揭示氨对正己酸生产影响的机制——影响途径、关键酶和微生物

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 35 ›› Issue (4) : 187 -198.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 35 ›› Issue (4) : 187 -198. DOI: 10.1016/j.eng.2023.08.018
研究论文

揭示氨对正己酸生产影响的机制——影响途径、关键酶和微生物

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Unveiling the Mechanism Underlying the Effects of Ammonia on n-Caproate Production: Influenced Pathways, Key Enzymes, and Microbiota Functions

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摘要

利用废弃生物质通过链延长（chain elongation, CE）生产的正己酸可以供应各种化石衍生产品，从而推动碳中和的实现。富氮废弃生物质降解释放的氨可以充当厌氧生物过程（包括CE过程）中的营养物质或抑制剂，二者的区别主要取决于氨的浓度。目前，使用乙醇作为电子供体进行开放培养正己酸生产的最佳氨浓度、毒性阈值以及潜在机制尚不清楚。本研究表明，生产正己酸的最佳氨浓度为2 g∙L-1，而超过此阈值的氨浓度会显著抑制CE性能。对该机制的探索揭示了两种形式的氨（即铵离子和游离氨）参与了这种抑制行为。高氨浓度（5 g∙L-1）诱导乙醇过度氧化并抑制逆β氧化（reverse β-oxidation, RBO）途径，直接导致负责乙酸形成的酶（磷酸转乙酰酶和乙酸激酶）的活性增强，丁酰辅酶A∶乙酰辅酶A转移酶、己酰辅酶A∶丁酰辅酶A转移酶和己酰辅酶A∶乙酰辅酶A转移酶活性降低，这些酶参与正丁酸和正己酸合成。此外，微生物群落的优势菌属由Paraclostridium（氨浓度为0.1 g∙L-1）转变为Fermentimonas, Clostridium sensu stricto 12和Clostridium sensu stricto 15（氨浓度为2 g∙L-1）。然而，在过量氨（氨浓度为5 g∙L-1）条件下，这些具有CE功能的细菌大多不存在。宏基因组分析揭示了在氨浓度为2 g∙L-1的条件下RBO、脂肪酸合成、K+外流、腺苷三磷酸酶（ATPase）代谢和金属阳离子输出等的功能基因上调，共同促进了正己酸产量的增加。相反，过量的氨会抑制上述功能（不包括金属阳离子输出）和K+流入，从而削弱氨解毒和正己酸生物合成。本研究对影响正己酸生产的氨驱动机制进行了全面的阐明，预计将激励研究人员设计出有效的策略来减轻氨诱导的抑制作用。

Abstract

n-Caproate, which is produced via chain elongation (CE) using waste biomass, can supply various fossil-derived products, thus advancing the realization of carbon neutrality. Ammonia released from the degradation of nitrogen-rich waste biomass can act as a nutrient or an inhibitor in anaerobic bioprocesses, including CE, with the distinction being primarily dependent on its concentration. Currently, the optimal concentration of ammonia and the threshold of toxicity for open-culture n-caproate production using ethanol as an electron donor, along with the underlying mechanisms, remain unclear. This study revealed that the optimal concentration of ammonia for n-caproate production was 2.0 g∙L−1, whereas concentrations exceeding this threshold markedly suppressed the CE performance. Exploration of the mechanism revealed the involvement of two forms of ammonia (i.e., ammonium ions and free ammonia) in this inhibitory behavior. High ammonia levels (5.0 g∙L−1) induced excessive ethanol oxidation and suppressed the reverse β-oxidation (RBO) process, directly leading to the enhanced activities of enzymes (phosphotransacetylase and acetate kinase) responsible for acetate formation and diminished activities of butyryl-coenzyme A (CoA):acetyl-CoA transferase, caproyl-CoA:butyryl-CoA transferase, and caproyl-CoA:acetyl-CoA transferase that are involved in the syntheses of n-butyrate and n-caproate. Furthermore, the composition of the microbial community shifted from Paraclostridium dominance (at 0.1 g∙L−1 ammonia) to a co-dominance of Fermentimonas, Clostridium sensu stricto 12, and Clostridium sensu stricto 15 at 2.0 g∙L−1 ammonia. However, these CE-functional bacteria were mostly absent in the presence of excessive ammonia (5.0 g∙L−1 ammonia). Metagenomic analysis revealed the upregulation of functions such as RBO, fatty acid synthesis, K+ efflux, adenosine triphosphatase (ATPase) metabolism, and metal cation export in the presence of 2.0 g∙L−1 ammonia, collectively contributing to enhanced n-caproate production. Conversely, the aforementioned functions (excluding metal cation export) and K+ influx were suppressed by excessive ammonia, undermining both ammonia detoxification and n-caproate biosynthesis. The comprehensive elucidation of ammonia-driven mechanisms influencing n-caproate production, as provided in this study, is expected to inspire researchers to devise effective strategies to alleviate ammonia-induced inhibition.

