光响应基因 BcCfaS通过脂质代谢调控灰葡萄孢菌的光形态建成及致病力

李广锦; 张占全; 陈勇; 陈彤; 李博强; 田世平

doi:10.1016/j.eng.2023.08.015

工程（英文） ›› 2024, Vol. 35 ›› Issue (4) : 201 -213. DOI: 10.1016/j.eng.2023.08.015

研究论文

光响应基因 BcCfaS通过脂质代谢调控灰葡萄孢菌的光形态建成及致病力

李广锦 ^a^,^b ,
张占全 ^a ,
陈勇 ^a ,
陈彤 ^a ,
李博强 ^a ,
田世平 ^a^,^b

作者信息 +

A Novel Light-Responsive Gene BcCfaS Regulates the Photomorphogenesis and Virulence of Botrytis cinerea via Lipid Metabolism

Guangjin Li ^a^,^b^,^# ,
Zhanquan Zhang ^a^,^# ,
Yong Chen ^a ,
Tong Chen ^a ,
Boqiang Li ^a ,
Shiping Tian ^a^,^b^,^* ,

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摘要

光是地球上生命赖以生存所必需的环境因子，它不仅是能量来源，也是一种信号分子。真菌能通过光获取时间和空间信息，进而控制重要的生理和形态应答。灰葡萄孢菌（ Botrytis cinerea）是一种危害性极大的植物病原真菌，它能利用光响应来优化致病能力，通过平衡产孢量和菌核发育，实现在不同环境中的传播和生存。然而，关于 B. cinerea光信号转导组分及调控机制至今尚不清楚。在本研究中，我们从 B. cinerea中鉴定到一个光信号转导途径的新组分 BcCfaS，该基因编码一个环丙烷脂肪酰基磷脂合成酶。 BcCfaS在转录水平上受光的显著诱导，并在光形态建成中发挥重要的调控作用。 BcCfaS缺失可导致营养生长缓慢，菌落形态改变，产核减少和产孢增加，其变化与光照条件密切相关。此外，该突变体在逆境应答和对寄主的致病力方面表现出严重缺陷。基于脂质代谢组学分析，我们鉴定到了许多未知的且受 BcCfaS调控的脂质，包括一些磷脂和脂肪酸。研究表明， BcCfaS通过正调控茉莉酸甲酯合成，在转录水平激活光信号组分基因表达，从而控制产孢和菌核发育，这些研究结果为深入认知真菌光形态建成的物质代谢基础提供了新证据。我们认为 BcCfaS是整合光信号和脂质代谢的关键节点，揭示了真菌通过调节发育模式来应对光环境变化的协同机制。这些新发现为创制真菌病害防控策略提供了重要的靶点。

Abstract

Light is a fundamental environmental factor for living organisms on earth—not only as a primary energy source but also as an informational signal. In fungi, light can be used as an indicator for both time and space to control important physiological and morphological responses. Botrytis cinerea (B. cinerea) is a devastating phytopathogenic fungus that exploits light cues to optimize virulence and the balance between conidiation and sclerotia development, thereby improving its dispersal and survival in ecosystems. However, the components and mechanisms underlying these processes remain obscure. Here, we identify a novel light-signaling component in B. cinerea, BcCfaS, which encodes a putative cyclopropane fatty-acyl-phospholipid synthase. BcCfaS is strongly induced by light at the transcriptional level and plays a crucial role in regulating photomorphogenesis. Deletion of BcCfaS results in reduced vegetative growth, altered colony morphology, impaired sclerotial development, and enhanced conidiation in a light-dependent manner. Moreover, the mutant exhibits serious defects in stress response and virulence on the host. Based on a lipidomics analysis, a number of previously unknown fungal lipids and many BcCfaS-regulated lipids are identified in B. cinerea, including several novel phospholipids and fatty acids. Importantly, we find that BcCfaS controls conidiation and sclerotial development by positively regulating methyl jasmonate (MeJA) synthesis to activate the transcription of light-signaling components, revealing for the first time the metabolic base of photomorphogenesis in fungi. Thus, we propose that BcCfaS serves as an integration node for light and lipid metabolism, thereby providing a regulatory mechanism by which fungi adapt their development to a changing light environment. These new findings provide an important target for antifungal design to prevent and control fungal disease.

