蚕丝基生物材料精准和功能性组装的3D打印策略

工程（英文） ›› 2024, Vol. 34 ›› Issue (3) : 98 -115. DOI: 10.1016/j.eng.2023.09.022

研究论文

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3D Printing Strategies for Precise and Functional Assembly of Silk-based Biomaterials

Xiaoliang Cui ^a ,
Jun Zhang ^a^,^* ,
Yan Qian ^a ,
Siqi Chang ^a ,
Benjamin J. Allardyce ^b ,
Rangam Rajkhowa ^b ,
Hui Wang ^a^,^* ,
Ke-Qin Zhang ^a^,^* ,

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Received	Accepted	Published
2023-01-15	2023-09-12
Issue Date
2024-06-12

PDF (7286K)

摘要

近年来，三维（3D）打印技术和蚕丝作为打印墨水生产生物相容性结构的研究都取得了显著进展。结合3D打印无限的设计潜力，蚕丝可以被加工成多种功能性材料和装置，适用于各种生物医学应用。蚕丝能够被加工成包括溶液、水凝胶、颗粒、微球和纤维在内的多种材料形式，这使其成为适配不同3D打印技术的理想候选材料。本文对基于蚕丝基材料的3D打印进行了系统概述，涵盖了主要的打印技术类别及其原型机制和结构特征。此外，本文为研究人员提供了一个路线图，旨在通过总结技术和材料方面的有前景的策略，将最先进的蚕丝材料加工与快速发展的3D打印技术相结合。因此，本研究的重点是阐明促进基于蚕丝材料精确组装策略发展的技术和方法。精准打印（包括高打印分辨率、复杂结构实现和打印保真度）是3D打印技术数字化设计能力的前提条件，并将显著拓宽蚕丝的应用领域，如复杂的仿生组织结构、血管结构以及透皮微针等。

Abstract

In recent years, significant progress has been made in both three-dimensional (3D) printing technologies and the exploration of silk as an ink to produce biocompatible constructs. Combined with the unlimited design potential of 3D printing, silk can be processed into a broad range of functional materials and devices for various biomedical applications. The ability of silk to be processed into various materials, including solutions, hydrogels, particles, microspheres, and fibers, makes it an excellent candidate for adaptation to different 3D printing techniques. This review presents a didactic overview of the 3D printing of silk-based materials, major categories of printing techniques, and their prototyping mechanisms and structural features. In addition, we provide a roadmap for researchers aiming to incorporate silk printing into their own work by summarizing promising strategies from both technical and material aspects, to relate state-of-the-art silk-based material processing with fast-developing 3D printing technologies. Thus, our focus is on elucidating the techniques and strategies that advance the development of precise assembly strategies for silk-based materials. Precise printing (including high printing resolution, complex structure realization, and printing fidelity) is a prerequisite for the digital design capability of 3D printing technology and would definitely broaden the application era of silk, such as complex biomimetic tissue structures, vasculatures, and transdermal microneedles.

关键词

3D打印 / 生物墨水 / 生物打印 / 丝素蛋白

Key words

3D printing / Bioink / Bioprinting / Silk fibroin

引用本文

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崔晓亮,张骏,钱妍,常思琪,Benjamin J. Allardyce,Rangam Rajkhowa,王卉,张克勤. 蚕丝基生物材料精准和功能性组装的3D打印策略[J]. 工程（英文）, 2024, 34(3): 98-115 DOI:10.1016/j.eng.2023.09.022

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1 引言

三维（3D）打印技术，也称为增材制造，被定义为“通过将材料逐层连接，根据3D模型数据制造物体的过程，与传统的减材制造方法相对”[1]。近年来，3D打印技术发展迅速，其应用范围从汽车材料到器官移植等[2‒5]。通过3D打印制造的人工组织和器官有望解决组织修复和器官移植中的诸多挑战 [6‒7]。鉴于其重要性，大量研究致力于改进用于制造仿生材料的打印方法（打印技术）和材料（打印墨水）。

