱

为了研究CS和CS-SNCC膜表面的元素含量以及SNCC在壳聚糖上的取代程度，通过EDX测定了两种样品中C、O、N和S的质量分数，如图3（a）、（b）所示。根据公式（1），壳聚糖的脱乙酰度为92.2%，与壳聚糖的生产规格值极为接近。此外，CS-SNCC的EDX光谱中出现了一个新的硫吸收峰，该吸收峰与两性离子磺基甜菜碱中的硫元素相对应。依据公式（2），CS-SNCC中SNCC的取代度为15.55%。

通过XPS分析CS和CS-SNCC表面化学键的结合能，以确认壳聚糖中引入了SNCC。结果如图3（c）~（f）所示，包含N 1s和S 2p的核级模式。在壳聚糖的N1s光谱[图3（d）]上能看到两个峰，结合能分别为398.98 eV和399.98 eV，分别归因于伯胺‒NH₂（脱乙酰基单元）和乙酰氨基‒NHCO‒（乙酰基单元）[31‒32]。理论上，壳聚糖的XPS光谱中不存在S 2p峰[图3（c）]。然而，在壳聚糖链中引入SNCC后，XPS光谱显示出明显差异。最重要的是，在CS-SNCC的N 1s核级图谱上能看到两个明显的峰，结合能分别为400.82 eV和402.12 eV，这两个峰分别归因于均三嗪环上的C—N ̿     C键和SNCC的季铵基团[‒N⁺(CH₃)‒] [21,32]。此外，在S 2p光谱上还能看到位于167.11 eV和168.32 eV的特征信号，它们分别属于磺酸基（SO₃⁻）的S 2p3/2和S 2p1/2。基于上述分析，一种新型一氯三嗪磺酸甜菜碱被成功合成并引入壳聚糖中。

3.3 晶体结构和热分析

利用XRD研究表征CS-SNCC和CS晶体结构的变化，结果见图4（a）。壳聚糖在19.81°、15.25°和10.67°处有明显的三个尖锐的衍射峰，这主要是壳聚糖主链分子间相互作用、有序排列形成的特征结晶峰[33]。SNCC对壳聚糖接枝改性后，CS-SNCC在这三处的峰强减弱，尤其在19.81°处的特征峰明显变宽且强度降低，说明SNCC对CS的接枝改性对壳聚糖分子间和分子内的作用力有一定的破坏，导致CS-SNCC的结晶程度下降，结构更为无序松散[22]。

通过热重分析仪来研究改性前后壳聚糖的热稳定性能。CS和CS-SNCC的TGA-DTG曲线如图4（b）所示，均呈现两个阶段的失重。第一阶段的失重是由于吸收的自由水分和分子间结合水的蒸发，第二阶段的失重是由于壳聚糖分子链的热降解[33‒34]。壳聚糖在第一阶段50~120 ℃的失重约为5%，第二阶段235~380 ℃的失重约为44%。CS-SNCC的第一阶段失重与壳聚糖非常相似，但第二阶段失重的起始温度稍早，热分解范围较大。这主要是由于SNCC的引入破坏壳聚糖分子间的氢键，降低结晶度，形成更多的非晶态区域，这与XRD的结果相一致[22,33]。

3.4 溶胀和酶降解性能

吸水性和溶胀性是生物医学材料的基本特性。CS和CS-SNCC膜的PBS吸水率如图4（c）所示。两种膜都表现出了快速的吸液能力，在2 h内就达到了溶胀平衡。壳聚糖具有很多亲水基团（包括羟基和氨基），可以促进吸水，所以膜的吸液溶胀性能较高（均大于100%）。CS-SNCC膜比CS膜具有更快的吸液速率和更高的平衡溶胀度，这主要是壳聚糖改性后引入亲水性磺酸根基团，可以提高表面润湿性能，加速水分子对膜的渗透[24]。

