从H1N1血凝素序列中提取的沙门氏菌递送的COBRA-HA1抗原对甲型流感亚型产生广谱保护作用

工程（英文） ›› 2024, Vol. 32 ›› Issue (1) : 45 -61. DOI: 10.1016/j.eng.2023.08.001

研究论文

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Salmonella-Delivered COBRA-HA1 Antigen Derived from H1N1 Hemagglutinin Sequences Elicits Broad-Spectrum Protection Against Influenza A Subtypes

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Received	Accepted	Published
2023-01-15	2023-08-01
Issue Date
2024-06-12

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摘要

为了解决抗原性漂移的不确定性和当前流感疫苗的低效性，迫切需要一种通用疫苗。在本研究中，一种称为计算优化广谱反应抗原（COBRA）的策略被用于生成1918年至2021年收集的流行性感冒病毒样本的血凝素球状头部（HA1）的共识序列，以追踪其渐进性变化，并将其纳入设计的构建体中。利用基于塞姆利基森林病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）的真核表达系统pJHL204，通过沙门氏菌介导的细菌感染，将携带不同HA1区域的构建体注入真核细胞。通过蛋白质免疫印迹和免疫荧光法证实了重组蛋白的表达。用所设计的构建体免疫小鼠产生了体液反应，其免疫球蛋白G（IgG）水平显著增加，以及细胞介导的免疫反应也显著增加，其中CD4⁺和CD8⁺ T细胞增加了1.5倍。具体来说，构建体#1和#5促进了产生CD4⁺和CD8⁺ T细胞的干扰素-γ（IFN-γ）的生成，使反应偏向了辅助性T细胞（Th1）途径。此外，产生白细胞介素-4（IL-4）的T细胞表达上调4倍。其保护效果得到验证，对选定的病毒株产生高达4倍的中和抗体，且血凝抑制滴度高于40。设计的构建体具有广泛的保护性免疫反应，导致流感A/PR8/34、A/Brisbane/59/2007、A/California/07/2009、KBPV VR-92和NCCP 43021株小鼠的病毒滴度显著降低，肺部炎症最小。这一发现彻底改变了流感疫苗的设计和递送；沙门氏菌介导的COBRA-HA1是一种高效的体内抗原呈递方法。这种方法可以有效地抗击季节性H1N1流感毒株和潜在的疫情暴发。

Abstract

A universal vaccine is in high demand to address the uncertainties of antigenic drift and the reduced effectiveness of current influenza vaccines. In this study, a strategy called computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) was used to generate a consensus sequence of the hemagglutinin globular head portion (HA1) of influenza virus samples collected from 1918 to 2021 to trace evolutionary changes and incorporate them into the designed constructs. Constructs carrying different HA1 regions were delivered into eukaryotic cells by Salmonella -mediated bactofection using a Semliki Forest virus RNA-dependent RNA polymerase (RdRp)-based eukaryotic expression system, pJHL204. Recombinant protein expression was confirmed by Western blot and immunofluorescence assays. Mice immunized with the designed constructs produced a humoral response, with a significant increase in immunoglobulin G (IgG) levels, and a cell-mediated immune response, including a 1.5-fold increase in CD4 ⁺ and CD8 ⁺ T cells. Specifically, constructs #1 and #5 increased the production of interferon-γ (IFN-γ) producing CD4 ⁺ and CD8⁺ T cells, skewing the response toward the T helper type 1 cell (Th1) pathway. Additionally, interleukin-4 (IL-4)-producing T cells were upregulated 4-fold. Protective efficacy was demonstrated, with up to 4-fold higher production of neutralizing antibodies and a hemagglutination inhibition titer > 40 against the selected viral strains. The designed constructs conferred a broadly protective immune response, resulting in a notable reduction in viral titer and minimal inflammation in the lungs of mice challenged with the influenza A/PR8/34, A/Brisbane/59/2007, A/California/07/2009, KBPV VR-92, and NCCP 43021 strains. This discovery revolutionizes influenza vaccine design and delivery; Salmonella-mediated COBRA-HA1 is a highly effective in vivo antigen presentation strategy. This approach can effectively combat seasonal H1N1 influenza strains and potential pandemic outbreaks.

关键词

COBRA / 甲型流感 / 沙门氏菌 / 疫苗 / 广谱保护

Key words

COBRA / Influenza A / Salmonella / Vaccine / Broad spectral protection

引用本文

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Ram Prasad Aganja,Amal Senevirathne,Chandran Sivasankar,John Hwa Lee. 从H1N1血凝素序列中提取的沙门氏菌递送的COBRA-HA1抗原对甲型流感亚型产生广谱保护作用[J]. 工程（英文）, 2024, 32(1): 45-61 DOI:10.1016/j.eng.2023.08.001

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1 引言

流行性感冒病毒（简称流感病毒）在世界范围内传播，导致流感从季节性暴发发展到对社会经济和医疗造成严重负担的大流行[1‒2]。抗流感病毒主要通过中和抗体（Nab）介导。然而，病毒在不断进化，经常通过抗原性漂移改变其抗原表位，以逃避宿主体内存在的Nab，为有效的疫苗开发带来了巨大的挑战[3]。目前的疫苗接种策略基于现场分离菌株的红血球凝聚素（HA）和神经氨酸酶（NA）序列的季节性变化，但其有效性不断受到循环病毒株的巨大抗原性变异的削弱[4]。因此，需要采取新的方法来提供广泛的保护和持久的免疫力。几组研究人员专注于开发一种使用更保守抗原的疫苗构建体，如基质蛋白和核蛋白，但这些抗原产生的免疫反应不足以预防流感病毒感染或预防高水平的流感病毒挑战下的发病率和死亡率[5‒6]。因此，针对流感病毒的保护性免疫应答基准仍然是由HA特异性抗体应答设定的[7]。