关键词

氨抑制 / 中链脂肪酸 / 正己酸 / 酶 / 宏基因组学

Key words

Ammonia inhibition / Medium chain fatty acids / n-Caproate / Enzyme / Metagenomics

Highlight

・2 g/L ammonia was the optimal dose and inhibitory threshold for MCFAs production.

・FNA and NH4+ were confirmed to be involved in the inhibitory effect.

・5 g/L ammonia could induce the process of excessive ethanol oxidation.

・Ammonia shifted the dominant CE functional bacteria.

・Functions of RBO, FAS, K+ transport and ATPase metabolism were inhibited by high ammonia.

引用本文

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Qing-Lian Wu,Ke-Xin Yuan,Wei-Tong Ren,Lin Deng,Hua-Zhe Wang,Xiao-Chi Feng,He-Shan Zheng,Nan-Qi Ren,Wan-Qian Guo,吴清莲,袁珂鑫,任韦同,邓琳,王华哲,冯骁驰,郑禾山,任南琪,郭婉茜. 揭示氨对正己酸生产影响的机制——影响途径、关键酶和微生物[J]. 工程（英文）, 2024, 35(4): 187-198 DOI:10.1016/j.eng.2023.08.018

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1 研究背景

中链脂肪酸（medium-chain fatty acids, MCFAs）是利用开放微生物群落培养基，通过链延长（chain elongation，CE）技术产生的有价值的平台化学品。它们具有替代部分化石燃料衍生产品的巨大潜力，从而为减少碳排放做出重大贡献[1‒2]。此外，随着分离和提取技术的进步，MCFAs提取效率的提高使得MCFAs的工业应用愈发可行[3]。在这些中链脂肪酸中，正己酸是最普遍和用途最广泛的中链脂肪酸之一，用于生产药品、香料、润滑剂、橡胶、染料[4‒5]，并且是生产液体生物燃料（包括柴油[6]和航空燃料[7]）的关键成分。全球正己酸市场需求正在显著增长，预计到2023年将达到约80亿美元[8]。在经济可行性和环境可持续性之间取得和谐平衡的背景下，强调使用废弃生物质作为主要原料生产正己酸，获得了一致认可[4]。然而，一些可用的废弃生物质来源，如酿造废水[9‒10]、食物垃圾[11]、剩余污泥[12]和牲畜粪便[13]，本身含有高氮含量。该特性导致在底物生物降解过程中释放氨，包括铵离子（NH4 +）和游离氨（FA）。氨浓度升高，会对微生物活动造成显著阻碍[14]。因此，一些厌氧反应器在氨触发的条件下运行，从而降低了CE性能和稳定性。了解氨诱导抑制的影响和潜在机制，对于制定提高正己酸产量的有效策略至关重要。重要的是，产生正己酸的细菌对氨抑制的响应可能与其他厌氧细菌（如产甲烷菌）的反应显著不同，因此需要在该领域进行进一步的研究。

到目前为止，很少有人关注氨对正己酸生产的影响。正己酸生产和甲烷/氢气生产截然不同，主要是因为未解离的正己酸对细菌具有毒性[4]。正己酸浓度为3.3 mmol∙L-1时，微生物活性受到显着抑制[15]，6.9 mmol∙L-1时会出现严重抑制，影响乙酸和正丁酸向正己酸的转化[16]。此外，作为中间体的短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）也起到抑制剂的作用，其毒性作用随着碳链的延长而加剧[3]。因此，中间产物和最终产物的积累会破坏微生态系统和微生物活动。当氨存在时，会对CE过程产生双重抑制作用。因此，CE反应器中氨抑制的阈值可能明显低于其他厌氧反应器。在CE中，两种常用的电子供体是乙醇和乳酸，它们的主要代谢区别在于电子供体氧化阶段[1]。例如，Zhang等[17]报道了当乙醇作为电子供体时，产正己酸菌株Clostridium kluyveri DSM 555的氨抑制阈值为2.1 g∙L-1。Wei等[18]发现，在以食物垃圾为底物、乳酸作为中间体和电子的以Clostridium Ⅳ为优势菌株的CE反应器中，1~4 g∙L-1的氨使正己酸产量线性降低了25%~80%。然而，据我们所知，当使用乙醇作为电子供体时，关于氨对开放培养正己酸生产的影响的综合研究仍然很少。此外，刺激性和抑制性氨浓度对开放培养正己酸生产的影响的复杂机制仍有待充分阐明。

因此，本研究旨在实现两个主要目标：首先，研究当乙醇作为电子供体时，不同的氨浓度对开放培养正己酸生产的影响；其次，揭示氨对正己酸生产影响的内在机制。这项全面的研究涵盖四个不同的维度：①确定负责诱导抑制行为的氨的形式；②揭示氨如何影响CE的两个关键阶段[即乙醇氧化和逆β-氧化（RBO）]，以及相应的关键酶活性；③确定微生物群落对不同氨浓度的响应；④阐明氨对微生物群功能的影响。

