枸杞来源的miR162a通过促进成骨分化发挥抗骨质疏松作用

顾春艳 ,  余夕潮 ,  唐校柱 ,  龚蕾蕾 ,  谭景全 ,  张园娇 ,  郑慧丽 ,  王泽 ,  张晨茜 ,  朱业锦 ,  周作建 ,  虞鹤鸣 ,  许凯 ,  段金廒 ,  顾晓松 ,  杨烨

工程（英文） ›› 2025, Vol. 46 ›› Issue (3) : 173 -182.

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工程（英文） ›› 2025, Vol. 46 ›› Issue (3) : 173 -182. DOI: 10.1016/j.eng.2023.09.007
研究论文

枸杞来源的miR162a通过促进成骨分化发挥抗骨质疏松作用

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Lycium barbarum L.-Derived miR162a Functions on Osteoporosis Through Directly Promoting Osteoblast Formation

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摘要

中医药（TCM）在治未病方面独具优势，发挥着重要作用，然而当前针对中药活性成分及药理作用开展的研究相对较少。以传统中药枸杞为例，其强健筋骨、治疗骨质疏松症的医学功效已被数千年的历史实践证实，但其发挥效用的活性物质尚不明确。以中医药现代化理论为指导方针，本研究聚焦于探索主导枸杞补肾生髓的新型活性成分。首先，本研究应用Illumina深度测序分析及茎环聚合酶链反应（PCR）检测揭示了一种来源于枸杞的微小RNA（miRNA），即miR162a，可经胃肠道吸收途径从而靶向作用小鼠骨髓。免疫荧光实验结果显示，miR162a通过胃部系统性RNA干扰缺陷跨膜蛋白家族成员1（SIDT1）介导吸收。经生物信息学预测结合荧光素酶报告基因实验分析发现，miR162a可靶向调控核受体辅阻遏物（NcoR）。功能研究方面，茜素红染色结合微型计算机断层扫描（microCT）分析证实，miR162a不仅可以促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，还在斑马鱼及骨质疏松小鼠模型中展现出良好的促骨生成作用。此外，本研究利用农杆菌介导的瞬时表达技术，成功在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中培育出过表达miR162a的转基因植物。microCT检测与抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果表明，转基因本氏烟草叶片可有效预防小鼠骨质疏松症。本研究阐释了枸杞改善骨质疏松症的作用途径与机制，并为诠释枸杞补肾壮骨的科学内涵提供了支撑。摄入以转基因植物为载体表达的miR162a，用于人类骨质疏松症治疗或许是一种安全有效的崭新策略。

Abstract

Traditional Chinese medicine (TCM) can help prevent or treat diseases; however, there are few studies on the active substances of TCM. For example, Lycium barbarum L. has been proven to be effective in treating osteoporosis for thousands of years, but its active substance remains to be unknown. Prompted by the efforts to modernize TCM, the present study focused on the novel active substance of Lycium barbarum L. to reinforce kidney essence to produce bone marrow. Illumina deep sequencing analysis and stem-loop polymerase chain reaction (PCR) assay revealed that miR162a, a Lycium barbarum L.-derived microRNA, can pass through the gastrointestinal tract to target the bone marrow in mice. Immunofluorescence staining showed that miR162a was absorbed through systemic RNA interference defective transmembrane family member 1 (SIDT1) in the stomach. Bioinformatics prediction and luciferase reporter assay identified that miR162a targeted nuclear receptor corepressor (NcoR). Alizarin red staining and micro-computed tomography (microCT) confirmed that miR162a promoted osteogenic differentiation in bone marrow mesenchymal stem cells, zebrafish, and a mouse model of osteoporosis. In addition, transgenic Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) leaves overexpressing miR162a were developed by agrobacterium infiltration method. microCT and tartrate-resistant acid phosphatase staining confirmed that transgenic N. benthamiana leaves effectively protected against osteoporosis in mice. Our study mechanistically explains how Lycium barbarum L. improves osteoporosis and supports that Lycium barbarum L. reinforces kidney essence, thereby strengthening the bone. miR162a expressed by transgenic plants may represent a novel and safe treatment for human osteoporosis.