HA是一种膜内糖蛋白，由细胞蛋白酶切割非共价同源三聚体蛋白HA0而形成[8]。HA包括HA1和HA2亚基。免疫显性但高度可变的球状头部区域由HA1亚基形成，这两个亚基都包含一个相对保守的茎柄区域。球状结构域主要由一个膜远端受体结合位点（RBS）构成，该位点与宿主的唾液酸受体结合[9‒10]。尽管流感亚型的糖基化模式和表面特性差异很大，但HA高度保守的结构完整性确保接触HA头部结构域会引发广谱免疫反应 [11]。克服当前针对大流行和季节性病毒株的流感疫苗抗原漂移和错配问题的一种合理策略是使用多轮共识构建来生成反映长期进化印迹的候选抗原，这种方法称为计算优化广谱反应抗原（COBRA）[12‒14]。通过这种方法，本文使用了1918年至2021年期间源自人类、鸟类和猪的H1N1序列，并开发了一个包含多样化表位的共识HA序列，以消除从单一疫情、收集来源或时间范围内选择的序列的潜在偏差。

传统的流感疫苗生产基于在胚胎卵子中培养病毒，然后将其灭活[15]，这是一个漫长而耗时的过程。此外，有证据表明，在以卵子为基础的病毒生产过程中可能会发生病毒突变，从而降低所得疫苗的有效性（要求抗原生产的一致性）[16]。另外，目前流行的基于细胞培养的疫苗生产需要先进的实验室，成本高昂，且疫苗产量低。为了解决这些问题，沙门氏菌可用作流感疫苗递送系统，因为它在经济性上适应工业规模的生产，不受传统的基于卵子的方法的影响，也不需要复杂的病毒繁殖技术，所以成为未来大规模生产的合适选择。通过删除沙门氏菌致病岛I（SPI1）的lon和cpxR基因以及SPI2的sifA基因，开发了具有高侵袭性和超免疫原性表型的沙门氏菌进行质粒递送[17‒19]。为确保安全性，采用天冬氨酸半醛脱氢酶（asd）基因营养缺陷型缺失代替抗生素选择标记，形成沙门氏菌JOL2500。为了获得抗原融合表达，使用了一种基于病毒RNA依赖的RNA聚合酶的真核表达质粒（RdRp-eep）载体pJHL204，该载体在细胞质中递送并增强了所需抗原的基因表达[20‒21]。因为沙门氏菌可以在细胞内存活，所以它可以将其质粒释放到细胞中。pJHL204载体的设计利用了塞姆利基森林病毒（SFV）复制子进行抗原表达。该载体由编码SFV非结构蛋白（nsp 1‒4）的基因组成，这些基因可产生一个复制酶复合物，负责复制抗原编码信使RNA（mRNA），从而通过RNA自我复制进行高效表达[22]。该系统是利用巨细胞病毒（CMV）启动子来启动转基因表达而创建的。因此，携带RdRp-eep载体中构建的编码HA1序列的减毒沙门氏菌JOL2500被设计为疫苗候选物品，以取代季节性流感疫苗的重组。

本研究旨在利用基于COBRA设计的合适的共识序列来开发候选疫苗，以诱导广谱免疫应答。因此，本研究使用COBRA方法在HA1共识序列的不同区域构建了抗原，并分别使用RdRp-eep和减毒沙门氏菌JOL2500来高效表达和递送该抗原。研究发现，在小鼠模型中，由沙门氏菌递送的COBRA-HA1引起了对流感病毒感染的免疫反应。因此，本研究已经证明COBRA-HA1的功能性表达可以保护小鼠免受异源、高致病性流感病毒（A/PR8/34、A/Brisbane/59/2007、A/California/07/2009、KBPV VR-92和NCCP 43021）变异的感染。

2 材料和方法

2.1 疫苗构建体的设计与选择

从美国国家生物技术信息中心（NCBI）流感病毒资源数据库[23]检索了1918年至2021年间的4800多个HA1序列，这些序列来自从人类、鸟类和猪中分离出的H1N1流感病毒。所有序列通过三层共识逐步编译，构建最终的序列[图1（a）]。使用BioEdit将序列按年间隔分组，生成人类、鸟类和猪病毒共识序列的第一层。通过选择最常见的氨基酸（AA），利用最大似然法构建第二层和第三层共识序列，从而进一步巩固排列方式。最终的共识序列来源于所有三层起源。从最终的序列中，选择90~240、1~240、100~240、100~300和1~300AA的区域进行进一步分析，并将构建体分别按#1至#5命名[图1（b）]。采用蛋白质结构同源模型†分析最终序列相应的分子结构。该模型的准确性是通过计算美国加利福尼亚大学洛杉矶分校氨基酸拉马钱德兰图（利用PROCHECK导出）† ^†来评估的[24]。利用免疫表位数据库（IEDB）资源中的BepiPred线性表位预测工具预测共识序列的线性B细胞表位[25]。通过确定预测的蛋白质结构的总体质量分数，在ProSA-web服务器‡上进行蛋白质结构验证。指定结构的抗原性通过ANTIGENpro‡ ^‡数据库确认。利用ClusPro 2.0蛋白，即蛋白对接法（与已知结构的已知Nab进行对接），评估完整长度的已推导的共识序列的可预测蛋白结构的完整性，命名为构建体#5 [26]。在这个过程中，使用了抗原结合的CH65片段（Fab）（蛋白质数据库ID：4WUK）头部单克隆中和抗体（MAb），该抗体专门与受体结合域相互作用。然后，使用Frodock软件[27]估计结合分。为了进行比较，使用2009年H1N1 HA大流行（rcsb_pdb_3UYX）的球状头部作为参考结构。