2 材料与方法

2.1 接种物与培养基

本研究中使用的接种物是从中国文昌污水处理厂沉淀池收集的废弃活性污泥。污泥经1 mm筛网过滤除去杂质，在4 ℃下沉降24 h浓缩，污泥最终性质为：总悬浮固体（TSS）为16.81 g∙L-1，挥发性悬浮固体（VSS）为10.93 g∙L-1，总化学需氧量（COD）为16.38 g∙L-1，可溶性COD为0.58 g∙L-1，pH为6.72。厌氧发酵培养基组成：每升包括0.2 g MgSO4·7H2O、0.23 g KH2PO4、0.31 g K2HPO4、0.8 g NaCl、0.25 g L-半胱氨酸-HCl·H2O、10 g 2-溴乙磺酸盐（产甲烷菌抑制剂）、1 mL维生素溶液和1 mL微量元素溶液。维生素和微量元素溶液的成分是从我们之前的研究中获得的[9]。

2.2 氨浓度对MCFAs生产性能的影响

实验在21个相同的厌氧反应器（工作体积为250 mL）中进行，分为7组，每组3个平行样品。将接种物（25 mL）、培养基（100 mL）和底物（150 mmol∙L-1乙醇+50 mmol∙L-1乙酸）添加到每个反应器中。为了达到所需的氨浓度，将NH4Cl引入至7组实验组中，浓度分别为0.1 g∙L-1、0.5 g∙L-1、1 g∙L-1、2 g∙L-1、3 g∙L-1、4 g∙L-1和5 g∙L-1。由于浓度低于0.2 g∙L-1的氨不受抑制，通常用于厌氧发酵[19]，因此将用0.1 g∙L-1氨处理的组标记为对照。此外，仅由25 mL接种物和100 mL蒸馏水组成的反应器被视为空白，以排除从接种物产生的MCFAs。将每个反应器的初始pH调节至6.5。所有反应器最终用N2（99.9%）冲洗5 min，并在空气浴摇床中搅拌（35 ℃, 120 r∙min-1）。

2.3 氨对乙醇氧化和RBO阶段的影响

实验在6个相同的血清瓶（工作体积50 mL，三个平行）中进行，并分为I组和II组，分别研究氨对乙醇氧化和RBO的影响。将5 mL接种物和20 mL培养基添加到每个血清瓶中。将NH4Cl添加到这两组反应器中以产生浓度为0.1 g∙L-1、2 g∙L-1和5 g∙L-1的氨。随后，将150 mmol∙L-1乙醇添加到第一组中的每个瓶子中作为唯一底物。添加3 mmol∙L-1乙酰辅酶A（CoA）（Sigma-Aldrich Corporation, USA）、3 mmol∙L-1乙酸盐和1 mmol∙L-1三磷酸腺苷（ATP）（Sigma-Aldrich Corporation, USA）到第二组的每个瓶子中作为底物。最后，所有血清瓶在与第2.2节所述相同的条件下运行6天。在第2、4和6天除去发酵液以测量乙醇、乙酰辅酶A、SCFAs和MCFAs的浓度变化。

2.4 氨对CE过程中关键酶活性的影响

制备第2.2节中含有0、2 g∙L-1和5 g∙L-1氨的反应器的细胞提取物，使用以下程序测定相关酶活性。从特定厌氧反应器中获取污泥（30 mL），8000 r∙min-1和4 ℃下离心10 min，并用0.05 mol∙L-1三（羟甲基）氨基甲烷-HCl（Tris-HCl）缓冲液（pH = 6.5）洗涤。该过程重复三次，将离心后的污泥重悬于20 mL Tris-HCl缓冲液中。然后，将悬浮污泥在冰水浴下超声破碎（30 kHz）20 min，并在10 000 r∙min-1、4 ℃下离心30 min以去除细胞碎片。所得上清液用作细胞提取物。参考之前的研究确定了参与乙醇氧化的酶[即乙醇脱氢酶（Adh）、乙醛脱氢酶（Ald）、磷酸转乙酰酶（Pta）和乙酸激酶（Ak）]的活性[20‒22]。按照Wei等[18]和Zhu等[23]所述方法测量与RBO相关的关键酶的活性，包括丁酰辅酶A：乙酰辅酶A转移酶（BCoAT）、己酰辅酶A：丁酰辅酶A转移酶（Cbt）和己酰辅酶A：乙酰辅酶A转移酶（Cat）。比酶活性计算为每毫克VSS的单位（U）。

2.5 微生物群落和宏基因组测序分析

三个装有0.1 g∙L-1、2 g∙L-1和5 g∙L-1氨的反应器半连续运行30 d，每10 d采集微生物样品以测量微生物群落。使用E.Z.N.ATM Mag-Bind土壤DNA试剂盒（Omega Biotek, USA）提取DNA。使用引物515F和806R进行16S核糖体RNA基因的V4区的聚合酶链反应扩增。构建测序文库，并使用上海美吉生物医药科技有限公司的Illumina MiSeq平台进行双端测序。使用UPARSE（版本7.0.1090）将干净的序列聚类为具有97%相似性阈值的操作分类单元（OTUs）。使用核糖体数据库项目分类器分析每个OTU序列的分类。

