转录因子HNF1A、HNF4A和FOXA2调节肝细胞蛋白N-糖基化

工程（英文） ›› 2024, Vol. 32 ›› Issue (1) : 62 -75. DOI: 10.1016/j.eng.2023.09.019

研究论文

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Transcription Factors HNF1A, HNF4A, and FOXA2 Regulate Hepatic Cell Protein N-Glycosylation

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Received	Accepted	Published
2022-10-07	2023-09-28
Issue Date
2024-06-12

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摘要

肝细胞核因子1α（HNF1A）、肝细胞核因子4α（HNF4A）和叉头框蛋白A2（FOXA2）是调控肝脏中复杂基因网络的关键转录因子，形成一个转录调控环路。Encode和ChIP-Atlas数据库确定了这些转录因子在许多糖基转移酶基因中的识别位点。本研究结合10个候选糖基因，对HNF1A、HNF4A和FOXA2进行计算机模拟分析，证实这些转录因子在肝脏中显著富集。之前的研究确定了HNF1A是血浆糖蛋白岩藻糖基化、聚糖分支和半乳糖基化的主要调控因子。本研究旨在从功能上验证了这三个转录因子对下游糖基因转录表达的作用以及对聚糖表型的可能影响。使用最先进的规律成簇间隔短回文重复序列/死亡CRISPR相关蛋白9（CRISPR/dCas9）分子工具来下调人肝癌细胞系HepG2细胞中的HNF1A、HNF4A和FOXA2基因。结果表明，这三个基因的下调单独或成对地影响了许多糖基因的转录活性，尽管糖基因的下调并不总是伴随着相应的聚糖结构的明确变化。这种效应可以被更好地视为总HepG2 N-糖基组的总体变化，主要是由于双触角聚糖的扩展。本文提出了另一种用于评估N-糖基组组成的替代方法，通过量化每个聚糖结构中的单体数量来估计糖基组的整体复杂性。还提出了一个模型，显示了HNF1A-FOXA2和HNF4A-FOXA2的相互激活影响了HepG2细胞中的糖基因和蛋白糖基化。

Abstract

Hepatocyte nuclear factor 1 alpha (HNF1A), hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4A), and forkhead box protein A2 (FOXA2) are key transcription factors that regulate a complex gene network in the liver, creating a regulatory transcriptional loop. The Encode and ChIP-Atlas databases identify the recognition sites of these transcription factors in many glycosyltransferase genes. Our in silico analysis of HNF1A, HNF4A, and FOXA2 binding to the ten candidate glyco-genes studied in this work confirms a significant enrichment of these transcription factors specifically in the liver. Our previous studies identified HNF1A as a master regulator of fucosylation, glycan branching, and galactosylation of plasma glycoproteins. Here, we aimed to functionally validate the role of the three transcription factors on downstream glyco-gene transcriptional expression and the possible effect on glycan phenotype. We used the state-of-the-art clustered regularly interspaced short palindromic repeats/dead Cas9 (CRISPR/dCas9) molecular tool for the downregulation of the HNF1A, HNF4A, and FOXA2 genes in HepG2 cells—a human liver cancer cell line. The results show that the downregulation of all three genes individually and in pairs affects the transcriptional activity of many glyco-genes, although downregulation of glyco-genes was not always followed by an unambiguous change in the corresponding glycan structures. The effect is better seen as an overall change in the total HepG2 N-glycome, primarily due to the extension of biantennary glycans. We propose an alternative way to evaluate the N-glycome composition via estimating the overall complexity of the glycome by quantifying the number of monomers in each glycan structure. We also propose a model showing feedback loops with the mutual activation of HNF1A-FOXA2 and HNF4A-FOXA2 affecting glyco-genes and protein glycosylation in HepG2 cells.

关键词

规律成簇间隔短回文重复序列 / （CRISPR）/死亡CRISPR相关蛋白9（dCas9） / 表观遗传学 / 肝细胞核因子1α（HNF1A） / 肝细胞核因子4α（HNF4A） / 叉头框蛋白A2（FOXA2） / N-糖基化 / HepG2细胞

Key words

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/dead Cas9 (CRISPR/dCas9) / Epigenetics / Hepatocyte nuclear factor 1 alpha (HNF1A) / Hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4A) / Forkhead box protein A2 (FOXA2) / N-glycosylation / HepG2 cells

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Vedrana Vičić Bočkor,Nika Foglar,Goran Josipović,Marija Klasić,Ana Vujić,Branimir Plavša,Toma Keser,Samira Smajlović,Aleksandar Vojta,Vlatka Zoldoš,Vedrana Vičić Bočkor,Nika Foglar,Goran Josipović,Marija Klasić,Branimir Plavša,Toma Keser,Samira Smajlović,Aleksandar Vojta,Vlatka Zoldoš. 转录因子HNF1A、HNF4A和FOXA2调节肝细胞蛋白N-糖基化[J]. 工程（英文）, 2024, 32(1): 62-75 DOI:10.1016/j.eng.2023.09.019