关键词

中医药 / 枸杞 / miR162a / 骨质疏松症 / 核受体辅阻遏物 / 转基因植物

Key words

Traditional Chinese medicine / Lycium barbarum L. / miR162a / Osteoporosis / Nuclear receptor corepressor / Transgenic plants

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顾春艳,余夕潮,唐校柱,龚蕾蕾,谭景全,张园娇,郑慧丽,王泽,张晨茜,朱业锦,周作建,虞鹤鸣,许凯,段金廒,顾晓松,杨烨. 枸杞来源的miR162a通过促进成骨分化发挥抗骨质疏松作用[J]. 工程（英文）, 2025, 46(3): 173-182 DOI:10.1016/j.eng.2023.09.007

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1 引言

中医药（TCM）虽历经数千年临床应用，但针对其如何发挥作用机制的研究尚不充分。在中医药现代化蓬勃发展的影响下，本研究明确了枸杞（一种药食两用的重要中药）的活性成分[1]。枸杞具有强筋健骨、补肾益精的功效，可改善骨质疏松[2]。从枸杞中提取的生物活性化合物——枸杞胺A和枸杞多糖——具有抗骨质疏松效果[3]，但其改善骨质疏松的作用机制尚不明确。

新技术的广泛应用推动了RNA研究的快速发展，使微小RNA（miRNA）成为疾病基因组学研究的前沿领域[4‒5]。大量研究表明，miRNA稳定存在于唾液、尿液、母乳等生物体液中[6‒7]。这些细胞外miRNA可靶向作用多个基因，进而影响特定的靶细胞[8‒9]。不同种类的动植物能通过激素类似物等分子进行交流[10]。从进化角度而言，miRNA的跨物种传递是物种间“跨界对话”的重要媒介[11‒13]。近期一项研究报道，miRNA在细胞通信中发挥关键作用，且通过摄食等方式实现的miRNA跨物种传递参与了不同物种间的跨界调控[14‒17]。例如，水稻来源miR168a可靶向作用低密度脂蛋白受体衔接蛋白1，从而提高血浆胆固醇水平[18]。

在中药研究领域，对金银花中miRNA的研究具有里程碑意义。miR2911被发现能在金银花煎剂中稳定存在，口服后在人体内可直接抑制病毒复制，并加速患者转阴[19]。金银花煎剂对新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者的治疗效果显著[19]。此外，已有研究证实人体和动物血清及组织中存在植物来源miRNA [18]。Teng等[13]研究表示，生姜来源外泌体样纳米颗粒（ELNs）-RNA可通过mdo-miR7267-3p靶向调控鼠李糖乳杆菌单加氧酶ycnE，诱导白细胞介素-22（IL-22）产生，从而改善小鼠结肠炎。近期研究发现，食物和中药里的miRNA可被吸收并传递到细胞内，且食物来源miRNA能调控基因表达和生物学过程[11,15‒17,20‒24]。膳食miRNA是食物和中药里的一种新型功效性成分。鉴于枸杞作为传统中药常应用于骨质疏松，我们推测枸杞中的miRNA可能会通过胃肠道（GI）进入血液。

本研究率先证实枸杞来源的功效物质miRNA（即miR162a）可通过靶向作用骨髓发挥治疗骨质疏松作用。相应发现揭示枸杞全新作用机制的同时，也为其“补肾益精、强筋健骨”的中医经典理论提供了支持。此外，本研究创新性开发了过表达miR162a的转基因本氏烟叶，可用于预防骨质疏松。

2 材料与方法

2.1 抗体和试剂

一抗包括核受体共抑制因子（NcoR; 20018-1-AP；武汉三鹰生物技术有限公司）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ; 16643-1-AP；武汉三鹰生物技术有限公司）、系统性RNA干扰缺陷跨膜蛋白家族成员1（SIDT1; 55352-1-AP；武汉三鹰生物技术有限公司）以及β-肌动蛋白（β-actin; 4970S；美国Cell Signaling Technology公司）。miR162a-3p激动剂由吉玛制药技术有限公司合成。其他试剂包括泼尼松龙（N15J11Q115595；上海源叶生物科技有限公司）、茜素红S（NO506Q031；北京索莱宝科技有限公司）、3-乙氧基苯胺甲磺酸盐（C12590064；上海麦克林生化科技有限公司）和依替膦酸二钠（K22A8M34493；上海源叶生物科技有限公司）。