根据提取的DNA进行宏基因组测序，测序深度为6 Gbase。使用Covaris M220（Gene Co., Ltd.,中国）将DNA提取物片段化至平均大小约300个碱基对（bp），使用由上海美吉生物医药科技有限公司提供的TruSeq DNA样品制备试剂盒（Illumina, USA）构建双端文库。使用 Illumina HiSeq4000 平台进行双端测序。Fastp软件（v0.20.0）用于原始测序数据的质量控制。宏基因组数据使用 MEGAHIT（v1.1.2）进行组装。选择长度≥300 bp的序列作为最终的组装结果。使用Prodigal（v2.6.3）预测开放阅读框（ORFs），对照组、2 g∙L-1和5 g∙L-1组收集的ORFs数量分别为774354、580690和851150。CD-HIT软件（v4.6.1）用于对具有95%序列同一性（90% 覆盖率）的遗传数据进行聚类。从每个簇中选择最长的序列作为代表序列来构建非冗余基因目录，将其与非冗余蛋白质序列数据库进行比对，e值截止为1 × 10-5。使用SOAPaligner软件将每个样本的高质量读数与非冗余基因集（95%同一性）进行比较。根据映射的读数，用每百万个转录本计算基因丰度。使用Diamond（v0.8.35）进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）注释，将非冗余基因目录与KEGG数据库进行比较，e值截止值为1 × 10-5。计算编码酶的功能基因的相对丰度，并进行比较，以评估不同氨浓度影响的功能和代谢途径。

2.6 分析方法

使用配备火焰离子化检测器和30 m × 0.25 mm DB WAX聚乙二醇毛细管柱的气相色谱仪（7890, Agilent Technologies, USA）对乙醇、SCFAs和MCFAs进行分析。入口和检测器温度分别为220 ℃和240 ℃。柱温程序将温度从初始70 ℃升至170 ℃，升温速度为20 ℃∙min-1，并在170 ℃下维持5 min，然后以20 ℃∙min-1升温至240 ℃。使用已建立的转换因子将它们的浓度转换为COD值[9]。

选择度是用来评价底物向MCFAs转化的转化比，其计算方法是将产物的电子当量除以参与底物消耗的电子[10]。碳流量分布以百分比表示，表示产品中碳的摩尔浓度相对于所用底物的比例。TSS、VSS、COD和氨浓度根据标准方法（APHA, 2005）进行测量。pH值使用pH探针（PHS-3E；LeiCi Corporation，中国）进行测量。使用等式（1）计算FA浓度[24]。

A   =   T A N 1   +   10 - p H K a  

式中，TAN表示FA和NH4 +的总浓度，mg∙L-1；K a表示解离常数，35 ℃时为1.13 × 10-9。

采用主成分分析（PCA）估计不同微生物组之间的差异和相似性。采用线性判别效应大小（LEfSe）识别关键鉴别微生物类群，并采用相应的线性判别分析（LDA）值定量评估影响程度。采用学生t检验评估细菌属水平的显著差异。

3 结果与讨论

3.1 氨浓度对正己酸产量的影响

图1描述了不同氨浓度下的底物利用、正己酸产量、产物选择性和碳流分布情况。与对照组相比，在0.5~2.0 g∙L-1氨浓度下，正己酸的产量明显增加，这表明正己酸生成所需的氨浓度可能高于普遍正常浓度（<0.2 g∙L-1）。当氨浓度为2.0 g∙L-1时，正己酸产量和选择性均达到最高，分别为10.88 g∙L-1和67.82%，比对照组高约44.49%和44.48%。然而，当氨浓度大于2.0 g∙L-1时，正己酸产量明显降低，低于对照组。特别是当氨浓度为5.0 g∙L-1时，正己酸的选择性低至5.96%。此外，当氨浓度为2.0 g∙L-1时，底物碳流向正己酸的比例约占70%，但随着氨浓度的增加，这一比例急剧下降。因此，最佳氨浓度和抑制阈值均为2.0 g∙L-1。同样，Zhang等[17]报道了以乙醇为电子供体的CE菌株Clostridium kluyveri的氨阈值为2.1 g∙L-1。然而，Wei等[18]发现，当乳酸作为电子供体的情况下，氨浓度超过1 g∙L-1时，正己酸合成就会受到抑制。这些结果表明，利用乙醇作为电子供体的微生物群落可能对氨的抵抗力更强，这可能是因为氨对乙醇氧化的抑制作用弱于乳酸氧化（CE的第一阶段）。这一猜想是基于乙醇的利用率，如图1（b）所示。在0.1~5.0 g∙L-1氨浓度下，几乎所有乙醇都能在6 d内被迅速利用。而据报道，在2~4 g∙L-1氨浓度下乳酸的利用明显减慢，甚至在5~6 g∙L-1条件下停止[18]。此外，过量的氨会残留更多的SCFAs，这表明过量的氨会限制转化SCFAs的RBO阶段。