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1 引言

糖基化显著地改变了蛋白质的结构和功能，但目前关于构成替代糖基化基础的分子调控机制的知识仍然不完整。糖基化过程是由一系列酶介导的，这些酶催化单糖按顺序添加到蛋白质骨架上。这些酶包括许多不同的糖基转移酶（半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酰基转移酶等）、糖苷酶（甘露糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡萄糖苷酶等）、参与单糖生物合成和转运的酶，以及转录因子[1]。蛋白质糖基化的调控是高度复杂的，因为大量的酶参与了糖蛋白合成和成熟的非模板化过程。尽管有许多研究认为糖基转移酶的活性与聚糖的组成有关，但很少有证据支持糖基化在糖基转移酶表达水平上被调控的假说[2‒3]。此外，蛋白质糖基化是细胞类型特异性的，并在转录、翻译和翻译后水平上受到调控[2,4‒5]。参与聚糖生物合成的基因的转录（例如，糖基因）受转录因子对糖基因启动子和增强子的作用，以及影响这些区域可及性的表观遗传因子的控制[6‒9]。蛋白质糖基化的改变出现在许多类型的疾病中，包括慢性炎症、自身免疫性疾病和感染性疾病，以及癌症[6‒7,10‒11]，通常是影响糖基因或转录基因本身转录的表观遗传变化的结果。

在肝脏中，调节凝血、先天免疫、细胞解毒和维持糖脂稳态过程的主要转录因子属于肝细胞核因子家族（HNF）。HNF有四个家族：肝细胞核因子1（HNF1）、叉头框蛋白A（FOXA）、肝细胞核因子4（HNF4）和一切同源框1（ONECUT、OC或HNF6）；虽然它们具有DNA结合和反式激活等共同特征，但它们也具有不同的结构域，导致其不同的作用[12‒14]。每个家族由几个成员组成，不同家族的亚型在转录环中相互调控。肝细胞核因子1α（HNF1A）和肝细胞核因子4α（HNF4A）是肝脏的主要转录因子，调节肝细胞分化、线粒体代谢、尿素生成、药物转运和代谢、脂肪酸代谢、凝血、脂质和碳水化合物代谢、肝脏再生等过程[15‒19]。它们也被认为是胰腺癌和肝细胞癌（HCC）中的肿瘤抑制因子[20‒24]。

根据Encode数据库，HNF1A转录因子在肝细胞中结合了超过1000个基因启动子，包括关键的糖基转移酶基因，如FUT5、FUT6、B4GALT1、MGAT4A、MGAT5、ST6GAL1和GMDS。由于HNF4A在许多肝功能中起着关键作用，因此HNF4A通常被称为肝功能的主调节因子。叉头框蛋白A2（FOXA2）转录因子被认为作用于HNF1A/HNF4A转录调控网络的上游，调控HNF1A/HNF4A转录[14]。FOXA2缺失突变体不能表达叉头框蛋白A1（FOXA1），并在小鼠中显示HNF1A和HNF4A水平降低[25‒26]。在人类中，FOXA2的突变以两性二型的方式与HCC相关联[27]。Luo等[22]和Odom等[26]已经证明，在肝细胞中HNF1A与至少222个基因启动子结合，HNF4A与大约1560个基因启动子结合，表明HNF1A和HNF4A作为肝脏转录调节因子的主要作用。HNF1A和HNF4A与FOXA2和叉头框蛋白A3（FOXA3）共同创建了一个调控网络，负责朗格汉斯岛（胰岛）β细胞和肝细胞的转录程序。本文研究团队之前通过人血浆N-糖基组全基因组关联研究（GWAS）确定了HNF1A是关键的岩藻糖基转移酶和岩藻糖生物合成基因的主调控因子[28]，而ChIP-Atlas分析显示HNF1A与ST6GAL1和MGAT4B基因的启动子结合。此外，之前的研究揭示了HNF1A基因第一个外显子的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG）甲基化与聚糖分支以及人血浆N-糖基组的半乳糖基化之间的相关性[29]。上述原因为本研究候选基因的选择提供指导：编码包含触角的岩藻糖基转移酶（FUT3、FUT5、FUT6）和核心岩藻糖基化（FUT8）的基因，以及分别编码岩藻糖激酶和鸟苷二磷酸（GDP）-甘露糖4‒6-脱水酶的FUK和GMDS基因；编码负责聚糖分支的糖基转移酶的MGAT3、MGAT4A、MGAT5和MGAT5基因，以及分别编码负责半乳糖基化和唾液酸化糖基转移酶的B4GALT1和ST6GAL1基因。

本研究的目的是研究主要的肝脏转录因子HNF1A、HNF4A和FOXA2在编码主要糖基转移酶的糖基因转录活性中的作用。为此，使用了最先进的规律成簇间隔短回文重复序列/死亡CRISPR相关蛋白9（CRISPR/dCas9）分子工具[8,30]。还对HNF1A、HNF4A和FOXA2的操控是否会影响整个细胞蛋白的N-糖基化进行研究。由于人血浆中的大多数糖蛋白来源于肝脏，因此选择了肝脏来源的HepG2细胞。尽管原代肝细胞将是一个更相关的模型，但使用CRISPR/dCas9方法进行操作所需要的时间框架超过原代细胞培养寿命。从其他组的研究表明，不考虑其他方面的显著差异，一些途径在HepG2细胞中仍然是完整的；本文研究团队之前的研究表明，相比在健康肝细胞中所预期的，主要的蛋白质糖基化途径似乎是完整的[7‒8,31]，表明HepG2细胞代表人类肝脏模型是合适的。本研究的结果显示，HNF1A、HNF4A和FOXA2基因的单独和（或）同时下调影响了许多糖基因的转录活性，尽管这种变化并不总是伴随着相应的聚糖结构的明确变化。相反，总的Hepg2 N-糖基组的整体复杂性增加了，主要是由于双触角聚糖的扩展。本研究提出了一种用于评估N-糖基组组成的替代方法，以及一个模型，该模型显示了HNF1A-FOXA2和HNF4A-FOXA2相互激活影响HepG2细胞中糖基基因和蛋白糖基化的反馈回路。