3D打印的主要优势在于可以直接实现定制化设计，特别是那些具有复杂几何形状和内部结构的设计，这在传统制造策略中是无法实现的。然而，尽管打印技术取得了显著进步，材料开发却限制了3D打印的潜力，仍是该领域的瓶颈。在过去的十年中，人们努力扩展用于3D打印应用的材料工具，以满足3D打印技术的潜能。理想的打印墨水应具有良好的可打印性、打印精度和机械完整性。对于生物医学应用——特别是细胞封装生物打印 [8]，墨水还需要具有生物相容性，以提供细胞友好的环境。然而，开发一种满足所有这些要求的材料仍然是一个关键挑战。例如，具有优异打印精度和强大机械性能的墨水可能过于刚硬，无法支持活细胞打印或后续的细胞增殖。

本文重点介绍了蚕丝在3D打印中的应用。蚕丝已被广泛用作生物材料，并被应用于美国食品药品监督管理局（FDA）批准的手术缝合线中。各种类型的蚕丝中，来自家蚕（Bombyx mori）的蚕丝是研究最深入且最广泛应用于生物材料的[9]。蚕丝的丰富性使其成为开发生物医学器件的理想材料。丝素蛋白（SF）是一种脱胶后残留的结构蛋白，由于其独特的弹性、强度和良好的哺乳动物细胞相容性，成为组织工程领域中极具吸引力的材料 [10]。SF 可以通过化学修饰来引入细胞识别基序、矿物质或细胞生长因子等功能特性。研究表明，它在体外[11‒14]和体内[15‒17]都具有良好的生物相容性，能够支持多种原代细胞和细胞系的生长。蚕丝在组织工程领域表现出巨大的潜力，适用于骨[12,18]、软骨[19‒20]、肌腱和韧带修复 [17,21‒22] 等应用。这些独特的特性使其成为用于3D打印生物支架的理想生物材料。

本文系统回顾了基于SF的3D打印的打印机理、材料加工、打印要求和结构特性（图1）。文中还讨论了不同打印技术和打印结构最适合的应用。此外，本文提出了一些提高打印质量的潜在策略，如分辨率、精度和功能性，以拓宽SF基3D打印材料在不同领域的应用范围。

2. 3 D打印概述

根据ISO/ASTM 52900标准[23]，3D打印技术可分为七大类：材料挤出（ME）、粉末床熔融（PBF）、黏结剂喷射（BJ）、槽式光聚合（VP）、直接能量沉积（DED）、材料喷射（MJ）以及片材层压（SL）[24]，每种技术适用于不同的材料形式。不同打印工艺的示意图如图2所示。基于不同的原型机制和原料形式，这七种技术可进一步归为四大系统：挤出型、粉末型、光聚合型和实体型。挤出型打印主要包括ME，通过喷嘴进行材料挤出[图2（a）]。这一类别主要包含两种主要的打印技术：熔融沉积成型（FFF）和直接墨水书写（DIW）。粉末型系统包括PBF、BJ和DED。PBF和BJ通过在粉末床上铺粉的方式来打印物体；两者的区别在于，PBF使用激光源熔化颗粒，而BJ则通过液体黏结剂将颗粒结合在一起[图2（b）]。相比之下，DED通过喷嘴将粉末材料沉积到基底上，并用激光源熔化颗粒[图2（d）]。光聚合系统主要包括VP和MJ，如图2（c）和（e）所示。这两种技术的打印机理都依赖于紫外线（UV）或光诱导的打印材料光聚合。不同之处在于，VP技术通过从光聚合材料槽中打印并提升物体，而MJ技术则通过喷头将光聚合材料喷射到构建平台上形成部件。最后一类实体型系统主要包括SL，此技术通过粘合片材形式的材料来形成物体[图2（f）]。

从打印材料的角度来看，不同的3D打印技术还可以根据构建单元的维度分为四种类型：点、线、面和体。各种打印技术的打印速度和分辨率概述如图3所示。随着构建单元维度（从点到体）的增加，打印速度通常会增加，但分辨率会降低，唯一的例外是数字光处理（DLP）和连续液态界面生产（CLIP），这两者均属于VP技术。通常，打印分辨率的顺序为光聚合 > 粉末 > 挤出 > 实体型系统，而打印速度则因具体的打印技术而异。