CS-SNCC膜是一类潜在的生物医用材料，对其生物降解性能的研究很有必要。为了评价CS-SNCC膜的生物降解性，在PBS溶液和含有溶菌酶的PBS溶液中测试了20天内膜的降解失重情况，如图4（d）所示，溶菌酶加速了CS和CS-SNCC薄膜的生物降解。在溶菌酶/PBS溶液和单独的PBS溶液中，CS-SNCC膜的降解速度均快于CS膜。培养21天后，CS和CS-SNCC膜在PBS溶液中的失重率分别为19.88%和23.13%，在溶菌酶溶液中的失重率分别为41.59%和45.54%。溶菌酶是一种天然存在于炎症伤口渗出液中的糖苷水解酶，可水解多糖中的β-1,4-糖苷键[35‒36]。对壳聚糖衍生物的生物降解性能的研究表明，溶菌酶可以通过裂解β-1,4-糖苷键来剪切壳聚糖的主链，从而降解壳聚糖[37]。所观察到的CS-SNCC膜的加速降解是由于在壳聚糖分子链中引入了两性离子磺基甜菜碱基团，破坏了CS-SNCC的晶体结构，使溶菌酶有更多机会快速进入β-1,4-葡糖苷键进行特定的裂解降解。CS-SNCC膜具有更高的溶胀性能和生物降解性能，表明所制备的壳聚糖衍生物膜具有潜在的生物医学应用价值。

3.5 抗细菌黏附和生物被膜控制功能

研究表明，两性离子表面因具有数量相等但电荷相反的阴离子基团和阳离子基团而具有有效的抗黏附性，可防止细菌的黏附和生物被膜的形成[29,38]。通过SEM观察细菌在膜表面的黏附情况来评估CS-SNCC膜的抗细菌黏附和生物被膜控制效果，如图5（a）所示。SEM图显示了CS和CS-SNCC膜表面在培养24 h后两种细菌的分布情况，大量细菌细胞附着在CS薄膜表面，形成微菌落和生物被膜；相比之下，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在CS-SNCC膜上只发现少量零散细菌，且没有形成生物被膜。这些SEM图像直观地表明，壳聚糖两性离子磺基甜菜碱膜具有抗细菌黏附的特性和生物被膜控制功能。为进一步定量分析CS-SNCC膜对细菌的抗黏附效果，采用菌落计数法对CS和CS-SNCC薄膜上的细菌进行评估。图5（b）显示了CS和CS-SNCC膜表面可繁殖细菌的定量数据。与CS膜表面的细菌数量（金黄色葡萄球菌：2.25×107 CFU·cm-2；大肠杆菌：1.98×107 CFU·cm-2）相比，CS-SNCC表面的细菌数量较少（金黄色葡萄球菌：2.95×106 CFU·cm-2；大肠杆菌：1.15×106 CFU·cm-2）。因此，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在CS-SNCC膜上的细菌黏附降低了约86.89%和94.19%。这些结果有力地表明，壳聚糖两性离子磺基甜菜碱膜能有效抵抗细菌黏附，控制细菌生物被膜的形成。

3.6 抗菌性能

研究了CS和CS-SNCC膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌（每片约106 CFU）的抗菌效果，结果如图6所示。由于壳聚糖固有的抗菌特性，CS薄膜显示出一定程度的抗菌活性，在暴露60 min后，有51.83%的大肠杆菌和87.77%的金黄色葡萄球菌被杀死。这是由于壳聚糖的氨基很容易质子化而获得正电荷，从而与细菌细胞壁上带负电荷的分子结合，破坏细胞壁的物理化学特性，进而导致细菌失活[39‒40]。接触60 min后，CS-SNCC膜灭活了93.43%的大肠杆菌和91.00%的金黄色葡萄球菌，与CS膜相比，CS-SNCC膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭能力更强。这一结果与之前关于壳聚糖甜菜碱磺酸盐衍生物抗菌特性的研究结果相似[22,25]。因此，如图1（b）所示，CS-SNCC膜具有抗菌、抗黏附和生物被膜控制的特性。

3.7 细胞相容性

细胞相容性是抗菌膜作为生物医学材料应用关注的主要问题之一。将NIH-3T3成纤维细胞与CS和CS-SNCC膜一起培养，通过传统的MTT试验评估其细胞毒性，结果如图7所示。在培养24 h和48 h后，与CS膜一起培养的细胞的代谢活性未受到明显影响，细胞活力分别约为98.21%和96.83%。将SNCC接枝到壳聚糖上培养24 h和48 h后，CS-SNCC膜上的细胞存活率超过90%。这些结果与之前的研究报告一致，即磺基甜菜碱无毒性且不会刺激皮肤[22,27]。

用荧光图像来观察分析与膜接触培养后的NIH-3T3成纤维细胞的形态和增殖状况[23]。如图7所示，在培养24 h和48 h后，大多数NIH-3T3成纤维细胞呈绿色且呈现纺锤形，与对照组无明显差异。培养48 h的膜上的细胞数量明显高于培养24 h的膜，这表明膜具有良好的细胞相容性。