2.2 细胞系与细胞培养

人骨髓间充质干细胞（BMSC）购自上海中乔新舟生物科技有限公司，用专用BMSC培养基（ZQ-1318；上海中乔新舟生物科技有限公司）进行培养。

2.3 成骨诱导和茜素红染色

将BMSC接种于6孔板中，每孔10 000个细胞。待细胞融合度达70%~80%后分为三组：空白对照组、阳性对照组和实验组。空白对照组细胞用BMSC专用培养基（ZQ-1318；上海中乔新舟生物科技有限公司）培养。阳性对照组细胞用成骨诱导培养基培养，由BMSC专用培养基、成骨诱导剂、β-甘油磷酸钠（10 mmol∙L-1）和抗坏血酸（50 mg∙L-1）组成。实验组细胞使用成骨诱导液后，用30 pmol miR162a-3p激动剂处理。每两天更换一次成骨培养基，持续四周。28天后，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞三次，再用4%多聚甲醛固定15 min。固定后的细胞用蒸馏水清洗三次，然后用2%茜素红S溶液（pH = 4.2）在37 ℃下染色30 min。染色后的细胞再用蒸馏水清洗三次，避光晾干后成像。

2.4 miRNA表达和载体构建

由4条定点突变引物和2条同源重组引物替换拟南芥miR319a的21个核苷酸（nt）及部分互补区域，获得成熟miR162a-3p的前体结构。WMD（http://wmd3.weigelworld.org/）设计miR162a-3p前体的4条替换引物。以含拟南芥miR319a（At-miR319a）前体序列的质粒pRS300为模板进行聚合酶链反应（PCR）。引物A（5'-CACGGGGGACTCTTGACgaattcctgcagccccaaac-3'）和miR162a*反向引物（5'-gaACGATAATCCTCTGCATCTAGtctacatatat-

attcct-3'）用于扩增miRNA162前体5'端。miR162a*正向引物（5'-gaCTAGATGCAGAGGATTATCGTtcacaggtcgtgatatg-3'）和miR162a反向引物（5'-gaCTGGATGCAGAGGTTTATCGAtcaaagagaatcaatga-3'）用于扩增前体中间部分。miR162a正向引物（5'-gaTCGATAAACCTCTGCATCCAGtctctcttttgtattcc-3'）和引物B（5'-TCATATggtcacctAGG-

ggatccccccatggcgatgcc-3'）用于扩增miR162a前体3'端。取上述PCR混合液0.5 μL作为模板，将引物A和引物B通过PCR反应重叠，使3个产物片段融合。融合产物经凝胶纯化后，经由两端的同源臂，克隆到含限制性核酸内切酶Nco I和Stu I的pCambin1301-热休克蛋白终端（tHSP）。本氏烟叶中miR162a前体表达由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动。随后，将pCambin1301-35S-miR162a-tHSP植物表达载体和pCambin1301-35S-tHSP空载体转化到EHA105根癌农杆菌。

2.5 根癌农杆菌浸润本氏烟草

将含miRNA表达质粒或空质粒的根癌农杆菌接种于加入卡那霉素和利福平的Luria-Bertani（LB）液体培养基，于28 ℃、180 r∙min-1振荡培养过夜。4500g离心10 min收集菌体，用MMA缓冲液（含10 mmol∙L-1 2-吗啉乙磺酸、10 mmol∙L-1 氯化镁和200 mmol∙L-1乙酰丁香酮）重悬。对600 nm处吸光度（OD600）= 1的菌悬液孵育3 h后浸润。

2.6 RNA提取和定量PCR（qPCR）

按前述方法[19]，从本氏烟叶和枸杞中提取总RNA。miR162a-3p特异性茎环逆转录（RT）引物序列为5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA-

CGACCTGGAT-3'。用ChamQ SYBR qPCR Master Mix（诺唯赞生物技术有限公司）对逆转录产物进行qPCR分析，所用引物为miR162a-3p特异性正向引物（5'-GCGGCGGTCGATAAACCTCTGC-3'）和茎环RT引物。