3.2 氨对两阶段CE反应的影响

研究了氨对乙醇氧化和RBO途径的影响，以确定具体的抑制途径。如图2（a）～（c）所示，乙醇作为唯一底物被迅速消耗，对照组、2 g∙L-1和5 g∙L-1氨浓度之间没有明显差异，但产物差异显著。在氨浓度为2 g∙L-1条件下，乙酸的产量与对照组相似，乙酰辅酶A的浓度也最高。然而，在氨浓度为5 g∙L-1条件下，整个过程中乙酸浓度最高，而乙酰辅酶A浓度最低。第4天，检测到正丁酸，其浓度变化趋势与乙酸几乎相反[图2（d）]。这表明，过量的氨可能会刺激乙醇氧化微生物过度地氧化乙醇（EEO）以生成乙酸（C2H6O + H2O → C2H3O2 - + H+ + 2H2），而不进行CE反应[25]，从而导致乙酰辅酶A的缺乏。因此，虽然乙醇的利用没有受到过量氨的抑制，但乙醇的转化途径可能与低氨浓度下不同。

当以乙酰辅酶A和乙酸为底物时，乙酰辅酶A很快被细菌利用，从第2天起，三组细菌的发酵液中几乎检测不到乙酰辅酶A [图2（e）]。在5 g∙L-1氨浓度下，乙酸浓度随反应进行略有增加[图2（f）]。然而，几乎没有检测到正丁酸和正己酸[图2（g）和（h）]，这表明乙酰辅酶A可能转化为乙酸，但并没有将乙酸进一步延长。相反，在对照组和2 g∙L-1反应器中，乙酸被利用，并分别生成了正丁酸和正己酸。因此，过量的氨不仅限制了乙醇氧化产生乙酰辅酶A，还抑制了SCFAs通过RBO途径的延伸。

3.3 产生抑制作用的氨形态

氨对厌氧微生物的抑制作用与NH4 +和游离氨（FA）这两种形式有关。其中，FA被普遍认为是主要的抑制剂，可自由扩散至微生物细胞中，导致生理机能失调[14]，其浓度主要取决于温度、pH值和总氨浓度[26]。37 ℃时pH值和FA浓度的变化见附录A中的图S1。随着乙醇向脂肪酸的转化，pH 值先下降后稳定，FA与NH4 +之比的平衡随氨浓度的变化而变化。据观察，在未受抑制（0.1~2 g∙L-1氨）和受抑制（3~5 g∙L-1氨）的反应器中，FA浓度分别小于4 mg∙L-1和在4~10 mg∙L-1范围内。为了确认低FA浓度是否会抑制正己酸生成，我们将初始pH值降至6，以降低FA浓度。pH、FA浓度和正己酸浓度的变化见附录A中的图S2。将图S2与图1比较，发现pH降低导致游离氨浓度降低，这也可能影响了氨的抑制浓度。例如，在氨浓度为3 g∙L-1的反应器中，初始pH=6和6.5时的FA浓度分别为0.7~1.7 mg∙L-1和3.1~5.7 mg∙L-1。而在较低的pH=6时，正己酸的产量比对照组略有提高，这表明FA浓度的降低减轻了抑制作用。本研究观察到的脂肪酸抑制浓度（> 3 mg∙L-1）低于所报道的厌氧发酵抑制阈值（> 10 mg∙L-1）[26‒28]。可能的解释是，多种抑制剂（包括氨和未解离脂肪酸）的存在降低了各自的抑制阈值。因此，与其他厌氧过程相比，MCFAs生产过程需要更严格的氨控制。

此外，受抑制的反应器（氨浓度为4 g∙L-1和5 g∙L-1）在pH=6时的最大FA浓度小于3 mg∙L-1，这表明高含量的NH4 +可能是一个关键的抑制因子。NH4 +主要通过降低参与微生物代谢的酶的活性来抑制厌氧菌[29]。测量了CE过程中关键酶的活性，以分析NH4 +的抑制作用。发现Adh、Ald、Pta和Ak参与乙醇氧化过程[1]。Zhu等[23]发现BCoAT专门负责正丁酸的生成，而Cbt和Cat则参与正己酸的生成。如图3（a）所示，在三种氨浓度下，Adh和Ald的活性差异没有Pta和Ak的活性差异显著，而且后两者的活性随着氨浓度的增加而增强，这进一步证实了过量的氨促进了EEO过程。在氨胁迫下，细菌需要消耗能量来平衡细胞内质子和pH [26]，这可能是促进乙酰辅酶A转化为乙酸的原因，因为这是一个获得能量的过程。此外，与对照组相比，在氨浓度为2 g∙L-1的条件下，BCoAT、Cbt和Cat的活性分别提高了约25%、40%和8%，而在5 g∙L-1条件下，它们的活性被显著抑制，几乎检测不到[图3（b）]，这与正己酸产量的差异一致。如图3（c）所示，上述酶参与了碳链延长过程的关键生物转化途径。因此，过量的NH4 +会抑制直接参与MCFAs合成的酶的活性。