2 材料和方法

2.1 在硅芯片富集分析中

为了检查不同组织中转录因子HNF1A、HNF4A、FOXA2和糖基因B4GALT1、ST6GAL1、MGAT3、MGAT4A、MGAT5、FUT3、FUT5、FUT6、FUT8、FUK、GMDS的相关性，本文使用ChIP-Atlas数据库（https://chip-atlas.org）[32‒33]、“Enrichment Analysis”模块、实验类型“ChIP：TFs and others”、显著性阈值50，以及Refseq编码基因作为控制数据集。对每种组织类型进行三种富集分析：转录因子、糖基因和所有基因（如上所述）。分析了肝脏、肺、消化系统、血液、神经和肌肉细胞类型的富集情况。

2.2 质粒结构

采用Krüppel相关盒（KRAB）-死亡化脓性链球菌Cas9（dSpCas9）融合结构靶向HNF1A、HNF4A和FOXA2基因位点，同时靶向HepG2细胞中HNF4A/FOXA2、HNF1A/FOXA2和HNF1A/HNF4A基因对。采用具有BsaI组装反应的模块化系统制成融合结构，如参考文献[30]所述。最终的融合结构包含KRAB-dSpCas9融合部分、荧光标记mRuby3和强大的鸡β-肌动蛋白（CBh）启动子下嘌呤霉素抗性的选择标记。一个引导RNA（gRNA）分子用于靶向HNF1A基因，而两个不同的gRNA分子用于靶向FOXA2或HNF4A基因。在实验中使用了一个共表达非靶向gRNA（NT-gRNA）的结构，该结构在人类基因组中没有序列同源性，被当作阴性对照（见附录A中的表S1）。

2.3 细胞培养和转染

一个人HepG2细胞系（ACC 180；DSMZ，德国）被保存在RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich，美国）中，并添加10%热灭活胎牛血清（Sigma-Aldrich）。细胞在37 °C中培养，置于含有加湿的5%二氧化碳（CO₂）的空气中。根据制造商的协议，HepG2细胞的转染使用聚乙烯亚胺（PEI）MAX 40 K（Polysciences，美国）。简而言之，在转染前一天将HepG2细胞接种于100 mm培养皿中，然后第二天以约80%的浓度与8 µg质粒进行转染。PEI与DNA的质量比为3∶1。转染24 h后筛选细胞进行荧光蛋白mRuby3的表达，并用嘌呤霉素（Gibco Life Technologies，美国）筛选细胞48 h。然后在转染后的第4天收集细胞，用于随后的DNA、RNA和蛋白质分离。

2.4 通过逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）进行基因表达分析

根据制造商的方案，总RNA使用RNeasy迷你试剂盒（Qiagen，德国）进行分离，并使用TURBO DNA-free试剂盒（Invitrogen，美国）用DNase处理。使用PrimeScript逆转录酶（TaKaRa，日本）和随机六聚体引物（Invitrogen）进行逆转录。根据制造商的方案使用7500快速实时聚合酶链反应（7500 Fast Real-Time Polymerase Chain Reaction System）系统、TaqMan基因表达主混合液（TaqMan Gene Expression Master Mix）和以下TaqMan基因表达分析（Applied Biosystems，美国）进行RT-qPCR：Hs00167041_m1（HNF1A）、Hs00232764_m1（FOXA2）、Hs002 30853_m1（HNF4A）、Hs00382135_m1（FUK）、Hs01046865_m1（GMDS）、Hs01868572_s1（FUT3）、Hs00704908_s1（FUT5），Hs03026676_s1（FUT6）、Hs00189535_m1（FUT8）、Hs02379589_s1（MGAT3）、Hs00923405_m1（MGAT4A）、Hs00159136_m1（MGAT5）、Hs00155245_m1（B4GALT1）、Hs00949382_m1（ST6GAL1）。将基因表达标准化为HMBS基因（Hs00609297_m1），并使用比较循环阈值（Ct）方法进行分析[34]。在所有实验中，表达显示为相对于非靶向转染细胞的倍数变化（FC）。