4 结论

本研究制备了一种可生物降解、细胞相容、抗菌且能控制生物被膜的新型壳聚糖衍生物膜，可用作生物医用材料。通过将SNCC接枝到CS上，合成了新的壳聚糖衍生物CS-SNCC，并利用FTIR、UV-Vis、EDX和XPS光谱验证了CS-SNCC的化学结构。结晶结构和热稳定性测试显示，CS中引入SNCC在一定程度上降低了壳聚糖的结晶度和热稳定性；溶胀和生物降解行为表明，CS-SNCC膜具有良好的吸水性和降解性，溶菌酶可加速CS-SNCC膜的降解；细胞相容性研究表明，CS-SNCC膜无细胞毒性。膜的抗细菌黏附性测试显示，CS-SNCC膜能减少其表面约86.89%的金黄色葡萄球菌和94.19%的大肠杆菌的黏附。CS-SNCC膜还具有良好的杀菌性能，在接触60 min内可分别杀死91.00%和93.43%的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。因此，合成的CS-SNCC膜具有良好的细胞相容性、生物降解性、抗菌性、抗细菌黏附和生物膜控制特性，在生物医用材料应用方面具有巨大潜力。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用
[1]

Zhao X, Liang YP, Huang Y, He JH, Han Y, Guo BL. Physical double-network hydrogel adhesives with rapid shape adaptability, fast self-healing, antioxidant and NIR/pH stimulus-responsiveness for multidrug-resistant bacterial infection and removable wound dressing. Adv Funct Mater 2020;30 (17):1910748. . 10.1002/adfm.201910748
[2]

Yin ML, Wan SS, Ren XH, Chu CC. Development of inherently antibacterial, biodegradable, and biologically active chitosan/pseudo-protein hybrid hydrogels as biofunctional wound dressings. ACS Appl Mater Interfaces 2021;13(12):14688‒99. . 10.1021/acsami.0c21680
[3]

Yin ML, Wang YF, Zhang Y, Ren XH, Qiu YY, Huang TS. Novel quaternarized N-halamine chitosan and polyvinyl alcohol nanofibrous membranes as hemostatic materials with excellent antibacterial properties. Carbohydr Polym 2020;232:115823. . 10.1016/j.carbpol.2019.115823
[4]

Li M, Aveyard J, Doherty KG, Deller RC, Williams RL, Kolegraff KN, et al. Antimicrobial nitric oxide-releasing electrospun dressings for wound healing applications. ACS Mater Au 2022;2(2):190‒203. . 10.1021/acsmaterialsau.1c00056
[5]

Liang YP, He JH, Guo BL. Functional hydrogels as wound dressing to enhance wound healing. ACS Nano 2021;15(8):12687‒722. . 10.1021/acsnano.1c04206
[6]

Li L, Cao X, Shen X, Yu ST, Su F, Liu SW, et al. Alkyl chitosan film—high strength, functional biomaterials. J Biomed Mater Res Part A 2017;105(11):3034‒41. . 10.1002/jbm.a.36163
[7]

Zhang SM, Li L, Ren XH, Huang TS. N-Halamine modified multiporous bacterial cellulose with enhanced antibacterial and hemostatic properties. Int J Biol Macromol 2020;161:1070‒8. . 10.1016/j.ijbiomac.2020.06.053
[8]

Demir B, Broughton RM, Qiao MY, Huang TH, Worley SD. N-Halamine biocidal materials with superior antimicrobial efficacies for wound dressings. Molecules 2017;22(10):1582. . 10.3390/molecules22101582
[9]

Vieira MGA, da Silva MA, dos Santos LO, Beppu MM. Natural-based plasticizers and biopolymer films: a review. Eur Polym J 2011;47(3):254‒63. . 10.1016/j.eurpolymj.2010.12.011
[10]

Patel S, Srivastava S, Singh MR, Singh D. Preparation and optimization of chitosan‒gelatin films for sustained delivery of lupeol for wound healing. Int J Biol Macromol 2018;107:1888‒97. . 10.1016/j.ijbiomac.2017.10.056
[11]