基于蚕丝材料的打印或生物打印（活体生物如细胞等与水性生物材料一同被打印）对于加工条件苛刻的技术（如PBF、DED和SL）并不适用。用于SF原型制作的主流打印技术包括ME、VP和MJ，这些技术在图3中用实心星标出，接下来的部分将重点讨论这些技术。VP技术具有最高的打印分辨率，是发展最快的打印技术。最近新兴的适用于打印SF的VP技术尚未被广泛研究，在图中用空心星标出，相关内容将在第7.1节中详细探讨。此外，值得注意的是，也有研究尝试直接使用蚕丝粉末作为BJ打印技术中的粉末基体（如图3中的笑脸标记）[25]。

作为3D打印中最关键的组成部分，生物墨水决定了所形成组织的结构和功能，通过提供一个稳定且生物兼容的微环境，促进细胞的增殖和分化。对于生物医学应用，理想的生物墨水需要具有优异的生物相容性，以保持细胞的活性和功能；良好的可打印性，以便通过3D打印形成支架；适当的机械强度，以保持3D打印结构的稳定；以及在移植过程中具备生物降解性。然而，由于海藻酸盐降解困难、聚乙二醇（PEG）的机械强度弱等各种问题，传统的墨水（包括海藻酸盐和合成高分子材料）无法使用。蚕丝因其优异的生物相容性、生物降解性、较小的炎症反应和可调的机械性能，在作为固体材料时展现了显著的开发潜力 [26‒27]。此外，由于蚕丝基生物墨水天生具有两亲性，它们可以通过调节墨水的流变性（通过改变pH值和离子强度）来制造皮升至纳升范围内的蛋白质滴。通过将脱胶的蚕丝溶解在一种解聚溶剂（如溴化锂）中，蚕丝纤维可以转变为液体，并重新固化成粉末、凝胶 [28‒30]、海绵 [31‒32]和薄膜 [33‒35]等各种再生产品，用于生物医学应用。由于这些独特的特性，蚕丝被认为是满足不同3D打印方法要求的合适候选材料。

3 蚕丝用作打印墨水

3.1 蚕丝结构

天然蚕丝由SF（一种结构性的纤维）和丝胶（一种黏附在茧上的类似胶状的涂层）组成。丝胶蛋白占蚕茧重量的19%~28%，它主要是亲水性的，并且可以通过脱胶去除，脱胶通常是将蚕茧在碱性水溶液中煮沸来进行的 [9]。脱胶对于蚕丝在生物医学应用中的使用至关重要，因为脱胶能够防止蚕丝的降解（如溶解），并且未脱胶的蚕丝会在体内引发免疫反应 [36]。

SF的结构由一条轻链（26 kDa）和一条重链（391 kDa）组成，二者通过轻链上的半胱氨酸-172残基和重链上的半胱氨酸-20残基之间的二硫键连接 [37‒38]。另外，一个25 kDa的糖蛋白P25也通过非共价键连接到这两条链上，帮助它们结合。轻链、重链和P25在天然纤维中的比例为6∶6∶1。重链由12个重复的晶体结构域和11个无定形结构域组成 [39]。它由大量的甘氨酸-X二肽重复单元构成，其中64%的重复单元中的X为丙氨酸，22%为丝氨酸，10%为酪氨酸，3%为缬氨酸，1.3%为苏氨酸 [40]。在疏水性结构域中，高度有序的氢键形成了反向平行的β-折叠，这些β-折叠进一步堆积成致密的β-折叠纳米晶体，据报道其尺寸范围在2.6 nm × 3.2 nm × 11.5 nm和21 nm × 6 nm × 2 nm之间 [40‒41]。相比之下，轻链则是相对弹性和亲水性的结构 [10,42]。