2.5 蛋白质提取和免疫印迹分析

在免疫印迹分析中，采用放射免疫共沉淀法（RIPA）缓冲液[50 mmol∙L^-1三羟甲基氨基甲烷（TRIS, pH = 7.5）、0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、1 mmol∙L^-1乙二胺四乙酸（EDTA）、135 mmol∙L^-1添加蛋白酶抑制剂混合物的氯化钠（NaCl）（cOmplete^TM ULTRA Tablets，不含EDTA，玻璃瓶；Roche，瑞士）溶解细胞。25 μg蛋白质在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，并被转移到硝酸纤维素膜上（Amersham^TMProtran^® Premium 0.45 μm硝酸纤维素；GE Healthcare，德国）。用0.1% Tween 20将细胞膜封闭于含5%牛奶（Milchpulver印迹级；Roth，德国）的三乙醇胺缓冲盐水溶液（TBS-T）中，然后与一抗一起孵育。一抗在如下阻断缓冲液中稀释：1∶2000抗HNF1A（ab272693；Abcam，英国）、1∶1000抗HNF4A（sc-374229；美国圣克鲁兹）、1∶2000抗FOXA2（ab60721；Abcam）、1∶2000抗组蛋白H3（ab1791；Abcam）和1∶1000抗β-actin（sc-69879；圣克鲁兹）。一抗在4 °C下孵育过夜。然后将细胞膜放在辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二级山羊抗小鼠（ab205719；Abcam）或山羊抗兔抗体（ab6721；Abcam）中孵育。使用Clarity Max™ Western ECL基底物（BioRad，美国）采集信号，并使用Alliance Q9高级成像系统（Uvitec，英国）进行拍摄。

2.6 HepG2细胞总N-糖基组含量的分析

在添加蛋白酶抑制剂混合液（cOmplete™ULTRA Tablets，无EDTA，玻璃瓶；罗氏）的裂解缓冲液[50 mmol∙L^-1 TRIS（pH = 7.4）、0.1% Triton X-100、1 mmol∙L^-1 EDTA、135 mmol∙L^-1 NaCl]中将细胞破裂，然后用甲醇和氯仿标准方案沉淀总蛋白。干燥后的蛋白颗粒在30 μL、1.33%（浓度）的十二烷基硫酸钠（SDS; Invitrogen）中重悬，并在65 °C下孵育10 min。随后，在10 μL、5× 磷酸盐缓冲盐水（PBS）中加入10 μL、4% Igepal -CA630（Sigma-Aldrich）和1.2 单位肽N-糖苷酶F（PNGase F；Promega，美国）。样品在37 °C下孵育过夜，以允许N-聚糖的释放。释放的N-聚糖用普鲁卡因酰胺（Sigma-Aldrich）标记。通过溶解普鲁卡因酰胺（38.3 mg∙mL^-1; Sigma-Aldrich）和2-吡啉硼烷（ 44.8 mg∙mL^-1; Sigma-Aldrich）于二甲基亚砜（DMSO; Sigma-Aldrich）和冰醋酸（7∶3，体积分数；德国默克公司）的混合液以制备新鲜的标记混合物。将标记混合物（25 μL）加入96孔板的每个N-聚糖样品中。振荡10 min以混合样品，然后在65 °C下孵育2 h。在每个样品（75 μL）中，加入700 μL的乙腈（ACN；JT Baker，美国）。使用亲水相互作用液相色谱固相萃取（HILIC-SPE）清理方法，从样品中去除自由标记剂和还原剂。采用0.45 μm亲水性聚丙烯（GHP）过滤板（Pall Corporation，美国）作为固定相。所有孔均用1× 200 μL乙醇/水（7∶3, V/V）和1× 200 μL水进行预洗，然后用1× 200 μL ACN/水（24∶1, V/V）进行平衡。溶剂是通过真空歧管（Millipore Corporation，美国）施加真空去除的。将样品装入孔中，随后用200 μL的ACN/水（24∶1, V/V）洗涤5次。用2× 50 μL水洗脱聚糖，组合洗脱液在-20 °C下保存直至使用。荧光标记和纯化的N-聚糖通过HILIC在Waters Acquity超高效液相色谱（UPLC）仪（美国）上进行分离，该色谱仪由四元溶剂管理器、样品管理器和荧光检测器（激发和发射波长分别为310 nm和370 nm）组成。该仪器使用Empower 2软件进行控制，构建2145（Waters）。血浆N-聚糖在Waters桥式乙烯杂化物（BEH）聚糖柱上进行分离，该聚糖柱尺寸为150 mm × 2.1 mm，使用1.7 μm BEH颗粒；采用100 mmol∙L^-1甲酸铵（pH = 4.4）作为溶剂A，ACN作为溶剂B。分离方法采用53%~70%（V/V）线性梯度的ACN，流速为0.561 mL∙min^-1，分析运行25 min。数据采用自动集成的方法进行处理。以相同的方式将色谱图被分离成不同的峰，每个峰中的聚糖含量以总积分面积的百分比表示。采用串联质谱（MS/MS）分析对所有聚糖结构进行注释，通过HILIC-UPLC耦合Synapt G2-Si-Si电喷雾电离四极杆飞行时间质谱（ESI-QTOF-MS）系统（Waters）。使用MassLynx v.4.1软件（Waters）控制仪器。质谱条件设置如下：正离子模式，毛细管电压3 kV，采样锥电压30 V，源温度120 °C，脱溶温度350 °C，脱溶气体流量800 L∙h^-1。记录的质谱范围在500~3000 m/z之间，频率为1 Hz。串联质谱实验在数据依赖采集（DAD）模式下进行。首先获得500~3000 m/z的光谱，然后选择两个强度最高的前体进行碰撞诱导解离（CID）破碎（100~3000 m/z）。采用碰撞能量斜坡[低质量碰撞能量（LM CE）Ramp Start 7 V，LM CE Ramp End13 V，高质量碰撞能量（HM CE）Ramp Start 97 V，HM CE Ramp End 108 V]获得碎片。