2.2 菌株、质粒和引物

本研究中使用的细菌菌株和质粒列于附录A中的表S1，所有菌株均在Luria Bertani（BD Biosciences，美国）培养基中在37 °C下进行常规培养。采用减毒鼠伤寒沙门氏菌（ST）菌株JOL2500，其中删去lon、cpxR、sifA和asd基因作为疫苗递送系统。

2.3 疫苗构建体的制备

对采用COBRA法设计的HA1基因的共识序列进行化学合成（Bioneer，韩国），获得构建体#1和#5。利用AscI和PacI酶切位点将设计的基因片段克隆到pJHL204中，并通过电穿孔将其转化为沙门氏菌JOL2500。携带构建体#1和#5的候选疫苗分别被标记为沙门氏菌JOL2781和JOL2786。通过聚合酶链反应（PCR）扩增合成构建体#2到#4，分别作为候选疫苗JOL2783、JOL2784和JOL2785。为了方便起见，候选疫苗使用它们各自的构建体编号来表示。将仅含有pJHL204的JOL2500作为载体控制（VC）JOL2865。

2.4 动物和伦理声明

所有使用小鼠的实验都得到了韩国全北国立大学动物伦理委员会（JBNU-2021-027）的批准，遵循《韩国动物保护协会指南》（Guidelines of the Korean Council on Animal Care）和《韩国动物保护法2007年第13条》（Korean Animal Protection Law, 2007: Article 13）。从韩国Samtako获得6周大、特异性无病原体雌性BALB/c小鼠，在全北国立大学兽医学院动物饲养机构进行了无抗生素食物和水的自由进食，满足喂养标准。

2.5 细胞系和病毒

RAW 264.7、HEK293T和MDCK细胞系从美国模式培养物集存库中获得，并在杜氏改良Eagle培养基（DMEM；Lonza，瑞士）中保存，在37 °C、5% CO₂环境中添加10%胎牛血清（FBS；Gibco，美国）、100单位·mL^‒1青霉素和100 μg·mL^‒1链霉素。使用RAW 264.7和HEK293T细胞进行蛋白表达研究。MDCK细胞用于传播流感A/PR8/34、A/Brisbane/59/2007、A/California/07/2009、KBPV VR-92和NCCP 43021病毒株，且预测病毒滴度为50%的组织培养感染剂量（TCID₅₀），病毒在使用前一直存储在-80 °C下。

2.6 重组蛋白的表达、纯化及抗体的制备

靶向抗原重组蛋白在大肠杆菌（E. coli）DE3宿主中按照标准克隆程序表达。简单来说，将靶向基因克隆到pET28a(+)中，用克隆的质粒转化大肠杆菌DH5-α菌株。然后提取含有所需基因的质粒，进行PCR确认，用于转化大肠杆菌BL21（DE3）。诱导细菌培养物在37 °C下表达含有1 mmol·L^‒1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的重组蛋白4 h，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）证实其表达。使用镍-硝基三乙酸柱层析（Takara，日本）和尿素裂解法纯化重组蛋白。将纯化的#1和#5重组蛋白接种到兔子体内，以培养针对该蛋白的多克隆抗体，如参考文献[28]所述。

2.7 疫苗构建体的表达

在六孔板中培养的RAW 264.7和HEK293T细胞中，研究了该抗原的体内表达。用携带#1到#5构建体的沙门氏菌转染单层细胞2 h，用庆大霉素（100 μg·mL^‒1）处理2.5 h，清除非入侵的胞外沙门氏菌 [21]。用富含2%胎牛血清的DMEM补充细胞，孵育48 h。然后，收集细胞，通过逆转录PCR（RT-PCR）、Western印迹法和免疫荧光试验（IFA）分析细胞的表达。采用Trizol法（GeneAll，韩国）提取总RNA，用RT-PCR转化为互补DNA（cDNA）。然后，进行PCR扩增，以确定所有构建体的全长表达。对于Western印迹法，在放射免疫沉淀试验（RIPA）裂解缓冲液中收集RAW 264.7细胞，并以50%振幅超声5 s，进行2~4个周期，周期之间间隔60 s。收集上清液，进行SDS-PAGE（12%），并转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜（止动剂R-P；Millipore，爱尔兰）。用兔一抗（1∶500稀释）处理膜，用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（1∶6000；SouthernBiotech，美国）孵育，然后添加化学发光底物生成图像。所开发的图像被记录下来以进行进一步分析（Cytiva，美国）。

此外，通过IFA验证了RAW 264.7细胞中的蛋白表达。孵育48 h后，将细菌接种的细胞用冷冻丙酮（80%）在-20 °C下固定10 min。用0.1% Triton X-100渗透固定细胞，然后用3%牛血清白蛋白封闭。用兔一抗（1∶200稀释）在4 °C下处理细胞过夜，然后用Alexa Fluor 488偶联的驴抗兔IgG（Invitrogen，美国）以1∶5000稀释比例洗涤并染色。接下来，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞进行核斑点染色（Sigma-Aldrich，德国），并在徕卡荧光显微镜（Leica Biosystems，德国）下观察明亮、绿色荧光和蓝色染色；记录图像。

2.8 ST的定位和疫苗构建体的安全性评估

对6周龄雌性小鼠（N = 9）肌肉注射携带#5构建体的1 × 10⁷个沙门氏菌，该构建体在100 μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备或仅使用PBS（对照组）制备，并在实验结束前监测不良影响，如体重减轻、腹泻、易怒、皮毛皱褶、健康恶化和食物摄入量减少。每组采集三只小鼠的脾脏和肝脏标本，分别于接种后3、7、14天（dpi）处死，在亮绿色琼脂上进行细菌定量。使用机械均质器（IKA ultra-TURRAX；Merck，德国）在PBS中分别匀浆，并以10倍连续稀释进行电镀。列举菌落，用特异性引物PCR确认具有代表性的菌落为携带构建体#5的沙门氏菌。