除了二级结构外，SF还可以形成不同的三级和四级结构，其中最常见的是Silk I、Silk II和Silk III [37]。Silk I是指随机卷曲和α-螺旋的排列，这是氨基酸之间弱的随机相互作用，通常是体积较大且极性的侧链之间的相互作用，也被称为无定形区域。在这种构象下，SF的重复β-折叠结构域不会强烈相互作用。Silk II是指SF自组装形成高度结晶的反向平行β-折叠纳米晶体或碎片，这些纳米晶体作为物理交联嵌入在无定形区域中。Silk III则是在气-水界面观察到的，它展现出三重螺旋结构 [43]。凭借其独特的蛋白质序列，SF能够进行复杂的分子内和分子间自组装 [9]。因此，蛋白质的二级结构和结晶结构域的取向受到环境和加工条件的强烈影响。例如，Silk I往往会因温度升高、脱水溶剂的存在和剪切力的作用而转变为Silk II [36]。这些结构特性赋予SF多种优异的性能，使其成为一种极具潜力的生物材料。

3.2 蚕丝打印墨水形式

在不同的蚕丝形式中，已有研究尝试将蚕丝颗粒、微/纳米纤维以及溶液应用于生物支架的3D打印，如表1所示。作为增强和功能化的部分，通过物理研磨和化学蚀刻制备的天然蚕丝颗粒和微/纳米纤维已被用于与壳聚糖 [44‒45]、黄原胶 [46]和聚己内酯（PCL）等基质材料结合的复合支架打印 [47]。大多数关于SF打印的研究使用再生SF溶液作为打印墨水，并采用不同的方法辅助成型，例如，通过诱导SF二级结构变化进行凝胶化、化学修饰、光聚合以及混合打印。根据三大主流打印技术的不同特点，本研究对详细的打印策略和机制进行了全面总结。此外，还提出了有前景的凝胶化和化学修饰方法作为新的成型方法（见第7.2节）。接下来的章节将介绍上述主要打印技术的打印机制、墨水要求以及蚕丝基墨水加工方法，同时讨论尚未被探索的有潜力的策略。

4 材料喷射

4.1 打印机理和墨水要求

MJ也被称为喷墨式3D打印，常被认为是一种简便、成本效益高且环保的增材制造方法 [48‒49]。通常，喷墨打印将通过压电或热力激活的墨滴从墨水盒中沉积到基材上，形成预设计的图案[图4（a）] [50‒51]。打印墨水通常具有较低的黏度，以确保墨水通过超细喷嘴后的良好沉积 [52]。由于其能够精确控制墨滴体积（可达到皮升级 [53‒54]）以及逐层打印的特性，MJ可以打印高分辨率的二维（2D）图案和具有良好精度的多功能3D结构 [50]。使用SF墨水的MJ打印通常停留在2D层面。

Z值通常用于评估MJ打印中的可打印性。Z值是奥内佐格数（Ohnesorge number，Oh）的倒数，计算公式如下所示[55]：

O h = η ρ γ a

（1）

Z = 1 O h

（2）

其中，η是墨水的黏度，ρ是墨水的密度，γ是表面张力，a表示喷嘴的半径。Z是一个无量纲数，用于预测稳定墨滴的形成。通常，当1 < Z < 10时，墨滴会稳定形成 [54]。如果Z < 1，墨水可能因高黏性力而堵塞喷嘴。然而，当Z值超过10时，可能会产生不希望出现的卫星墨滴。因此，墨滴的形成和稳定性取决于墨水黏度、密度、表面张力和喷嘴半径的动态调节。黏度与墨滴的稳定性相关，黏度过高可能导致喷嘴堵塞。

足够的表面张力对于蚕丝基墨水的MJ打印也至关重要，因为它可以保持喷嘴处的弯月面，防止喷嘴尖端沉入液体；通常在室温下，表面张力设置在0.04 ~ 0.07 N·m^-1范围内[54]。高表面张力会使墨滴更快地落下。此外，分辨率的限制主要取决于喷嘴的大小。墨滴之间的距离必须根据墨滴的大小进行调整，以产生连续的线条[50,56]。