2.7 统计分析

所有体外实验共9个重复。所有数据均以平均值±标准差（SD）表示。采用双尾Mann-Whitney检验[使用Windows GraphPad Prism5.0.3版本（GraphPad软件，美国）]计算组间的统计学差异。表达和聚糖组成/复杂性分析以及相应的数据可视化，使用R语言和统计环境（R Core Team，奥地利）来完成。

3 结果

3.1 计算机模拟分析表明，转录因子HNF1A、HNF4A和FOXA2特异性地调控人肝脏中的糖基因

本文旨在研究HNF1A、HNF4A和FOXA2转录因子在人肝脏细胞模型HepG2的糖基因调控中的作用。为了验证这三个关键转录因子是否在人类肝脏中特异性地与候选糖基因结合，本文使用ChIP-Atlas数据库[32‒33]进行富集分析。检测了编码主要糖基转移酶的候选糖基因——B4GALT1、ST6GAL1、MGAT3、MGAT4A、MGAT5、FUT3、FUT5、FUT6和FUT8基因——以及分别编码岩藻糖激酶和GDP-甘露糖4,6-脱氢酶的FUK和GMDS基因。这一分析结果清楚地表明，这种调控主要发生在肝脏（表1）。作为对照组的血液、神经和肌肉样本几乎没有发现富集（这些结果没有显示在表中，因为根本没有富集）。FOXA2在肺和HNF4A在消化道有一定的调控（主要在CaCo-2，是人结直肠腺癌细胞系）

**3.2 HNF1A、HNF4A或FOXA2基因的单独操作影响糖基因的转录和总HepG2细胞N-聚糖的组成**

由于HNF1A、HNF4A和FOXA2是人类肝脏中基因转录网络的主调控因子，本研究的计算机分析显示这些转录因子与候选糖基因结合，本文研究团队想使用CRISPR/dCas9工具通过实验验证这一点。如果糖基因的表达受到HNF1A、HNF4A和FOXA2的调控，本研究认为这对HepG2细胞总蛋白N-糖基化有一定的影响。首先，在单独的实验中，KRAB-dSpCas9融合结构被特定的gRNA引导到这三个基因的启动子区域，以抑制它们的转录。在转录本和蛋白水平上，HNF1A、HNF4A和FOXA2基因的表达均显著下降（图1至图5）。在对这三个基因进行操作后，发现几个糖基因的转录和细胞糖组发生了显著变化（图1至图5）。令人惊讶的是，在某些情况下，某些糖基因的信使RNA（mRNA）水平的变化并没有导致相应的聚糖的明确变化。结果如表2所示。

研究发现HNF1A在转录本（FC = 0.42）和蛋白水平上均有下调[图1（a）、表2]，导致B4GALT1的转录显著增加（FC = 1.79），B4GALT1编码β-1,4-半乳糖转移酶，该酶负责向N-乙酰氨基葡萄糖残基添加半乳糖。另外，观察到二半乳糖基化（-8.73%）、三半乳糖基化（-18.6%）和整体半乳糖基化结构（-14.59%）的下降[图1（b）]。此外，FUK基因（FC = 1.43）的转录水平增加，FUK是焦点挽救途径的核心组成部分[图1（e）]，即使岩藻糖基化保持不变。尽管编码糖基转移酶（调控聚糖的分支）的MGAT4A（FC = 1.29）的转录增加，但没有检测到高度分支聚糖结构的增加，而是检测到高分支（-18.44%）和低分支（-8.73%）复合聚糖结构的增加[.图1（d）]。在糖组水平上，还观察到单唾液酸化、双唾液酸化和三唾液酸化结构（-10.49%、-13.05%和-20.30%）和总唾液酸化结构（-14.81%）的下降，尽管ST6GAL1的转录没有显著变化[图1（c）]。HNF1A下调后，FOXA2基因转录降低（FC = 0.73），而HNF4A基因转录没有明显变化[见附录A中的图S1（a）]。

FOXA2在转录本（FC = 0.19）和蛋白水平上均有下调[图2（a）、表2]，随后HNF1A（FC = 0.54）和HNF4A（FC = 0.54）基因以及几个糖基因[见附录A中的图S1（b）]的转录水平均发生了变化。FUT6基因转录水平下降（FC = 0.69），而负责岩藻糖基化的FUT8基因的转录水平增加（FC = 1.33）。MGAT4A的转录水平升高（FC = 1.26），而MGAT5和ST6GAL1 [唾液酸转移酶，催化唾液酸从5'-单磷酸胞苷（CMP）-唾液酸转化为含半乳糖的底物]的转录水平降低（FC分别为0.76和0.74）。在糖组水平上，只有唾液酸化的聚糖结构增加（10.75%），与ST6GAL1表达减少相一致，而其他聚糖结构的数量没有明显变化[图2（b）]。