Liu C, Shan HR, Chen XX, Si Y, Yin X, Yu JY, et al. Novel inorganic-based N-halamine nanofibrous membranes as highly effective antibacterial agent for water disinfection. ACS Appl Mater Interfaces 2018;10(51):44209‒15. . 10.1021/acsami.8b18322
[12]

Li JH, Zhuang SL. Antibacterial activity of chitosan and its derivatives and their interaction mechanism with bacteria: current state and perspectives. Eur Polym J 2020;138:109984. . 10.1016/j.eurpolymj.2020.109984
[13]

Bakshi PS, Selvakumar D, Kadirvelu K, Kumar NS. Chitosan as an environment friendly biomaterial—a review on recent modifications and applications. Int J Biol Macromol 2020;150:1072‒83. . 10.1016/j.ijbiomac.2019.10.113
[14]

Sahariah P, Masson M. Antimicrobial chitosan and chitosan derivatives: a review of the structure‒activity relationship. Biomacromolecules 2017;18 (11):3846‒68. . 10.1021/acs.biomac.7b01058
[15]

Yin ML, Lin XH, Ren T, Li ZG, Ren XH, Huang TS. Cytocompatible quaternized carboxymethyl chitosan/poly(vinyl alcohol) blend film loaded copper for antibacterial application. Int J Biol Macromol 2018;120(Pt A):992‒8. . 10.1016/j.ijbiomac.2018.08.105
[16]

Sahariah P, Benediktssdottir BE, Hjalmarsdottir MA, Sigurjonsson OE, Sorensen KK, Thygesen MB, et al. Impact of chain length on antibacterial activity and hemocompatibility of quaternary N-alkyl and N,N-dialkyl chitosan derivatives. Biomacromolecules 2015;16(5):1449‒60. . 10.1021/acs.biomac.5b00163
[17]

Patrulea V, Gan BH, Perron K, Cai X, Abdel-Sayed P, Sublet E, et al. Synergistic effects of antimicrobial peptide dendrimer‒chitosan polymer conjugates against Pseudomonas aeruginosa . Carbohydr Polym 2022;280:119025. . 10.1016/j.carbpol.2021.119025
[18]

Ma YZ, Gao K, Yu HH, Liu WX, Qin YK, Xing RG, et al. C-coordinated O-carboxymethyl chitosan Cu(Ⅱ) complex exerts antifungal activity by disrupting the cell membrane integrity of Phytophthora capsici Leonian. Carbohydr Polym 2021;261:117821. . 10.1016/j.carbpol.2021.117821
[19]

Li DD, Gao X, Huang XC, Liu PL, Xiong W, Wu ST, et al. Preparation of organic‒inorganic chitosan@silver/sepiolite composites with high synergistic antibacterial activity and stability. Carbohydr Polym 2020;249:116858. . 10.1016/j.carbpol.2020.116858
[20]

He HC, Xiao ZC, Zhou YJ, Chen AQ, Xuan X, Li YY, et al. Zwitterionic poly(sulfobetaine methacrylate) hydrogels with optimal mechanical properties for improving wound healing in vivo . J Mater Chem B 2019; 7(10):1697‒707. . 10.1039/c8tb02590h
[21]

Lin HT, Venault A, Chang Y. Zwitterionized chitosan based soft membranes for diabetic wound healing. J Membr Sci 2019;591:117319. . 10.1016/j.memsci.2019.117319
[22]

Chen YX, Li JN, Li QQ, Shen YY, Ge ZC, Zhang WW, et al. Enhanced watersolubility, antibacterial activity and biocompatibility upon introducing sulfobetaine and quaternary ammonium to chitosan. Carbohydr Polym 2016;143:246‒53. . 10.1016/j.carbpol.2016.01.073
[23]

Chu XH, Zhang M, Zhou NL, Wu F, Sun BH, Shen J. Synthesis and characterization of a novel antibacterial material containing poly (sulfobetaine) using reverse atom transfer radical polymerization. RSC Adv 2018;8(58):33000‒9. . 10.1039/c8ra05793a
[24]

Yang X, Sha D, Jiang H, Shi K, Xu JD, Yu C, et al. Preparation of antibacterial poly(sulfobetaine methacrylate) grafted on poly(vinyl alcohol)- formaldehyde sponges and their properties. J Appl Polym Sci 2019;136 (6):47047. . 10.1002/app.47047
[25]