关键词

光 / 灰葡萄孢菌 / 环丙烷脂肪酰基磷脂合成酶 / 脂质代谢 / 光形态建成 / 致病力

Key words

Light / Botrytis cinerea / Cyclopropane fatty-acyl-phospholipid synthase / Lipid metabolism / Photomorphogenesis / Virulence

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李广锦,张占全,陈勇,陈彤,李博强,田世平. 光响应基因 BcCfaS通过脂质代谢调控灰葡萄孢菌的光形态建成及致病力[J]. 工程（英文）, 2024, 35(4): 201-213 DOI:10.1016/j.eng.2023.08.015

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1 引言

光作为一种重要的环境因子，不仅提供了能量来源，同时也是一种重要的外界信号。大多数生物体（植物、动物和微生物）都能通过光捕获周围的环境信息，并驱动其生存适应能力[ 1‒ 2]。作为固着生物，真菌可利用周围环境的光信号来精确地感知时间，并获取自身所处的环境信息（例如，是否在土壤中、寄主内部或空气中，或其他胁迫条件下）[ 3]。通过识别这些信息，真菌在转录水平调控多种生理和形态应答过程，使其能够根据环境条件优化自身的生长和发育[ 4]。光在协调真菌无性和有性发育之间的平衡中发挥着重要作用，进而促进真菌在不同环境中的生存和传播[ 5]。有些病原真菌可利用光信号或生物节律，协调其致病能力，并能在特定的时间达到最大的侵染率[ 6‒ 8]。真菌的快速传播和较强致病力导致严重的植物病害及人类疾病，对人类生活产生了严重危害。此外，真菌的光生物学特性及产生的代谢物（如色素和抗病毒化合物等）可应用于食品和医药行业，进而服务于人类健康[ 9‒ 10]。因此，阐明真菌光生物学的分子调控机制，对推动真菌在生物技术中的应用，以及深入揭示病原真菌复杂的侵染机制，开发真菌病害的防控技术，提供有效策略和作用靶点。

灰葡萄孢菌（ B. cinerea）是一种极具危害性的植物病原真菌，能侵染1400余种植物引发灰霉病，其寄主包括了几乎所有的水果和蔬菜[ 11‒ 12]。世界范围内的调查表明 B. cinerea的危害和重要性在所有植物病原真菌中高居第二[ 13]。 B. cinerea主要通过分生孢子来侵染寄主，分生孢子能借助气流进行传播，是决定灰霉病流行程度和严重程度的关键因素。此外，菌核也可以作为初始侵染源，它能在土壤或植物残体中存活多年，当环境条件适宜时，菌核萌发产生菌丝和分生孢子。 B. cinerea在采前或采后侵染植物的茎、叶、花、果实和种子等不同器官[ 12, 14]。我们在前期研究中发现， B. cinerea可通过产生活性氧来调控自身发育和对寄主的致病力，由此，活性氧也成为防病的重要靶标[ 15‒ 17]。除了具有广泛寄主和复杂侵染机制外， B. cinerea对环境的快速适应能力大大增加了灰霉病的防控难度。与大多数丝状真菌一样， B. cinerea已经进化出感知和响应光环境变化的能力。光在决定 B. cinerea产生无性孢子或菌核的过程中起着重要的调控作用。此外，光可以调控营养生长、孢子萌发、次生代谢、胁迫应答和致病力，进而使 B. cinerea能够实现最佳的生命周期[ 18]。鉴于 B. cinerea全基因组测序的完成及其对光的生理响应，它成为研究病原真菌光生物学的理想模式菌。

环丙烷脂肪酰磷脂（CFA）合成酶是一类在生物体内普遍存的高度保守的蛋白质，是催化甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移到不饱和脂类物质的关键酶[ 19‒ 21]。CFA合成酶在细菌中的作用机制已经得到了广泛研究，它能通过催化膜磷脂的环丙烷化，增强细菌对温度、盐度、氧化和pH值等环境因子的适应能力[ 22‒ 24]。在人类一些病原细菌中，如幽门螺杆菌（ Helicobacter pylori）和结核分枝杆菌（ Mycobacterium tuberculosis），CFA合成酶是抵御抗菌药物和致病力所必需的组分[ 25‒ 27]。CFA合成酶在植物细胞脂质代谢中发挥重要作用，它的缺失将导致脂肪酸成分发生变化[ 20]。仅对真菌CFA合成酶在模式蕈菌灰盖鬼伞（ Coprinopsis cinerea）中进行了零星的研究，发现其与子实体形成有关[ 28]。然而，CFA合成酶在病原真菌中的作用机制尚未见报道。

在本研究中，我们从 B. cinerea中鉴定到了一个新的光信号组分 BcCfaS，并揭示其在光响应及生理应答中发挥的重要调控作用。通过脂质分析和化学互补分析，我们证明了 BcCfaS是通过调控茉莉酸甲酯（MeJA）的合成来抑制分生孢子形成和促进菌核发育，说明 BcCfaS能协调 B. cinerea光信号转导和脂质代谢来控制其在自然界中的生存和传播。