4.2 蚕丝基MJ打印墨水

由于喷墨打印在喷嘴大小、墨滴数量、墨滴排列和打印温度方面的灵活性，MJ被认为是控制溶胶-凝胶反应的有效方法 [56]。SF具有水溶性好、生物相容性好、可控的晶体结构和降解性、多态性特征以及多功能化的优点，被视为MJ打印的优异生物墨水。表2 [50‒52,55‒62]总结了基于SF的MJ打印策略。使用甲醇来形成β-折叠结构是最常见的方法 [50‒52,55‒57]。例如，可以先打印一层SF墨水，然后沉积甲醇促进β-折叠结构的形成，从而促进打印反应。通过改变SF与甲醇的比例，可以调节SF的结晶度和表面性质[52,56‒57]。此外，SF墨水中常常混合一些功能性成分，如纳米颗粒、酶、抗生素、生长因子和抗体，以实现特定功能 [54,58]。Umar等[48] 将金纳米颗粒（AuNPs）引入SF/染料墨水中，观察到通过添加AuNPs可以稍微调节激光波长，以制造用于先进传感和诊断应用的生物材料光子芯片。除了作为打印墨水使用外，SF还可以作为薄膜形式的蛋白质基底 [49,58,63]。

2006年，Limem等[59]首次报道使用喷墨沉积在0.6%的SF溶液中成功地进行细胞图案化。该研究创造了分辨率为（111 ± 24） μm的细胞图案，并展示了该方法成功调控细胞功能。然而，甲醇的毒性可能会阻碍细胞的包埋和生长，这一问题可以通过化学修饰来解决[51]。Suntivich等[60]和Drachuk等[61]提出了一种方法，将聚赖氨酸和聚谷氨酸基团接枝到SF分子上，创造了阳离子和阴离子位点，并通过交替沉积形成稳定的化学键。结果显示，所制备的SF小室可以包埋大肠杆菌细胞，并将其打印成定制结构 [60]。另一种方法是将辣根过氧化物酶（HRP）和过氧化氢（H₂O₂）加入SF溶液中，形成酪氨酸残基之间的共价二酪氨酸键，并与SF部分交联以调节墨水黏度进行打印 [50]。此外，还存在混合墨水，其中SF与其他材料（如胶原蛋白和海藻酸盐）混合。在一些打印案例中，还需要冷冻干燥后处理，以保持打印结构并避免熔化 [50]。

图4展示了使用MJ技术制备的代表性SF打印结构。打印结构具有出色的细节，但通常仍停留在2D层面。Rider等 [52] 通过交替打印SF水溶液和甲醇，使用反应式喷墨打印方法制备了生物相容性薄膜。喷墨打印的SF薄膜与成纤维细胞的黏附和增殖，表明其具有良好的生物相容性。SF基墨水的另一个优点是可以使用水基工艺制备，从而能够将SF墨水与其他大分子（如抗体、糖类、脂质、核酸和功能聚合物）结合，提供了广泛的机会。这为打印功能性形式（如传感器和检测试剂的设计）提供了宝贵的途径。Tao等[54] 通过引入几种生物掺杂剂合成了一种功能性SF墨水[图4（b）]。他们通过改变SF多晶型并添加其他功能组分来调节墨水的机械和生化特性。研究人员还调节了SF水性光刻的打印参数，从而成功创建了灰度结构 [58]。如图4（c）所示，“SIMIT”图案的每个字母由具有不同晶格常数（Λ = 100、70和45 μm）的2D点阵组成，呈现出不同的色调。这种对图案几何形状、周期性和SF水性光刻功能的控制，为生物光子学提供了一个便捷的“打印到图案”平台。

5 材料挤出

5.1 打印机理和墨水要求

ME类别主要有两种打印方式：FFF 和 DIW。FFF打印机可能是最广泛使用的家用3D打印机。它采用热塑性塑料，通过熔融挤出打印方法进行打印。尽管有报道指出，经过特定加热和加压条件处理的再生蚕丝具有热塑性，但再生蚕丝在打印系统中的应用仍然具有挑战性 [64]。这种方法所需的高温也对SF构成挑战，因为SF在高温下可能会降解或氧化。然而，Vyas等[47] 使用粉碎的蚕丝颗粒作为填充材料，用于FFF打印PCL复合支架，结果表明，添加蚕丝后细胞反应良好，表明蚕丝有助于调节PCL的降解速率。