HNF4A基因在转录本（FC = 0.49）和蛋白水平上的下调[图2（c）、表2]导致HNF1A（FC = 0.71）和FOXA2（FC = 0.61）的转录水平降低[见附录A中的图S1（c）]。这种操作也显著影响了几个糖基因的表达。MGAT3（编码N-乙酰氨基葡萄糖苷酶转移酶Ⅲ）和B4GALT1的转录水平升高（FC分别为1.52和1.96），而FUT6（FC = 0.79）的转录水平降低，FUK（FC = 0.84）的转录水平下降明显[见附录A中的图S1（c）]。在细胞总糖基组组成的变化方面，核心岩藻糖聚糖结构（-7.28%）和双唾液酸化聚糖结构（-2.33%）的数量明显减少，尽管相应的基因表达没有发生变化[图2（d）]。单个峰和衍生性状的数据见附录A中的表S2。

**3.3 HNF4A和FOXA2基因同时下调影响B4GALT1、FUT3、FUT8和MGAT3的转录，但相应的聚糖结构没有明确变化**

为了进一步分析HNF1A、HNF4A和FOXA2之间的调控网络，本研究使用特异性gRNA，采用KRAB-dSpCas9同时调控HNF4A和FOXA2。这导致HNF4A（FC = 0.55）和FOXA2（FC = 0.38）的mRNA水平显著下调，对它们的蛋白水平也产生影响[图3（a）、表2]。HNF4A/FOXA2基因调控同时导致几个糖基因，即B4GALT1（FC = 2.31）、FUT3（FC=1.67）、FUT8（FC = 1.31）和MGAT3（FC=1.57）的mRNA水平升高，而HNF1A的表达没有显著变化[见附录A中的图S1（d）]。在N-糖基组水平上，尽管B4GALT1转录水平增加，但总半乳糖基化聚糖结构水平下降（-3.99%）[图3（b）]。总唾液酸化结构的数量减少（-4.165%），尽管ST6GAL1的转录没有显著变化[图3（c）]。低分支和高分支聚糖的数量没有出现明显的变化[图3（d）]。触角型岩藻糖基化结构数量降低（-6.39%），而相应基因FUT3的转录水平升高[图3（e）]。单个峰和衍生性状的数据见附录A中的表S2。

**3.4 HNF1A和FOXA2基因同时下调会影响HNF4A、B4GALT1、ST6GAL1、FUT3、FUT5、FUT6、MGAT4和GMDS的转录，而相应的聚糖结构并没有发生明确的变化**

此外，KRAB-dSpCas9融合同时靶向HNF1A和FOXA2的启动子区域，以诱导它们的转录抑制。这两个基因的转录本和蛋白水平均显著下降（FC分别为0.26和0.19）[图4（a）、表2]。这种调控导致几个糖基因和HNF4A转录水平的显著变化[FC = 0.41，见附录A中的图S1（e）]。B4GALT1的转录水平显著升高（FC = 1.22），而总半乳糖基化聚糖结构数量减少（-5.68%），无半乳糖基化聚糖转录水平增加（26.04%）[图4（b）]。ST6GAL1的转录水平略有下降，但变化无统计学意义。然而，总唾液酸化聚糖结构数量显著下降（-5.72%），而唾液酸化聚糖结构的数量没有显著变化[图4（c）]。在参与聚糖分支的三个基因中，只有MGAT4A转录水平增加（FC = 1.12），而高分支聚糖结构数量没有明显变化[图4（d）]和低分支聚糖结构数量减少（-7.21%）。此外，参与触角型岩藻糖基化的糖基因的转录水平发生了变化：FUT3（FC=1.46）和FUT5（FC = 1.92）的转录水平升高，而FUT6的转录水平下降[FC = 0.59，图4（e）]。然而，虽然FUT8的转录水平没有发生显著变化，但核心岩藻糖基化结构的转录水平显著增加[5.04%，图4（e）]。编码催化GDP-甘露糖合成GDP岩藻糖第一步的酶的GMDS基因的转录水平显著降低（FC = 0.83），而FUK的转录水平没有显著变化[图4（e）]。

**3.5 HNF1A和HNF4A基因的同时下调影响大多数糖基因的转录，而不会导致相应聚糖结构的明确变化**

利用特异性gRNA的KRAB-dSpCas9融合结构同时靶向HNF1A和HNF4A启动子后，这两个基因在转录本和蛋白水平（FC 分别为0.45和0.34）上的表达均下降[图5（a）、表2]。本文观察了大多数选定的下游基因（除GMDS、FUT6、MGAT3和MGAT4A外）对转录水平的影响（图5、表2），而沉默该基因对并没有显著影响FOXA2的转录[见附录A中的图S1（f）]。B4GALT1（FC = 1.73）、FUT3（FC = 2.02）、FUT5（FC = 4.5）、FUT8（FC = 1.61）、MGAT5（FC = 1.48）和FUK（FC = 1.6）的转录水平升高，而ST6GAL1转录水平下降（FC = 0.68）（图5）。单唾液酸化（-10.22%）、双唾液酸化（-13.53%）、三唾液酸化（-19.84%）结构和总唾液酸化结构的减少，以及唾液酸化聚糖结构（+20.33%）的增加与ST6GAL1转录水平的下降一致[图5（c）]。然而，其他的聚糖性状的变化与相应的聚糖基因的转录变化并不呈正相关。总半乳糖基化聚糖数量减少（-14.29%），同时无乳糖基化聚糖结构增加（+45.86%），这与B4GALT1转录水平的增加不一致[图5（b）]。高（-15.12%）和低分支（-13.28%）结构的比例降低，而MGAT5的转录水平增加[图5（d）]。同样，尽管FUT3和FUT5的转录水平增加，但本文观察到含触角岩藻糖的聚糖结构减少了（-25.28%），而FUT8转录水平增加对核心岩藻糖基化聚糖的数量没有显著影响[图5（e）]。