2 材料和方法

2.1 菌株和培养条件

本研究选用 B. cinerea B05.10作为野生型菌株，用于基因缺失突变株的构建。原生质体的转化和再生使用Schenk and Hildebrandt (SH)培养基[ 29]。在表型分析时，各菌株接种于PDA培养基上（200 g马铃薯、20 g葡萄糖、15 g琼脂和1000 mL蒸馏水），置于22 ℃光照条件下培养以诱导分生孢子的产生，或者黑暗条件下以诱导菌核的形成。光照强度为7000 lx。在制备分生孢子悬浮液时，分别收集PDA平板上接种10 d的各菌株孢子，然后经两层神奇滤布过滤后，根据实验需求稀释至所需浓度。

2.2 基因序列分析

在 B. cinerea数据库（ http://fungi.‍ensembl.‍org/Botrytis_cinerea/Info/Index）中下载 BcCfaS的序列，利用GenBank（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）数据库进行BLAST搜索，获得 BcCfaS的同源序列。使用EMBOSS Needle webtool（ www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）进行多序列比对分析。系统进化树的构建参照[ 30]所述方法，利用MEGA 5.0软件构建。

2.3 载体构建和转化

基于同源重组原理，参考文献[ 29]的方法构建 BcCfaS的敲除突变株。以特异性引物扩增 BcCfaS基因上下游约1.0 kb的侧翼序列，使用ClonExpress II One Step Cloning Kit（Vazyme, China）将上述片段分别克隆至pLOB7载体上潮霉素磷酸转移酶基因（ HPH）的上下游。扩增包含侧翼序列和 HPH表达框在内的4.4 kb片段，并通过聚乙二醇（PEG）介导的方法转化至原生质体中，在含有50 μg·mL ^-1潮霉素B（Roche, Germany）的SH培养基上进行阳性转化子筛选。为了获得同核突变体，在含有150 μg·mL ^-1潮霉素B的SH培养基上对突变株进行单孢分离。参考文献[ 31]的方法对突变株进行Southern blot分析以鉴定单拷贝插入。

基因互补载体的构建参照文献[ 32]的方法进行，首先扩增包括 BcCfaS编码序列及其上游和下游元件在内的基因表达框，然后将其克隆至经Spe I/EcoR I酶切的pNAN-OGG载体。将诺尔丝菌素抗性基因和 BcCfaS基因表达框整合至 bcniiA基因位点，从而获得 BcCfaS敲除突变株的互补菌株。构建基因敲除突变株和互补菌株的引物序列见附录A中的表S1。

扩增 BcCfaS的开放阅读框序列，克隆至经限制性内切酶Not I酶切的pNAN-OGG-eGFP载体，实现 BcCfaS和绿色荧光蛋白（GFP）基因的融合表达载体的构建。用特异性引物扩增含有 bcniA侧翼序列、 BcCfaS-GFP表达盒和诺尔丝菌素抗性基因的7.4 kb片段，然后转化到WT菌株的原生质体中。在含有50 μg·mL ^-1诺尔丝菌素的SH培养基上进行阳性转化子筛选。将阳性转化子接种于PDB培养基中，于22 ℃、180 r·min ^-1条件下培养4 h，收集菌丝，然后光照或者黑暗条件下再孵育2 h，进行亚细胞定位分析。利用ER-tracker red（Thermo Fisher Scientific, USA）染色进行内质网定位分析。通过共聚焦显微镜（ZEISS LSM 980, Germany）观察融合蛋白的荧光。

2.4 生长和发育分析

在生长3 d的菌落边缘打取直径为2 mm的菌块，接种到PDA平板上，在光照或者黑暗条件下培养，测定菌丝生长速率、产孢量和菌核数量。于不同时间点利用十字交叉法测定菌落直径，以自动细胞计数仪测定分生孢子数量，通过观察和统计菌核数量明确菌核的形成情况。将各菌株在铺有无菌玻璃纸的PDA平板上培养3 d，在荧光显微镜（Leica DM 2500, Germany）下观察菌落特征。

2.5 致病力检测

选取外观完整、无病害的苹果果实、草莓果实和番茄叶片进行 B. cinerea致病性检测。接种前，将果实浸泡于2%次氯酸钠溶液进行表面消毒，然后用清水进行冲洗，晾干后用消毒接种针刺伤果实。以1/4 PDB将孢子悬浮液浓度稀释至2×10 ⁵个·mL ^-1，吸取5 µL孢子悬浮液，滴加到果实伤口或番茄叶片上表面。将接种后的材料转移至湿度恒定的密闭容器内，置于22 ℃、黑暗条件下进行培养，不同时间点利用十字交叉法统计病斑直径并拍照。每个处理设置三个重复，每个重复至少包含20个果实。

2.6 胁迫适应性分析

为了比较不同菌株的胁迫耐受能力，分别将孢子悬浮液（5 µL, 1×10 ⁶个·mL ^-1）接种于含有渗透胁迫剂NaCl和KCl、氧化胁迫剂H₂O₂、低氧胁迫剂CoCl₂和细胞壁胁迫剂刚果红的PDA平板上，以培养3 d时的菌落直径和相对生长抑制率为评价指标评估菌株对胁迫的适应能力[ 33]。实验重复三次，每个重复中各菌株至少接种三个平板。