采用组织病理学和免疫组化分析，以确定组织恶化和ST位置。在这些实验中，器官首先被收集并保存在甲醛溶液（10%）中。样品用石蜡包埋并切片（2 μm）。组织切片用苏木精和伊红（H&E）染色，以检查脾脏和肝脏的组织病理学和损伤程度。依照标准方案，利用兔抗沙门氏菌抗体进行免疫组化染色，检测ST位置。简单地说，样品用二甲苯脱蜡，随后用乙醇梯度和蒸馏水水合。然后，将标本在柠檬酸缓冲液（pH = 6）中以100 °C加热30 min，提取抗原，然后加入0.3%的甲醇H₂O₂混合物抑制过氧化物酶活性。样品用兔体内培养的一抗（1∶200稀释）连续标记，并用HRP偶联的山羊抗兔抗体（1∶3000稀释）处理。最后，加入3,3′-二氨基联苯胺（DAB；Sigma-Aldrich）来显色，并记录图像。

2.9 免疫接种

每组8只小鼠用候选疫苗（携带沙门氏菌的构建体）进行肌肉注射接种，剂量为每只小鼠1 × 10⁷菌落形成单位（CFU）。同样，VC组给予ST携带空载体（JOL2865）治疗，健康对照组接受PBS治疗。在21 dpi时，每组处死5只小鼠，并收集脾细胞，如文献[29]所述。监测其余小鼠的体重变化，直到28 dpi，以评估接种的效果。

2.10 酶联免疫吸附试验（ELISA）

21 dpi时取免疫小鼠（每组5只小鼠）的血清，用ELISA法检测总IgG、IgG1、IgG2a。简单地说，96孔ELISA板（Greiner Bio-One，奥地利）被重组蛋白（在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中为5 μg·mL^‒1，pH = 9.6）包裹，在4 °C下孵育过夜。用5%脱脂牛奶封闭孔板，用含有0.1% 吐温-20的PBS洗涤，并与血清样品在37 °C下孵育1 h。样品与HRP偶联的山羊抗小鼠IgG、IgG1和IgG2a抗体以1∶5000稀释，在37 °C下孵育1 h，以确定各自抗体的浓度。最后，用新制备的邻盐酸二苯二胺底物进行显色。加入3 mol·L^‒1 H₂SO₄后停止反应，所以，用酶标仪（Tecan，瑞士）在492 nm波长处测量光密度（OD）。所有实验均重复进行三次。

2.11 荧光激活细胞分选（FACS）和脾细胞增殖试验

从小鼠（每组5只小鼠）中无菌收集脾细胞，并在添加10%胎牛血清的罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）培养基中培养，用于FACS分析、脾细胞增殖试验和细胞因子测定。细胞在96孔板中培养用于FACS和脾细胞增殖试验，并在12孔板中用于细胞因子测定。用重组蛋白（每孔400 ng）刺激细胞，在5% CO₂培养箱中，于37 °C下放置72 h。孵化器用藻红蛋白（PE）标记的抗CD3e、PerCPVio700标记的抗CD4和异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗CD8a抗小鼠抗体（Miltenyi Biotec，德国）对脾细胞进行染色，通过流式细胞术确定免疫后T淋巴细胞亚群的变化。此外，为了评估细胞内细胞因子[干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）]的表达，用重组蛋白刺激用#1和#5处理小鼠的脾细胞。brefeldin A处理4 h后保留细胞内细胞因子。T淋巴细胞最初用CD4和CD8标记，然后按照制造商的说明分别用PE标记的抗IFN-γ（Miltenyi Biotec）和PE标记的IL-4（BioLegend，美国）抗小鼠抗体处理。CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺ T细胞亚群由CD3⁺进行门控（见附录A中的图S1），以及使用MACS Quant分析系统（Miltenyi Biotec）对T淋巴细胞群中IFN-γ及IL-4生成细胞进行定量。

将3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium]（MTT）发色团溶液加入脾细胞中，测定重组蛋白诱导的增殖情况。将免疫小鼠在570 nm（A570）处的吸光度除以对照组小鼠相应的数值，计算增殖指数[30]。这个实验重复进行了三次。

2.12 细胞因子反应

根据制造商的说明，使用RNeasy迷你试剂盒（Qiagen，德国）收集受重组蛋白刺激的脾细胞以提取总RNA。然后，用1 μg纯化RNA（Elpis Biotech，韩国）合成cDNA。如前所述，使用SYBR绿色PCR主混合物（Elpis Biotech），用Applied Biosystems（#4367659；Applied Biosystems，美国）在mRNA水平上测量细胞因子[IFN-γ、肿瘤坏死因子-α（ TNF-α）、IL-10、IL- 4、IL-17]的表达。本研究使用的引物列于附录A中的表S2 [31]。本文进行了熔融峰分析，以确认没有污染和PCR扩增的特异性。采用2^‒ΔΔCT方法，以β-actin为内对照，检测mRNA水平的变化[32]。