3.4 氨对微生物群落的影响

通过分析微生物组成，确定不同氨浓度对微生物的影响。主成分分析结果显示[图4（a）]，对照组、2 g∙L-1氨和5 g∙L-1氨组的微生物群落被清晰地聚类并相互分离，表明这三个组之间的群落结构存在明显差异。氨含量的变化可能通过改变微生物群落结构影响正己酸的生成。在所有三个组中，Firmicutes、Actinobacteriota、Bacteroidota、Proteobacteria、Chloroflexi和Desulfobacterota是主要的菌门[附录A中的图S3（a）~（c）]。与对照组相比，Firmicutes的相对丰度降低，但随着氨浓度增加，Bacteroidota的相对丰度显著增加，这表明Bacteroidota对氨具有更高的耐受性。相比之下，Actinobacteriota在2 g∙L-1氨浓度下的相对丰度显著增加，但在5 g∙L-1氨胁迫下降低。Bacteroidota和Actinobacteriota都是参与MCFA生成的重要菌门[9,30]。因此，这两个菌门可以被认为是关键的正己酸生产者。三个优势纲，即Clostridia、Actinobacteria和Bacteroidia的丰度变化与其所属菌门的变化趋势相似[附录A中的图S3（d）～（f）]。

线性判别分析（LEfSe）和学生t检验相结合，用于识别关键鉴别性的微生物分类群，并评估三组之间的显著差异。如附录A中的图S4以及图4（b）和（c）所示，Clostridia（2 g∙L-1氨时占25%，5 g∙L-1氨时占33%）和Actinobacteria（2 g∙L-1氨时占42%，5 g∙L-1氨时占11%）分别被鉴定为2 g∙L-1和5 g∙L-1氨条件下的主要菌纲。其中，Clostridia被广泛认为包含最丰富的正己酸生产微生物[31]。Clostridiales和Clostridiaceae的成员也被鉴别为区分2 g∙L-1氨与其他条件的关键细菌[LDA值（以10为底的对数尺度）>4.5]。此外，与对照组（9%）相比，Paraclostridium属在2 g∙L-1 (2.4%)和5 g∙L-1 (3.7%)氨条件下的相对丰度差异最为显著。Paraclostridium属具有与Clostridium属相同的生理和形态特征，能够将有机基质转化为H2和正丁酸[32]。此外，Zagrodnik等[33]和Yin等[34]揭示了利用乙醇和乙酸为基质，正己酸的产生与Paraclostridium之间存在正相关关系。因此，推测Paraclostridium主要参与RBO过程中正丁酸合成的第一轮循环。Paraclostridium属在所有三组中均为优势属，但其丰度随着氨浓度的增加而显著下降，表明其对氨的耐受性较低。相反，一些耐氨的产甲烷相关细菌得到了富集，包括Fermentimonas属、Macellibacteroides属、严格意义上的Clostridium sensu stricto 12、严格意义上的Clostridium sensu stricto 15和Sporanaerobacter属。Fermentimonas属是一种参与乙醇氧化的厌氧乙酸生成菌[35]。同样，严格意义上的Clostridium sensu stricto 15通过将有机物转化为乙酸间接促进正己酸的产生[36]。Macellibacteroides属被鉴定为在RBO过程中与Clostridium协同作用的正丁酸生产者[37]。在多个CE反应器中观察到严格意义上的Clostridium sensu stricto 12，其与正己酸的生产直接相关[38‒40]。Sporanaerobacter属能够参与直接的物种间电子转移[41]，这也与MCFA生产显著正相关[34]。这些属在2 g∙L-1氨浓度下的显著富集是增强正己酸产生的重要原因。然而，这些属不能耐受高氨胁迫（5 g∙L-1），在过量氨浓度下几乎没有富集正己酸产生细菌。Wei等[18]也揭示了CE功能菌比产丙酸细菌对高氨水平的耐受性更低，随着氨从2 g∙L-1增加到4 g∙L-1，微生物群落从Clostridium Ⅳ优势转变为Clostridium Ⅳ和Propionibacterium属共优势。

3.5 氨对微生物群落功能特征的影响

微生物的代谢行为与其功能基因相关[42]。因此，采用宏基因组学分析来确定氨改变微生物群落并影响正己酸生产的根本原因。图5（a）～（c）分别展示了功能基因和途径的相对丰度、氨浓度促进或抑制的相关功能，以及氨浓度影响的关键途径。