2.7 RNA分离和荧光定量PCR

使用RNA提取试剂（Omega, USA）分离总RNA，将1 μL总RNA以PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa, USA）反转录成cDNA。RT-qPCR所使用的试剂为SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa, Japan)，仪器为Step One Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA)。选择 BcactA为内参基因，每个样品设置三次技术重复[ 15]。所用引物见附录A中的表S1。

2.8 脂质分析

将WT和Δ BcCfaS菌株接种于铺有玻璃纸的PDA培养基上，置于黑暗条件下培养48 h后，将各菌株平均分成两份，取一部分转移至光照条件下。继续培养12 h后，收集黑暗和光照条件下的菌丝并在液氮中将其研磨成粉末。称取大约100 mg粉末溶解在750 μL甲醇和2.5 mL甲基叔丁基醚中，在摇床上孵育1 h [ 34]。加入625 μL水混匀，室温孵育10 min后，1000 g离心10 min。收集上层有机相，向下层相中加入1 mL甲基叔丁基醚/甲醇/水（10:3:2.5, V/ V/ V）再次萃取。将两次收集的有机相合并用氮吹仪进行氮吹浓缩，并用100 μL异丙醇进行复溶。使用与Q Exactive HF质谱仪（Thermo Fisher, Germany）联用的Thermo Vanquish UHPLC液相色谱系统对脂质提取物进行分析。脂质分离的条件参考文献[ 35]。质谱分析采用正离子和负离子扫描模式[喷雾电压为3 kV，毛细管温度为350 ℃，鞘气压力为20 psi（1 psi = 6.895 kPa），辅助气流量为5 L·min ^-1，吹扫气速率为1 L·min ^-1]，扫描范围 m/ z 114~1700。使用Compound Discoverer 3.01软件（Thermo Fischer）对原始数据进行标准化处理和分析，从而对脂质数据结果进行定性和定量。数据处理和统计分析参考文献[ 35]所述方法进行。差异脂质代谢物筛选的标准为VIP > 1、 P < 0.05且倍数变化≥ 1.5或倍数变化≤ 0.67。通过对代谢物峰面积进行log2转换和min-max标准化处理进行聚类热图的绘制。基于欧几里得距离和完全连接法获得聚类模式。

2.9 液相色谱-串联质谱检测茉莉酸甲酯的含量

按照2.8节的方法进行样品制备和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。MeJA的提取、纯化和分析参考文献[ 36]所述方法并进行适当修改：将菌丝研磨成粉末，溶解在三倍体积的80%预冷乙醇中，4 ℃孵育过夜，然后于4 ℃、6000 g离心20 min收集上清，经Sep-pak C18固相萃取柱纯化后进行LC-MS/MS分析。LC-MS分析条件如下：色谱柱，ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm × 100.0 mm, 1.8 μm; Waters, USA）；流动相，水（0.1%甲酸）和乙腈（0.1%甲酸）；梯度洗脱程序，5:95 V/ V，0~4 min；90:10 V/ V，4~8 min；5:95 V/ V，8~10 min；流速，0.38 mL∙min ^-1；柱温，45 ℃；进样体积，10 μL。

2.10 统计分析

利用SPSS软件（SPSS Inc., USA）对本研究获得的数据进行单因素方差分析，通过独立样本 t检验或者邓肯多重比较法进行差异显著性分析， P ≤ 0.05 时为差异显著。

3 结果

**3.1 BcCfaS是一个新的 B. cinerea光响应基因**

为了鉴定 B. cinerea光信号通路中的关键调控元件，我们对60 min光照处理的 B. cinerea样品进行了高通量RNA测序分析。通过测序鉴定到了大量的光响应基因，其中 Bcin03g06110在转录水平上受到光照的显著诱导[ 图1（a）]。 Bcin03g06110在NCBI数据库（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中被注释为假定的CFA合成酶编码基因。因此，我们将该基因命名为 BcCfaS。为了进一步确认 BcCfaS的光响应表达模式，首先将WT菌株置于黑暗条件下生长60 h，然后转移到白光下处理15~240 min，收集菌丝后进行RT-qPCR分析。结果显示， BcCfaS的基因表达水平在光照处理15 min后便被迅速诱导，并在60 min时达到峰值，增加了14.2倍，呈现出快速和强烈的光应答反应[ 图1（b）]。