2.13 病毒中和试验

病毒的中和测定使用其他研究[33]中所描述的微中和（MN）试验进行。收集的血清在56 °C下热灭活30 min，在稀释系数为2情况下进行连续稀释。稀释后的血清样品用200 TCID₅₀ H1N1 A/PR8/34在37 °C下孵育1 h。允许这些混合物形成抗体病毒复合物，并将其添加到96孔板中的犬肾传代细胞（Madin-Darby canine kidney, MDCK）单层中。这些细胞在加湿的CO₂中于37 °C下培养72 h，使用显微镜连续监测三天，以确定细胞病变效应（CPE）。中和抗体滴度被记录为最高的血清稀释，导致三个孔板中的两个都出现完全CPE抑制。同样，估计了H1N1 A/Brisbane/59/2007、A/California/07/2009、KBPV VR-92和NCCP 43021毒株的病毒中和滴度。

2.14 血凝抑制试验

进行血凝抑制（HI）试验以量化每种血清凝集红细胞的能力。HI试验采用0.75%的鸡红细胞进行。将热灭活血清（在56 °C下灭活30 min）连续稀释两倍，用4个血凝单位[即世界卫生组织（WTO）流感病毒实验室监测手册中描述的病毒量]处理[34]。HI滴度由无凝集的最后一个孔板确定，并指定为该稀释度的倒数。这些试验重复进行两次。

2.15 免疫小鼠的挑战

为了测试系统的保护效果，所有组和对照组的免疫小鼠（每组8只）均通过鼻腔感染甲型流感病毒。在这项研究中，小鼠在增强免疫两周后接受致死剂量[1 × 10⁶平均胚胎感染剂量（EID₅₀）]的H1N1甲型流感病毒A/PR8/34。在广谱保护研究中，使用疫苗构建体#1和#5免疫的小鼠在初次免疫28天后接受甲型流感病毒A/Brisbane/59/2007、甲型流感病毒A/California/07/2009、KBPV VR-92和NCCP 43021毒株感染。感染小鼠按照标准指南进行处理，并每天监测其全身感染迹象、体重变化和死亡率。病毒接种后第3天处死小鼠（每组5只），收集肺组织以测定其形态特征和病毒滴度。以幼年小鼠的肺组织为对照，对所收集的肺组织进行疾病严重程度评分，0表示无变化，1~3表示有轻度、中度和重度并发症。

使用Trizol方法在RiboEx中收集肺组织以分离病毒RNA。如前所述，通过提取RNA，将其反转为cDNA并以病毒RNA作为比较标准进行定量RT-PCR（qRT-PCR）来确定病毒RNA拷贝数[35]。按照上述方法，通过H&E染色检测肺部的组织病理学变化。使用之前描述的针对兔多克隆抗体的免疫组化（IHC）方法确定病毒颗粒的位置。

2.16 统计分析

所有数据均采用GraphPad Prism 9.0软件（GraphPad，美国）进行分析。采用Dunnett多重比较检验进行单因素方差分析（ANOVA），以确定接种组和对照组之间的统计学差异。P值小于0.05时为差异显著。

3 结果

3.1 构建体设计和计算机分析

从NCBI流感数据库中检索到4800多个流感病毒基因组的HA序列，该数据库的时间跨度从1918年到2021年，涵盖了人类、禽类和猪源的H1N1分离株。所有序列都被逐步编译，得到共识序列，最终被压缩成一个单一序列（图1）。使用生物信息学工具分析了共识序列的蛋白质的结构完整性。当通过得出蛋白质的拉马钱德兰图来评估模型的准确性时，研究人员发现在禁止的区域中完全不存在异常AA。此外，模型结构显示近99%的AA残基分布在有利且额外允许的区域[图2（a）] [36]。在预测的B细胞表位中，主要部分以黄色突出的区域表示，表明该序列有可能引起所设计蛋白的体液反应[图2（b）]。使用ProSA-web对预测构建体的局部结构质量进行分析，预测的总体质量Z分数为-7.04 [图2（c）]。用ANTIGENpro预测的最终共识序列的抗原性为0.916077。使用Phyre-2服务器进行的计算机分析显示，H1N1流感A/PR8/34病毒的RBS头部球状区域的自然结构与三维结构相似[图2（d）]。本文进行了一次最终的共识序列分析，设计了不同的疫苗构建体，它们都保留了受体结合域（RBD）区域（130环、150环、190螺旋和220环结构）。设计的这些结构包含HA1的不同区域。构建体#5包含了从N端信号序列到C端茎柄部分的一个完整长度的共识序列，包括球状头部区域。构建体#1覆盖了RBS和球状头部区域，除了第95个位点外，没有糖基化位点，这几乎在所有H1病毒中都存在。通过终止#5构建体茎柄的C端区域，选择构建体#2以包含近端抗原受体位点和RBS。该区域高度保守，并在膜融合中起作用。同样地，构建体#3覆盖了球状头部区域的RBS，作为HA分子的核心相互作用部分，并被设计为排除所有的附属区域。构建体#4由HA相对保守的茎柄部分与RBS一起构建，通过相对保守的HA区域提供广谱覆盖。使用Frodock软件的对接方法预测了每个构建体与著名的重组人抗H1N1HA抗体，即与RBD相互作用的CH65 Fab之间的结合能[图2（e）和（f）] [27]。结合对照评分，即2009年大流行性流感A/California/04/2009（H1N1）毒株的HA，与设计的构建体的评分相当，范围为2430~2900。因此，对于CH65单抗结构，分析预测的亲和力最高的是构建体#5 [图2（f）]。

3.2 蛋白质表达

在感染后，以mRNA水平评估了RAW 264.7和HEK293T细胞中疫苗构建体的蛋白质表达。使用RT-PCR方法可知，感染疫苗候选物（VC JOL2865 除外）的细胞裂解物显示所有疫苗候选物从相应cDNA进行全长扩增[图 3（a）和（b）]。通过细胞裂解物的蛋白质印迹法确认蛋白质表达，蛋白质条带分别为17 kDa、26 kDa、16 kDa、22 kDa和33 kDa，分别对应于构建体#1至#5 [图3（c）]。感染相应疫苗株的 RAW 264.7细胞的明亮荧光证实了蛋白质表达[图 3（d）]。感染VC的细胞没有显示绿色荧光。