Wang R, Neoh KG, Kang ET. Integration of antifouling and bactericidal moieties for optimizing the efficacy of antibacterial coatings. J Colloid Interface Sci 2015;438:138‒48. . 10.1016/j.jcis.2014.09.070
[26]

Zhao X, Guo BL, Wu H, Liang YP, Ma PX. Injectable antibacterial conductive nanocomposite cryogels with rapid shape recovery for noncompressible hemorrhage and wound healing. Nat Commun 2018;9(1):2784. . 10.1038/s41467-018-04998-9
[27]

He L, Gao C, Li S, Chung CTW, Xin JH. Non-leaching and durable antibacterial textiles finished with reactive zwitterionic sulfobetaine. J Ind Eng Chem 2017;46:373‒8. . 10.1016/j.jiec.2016.11.006
[28]

Chen C, Yang SG, Guo YP, Sun C, Gu CG, Xu B. Photolytic destruction of endocrine disruptor atrazine in aqueous solution under UV irradiation: products and pathways. J Hazard Mater 2009;172(2‒3):675‒84.
[29]

Chen S, Yuan L, Li Q, Li J, Zhu X, Jiang Y, et al. Durable antibacterial and nonfouling cotton textiles with enhanced comfort via zwitterionic sulfopropylbetaine coating. Small 2016;12(26):3516‒21. . 10.1002/smll.201600587
[30]

Chen YJ, Wang W, Qiu Y, Li LS, Qian LJ, Xin F. Terminal group effects of phosphazene‒triazine bi-group flame retardant additives in flame retardant polylactic acid composites. Polym Degrad Stabil 2017;140:166‒75. . 10.1016/j.polymdegradstab.2017.04.024
[31]

Yuan DW, Cadien K, Liu Q, Zeng HB. Adsorption characteristics and mechanisms of O-carboxymethyl chitosan on chalcopyrite and molybdenite. J Colloid Interface Sci 2019;552:659‒70. . 10.1016/j.jcis.2019.05.023
[32]

Tang RL, Zhang Y, Zhang Y, Yu ZM. Synthesis and characterization of chitosan based dye containing quaternary ammonium group. Carbohydr Polym 2016;139:191‒6. . 10.1016/j.carbpol.2015.12.047
[33]

Yin ML, Chen XL, Li R, Huang D, Fan XY, Ren XH, et al. Preparation and characterization of antimicrobial PVA hybrid films with N-halamine modified chitosan nanospheres. J Appl Polym Sci 2016;133(46):44204. . 10.1002/app.44204
[34]

Li R, Hu P, Ren XH, Worley SD, Huang TS. Antimicrobial N-halamine modified chitosan films. Carbohydr Polym 2013;92(1):534‒9. . 10.1016/j.carbpol.2012.08.115
[35]

Nieto-Suárez M, López-Quintela MA, Lazzari M. Preparation and characterization of crosslinked chitosan/gelatin scaffolds by ice segregation induced self-assembly. Carbohydr Polym 2016;141:175‒83. . 10.1016/j.carbpol.2015.12.064
[36]

Ganguly S, Maity PP, Mondal S, Das P, Bhawal P, Dhara S, et al. Polysaccharide and poly(methacrylic acid) based biodegradable elastomeric biocompatible semi-IPN hydrogel for controlled drug delivery. Mater Sci Eng C 2018;92:34‒51. . 10.1016/j.msec.2018.06.034
[37]

He MY, Potuck A, Zhang Y, Chu CC. Arginine-based polyester amide/polysaccharide hydrogels and their biological response. Acta Biomater 2014;10(6):2482‒94. . 10.1016/j.actbio.2014.02.011
[38]

Ma Y, Li JY, Si Y, Huang K, Nitin N, Sun G. Rechargeable antibacterial N-halamine films with antifouling function for food packaging applications. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11(19):17814‒22. . 10.1021/acsami.9b03464
[39]

Heimbuck AM, Priddy-Arrington TR, Padgett ML, Llamas CB, Barnett HH, Bunnell BA, et al. Development of responsive chitosan‒genipin hydrogels for the treatment of wounds. ACS Appl Bio Mater 2019;2(7):2879‒88. . 10.1021/acsabm.9b00266
[40]

Li WY, Wang BX, Zhang MH, Wu ZT, Wei JX, Jiang Y, et al. All-natural injectable hydrogel with self-healing and antibacterial properties for wound dressing. Cellulose 2020;27(5):2637‒50. . 10.1007/s10570-019-02942-8

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