BcCfaS基因由6个内含子和7个外显子组成，位于III号染色体上，开放阅读框含有1026个核苷酸，编码由342个氨基酸组成的内质网定位蛋白[ 图1（c）]。蛋白质序列比对分析表明，BcCfaS与其他丝状真菌的直系同源物具有高度相似性，如 Monilinia fructicola (99.1%)、 Sclerotinia sclerotiorum (98%)、 Magnaporthe oryzae (87.2%)、 Colletotrichum gloeosporioides (91.8%)、 Verticillium dahlia (91.2%)、 Lasiodiplodia theobromae (84.2%)、 Botryosphaeria dothidea (83.4%)、 Aspergillus nanangensis (80.2%)、 Aspergillus affinis (75.9%)、 Ustilago hordei (62.0%)、 Ustilago maydis (64.7%)。为了研究不同物种间同源蛋白序列的进化关系，构建系统进化树进行系统进化分析。结果表明，BcCfaS在丝状真菌中高度保守，与包锤舌菌纲的 M. fructicola和 S. sclerotiorum亲缘关系较近[ 图1（d）]。

**3.2 BcCfaS是光形态建成的重要调控因子**

为了探索 BcCfaS在 B. cinerea中的生物学功能，我们通过同源重组的方式，获得了 BcCfaS敲除突变株，WT菌株B05.10中 BcCfaS的整个开放阅读框被潮霉素抗性基因表达框取代。从具有潮霉素抗性的转化子中筛选出两个独立的基因缺失突变株Δ BcCfaS-1和Δ BcCfaS-2，进行单孢分离，通过PCR、southern blot和表达模式分析对突变株进行了鉴定（附录A中的图S1）。此外，为了确认 BcCfaS的功能，我们将 BcCfaS的全长核苷酸序列异位整合到Δ BcCfaS中，构建了互补菌株。

首先研究了 BcCfaS对 B. cinerea在光照或黑暗条件下营养生长的影响。结果如图2（a）、（b）所示，Δ BcCfaS的生长速率显著降低，但其生长缺陷的程度与光照条件密切相关。生长2 d后，与WT和互补菌株相比，Δ BcCfaS在黑暗条件下的菌落直径减少了42%，但在光照条件下仅减少了25%。有趣的是，WT和 BcCfaS缺失突变株的光调控生长模式不同。受到光照后，WT菌株的生长速率会略有下降。然而，Δ BcCfaS菌株在光照下比在黑暗中生长得更快，表明 BcCfaS是光照条件下抑制营养生长的正调控因子。进一步观察菌丝生长情况，显示Δ BcCfaS在黑暗条件下菌落形态异常，菌丝更为致密，而在光照条件下则正常[ 图2（a）]。这些结果表明 BcCfaS能以光依赖性方式调控 B. cinerea的营养生长。

BcCfaS在转录水平上对光的快速响应表明它可能是 B. cinerea的重要光信号成分。鉴于光在调控真菌发育中发挥着主导作用，我们进一步研究了 BcCfaS在光控发育中的作用。在黑暗条件下生长7 d后，WT菌株开始产生菌核，但Δ BcCfaS几乎不能形成任何菌核[ 图2（c）]。生长14 d后，Δ BcCfaS只能形成数量较少且体积更大的菌核[ 图2（d）、（e）]，而产生大量的分生孢子[ 图2（f）]，表明 BcCfaS在黑暗条件下能抑制产孢和促进产核。在光照条件下，尽管Δ BcCfaS的生长速率显著低于WT菌株，但其呈现出过早且过度产孢的表型。接种7 d后，Δ BcCfaS的分生孢子数量比WT菌株高出三倍[ 图2（g）]，表明 BcCfaS是抑制光照条件下产孢的重要因子。恢复突变株能够较好地恢复Δ BcCfaS的上述光控发育缺陷，进一步证实 BcCfaS是 B. cinerea光控发育的关键因子。

为了明确 BcCfaS在光应答反应和光控发育中的分子机制，我们检测了11个预测的光受体编码基因和调控光形态建成的5个光响应基因（ BcLTF1、 BcLTF2、 BcLTF3、 BcVEL1和 BcFRQ1）的表达水平。RT-qPCR结果表明，在黑暗和光照条件下，Δ BcCfaS中的5个光受体编码基因（ BcLOV3、 BcWCL2、 BcPHY1、 BcPHY2和 BcBOP1）和三个光响应基因（ BcLTF1、 BcLTF2和 BcFRQ1）的表达量均下调[ 图2（h）]。此外，Δ BcCfaS中 BcCRY1、 BOP2和 BcLTF3的表达量仅在黑暗条件下降低，而其他基因的转录没有显著变化（附录A中的图S2）。这些结果表明 BcCfaS是光受体编码基因和光响应基因表达所必需的调控因子。