3.3 沙门氏菌的安全性评估和定位

在实验期间，小鼠肌肉注射后，携带疫苗株的沙门氏菌减毒活菌没有诱发其不良症状或死亡。注射部位无局部病变，排除了所有不良反应。监测免疫小鼠体重的变化，在实验结束前，该组与对照组的差异不显著[图4（a）]。组织匀浆中的细菌负荷在3 dpi和7 dpi时显示高定植。在14 dpi时，沙门氏菌从肝脏和脾脏中消失[图4（b）]，说明沙门氏菌疫苗株在靶点定位上相对安全、精确。第三天脾和肝脏的组织病理学分析显示轻微的炎症变化和组织损伤[图4（c）]。本文观察到脾脏中红髓在3 dpi时的弥散在14 dpi时被清除（数据未显示）。在IHC分析中，沙门氏菌在脾脏和肝脏中的定位很明显[图4（d）]。沙门氏菌在脾脏中分散，并集中于肝脏中。

3.4 体液免疫反应

用间接ELISA测量了21 dpi时体液免疫反应的诱导情况。用疫苗株免疫的小鼠表现出IgG、IgG2a和IgG1的产生增加。在用疫苗构建体 #1、#2 和 #5治疗的小组中，这种增加尤为明显[图5（a）]。构建体#1和#5的所有三种测量免疫球蛋白均显著增加，表明存在抗原特异性抗体反应。IgG2a的水平高于IgG1，说明Th1占主导地位的免疫反应[图5（b）]。如此有效的体液反应刺激表明表达的共识序列具有抗原性。

3.5 细胞介导的免疫反应

在21 dpi时对免疫小鼠的细胞介导免疫反应进行了研究。检测了用相应重组蛋白重新刺激的脾细胞，以了解T细胞群、增殖指数和细胞因子谱的变化。T细胞的流式细胞术分析显示，与PBS组相比，注射疫苗#1、#4和#5构建体的小鼠中CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺显著增加[图5（c）]；构建体#1组和构建体#5组的CD4⁺T细胞数量均增加了近4%。与对照组相比，免疫组的脾细胞增殖显著增加。所有疫苗毒株的增殖指数均增加了1.5倍以上，其中#4构建体株的增殖指数最高（1.66倍）[图5（d）]。T细胞亚群和增殖指数的显著增加建立了一个强大的T细胞介导的免疫回忆反应。

3.6 细胞因子反应

通过qRT-PCR评估细胞因子的表达谱，结果显示IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17的表达谱显著上升。IFN-γ表达的转录本高度上调为1.8~2.8倍[图5（e）]。同样，IL-10的表达也显著增加，特别是在构建体#4和#5中。除构建体#4外，所有候选疫苗的IL-4表达都很显著。IL-17表达显著上调，表明Th17细胞群被激活。令人惊讶的是，TNF-α水平并没有显著增加，这反映了有限的促炎反应。一般来说，在Th1细胞因子的上调中，IFN-γ的表达高于Th2细胞因子IL-4，表明Th1极化的免疫反应。此外，由构建体#1和#5驱动的CD4⁺IFN-γ⁺和CD8⁺IFN-γ⁺细胞群的数量上升，表明由活化的T淋巴细胞诱导的细胞介导的Th1反应（图6）。构建体#5产生的CD4⁺IFN-γ⁺ T细胞（3.25% ± 1.01%）比构建体#1（1.79% ± 0.67%）高近两倍，而构建体#5产生的CD8⁺IFN-γ⁺ T细胞数量略高。免疫小鼠的T细胞表达的胞内细胞因子IL-4高于对照组小鼠，表明T淋巴细胞的激活也会通过B细胞激活诱导体液反应。

3.7 血清中和及血凝抑制

在21 dpi收集的小鼠血清中评估了针对五种选定的H1N1病毒株的NAb诱导情况。血清表现出CPE抑制，表明病毒被中和，构建体#1和#5的平均 log₂(滴度值)为 6。NAb滴度始终高于对照组和VC组[图 7（a）]。为了测试免疫后产生的抗体强度，使用连续稀释血清的HA抑制来分析病毒凝集红细胞的能力。从免疫小鼠中收集的血清的HI滴度明显高于对照组小鼠[图 7（b）]。此外，VC免疫组血清处理孔中出现CPE，这强化了在免疫小鼠中诱发NAb的发现[图 7（c）]。

3.8 挑战和保护

本病毒攻毒实验旨在研究免疫小鼠对H1N1 A/PR8/34病毒的预防作用。在实验后的第三天，通过监测小鼠肺部全身感染的迹象来评估对病毒攻击的免疫水平。经PBS和VC免疫的小鼠在攻毒后体重严重下降[图8（a）]。肺部大体形态学检查显示感染引起的异常，包括深红色病变和肺水肿，并与初始对照组进行了比较。用#1或#5构建体免疫的小鼠肺部有轻度或无炎症，肺指数评分约为1.0 [图8（b）]。其余的构建体评分较高，表明保护作用最小。与未免疫组和VC组相比，所有疫苗株处理的小鼠的病毒拷贝数均显著减少。这意味着所设计的疫苗构建体具有潜在的保护作用[图8（c）]。从采集的肺中记录到了一致的形态学观察结果。研究发现免疫小鼠的肺部组织变化很小，而 PBS 和 VC 组则出现了深色病变[图8（d）]。