（1）与乙醇氧化相关的功能。乙醇氧化的效率对正己酸的生产具有决定性影响，因为它提供了能量、还原当量以及正己酸合成不可或缺的中间产物乙酰辅酶A [3]。如图5（a）所示，与对照组相比，参与了乙酰辅酶A生成的功能基因Adh、Ald和编码醛-铁蛋白氧化还原酶的基因Aor，以及参与了乙酰辅酶A向乙酸转化的基因Pta和Ak，在2 g∙L-1氨浓度下上调了4.25%~54.64%。其中，在5 g∙L-1氨浓度下，基因Adh和Ak的丰度分别显著提高了13.12%和31.29%，而其他三个基因几乎没有变化。这表明乙醇氧化受到两种氨浓度的促进，与第3.2节的结论一致；因此，乙醇氧化对氨具有耐受性。Xing等[43]也报道了在对产甲烷菌有毒剂量的氨浓度下乙醇氧化的稳健性，其中基因Adh和Aor的丰度增加了32%。因为将乙酰辅酶A转化为乙酸是一个获得ATP的过程[4]，在2 g∙L-1和5 g∙L-1氨浓度下编码这一过程的基因丰度显著增加，可以确保后续的CE过程有足够的能量。然而，在RBO阶段乙酰辅酶A缺乏的情况下，乙酰辅酶A向乙酸的过量氧化（EEO）是不被期待的[25]。幸运的是，2 g∙L-1氨并未诱导EEO，因为乙酸和正丁酸没有明显积累。然而，在5 g∙L-1氨浓度下发生了乙酸积累，这可能是由EEO或RBO减弱引起的。

（2）与RBO相关的功能。RBO紧随乙醇氧化反应，以乙酰辅酶A作为2碳供体，参与正己酸的合成。如图5（a）所示，编码此步骤关键酶的基因的相对丰度在三种氨浓度下差异显著。首先，参与开启RBO第一个循环的乙酰乙酰辅酶A生成的乙酰辅酶A C-乙酰转移酶（atoB）的基因丰度，在2 g∙L-1和5 g∙L-1氨浓度下分别增加32.56%和减少46.15%。随后，负责丁酰辅酶A形成的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶（Hbd）、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶（croR）以及电子传递黄素蛋白α（etfA）和β亚基（etfB）的基因丰度，在2 g∙L-1氨浓度下增加了9.78%~48.09%，但在5 g∙L-1氨浓度下减少了22.55%~48.53%。类似的情况也出现在丁酰辅酶A∶乙酸辅酶A转移酶（BCoAT）基因上，该基因催化丁酰辅酶A和乙酸转化为丁酸和乙酰辅酶A [44]。因此，过量的氨严重抑制了RBO的第一个循环——正丁酸合成。相比之下，2 g∙L-1的最佳氨浓度对其起到了积极的促进作用，直接提高了正己酸产量。除了第一个循环外，过量的氨还抑制了第二和第三个循环，这主要体现在乙酰辅酶A酰基转移酶-2（Acca）、烯酰辅酶A水合酶（Echs）和酰基辅酶A硫酯酶（Te）基因丰度的减少上。同时，在2 g∙L-1氨浓度下，上述三个基因以及3-羟基酰辅酶A脱氢酶（Hadh）和反式-2-烯酰辅酶A还原酶（Ter）基因也在一定程度上增加了。此外，第二和第三个RBO循环中的基因丰度变化不如第一个循环显著。总之，过量的氨显著抑制了RBO途径，尤其是在第一个循环中，而最佳氨浓度则促进了整个RBO过程。

（3）与脂肪酸合成（FAS）相关的功能。除了RBO之外，FAS作为微生物中不可或缺的生物过程，在合成MCFAs方面发挥作用，这些MCFAs是构建磷脂和甾醇的前体物质[45]。FAS是由3碳供体丙二酰辅酶A启动的，该物质分别由乙酰辅酶A羧化酶（Acc）和酸-硫醇连接酶（Atl）催化的乙酰辅酶A的羧化以及丙二酸的转化产生[3]。编码基因Acc和Atl在2 g∙L-1氨浓度时上调，但在5 g∙L-1时下调。似乎氨对脂肪酸合成的影响与对RBO的影响类似。然而，其他编码FAS途径上的酶的基因表达并没有如此规律和显著地改变。例如，参与关键中间体生成的编码β-酮酰合成酶Ⅱ（fabF）和3-酮脂酰还原酶（fabG）的基因，在2 g∙L-1氨浓度下有所提高，但在5 g∙L-1时比对照组减少。然而，编码负责生成丙二酰载体蛋白的磷酸丁酰转移酶（fabD）、3-羟基酰基脱氢酶（fabZ）以及烯酰还原酶（NADH）（fabV）的基因在两种氨浓度下都减少了。此外，与FAS相关的基因的相对丰度远低于与RBO相关的基因，这表明与FAS相关的基因几乎不影响正己酸的生产。