**3.3 BcCfaS是 B. cinerea致病所必需的**

为了研究 BcCfaS是否参与对 B. cinerea致病力的调控，将WT、Δ BcCfaS和互补菌株的分生孢子悬浮液分别接种到番茄叶片、苹果和草莓果实上。如图3所示， BcCfaS的缺失导致对多种寄主致病力的下降。接种番茄叶片24 h后，WT和互补株形成了非常明显的病斑，而Δ BcCfaS未观察到病斑。接种48 h后，Δ BcCfaS在番茄叶片只能产生非常小的病斑，仅为对照直径的48.6% [ 图3（a）、（b）]。与此类似，突变株接种苹果果实72 h后的病斑直径较WT减少了60.3% [ 图3（c）、（d）]，草莓果实的病斑直径减少了37.8% [ 图3（e）、（f）]，互补能够较好地恢复敲除突变株的致病力缺陷。这些结果表明 BcCfaS是 B. cinerea致病所必需的。

**3.4 BcCfaS参与对胁迫应答的调控**

植物病原菌的胁迫耐受能力是成功侵染寄主的前提。CFA合成酶已被证明在细菌抵御各种环境胁迫的反应中具有重要功能[ 22]。为了研究 BcCfaS是否参与胁迫响应，将WT、Δ BcCfaS和互补菌株分别接种在含有各种胁迫剂的PDA培养基上，培养3 d后，比较各菌株在胁迫环境的生长速率，计算菌丝生长的抑制率，评估其对胁迫的敏感性。如图4所示，在含有渗透胁迫剂NaCl或KCl、酸胁迫剂柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液（pH 4.0）、氧化胁迫剂H₂O₂和低氧胁迫剂CoCl₂的培养基上，WT和互补菌株的菌丝生长受到显著抑制[ 图4（a）、（b）]，而Δ BcCfaS在这些胁迫下的生长抑制程度降低[ 图4（c）]。这些结果表明， BcCfaS缺失后导致 B. cinerea对渗透胁迫、酸胁迫、氧化胁迫和低氧胁迫的耐受力增强，敏感性减弱。相反，与WT和互补菌株相比，Δ BcCfaS在含有细胞壁胁迫剂刚果红的培养基上生长较慢，说明Δ BcCfaS对细胞壁胁迫更敏感[ 图4（c）]。上述结果表明 BcCfaS在 B. cinerea对各种环境胁迫的应答中发挥多效性作用。

**3.5 BcCfaS以光依赖的形式调控脂类物质的组成**

为了揭示 BcCfaS在脂质代谢中的功能，我们对Δ BcCfaS和WT在黑暗或光照条件下的脂质谱进行了分析。本研究共鉴定到789种脂质（正离子模式下435种，负离子模式下354种），属于19个脂质亚类（附录A中的表S2）。其中，数量最丰富的是磷脂酰胆碱（PC，220种），其次是甘油三酯（TAG，106种）、磷脂酸（PA，76种）、脂肪酸（FA，73种）、磷脂酰乙醇胺（PE，65种）、神经酰胺（Cer，41种）、双磷脂酰甘油（CL，39种）、磷脂酰甘油（PG，38种）、甘油二酯（DAG，27种）和磷脂酰丝氨酸（PS，27种）[ 图5（a）和附录A中的表S2]，表明这种基于LC-MS/MS的脂质组学方法对 B. cinerea脂类物质的覆盖率较高。为了确保数据准确性，所有样品均采用正离子和负离子两种模式检测，每个处理进行4次重复，各组结果均表现出良好的重现性，PLS-DA分析显示各组之间具有明显的分离[ 图5（b）]。

为了鉴定光响应脂质代谢物，首先分析了光照处理后WT和Δ BcCfaS菌株中脂质组成的变化[ 图6（a）]。光照处理引起WT菌株中19种脂质代谢物发生差异积累。Δ BcCfaS中共鉴定到33种脂质代谢物具有光响应特性，其中仅有三种与WT重合，说明 BcCfaS可能在光对脂质代谢的调控中发挥重要作用。随后，我们重点分析了 BcCfaS缺失后发生差异积累的脂质代谢物[ 图6（b）]。与WT菌株相比，Δ BcCfaS在黑暗条件下和光照条件下分别有84种和68种差异脂质代谢物。为了更好地了解Δ BcCfaS和WT之间的脂质组成变化，进一步对差异脂质进行分类，并使用TBtools软件绘制热图对结果进行可视化分析。如图6（c）所示，这些差异代谢物主要富集在7个脂质亚类中，包括CL（10种）、PC（21种）、PG（5种）、FA（19种）、PA（24种）、Cer（12种）、DAG（5种），表明 BcCfaS能以光依赖性方式调控 B. cinerea脂类物质的组成。