通过用不同毒株的H1N1病毒（即A/Brisbane/59/2007、A/California/07/2009、KBPV VR-92和NCCP 43021）对免疫小鼠进行攻击，评估了所设计的构建体提供NCCP 43021的能力。受到攻击的小鼠在体重方面表现出相似的结果[图9（a）]。此外，最低肺评分证明免疫接种可减少肺损伤，这表明其存在保护性免疫反应[图9（b）]。病毒拷贝数显著下降，在攻击流感病毒A/Brisbane/59/2007、A/California/07/2009、KBPV VR-92和NCCP 43021后第7天达到较低的检测水平 [图9（c）]。

对病毒感染小鼠的肺部进行组织病理学分析发现，非免疫组和VC组有明显的组织损伤。在免疫小鼠的肺中这种组织变形程度很小（图10）。通过对肺样本中病毒的IHC分析，进一步证实了其保护效力。与免疫小鼠组相比，非免疫小鼠组和VC组出现了更高浓度的病毒浓度，显示为棕色病灶，表明免疫接种降低了肺切片中的病毒载量（图11）。

4 讨论

病毒株的进化抗原漂移导致持续的抗原性变异，削弱了基于野外分离株HA和NA序列季节性变化而开发的流感疫苗的效力。为了解决因抗原表位变异而导致的病毒逃逸问题并防止每年重新配制疫苗，需要一种具有广泛保护作用且效果持久的候选疫苗。因此，本文提出了一种称为COBRA的战略方法，以高度可变的球状头部区域HA1为目标，在人类、禽类和猪源菌株中寻找1918年至2021年的进化痕迹[12‒14]。利用这种方法，开发了一种新型疫苗平台，将真核表达载体与活的高度减毒沙门氏菌相结合作为递送系统。基于COBRA，通过选择特定的时间间隔可以产生病毒样颗粒。据报道，这些颗粒可以引发广泛反应的中和抗体，这种抗体可以中和多种流感病毒株，并保护小鼠、雪貂和非人类灵长类动物免受 H1N1、H3N2和H5N1亚型病毒的攻击[12‒13,37‒38]。HA1形成一个三聚体，在每个亚基的末端显示抗原位点。五个免疫显性抗原位点Sa（残基128~129、156~160、162~167 AA）、Sb（残基187~198 AA）、Ca1（残基169~173、206~208、238~240 AA）、Ca2（残基140~145、224~225 AA）和Cb（残基74~79 AA）位于球状部分，对刺激针对流感病毒的免疫反应至关重要[39]。Sa和Sb是刺突尖端附近菌株特异性位点，RBS是一个高度易变的热点，导致抗原性漂移。位于更下方的C位点变化较小且表现出交叉反应。HA中的抗原变异有利于逃避疫苗或先前感染诱导的抗体的中和。因此，设计了针对H1N1球状头部区域不同部分的疫苗构建体。构建体#5从1 AA到300 AA对HA球状头部区域进行编码，被选择为全长结构。构建体#1覆盖了RBS从90 AA到240 AA的核心区域，针对127~235 AA序列中的结合位点。在构建体#1中，除了95 AA外，糖基化位点全部消失，所有的H1N1病毒中几乎都出现了这种情况。

HA上的聚糖可保护抗原位点免受免疫识别，并降低其对受体的亲和力[40‒41]。有报道称，人类免疫缺陷病毒等包膜病毒具有这种屏蔽效应[42]。考虑非糖基化的HA球状头部区域有望引发更有效的抗体反应，并且HA球状头部折叠可以在没有其他糖基化位点的情况下形成蛋白质晶体[43]，因此本研究将构建体#1设计为具有最少的糖基化位点。先前的研究报道称，类似的非糖基化形式的HA受体结合域（RBD; 63~286 AA）表现出自发重新折叠为其天然免疫原性结构，保持完整的表位和功能性受体结合口袋[44]。因此，所选构建体预计会发生自发折叠并形成稳定的抗原蛋白结构。研究发现，除了95 AA之外没有糖基化区域的构建体#1可提供一致且有效的免疫力。这一发现与之前在雪貂中的发现一致[44‒45]。值得注意的是，季节性人类H1N1流感病毒的HA-RBD中通常有四个或五个糖基化位点，而 1918年H1N1西班牙流感大流行病毒和2009 猪源H1N1大流行病毒的HA-RBD只有一个糖基化位点[11]。通过计算机模拟分析评估战略设计的共识序列（#1至#5）的结构完整性，以及Ramachandran图中没有异常值，验证了这些构建体的可靠性[图2（a）]。将沙门氏菌递送系统与特定的真核表达载体pJHL204结合使用，以确保成功递送DNA并表达所需的抗原[21]。这种RdRp依赖性真核表达系统通过细胞质 mRNA扩增增强抗原表达。疫苗构建体使用减毒活沙门氏菌递送，小鼠（RAW 267.4）和人类（HEK293T）细胞系在细菌感染后均表现出mRNA表达[图3（a）和（b）]。在此，证明了沙门氏菌介导的重组蛋白体外表达的概念，如蛋白印迹和IFA结果所示[图3（c）和（d）]。这表明使用减毒沙门氏菌与真核表达载体来提供抗原表达的共识序列的可行性。针对疫苗构建体的NAb的产生增强了表达抗原的功能特性[46]。本文还评估了该疫苗构建体在小鼠中的安全性。在免疫后的短时间内，该构建体在脾脏和肝脏产生了极少的炎症，这也表明存在免疫反应[图4（b）]。感染后第二周脾脏和肝脏中沙门氏菌的清除证实了候选疫苗的安全性[28]。