DIW是另一种基于挤出的打印方法，可以看作是FFF的类似方法。它能够使用各种流体，只要这些流体具有合适的流变学性质或者可以通过修改获得正确的性质。在DIW打印过程中，墨水被挤出并在指定区域内固化，物体被一层一层地打印，由细丝构成。该方法最早于1996年在美国桑迪亚国家实验室作为一种无模具制造技术开发 [65‒66]。由于可选择的材料范围广泛且操作简便，因此大多数蚕丝基打印研究使用这种方法。该方法不需要高温但依赖于打印墨水的流变性质。DIW墨水的最基本和最关键的流变性质包括以下几点：

（1）墨水能够顺利流出微米级喷嘴而不造成堵塞。

（2）对于大多数DIW墨水，剪切稀化是更为理想的性质，这意味着墨水在静态状态下表现为固态行为[储存模量（G′） > 损失模量（G″）]，在剪切作用下转变为流体行为（G″ > G′）。这种行为也表现为随着剪切速率增加，黏度下降。

（3）墨水在挤出后迅速固化是确保打印精度的关键。这个液态到固态的转变过程可以依赖于墨水的自恢复特性，使其在沉积后保持G′，或者可以通过外部因素诱导，例如通过凝固浴（如使用酒精诱导物理交联）或紫外线（如需要使用甲基丙烯酸化的SF）。

在典型的流动过程中，牛顿流体的剪切速率可以根据Mooney分析计算 [67]：

γ ˙ N = 4 Q π a 3

（3）

其中，

γ ˙ N

是牛顿流体的剪切速率，Q是体积流量（mm³·s^-1）。对于非牛顿流体，根据power-law模型 [68]，公式可以修正为：

γ ˙ = 3 n + 1 4 n γ ˙ N

（4）

其中，

γ ˙

是非牛顿流体的剪切速率，n是流动指数（非牛顿指数）。当 n = 1 时，流体为牛顿流体；当 n > 1 时，流体表现出剪切增稠（膨胀性）；当 n < 1 时，流体表现为剪切稀化（假塑性）。

打印墨水的假塑性行为可通过Herschel-Bulkley模型表示：

τ = τ b + K γ ˙ n

(5)

其中，τ是剪切应力，τ_b是屈服应力，K是稠度系数[69]。因此，为了引发墨水流动，喷嘴施加的剪切应力必须超过墨水的屈服应力。墨水流变性与打印要求之间的关系，使研究人员能够开发出适用于不同应用的蚕丝基DIW打印墨水，具体如图5所示。

剪切速率-黏度曲线常用于评估DIW打印墨水的流动性能。通常报告的表观黏度范围为10^-1~10³Pa·s，剪切速率为0.1 s^-1，确保墨水具备良好的打印性 [70]。在图5（a）~（d）中，所有蚕丝基打印墨水均表现出剪切稀化行为，其黏度值位于可打印范围内。Mu等[71] 观察到，纯SF溶液的黏度随浓度增加呈指数增长，主要原因是分子缠结的增多。SF墨水的特性研究揭示了与浓度相关的分子机制（如酪氨酸相互作用），这可能促进了SF的溶胶-凝胶转变。由SF和海藻酸盐组成的混合打印墨水也表现出显著的剪切稀化行为[图5（b）]。通过海藻酸盐的离子交联处理提高了用于DIW打印的墨水黏度 [72]。CareGum多功能墨水由SF、单宁酸（TA）、CaCl₂ 和还原型氧化石墨烯（rGO）组成，其黏度在剪切速率为100 s^-1下为 200~2000 Pa‧s^{[图5（c）]，相当于通过22号针头手动挤出时的剪切速率，为实际打印加工提供了指导[73]。SF墨水的黏度可以通过引入纳米填料来调整[图5（d）]。例如，在纯SF打印墨水中加入氧化细菌纤维素（OBC）纳米纤维后，黏度增加了约5倍 [74]。墨水的流变性能直接影响挤出时的凝胶化，因此对成功的挤出打印过程至关重要[图5（e）] [75]。}