**3.6 BcCfaS介导的茉莉酸甲酯合成对光形态建成至关重要**

真菌脂肪酸的组成和发育密切相关[ 37‒ 39]。脂质组学分析表明， BcCfaS缺失后，灰霉病菌中26%的脂肪酸的水平发生了显著变化[ 图6（c）]。大部分脂肪酸在真菌中的生物学功能是未知的。其中，茉莉酸甲酯是一种脂肪酸衍生物类的信号分子，因其在多种生物体中具有独特的生理功能而引起了我们的关注[ 40‒ 42]。我们进一步通过LC-MS/MS检测了WT和Δ BcCfaS突变株在黑暗或光照条件下的茉莉酸甲酯含量[ 图7（a）]。结果显示，在Δ BcCfaS和WT菌株中均可以检测到茉莉酸甲酯，但无论是黑暗还是光照条件下，Δ BcCfaS中茉莉酸甲酯的含量相比于WT菌株均显著降低[ 图7（b）]。此外，受到光照后，WT菌株中MeJA的水平上升1.37倍，但这种诱导作用在Δ BcCfaS中几乎消失[ 图7（b）]。上述结果表明 BcCfaS在 B. cinerea的茉莉酸甲酯合成中发挥重要作用。

为了研究 B. cinerea的光形态建成是否与MeJA的含量相关，将WT菌株和Δ BcCfaS培养在含有不同浓度外源MeJA的PDA培养基上。结果表明，低浓度的MeJA对WT菌株的营养生长影响较小，但能显著影响分生孢子和菌核的形成（图S3）。如图8所示，MeJA处理不能恢复Δ BcCfaS在黑暗[ 图8（a）、（b）]或光照[ 图8（a）、（c）]条件下的生长缺陷。但有趣的是，外源添加MeJA能以浓度依赖性方式恢复突变株产核和产孢的缺陷[ 图8（h）]。当MeJA的浓度增加到100 μmol·L ^-1时，Δ BcCfaS突变株在黑暗条件下的菌核和分生孢子数量[ 图8（d）、（e）]以及光照条件下的分生孢子数量[ 图8（f）]几乎恢复到WT菌株的水平。此外，MeJA处理能诱导Δ BcCfaS中 BcLTF1、 BcWCL2和 BcPHY2等光信号通路关键组分的表达[ 图8（g）]。这些结果表明Δ BcCfaS的光控发育缺陷很大程度上是由于MeJA的含量减少造成的，外源MeJA处理能较好地恢复突变株的表型缺陷。

4 讨论

真菌能感知和传递环境中的光信号，通过协同转录调控，调节自身的生长发育及对环境的适应能力[ 2, 4]。在过去的几十年里，粗糙脉孢菌（ Neurospora crassa）和构巢曲霉（ Aspergillus nidulans）中已经报道了大量的光响应基因，并且这些基因在光应答中的作用机制也已被阐明[ 43‒ 45]。相比之下，作为死体营养型病原真菌和寄主互作的模式菌 B. cinerea，光应答的核心组分及其调控机制至今仍不清楚。在本研究中，我们从 B. cinerea中鉴定到了一个新的光响应基因 BcCfaS，它编码一种CFA合成酶家族蛋白，光照能显著诱导WT菌株中 BcCfaS的表达[ 图1（a）、（b）]。在其他微生物中也观察到类似的研究结果。例如，在人类病原细菌巴氏不动杆菌（ Acinetobacter baumannii）和模式蕈菌 C. cinerea中，编码CFA合成酶的基因在转录水平上受到光诱导[ 46‒ 47]。最近的研究发现， C. cinerea的CFA合酶基因是光响应转录因子NsdD的直接靶标，它与NsdD协同调控 C. cinerea的光形态建成[ 48]，暗示CFA合酶可能是不同生物体中保守且重要的光信号转导组分。在本研究中，我们首次从遗传和表型层面证明了 BcCfaS是调控 B. cinerea光响应及形态发育的重要因子。

光在协调真菌生长、平衡无性和有性发育过程中发挥着关键作用[ 4]。正如前人报道，光胁迫会导致 B. cinerea的菌丝生长速率缓慢[ 18]。然而，在Δ BcCfaS突变体中，光对生长的抑制程度减弱，该突变体在光照条件下生长更快[ 图2（a）、（b）]。因此，我们认为敲除 BcCfaS可能导致 B. cinerea对光的敏感性降低。Δ BcCfaS突变体“光盲”的发育表型，以及突变体中大量光调控基因表达量的下降，也证实了我们的猜想。尽管分生孢子在真菌生命周期中非常重要，但过度产孢对病原真菌是不利的。因为过度产孢会抑制营养生长和有性生殖，甚至减弱其致病能力。病原菌从寄主体外感受到环境光信号后会启动产孢程序，从营养生长转向产孢过程，有利于病原在空气中传播[ 49]。相反，在缺乏光照的环境下，例如，在土壤中或腐烂的植物寄主中，产生的无性分生孢子无法在空气中进行传播。因此，在黑暗条件下， B. cinerea会更多地产生菌核[ 18, 49]。除了产孢促进因子， B. cinerea也通过一些产孢抑制因子来维持正常的生长发育，如 BcWCL1、 BcLTF1、 BcLTF3、 Bcmads1和 Bcvel1 [ 50‒ 53]。这些基因的缺失导致发育过程不依赖于光照条件，引起过度产孢而几乎完全丧失产核能力，突变体表现出“光盲”的表型。我们的研究表明： BcCfaS的缺失会引起类似的“光盲”表型，突变体在光照和黑暗条件下的产孢量都显著增加，并且在黑暗条件下的产核能力显著下降[ 图2（c）]，说明 BcCfaS是介导光控发育过程的重要调控因子。伴随着光控发育的缺陷，Δ BcCfaS突变体中8个光调控基因在黑暗和光照条件下的表达量均显著下调[ 图2（h）]。其中， BcLTF1是一个重要的光信号组分，与 BcCfaS具有类似的功能[ 50]，由此表明 BcCfaS可能通过调控 BcLTF1介导光控发育过程。