（4）与K+转运相关的功能。在氨胁迫条件下，游离氨可以快速通过细胞膜扩散并吸收H+形成NH4 +，导致细胞内pH扰动和质子失衡[46]。因此，微生物必须激活K+逆向转运器以泵出K+来维持细胞内质子平衡，其中K+转运系统（包括K+进入和排出）发挥着关键作用[43]。K+进入主要由Trk、Ktr（在许多方面类似于Trk）和Kdp基因调控[47]。如图5（a）和（b）所示，与对照组相比，在5 g∙L-1氨浓度下，Trk系统的三个重要基因（trkA、trkG和trkH）以及Kdp系统的四个基因（kdpA、kdpC、kdpD和kdpE）均下调。K+排出系统的基因（kefB、kefC、kefF和kefG）也减少至低丰度。此外，包括编码K+通道（kch）、K+依赖性机械敏感性通道（mscK）以及包括微导电性（mscM）、小导电性（mscS）和大导电性（mscL）的非特异性机械敏感性通道在内的离子通道基因，在5 g∙L-1氨浓度下减少或几乎不变。K+进入和排出系统的基因下调表明K+转运功能被过量的氨抑制，这削弱了细胞抵抗细胞内pH扰动和质子失衡的能力。相比之下，在2 g∙L-1氨浓度下，trkA、K+吸收蛋白（kup）、kch、mscK、mscL和mscM等基因的丰度提高了30%以上。尽管K+的进入和排出都增强了，但更多的K+排出功能基因上调，这使得细胞能够泵出K+以抵抗氨毒性。

（5）与ATP酶代谢相关的功能。如上所述，K+排出是一个耗能过程，在氨胁迫条件下会发生变化。为了阐明氨抑制作用的机制，分析了氨对ATP酶代谢的影响。细菌主要表达F型ATP酶，该酶催化腺苷二磷酸（ADP）向ATP的转化[43]。与对照组相比，F型ATP酶基因的相对丰度在2 g∙L-1和5 g∙L-1氨浓度下分别增加18.5%和下降4.3%。考虑到K+排出功能的增强，2 g∙L-1氨浓度下ATP酶基因表达的增加确保了K+排出以及其他酶促反应的充足能量供应，避免了氨的损害。然而，在高氨胁迫条件下，由于ATP产量的减少，钾离子排出用于质子/pH平衡以及其他代谢反应，包括正己酸的生成，可能会受到严重阻碍。

（6）与转位酶相关的功能。转位酶是第七种用于催化离子/分子跨细胞膜运输或在细胞膜内转位的酶。编码转位酶的基因丰度，尤其是金属阳离子转位酶，受到氨浓度的显著影响。特别是，在2 g∙L-1氨浓度下，编码Na+、Ca2+和Zn2+输出转运蛋白的基因丰度显著上调，但在5 g∙L-1氨浓度下几乎不变，这与编码H+输出转运蛋白和H+转运ATP酶的基因变化一致。这进一步支持了这样一个结论：即使在氨抑制阈值以下，金属阳离子和H+的输出也会通过消耗能量来促进，以减轻氨毒性。然而，过量的氨可能会限制这些解毒行为。此外，在过量氨的条件下，包括Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+和K+在内的金属阳离子输入基因略微下调。Zn2+是Adh和Ald的必需活性位点，它们催化乙醇氧化。Fe2+构成铁氧还蛋白氧化还原酶，它在储存CE能量中起着至关重要的作用[48]。金属阳离子输入的减少也可以被解释为一种旨在维持细胞内质子平衡的氨解毒形式。然而，这同时也会削弱在正己酸生产中起关键作用的含金属酶的合成能力。

图5（c）概述了在氨差异化反应器中促进和抑制的关键过程。总之，在最佳氨含量下，RBO、FAS、钾离子排出、ATP酶代谢和金属阳离子输出等功能在一定程度上得到了上调，这直接提高了正己酸产量。除了金属阳离子输出外，其他功能和K+进入受到了抑制。过量的氨促进了竞争性的EEO过程，这表明氨解毒能力丧失，以及其他细胞内代谢功能，包括正己酸合成，都出现了下降。

4 结论

本研究评估了氨对开放培养体系中以乙醇作为电子供体生产正己酸的影响，并全面阐明了其潜在机制。结果表明，随着氨浓度从0.1 g∙L-1升至2 g∙L-1，正己酸产率和选择性逐渐提高。然而，当氨水平超过2 g∙L-1阈值时，正己酸的产生受到显著抑制。因此，确定最佳氨浓度和抑制阈值为2 g∙L-1。当超过抑制阈值时，FA和NH4 +均会导致抑制作用。有趣的是，虽然乙醇氧化基本上不受影响，但过量的氨促进了竞争性EEO反应，同时抑制了RBO途径。这些反应中关键酶活性的变化支撑了这一结论。此外，氨显著影响微生物群落和功能。更多的耐氨CE相关细菌被富集，并且在最佳氨浓度下，RBO、FAS、K+外排、ATP酶代谢和金属阳离子输出等功能基因上调。相反，过量的氨导致CE功能菌逐渐消失。同时，过量的氨显著抑制了涉及氨解毒和正己酸合成的主要功能。因此，控制正己酸生产反应器中的氨浓度至关重要。

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