2.7 实验动物及其处理

所有C57BL/6J小鼠均饲养于南京中医药大学动物房，每天交替光照、黑暗各12 h。雌性C57BL/6J小鼠经双侧卵巢切除术，术后连续饲养90天，构建骨质疏松小鼠模型。

AB野生斑马鱼胚胎（1日龄）由南京一树梨花生物科技有限公司提供。斑马鱼养殖系统由北京爱生科技发展有限公司提供，饲养条件为26 ℃，光照周期为14 h光照/10 h黑暗。用氯化钠和碳酸氢钠溶液维持养殖水的pH值（7.0~7.4）和电导率（500~550 μS∙cm-1）。斑马鱼胚胎受精后，收集于12孔板中，分为空白组、泼尼松龙模型组（20 μmol∙L-1泼尼松龙）、阳性对照组（30 μg∙mL-1 依替膦酸二钠）和激动剂组（100 pmol∙L-1、300 pmol∙L-1、900 pmol∙L-1）。除泼尼松龙溶于二甲基亚砜（DMSO）外，其余药物均溶于蒸馏水。实验期间，对照组中DMSO的终浓度为0.1%。自受精第3天起，模型组和各药物组用20 μmol∙L-1泼尼松龙处理，空白组用0.1% DMSO处理。自受精第5天起，加入不同浓度激动剂。实验于第9天结束并重复3次。

所有动物实验都根据政府建议的《实验动物饲养管理和使用指南》进行，并获得南京中医药大学机构伦理审查委员会的批准（伦理登记号：201905A003）。

2.8 免疫荧光染色和共聚焦成像

参考已有方法[25]进行免疫荧光染色。用共聚焦显微镜（TCS SP8；德国徕卡公司）拍摄图像。

2.9 统计学分析

用22.0版SPSS软件进行统计学分析，除非另有说明，所有数据以均值±标准差（SD）表示。用双尾t检验（两组）或单因素方差分析（ANOVA；三组及以上）评估统计学显著性。P < 0.05即为具有统计学意义。

3 结果

3.1 服用枸杞后，植物来源的miR162a可被小鼠吸收并转移至血液中

为验证植物来源miRNA能否被吸收进入血液，对C57BL/6J小鼠以10 mL∙kg-1的剂量灌胃给药枸杞。14天后，收集血液样本并进行Illumina深度测序[图1（a），GSE232626]。枸杞中miRNA的碱基偏好性分析显示，不同长度miRNA的第一个碱基偏好存在显著差异。例如，长度为18~24 nt的miRNA，第一个碱基多为U；而长度为25~29 nt的miRNA，第一个碱基多为A [图1（b）]。序列长度分布分析表明，枸杞来源miRNA长度多为22 nt [图1（c）]。枸杞中大部分高表达miRNA在小鼠血液样本中的拷贝数减少，而miR162a的拷贝数仍保持较高水平[图1（d）]。此外，我们用茎环PCR法探测了miR162 [图1（e）]。

3.2 SIDT1介导的膳食miRNA吸收发生在胃部

荧光素亚磷酰胺标记的合成miR162a通过灌胃给药。如图2（a）所示，在全血和骨髓中可观察到显著荧光，表明miR162a已进入血液和骨髓。此外，在小鼠肾脏和肝脏中也观察到明显的荧光[图2（b）]。由于SIDT1位于细胞质膜[26]，并可介导细胞间miRNA转运及细胞外小干扰RNA（siRNA）的摄取[27]，故而我们推测SIDT1可能介导小鼠体内miR162a的吸收。灌胃后0.5 h分析胃肠道中SIDT1表达，以检测经SIDT1的miRNA吸收。结果显示，主要在胃和大肠（包括盲肠、结肠和直肠）中检测到SIDT1 [图2（c）]，并未在小肠中检测到。有趣的是，SIDT1和荧光素亚磷酰胺标记的miR162a共定位。收集原代胃上皮细胞（PGEC）后发现，荧光标记的miR162a进入了PGEC细胞质和细胞核[图2（d）]。值得注意的是，灌胃3 h后未见miRNA，表明miRNA在胃部被吸收[图2（e）]。示意图显示，胃是SIDT1介导的miR162a吸收的主要器官[图2（f）]。