早期适应性体液反应的诱导有助于在感染初期清除入侵的H1N1流感病毒[47]。为了研究是否发生了这种反应，本研究监测了免疫反应启动引起的IgG水平[图5（a）]。此外，检测了IgG的亚类，发现IgG2a的产量高于IgG1 [图5（b）]。这一观察结果表明，Th1主导的细胞介导反应，以及这种对Th1免疫反应的倾向解释了细胞内抗病毒反应的范式[48]。细胞介导免疫（CMI）对保护宿主抵御细胞内病原体起着至关重要的作用。据报道，H1N1流感病毒特异性CD4和CD8 T细胞的增加降低了感染率[49]，本研究观察到接种#1和#5构建体后T细胞均显著增加[图5（d）]，表明CMI诱导是接种疫苗后的保护性反应。构建体#2携带糖基化区域，而糖基化的病毒蛋白和经过处理的表位很少被 T 细胞靶向[50]，这抑制了T细胞识别，并且改变了T细胞对病毒感染的免疫。此外，具有单个N-聚糖的HA蛋白比杂合型N-聚糖更能有效地触发小鼠树突状细胞活化和成熟[51]。这说明越简单的糖基化，如在构建体#1中，越能有效地触发免疫反应的观点。值得注意的是，构建体#3可能没有适当刺激免疫反应的抗原呈递。本文评估了Th1相关的细胞因子IFN-γ，以支持发现的抗病毒活性；通过抗体反应诱导抗病毒防御也反映在Th2相关的细胞因子IL-4上。一般来说，IL-10表示Th2反应。具体来说，在流感感染期间，IL-10由CD4⁺效应T细胞和CD8⁺ T细胞产生，以限制过度炎症[52‒53]。IL-17的显著增加意味着Th17细胞的激活，这些细胞与调节炎症和清除黏膜屏障上的流感感染有关[54]。IFN-γ的抗病毒活性已得到充分证实，IFN-γ对肺上皮细胞的作用可抑制流感病毒的扩增[55‒56]。活性T辅助细胞（CD4⁺）产生IFN-γ来募集免疫细胞并刺激B 巴细胞分化以清除病毒感染，而细胞毒性T细胞（CD8⁺）产生IFN-γ来直接杀死及清除病毒颗粒和受感染的细胞。因此，用构建体#5或#1免疫后，CD4⁺IFN-γ⁺和CD8⁺IFN-γ⁺ T细胞的产生量增加，表明免疫诱导了显著的抗病毒效果。此外，刺激B细胞增殖和同型转换对产生免疫球蛋白至关重要，而Th2型细胞产生IL-4以满足此目的[57]。在免疫小鼠中发现的CD4⁺IL-4⁺ T细胞大量生成，这有助于B细胞增殖[58]。这证实了构建体#1和#5诱导体液反应。

通过NAb的产生来评估经过免疫递送的抗原的功能特征[46]。因此，本研究评估免疫组中NAb的存在以确定抗病毒反应。构建体#1和#5记录的MN滴度log₂(NAb滴度)为6.0 [图7（a）]。在之前的报道中，针对甲型流感的1∶40 的MN滴度可提供49%的针对PCR确诊病例的保护率[59]。因此，本研究中免疫小鼠产生的NAb浓度足以保护它们免受H1N1感染。高于40的HI滴度通常被认为是开启免疫的阈值[60]。这两种构建体对所有测试病毒株的HI滴度都高于该阈值，表明其诱导了保护性免疫[图7（b）]。此外，病毒中和和HI的效价值相似，表明两者之间呈正相关，这与已发表的报道结果一致[61]。

由COBRA设计的共识序列所提供的广谱保护已经在甲型流感病毒的各种H1N1毒株中进行了全面测试。毒株的选择基于它们在过去和当前流行的疫情中的普遍程度。为了确保全面评价，选择了三种全球毒株来代表广泛的地理位置，并分离出其他两个本地毒株。与对照组相比，免疫接种组通过最小体重减轻程度和最小肺部严重程度评分指数，证明了免疫提供的保护效果。因为肺泡塌陷的增加是甲型流感病毒严重感染的迹象[62]。通过qRT-PCR分析，免疫小鼠的病毒拷贝数较低，证实了其保护效果。A/PR8/34流感毒株的小鼠肺部形态变化可以忽略不计，其病毒拷贝数显著减少，特别是构建体物#1和#5中。因此，本研究只评估了这两种构建体对其他病毒株的预防能力。其中在A/Brisbane/59/2007、A/California/07/2009、KBPV VR-92和NCCP 43021毒株感染后7天，病毒载量显著下降，这更好地说明了其预防作用。组织病理学分析显示，用构建体#1和#5免疫的小鼠有轻微的炎症。相反，在对照组和VC组中发现大气道上皮细胞有明显的炎症，血管周围和支气管周围存在白细胞浸润。此外，非免疫组和VC组的肺泡充血明显证明了由感染引起的组织变形（图10）。因此，这项研究清楚地表明，使用COBRA衍生的共识序列免疫有效地降低了肺部感染的严重程度，降低病毒复制，并减轻与多种H1N1病毒攻击相关的炎症和组织损伤。因此，COBRA方法适用于开发一种针对甲型流感病毒感染的高效疫苗。

总之，使用COBRA构建H1N1流感病毒HA1区共识序列，解决了抗原变异和每年疫苗配方调整的问题。使用真核表达载体和减毒沙门氏菌递送系统证明了设计的构建体的体内基因递送。该策略在小鼠模型中产生了强大的体液和CMI反应，对五种H1N1流感毒株（A/Brisbane/59/2007、A/California/07/2009、KBPV VR-92和NCCP 43021）提供广谱保护。通过使用沙门氏菌作为递送系统，不仅消除了每年调整配方的需求，而且还确保了在疫情暴发时快速生产的能力。

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