在真菌中，一些光响应基因参与调控胁迫应答过程，从而增强对光胁迫的适应性，但对其调控机制并不清楚[ 50, 54‒ 55]。本研究中，我们发现Δ BcCfaS突变体对细胞壁胁迫的敏感性增加，但对渗透、酸、氧化和缺氧胁迫的敏感性降低（图4）。序列分析表明BcCfaS可能作为CFA合成酶发挥作用，CFA合成酶在细菌、植物和寄生虫中的脂质代谢中具有重要的调控作用[ 19‒ 20, 56]。与上述发现一致，我们观察到 BcCfaS的缺失对 B. cinerea在黑暗和光照条件下的脂质组分合成均产生了很大的影响。差异脂质代谢产物的分析表明， BcCfaS缺失显著改变了磷脂的含量，包括PC、PG、CL、PE和PS [ 图6（c）]。磷脂是细胞膜的主要组分，膜磷脂的脂肪酰基链组成是决定膜特性的关键因素，影响多种重要的膜相关功能[ 57]。在大肠杆菌中，CFA合成酶介导的环丙烷化，导致膜磷脂中的不饱和脂肪酰基转变为饱和脂肪酰基，从而降低了膜透性，进而影响大肠杆菌对多种胁迫的应答能力[ 22‒ 23]。我们的结果表明， BcCfaS可能是通过调控细胞膜磷脂组分来控制 B. cinerea的胁迫应答。病原体在侵染过程中通常会遇到寄主的抵抗，病原菌对寄主的抗性应答（如酸胁迫、细胞壁胁迫和氧化应激）对其致病力至关重要[ 58‒ 59]。在人类病原体幽门螺杆菌的研究中，研究者发现CFA合成酶能通过调节对酸胁迫的耐受性来促进其在胃部的定殖[ 25]。在本研究中，我们发现 BcCfaS的缺失导致 B. cinerea对不同植物寄主的致病力降低（图3），说明 BcCfaS缺失影响病原菌的胁迫应答，进而导致其致病力降低。这些结果表明： BcCfaS在脂质代谢、胁迫应答和致病力等方面具有重要的调控作用。

茉莉酸甲酯是一种脂质衍生的环戊酮化合物，作为信号分子参与调节植物生长、发育，及生物和非生物胁迫等多种生理过程[ 42]。在真菌中，内源MeJA仅在稻瘟菌 M. oryzae中有报道，它在植物与病原菌的互作中具有重要的作用[ 60]。在多种真菌中也鉴定到了其游离酸茉莉酸及衍生物，但迄今为止它们的功能尚未被报道[ 61‒ 63]。体外实验表明，MeJA处理影响真菌生长、分生孢子产生和孢子萌发[ 64‒ 67]。最近的研究表明，外源MeJA可以恢复Δ pth11突变导致的芽管发育和附着胞形成的缺陷表型[ 68]，说明MeJA可能是真菌发育过程中的一个关键调控因子。在本研究中，我们通过LC-MS/MS进行脂质组学和靶向分析，发现 B. cinerea能够合成MeJA，并且 BcCfaS的缺失导致黑暗和光照条件下MeJA的含量减少（图7），说明 BcCfaS参与了MeJA生物合成。更有趣的是，外源添加MeJA可以激活光信号组分的转录，并挽救 BcCfaS突变体的光控发育缺陷（图8），表明 BcCfaS通过调控MeJA合成来抑制分生孢子产生和促进菌核形成。这对 B. cinerea从营养生长到生殖生长的转变至关重要，我们的研究揭示了 B. cinerea对光响应的新机制。

综上所述， BcCfaS是死体营养型病原真菌 B. cinerea的一种新的光信号组分，在光形态建成、致病力调控、胁迫响应和脂质代谢中发挥着重要作用。研究结果首次勾画出 BcCfaS在协同调控 B. cinerea无性发育与有性生殖之间平衡的工作模型（图9）： BcCfaS是整合病原菌光信号响应和脂质代谢的关键节点。这些发现不仅揭示了真菌通过调节生长发育模式来适应光环境变化的协同机制，而且为研发真菌病害防控技术提供了新策略和重要靶标。

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