3.3 植物来源的miR162a直接结合NcoR并促BMSC成骨分化

为验证miR162a是否是枸杞的生物活性成分，本研究对miR162a结构进行了生物信息学分析[图3（a）]，并筛选其下游调控靶点[图3（b）]。利用人类参考基因组和Mireap在线工具的预测结果，我们发现NcoR是miR162a的下游靶基因[图3（b）]。已有研究报道，靶向作用NcoR可提高糖尿病患者的胰岛素敏感性，降低血糖并改善骨质疏松[28]。NcoR敲低可诱导大鼠BMSC成骨分化[29]。通过茜素红染色验证miR162a的生物活性，结果发现miR162a可促进成骨分化[图3（c）]。此外，荧光素酶实验证实NcoR是miR162a的下游调控靶点[图3（d）]。蛋白质印迹法（WB）证实，经miR162a处理后，NcoR及其结合蛋白PPARγ表达降低[图3（e）]。实验还发现，miR162a可显著降低PPARγ表达，且罗格列酮（PPARγ激动剂）可逆转该过程[图3（f）]。此外，qPCR检测证实，经miR162a处理后，包括runt相关转录因子2（RUNX2）、骨唾液蛋白（BSP）、骨钙素（OCN）和osterix（成骨细胞特异性转录因子）等在内的经典成骨标志物表达均显著上调，而罗格列酮可大幅削弱该效应[图3（g）]。

3.4 miR162a促进斑马鱼的成骨分化

我们通过构建斑马鱼骨质疏松模型验证miR162a的体内抗骨质疏松作用[30]。荧光定位分析显示，合成miR162a进入斑马鱼体内，主要聚集于胃肠道[图4（a）]。与空白组相比，20 μmol∙L-1泼尼松龙处理显著抑制了幼年斑马鱼第一椎骨的形成，表现为茜素红染色面积减少[图4（b）和（c）]及染色光密度降低[P < 0.001；图4（d）]。这些发现表明，幼年斑马鱼骨质疏松模型构建成功。作为治疗骨质疏松的阳性药物，依替膦酸二钠明显增加了幼年斑马鱼第一椎骨的矿化面积和光密度。不同浓度的合成miR162a均显著改善了幼年斑马鱼第一椎骨的染色面积和光密度[图4（c）和（d）]。100 pmol∙L-1和300 pmol∙L-1的合成miR162a明显促进了幼年斑马鱼椎骨结节的形成[图4（e）]。这些数据表明，miR162a可缓解泼尼松对幼年斑马鱼骨骼发育的抑制作用。

3.5 转基因本氏烟叶过表达miR162a有效预防小鼠骨质疏松

本文利用转基因技术以本氏烟叶为载体过表达miR162a，并检验含miR162a的转基因本氏烟叶能否预防骨质疏松[图5（a）]。基于本氏烟叶易种植、生命周期短、产量高等特性，选择其表达miR162a。通过替换拟南芥miR319a的21个核苷酸及部分互补区域，获得了成熟miR162a的修饰前体[图5（b）]。用含miRNA表达质粒的根癌农杆菌在转基因本氏烟叶中过表达miR162a [图5（c）]。茎环实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）[图5（d）]和半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）[图5（e）]结果证实，在miR162a过表达（OE）的本氏烟叶中，miR162a-3p高表达，而在空载体（EV）本氏烟叶中无高表达。

切除雌性C57BL/6J小鼠双侧卵巢构建骨质疏松模型，密切观察小鼠90天。左股骨的苏木精-伊红（H&E）染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色显示，模型组出现骨质流失，骨骺密度大幅降低[图5（f）]。转基因本氏烟叶、枸杞和依替膦酸二钠能有效预防小鼠骨质流失[图5（f）]。如图5（g）所示，模型组小鼠的骨钙素（BGP）水平明显降低，TRAP和碱性磷酸酶（ALP）水平显著升高，表明模型组小鼠患有严重骨质疏松[图5（h）和（i）]。此外，转基因本氏烟叶、枸杞和依替膦酸二钠能维持小鼠骨稳态，抑制骨质流失并促进骨形成[图5（g）~（j）]。骨钙素水平的变化表示，枸杞对骨形成的作用比转基因本氏烟叶和依替膦酸二钠更有效[图5（g）]。TRAP和ALP水平的变化表示，转基因本氏烟叶和依替膦酸二钠在预防骨质流失和维持骨代谢比枸杞更有效[图5（h）和（i）]。微型计算机断层扫描（microCT）结果显示，使用转基因本氏烟叶、枸杞和依替膦酸二钠可有效防止小鼠骨质流失[图5（k）]。