3.6 在HNF1A、HNF4A和FOXA2下调后，双触角聚糖的扩展使得总HepG2 N-糖基组的总体复杂性增加

单个聚糖结构和狭窄定义的聚糖性状的变化对于捕获细胞总N-聚糖组水平变化的能力有限。因此，本研究定义了“聚糖级”标准来表示聚糖结构中单糖单位的数量。本文测量了低聚甘露糖修剪合成的聚糖结构，每个单元的添加对应于一个酶促反应。在整个糖基组水平上，本文研究团队发现，当HNF1A/FOXA2和HNF1A/HNF4A基因对被沉默时，聚糖平均复杂度持续增加约一个单位（图6）。为了更好地了解细胞总N-糖基组水平的变化，本研究评估了单个聚糖结构对整体糖基组复杂性的贡献。对复杂性增加最重要的贡献来自双触角聚糖，其大小足以弥补三、四触角结构的相对减少（图7）。这一结果补充并进一步解释了在两个实验中观察到的糖基转移酶表达的变化，表明所研究的糖基因最重要的贡献是它们对扩展双触角结构的作用，尽管更复杂的结构在基因调控后似乎较少。这一发现表明，B4GALT1和ST6GAL1基因产物的增加主要作用于双触角结构。

4 讨论

在本研究中，使用最先进的基于CRISPR/dcas9的分子工具[8,30]来研究HepG2细胞（这是一个人类肝脏模型）中编码主要糖基转移酶和相应聚糖的糖基因是否受HNF1A、HNF4A和FOFA2转录因子的调控，。选择使用CRISPR/dCas9-KRAB分子工具下调HNF1A、HNF4A和FOXA2基因，因为HNF1A、HNF4A和FOXA2是人肝脏中几个关键细胞通路交叉点的关键转录因子[14,26]。因此，这些转录因子的完全敲除将是致命的或显著降低细胞活力，最终干扰实验目标，即评估HepG2细胞在改变主要糖基因的表达后，N-糖基化谱的变化幅度和方向，这可能由这三个转录因子调节。本研究还关注了生理学条件下蛋白质糖基化过程的微调。因此，使用KRAB-dSpCas9结构靶向它们的天然启动子，HNF1A、HNF1A或FOXA2基因分别或同时成对（HNF1A/HNF4A、HNF1A/FOXA2和HNF4A/FOXA2）下调。

FOXA2的下调导致HNF1A和HNF4A基因的转录水平均下降，表明FOXA2是对肝脏发育至关重要的先锋转录因子[35]。HNF4A下调导致HNF1A和FOXA2基因转录下降，而HNF1A下调导致FOXA2转录下降，而HNF4A转录没有下降。这一结果与之前的研究结果一致，即HNF4A转录因子在肝细胞必需的调控网络层级上高于HNF1A。以往的研究表明，HNF4A是HNF1A基因调控所必需的；研究人员也阐明了HNF1A在HNF4A的相互调控中的重要作用[36‒38]。综上所述，每个转录因子HNF1A、HNF4A和FOXA2对小组中其他转录因子的表达的强烈影响证实了控制调节回路的存在，该回路的主要因子已被确定，但确切的机制仍需进一步被阐明。值得注意的是，与其他两对基因HNF4A/FOXA2和HNF1A/FOXA2（只影响部分候选基因）下调和相比，HNF1A和HNF4A的同时下调影响大多数糖基因的转录，。这一结果有力地证实了HNF1A和HNF4A作为肝脏转录的关键调控因子已有的作用[26]，并表明它们的调控回路控制着人肝脏中的蛋白糖基化（图8）。

本研究使用KRAB-dCas9对HNF1A、HNF4A和FOXA2单独和组合下调的实验清楚地证明了这些转录因子对HepG2细胞下游糖基因和N-糖基组的影响。然而，基因转录的变化并不总是像人们预期的那样与相应的聚糖结构的变化呈正相关。FOXA2的下调和HNF1A/HNF4A的同时下调降低了ST6GAL1的转录，并伴随着唾液酸化聚糖结构的减少（图2和图5）。有趣的是，在HNF1A下调后，无论ST6GAL1转录水平是否保持不变，单唾液酸化、双唾液酸化和三唾液酸化结构都显著下降。单独下调HNF1A或下调HNF1A/HNF4A和HNF4A/FOXA2基因对会导致B4GALT1的表达显著增加；然而，同时半乳糖基化聚糖水平下降。此外，在所有涉及HNF1A、HNF4A和FOXA2操控的实验中，都发现这些转录因子对负责聚糖分支的几种糖基转移酶的转录活性有很强的影响。因此，糖基转移酶的表达与HepG2 N-糖基组组成之间的关系并不简单。关于这种特定糖基因的转录水平与其相应的聚糖结构之间的差异以前已经报道过[2‒3]。例如，在小鼠胚胎干细胞向胚胎内胚层（ExE）细胞成熟的过程中，B3GNT1、B3GNT4和B4GALT1表达的增加对相应的聚糖结构的聚乳糖胺延伸没有影响。此外，即使FUT8和MGAT3的水平没有升高[2]，ExE细胞中核心岩藻糖基化聚糖和平分型聚糖的比例仍然在增加。最近，Nguyen等[39]报道，在分析的42个糖基因中，只有10个过表达对中国仓鼠卵巢细胞的免疫球蛋白G（IgG）糖基化有影响。