4 讨论

中药现代化是众多药学专家面临的重大课题。尽管中医药疗效显著，但由于其作用机制和活性成分尚不明确，难以形成国际共识，这严重制约了中药的现代化进程和市场化发展。枸杞作为一种药食两用的传统药材已有数千年的应用历史。研究显示，枸杞可促进BMSC成骨向分化和矿化[31‒32]。此外，枸杞还可通过激活雌激素相关受体γ（ERRγ）和促进运动效果，增加Ⅱ型肌纤维类型[33]。这些研究表明，枸杞可通过直接或间接途径调节骨代谢。目前已有部分研究探索了枸杞多糖对改善骨质疏松的作用，但针对枸杞其他生物活性成分的抗骨质疏松研究却较为匮乏。

目前，临床上治疗骨质疏松的药物包括钙、活性维生素D、重组甲状旁腺激素、降钙素及双膦酸盐类等，但这些西药的疗效不尽理想。中医理论记载，肾藏精，精能生髓，髓可养骨。西医认为，干细胞凭借干性及多能分化的特点成为最原始的细胞类型。干细胞（包括BMSC和造血干细胞）具有诸多功能，如造血、修复和发育等[34]。这与中医理论中“肾精（包括先天之精和后天之精）为生命之本”的观点相契合。肾精遍布全身并调控身体各项机能，尤其对骨髓功能具有重要的调节作用[35]。本研究以中医理论为指导，从miRNA角度揭示了枸杞抗骨质疏松的新机制，阐明其“补肾益精、强筋健骨”的作用原理。

尽管膳食miRNAs在受体生物体内的丰度相对较低，但它们具有功能活性。除著名的可治疗COVID-19的金银花来源miR2911之外，其他膳食miRNA也在代谢和免疫反应中发挥着重要作用[36‒40]。水稻来源miR168a可提高血浆胆固醇水平[18]。牛乳来源miR-155可调节B细胞成熟和免疫反应，而牛乳来源miR181a和miR181b则介导B细胞分化[41]。此外，牛乳外泌体来源miR-155通过调节叉头框蛋白P3（FoxP3）表达和白细胞介素-4（IL-4）信号传导，控制免疫球蛋白E（IgE）与高亲和力IgE受体的结合，从而调控调节性T细胞反应[40]。膳食草药来源miRNAs能以跨物种的方式影响食用者的机体[42]。草莓果实来源miR168通过限制树突状细胞迁移[与Toll样受体3（TLR3）以及含Toll/白细胞介素-1受体（TIR）结构域的接头诱导干扰素-β（IFN-β）信号通路相关]，诱发并加剧了实验性自身免疫性脑脊髓炎[39]。口服给药肿瘤抑制性miRNAs可减缓小鼠模型中结肠癌的生长。植物来源miRNA与肿瘤抑制性miRNA联用能进一步抑制肿瘤生长[43]。可检测浓度的miR159通过直接靶向编码Wnt信号通路相关转录因子的转录因子7（TCF7），抑制乳腺癌的生长[44]。

经胃肠道加工和吸收后，膳食miRNA仍能保持生物活性。既往研究发现，miRNAs在食品加工过程中保持稳定。饲喂新鲜玉米的猪体内，玉米来源miRNAs（zma-miR164a-5p和zma-miR319a-3p）的血清浓度在6~12 h达到峰值[45]，且miRNAs可在胃肠道稳定存在1 h以上[20,46]。随机饲喂新鲜玉米后，血清miRNA浓度在7天内保持稳定[47]。值得注意的是，摄入生菜来源miR156a 3 h后，在外周循环外泌体中可检测到其中一半的量[48]。然而，仅有少量食物miRNAs被吸收，表明食物中的miRNAs被选择性吸收[16,49]。miRNA的特异性是影响其吸收的重要因素[49]。金银花汤剂中的miR2911性质稳定，口服后可被吸收进入循环系统并传送至组织。miR2911的稳定特性主要取决于其特殊结构和高GC含量[19]。本研究通过检索microRNA数据库中不同物种的miR162a-3p序列并分析其成熟序列的保守性，发现miR162a-3p在不同物种间高度保守。此外，利用RNAFold网络服务器验证其前体特征，发现miR162a-3p前体序列具有典型的茎环结构特征。其成熟序列位于前体序列的3'端，长度和GC含量分别为228 bp和36.84%。最小折叠自由能（MFE）为-68.30 kcal∙mol-1，MFE指数（MFEI）为0.81，表明此miRNA前体相对稳定。利用小鼠模型证实，miR162a-3p通过SIDT1依赖性吸收途径经过小鼠胃肠道进入血液和骨髓。SIDT1最初被认为是哺乳动物细胞中的双链RNA（dsRNA）转运蛋白[26]。miR156a、miR168a和miR2911的吸收效率存在显著差异，提示SIDT1可能选择性介导外源性miRNAs的摄取[18‒19]。miR162a是首个经中药鉴定、能靶向作用BMSC的膳食miRNA。然而，食物来源miRNAs在人体胃肠道内的直接吸收和稳定性尚未得到证实，且许多研究未能在动物模型中检测到膳食miRNAs [50‒51]。因此，膳食miRNAs的吸收机制，尤其在哺乳动物体内的情况，仍需进一步研究。

miRNA转运蛋白和外泌体表面蛋白在miRNA的内吞过程中也发挥着关键作用。内吞作用是膳食miRNA的吸收和转运的重要途径[52‒53]。既往研究表明，miRNA被植物来源外泌体样纳米颗粒包裹[54‒55]。经蛋白酶K处理破坏牛奶外泌体表面蛋白后，人内皮细胞的转运速率显著降低，这表明外泌体表面蛋白直接参与了miRNA的跨细胞转运[56]。牛奶相关外泌体及肠道细胞表面的β-半乳糖苷和N-乙酰葡糖胺修饰在内吞作用中起着重要作用[57]。此外，miRNA可通过哺乳传递到婴幼儿的肠道中，由外泌体等多种物质保护，在消化系统中保持完整，并被肠上皮细胞吸收[38,46,57]。因此，有必要研究TCM中miRNA的吸收机制，为疾病治疗奠定更好的基础，并推动TCM现代化进程。

TCM现代化倡导用TCM理论为指导，应用现代技术分析其有效成分。如三氧化二砷（砒霜）治疗白血病、青蒿素治疗疟疾等典型成功案例所示，中医经典理论为中医药来源活性成分的挖掘提供了重要线索。近年来，转基因技术和纳米医学的应用显著推动了TCM现代化进程[58]。转基因技术能使植物产生治疗性分子，为miRNA的生成带来了变革。此前一项研究中，Zhang等[59]在可食用生菜中生成了小沉默RNA，可抑制小鼠模型中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）基因表达并减轻肝损伤。Fu等[60]开发了一种可控的siRNA自组装与递送系统，调控目标驱动模型中的基因表达。本研究发现，miR162a是枸杞的一种新型活性成分，可经吸收入血后靶向作用NcoR并促进成骨分化（图6），从分子层面印证了枸杞“补肾壮骨”的经典理论。此外，研究表明胃中的SIDT1介导了miR162a的吸收。由于枸杞中miR162a含量相对较低，我们利用植物科学领域应用最广泛的实验模型之一（转基因本氏烟叶）来过表达miR162a。转基因本氏烟叶不仅实现了miR162a的高效生产，还在小鼠模型中展现出有效预防骨质疏松的作用。基于产量高、成本低、环境适应性强等优势，转基因植物生成治疗型miRNA在疾病防治领域具有广阔的应用前景和市场价值。然而，本研究仍存在一些局限性。尽管已证实miR162a可被吸收进入血液，但其在体内的药代动力学和生物分布仍有待研究。更重要的是，将miR162a的基础研究转化为临床应用仍是关键问题。

综上所述，本研究证实了枸杞中的miR162a可被吸收进入血液，通过靶向作用NcoR，促进成骨分化来改善骨质疏松。未来，我们将致力于研发基因工程植物和多功能纳米平台实现口服获取miR162a，满足更高效、安全、经济、可行的需求。

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