尽管有大量的研究尝试，但仍然缺乏一致的数据显示糖基转移酶表达对糖基组组成具有强烈而直接的影响，而且在生理学条件下，糖基转移酶表达的变化在观察到的糖基组组成的变化中没有被反映出来[3]。当考虑相同的糖基转移酶产生的聚糖附着在细胞中数百种不同蛋白质上时，这实际上并不令人惊讶。此外，如果糖基转移酶的表达是关键的调控机制，那么成千上万的蛋白质将以同样的方式被调控，这在生物学上是不可能的。事实上，一系列的GWAS已经揭示了糖基转移酶只占与N-糖基组组成相关的基因网络的一小部分[28,40‒43]。最近IgG和转铁蛋白的平行GWAS清楚地表明，尽管这些聚糖是由相同的糖基转移酶产生的[44]，但与这两种不同蛋白质相连的非常相似的聚糖是由不同的基因网络调控的。本研究获得的结果加强了先前的研究结果，并强烈提示糖基转移酶的表达并不是导致最终糖基化表型的主要调控机制。

尽管识别一些关键的肝脏蛋白质及其糖基化以获得更多的生物信息是有趣的，但糖肽分析的定量分析低于本研究中的UPLC分析（基于引入的荧光标签的存在来量化聚糖）。本研究量化了对细胞总N-糖基组相对较小的影响，然而由于技术限制和更大的测量误差，这在糖蛋白水平上是不可能的。此外，分析了糖基化机制的一般影响，并在之前一系列的GWAS（血浆或IgG糖体）中清楚地表明，当对不同的蛋白质和（或）糖基化特征进行整合时，这种影响更加明显[40‒41,43‒45]。

本研究提出了一种用于评估N-聚糖基组组成的替代方法，通过量化每个聚糖结构中单个单体构建模块的数量来评估糖基组的整体复杂性。通过这种方法分析，关键转录因子HNF1A/HNF4A和HNF1A/FOXA2对的沉默对HepG2细胞总N-糖基组的复杂性有非常强和一致的影响。结果证实了最初的推理路线，即转录因子的组合具有协同效应（尤其是在HNF1A/HNF4A对中）。基于本研究的转录分析，本文研究团队还建立了通过这三个肝脏转录因子调控糖基因的模型（图8）。本研究的数据证明HNF1A/FOXA2和HNF4A/FOXA2之间存在正反馈回路，该回路加强了彼此的表达。紧密连接的转录相互作用网络证实了这三种转录因子显著地影响了HepG2细胞中的蛋白糖基化。然而，本研究观察到，糖基组组成的变化并不总是与相关糖基因的转录表达的变化相关，表明在糖基转移酶表达之上存在一个额外的调控层。这个结果是直观的，因为成千上万种蛋白质结构的协调变化没有生物学意义。这也与在不同研究[2‒3]中观察到的糖基组组成和糖基转移酶基因表达之间非常有限的联系相一致。此外，调控也可能发生在转录后水平或通过与糖基因转录无关的机制（即由microRNA）进行[4‒5]。尽管如此，仍然能够证实上游调控因子对HepG2蛋白质糖基化的关键影响，并解释了观察到的大多数糖基化模式的变化。

先前的队列研究已经提供了糖基组组成与HNF1A活性之间关联的证据[29,41]。本文研究团队已经证明，HNF1A启动子区域甲基化的增加与血浆N-糖基组中四触角聚糖结构的增加正相关[29]，并且HNF1A基因区域第一个外显子的四个CpG位点与其转录功能相关[30]。HNF1A已被确定为人血浆N-糖基组GWAS最佳对象之一[28]，该基因的突变显著改变血浆N-糖基组[46]，这些都表明HNF1A在调节人血浆蛋白N-糖基化中发挥重要作用。因此，虽然通路富集分析是识别基因及其产物在细胞代谢中作用的有力工具，但本研究侧重于从之前GWAS确定的候选基因开始的方法，其中假定的通路已经代表了一个假设，然后专门针对候选基因做进一步测试。因此，本文研究工作是第一个研究使用基于CRISPR/dCas9分子工具直接操纵HNF1A、HNF4A、FOXA2基因和探索糖基因转录表达及最终产物聚糖结构（在肝脏模型细胞系HepG2中的总N-糖基组）表达的研究工作，。通过本研究和本文研究团队之前的研究证明，CRISPR/dCas9方法在探索健康和疾病状态下糖基化的复杂通路时，可以用于候选基因的功能分析[47‒49]。因为糖基组的复杂性也与2型糖尿病的发展有关（蛋白质糖基化的变化至少发生在胰岛素抵抗诊断前7年）[50]，理解HNF1A与蛋白质糖基化[29]的分子机制可能有助于识别糖尿病和相关代谢性疾病的潜在新药物靶点。

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