振荡测试是挤出墨水流变学测量中常用的方法。如图5（f）所示，随着高浓度钾的加入，SF墨水的储能模量显著增加，这为选择有效的凝血剂及其工作浓度提供了支持性数据 [76]。为了模拟挤出过程，使用三步振荡时间扫描（包括初始状态、挤出过程和恢复阶段）来测量墨水的解构和恢复特性[图5（g）] [46]。图5（h）展示了用于评估线性黏弹性区域（LVER）的SF打印墨水的振幅扫描结果。在0.01%~1%的应变范围内，墨水表现出 G′明显大于G″，表明其具有凝胶状行为。在超出LVER范围后，墨水开始发生永久性变形，当G′和G″交叉时，墨水开始像液体一样流动 [77]。打印墨水的凝胶化动力学通过不同固化方法的复合黏度变化进行评估[图5（i）] [78]。除了上述的定性分析，最近的一项关于蚕丝/羟基磷灰石（HA）复合材料挤出打印的研究，通过将关键的线性和非线性黏弹性性能与打印几何结果相关联，提出了一种基于线性和非线性流变学测量的专用机器学习算法来估算墨水的可打印性 [79]。

5.2 蚕丝基ME打印墨水

ME是最常用的SF打印方法。与其他对墨水要求很高的打印方法不同，只要墨水流变性能调整到合适的范围内，ME能够挤出几乎任何流体。本文基于不同的墨水配方策略，综述了SF基挤出打印的研究。将SF挤出打印案例分为五大类：纯SF、化学修饰SF、SF混合物、SF颗粒/纤维复合材料以及SF混合颗粒/纤维复合材料。详细的墨水组成、交联类型和成型机制见表3 [71‒74,76,80‒103]。

由于其低黏度，纯SF溶液通常难以直接通过ME打印。仅有少数纯SF打印案例依赖于甲醇 [71,80] 或盐浴 [76]进行的原位诱导SF结构构象，或依赖悬浮打印方法 [81]。化学修饰方法可以为打印过程赋予某些功能性，如光交联特性 [82‒84]。SF混合物是挤出打印中最常用的策略，用于调节墨水流变性能或引入特定功能性。天然聚合物（如明胶 [85‒86]、胶原蛋白 [87‒88]和海藻酸盐 [72,89]）及合成聚合物（如PEG [90]）通常与SF混合用于挤出打印。还观察到纳米颗粒或纤维增强或功能化SF墨水。例如，OBC纳米纤维可提高SF凝胶打印精度 [74]。使用SF/HA墨水打印的生物支架表现出增强的骨再生性能[91]。SF混合颗粒/纤维复合材料是最后一类，充分利用了混合打印和颗粒增强的特点。

一些典型的ME打印形状如图6所示。Zheng等 [90] 报道了使用SF/PEG水凝胶作为3D打印的生物墨水用于组织工程[图6（a）]。通过将PEG与SF混合，诱导SF中β-折叠结构的形成，从而通过物理交联实现凝胶化和水不溶性。这些结果表明，SF/PEG水凝胶为细胞打印和功能提供了适宜的环境。Das等[78]开发了一种可生物打印、富含细胞的SF-明胶水凝胶[图6（b）]。通过使用蘑菇酪氨酸酶的酶促交联和超声波诱导的物理交联实现了生物墨水的凝胶化。从机制上讲，酪氨酸酶通过三步反应氧化SF和明胶中的酪氨酸残基。超声处理能够加速SF大分子的自组装，从而促进SF中β-折叠结构的形成。在该研究中，将人鼻下鼻甲组织衍生的间充质祖细胞包裹并用这种生物墨水打印，开辟了基于患者特定需求直接打印组织支架的新方向。

Zhong等 [98] 将SF与HPMC混合作为生物墨水，用于打印水凝胶以再生气管上皮组织[图6（c）]。研究表明，加入HPMC改变了β-折叠晶体结构的大小，并协同影响了凝胶行为，从而获得了具有良好机械性能的再生SF水凝胶。这是一种通过引入额外的聚合物来诱导SF的β-折叠结构形成水凝胶的优异方法。将其他天然聚合物引入生物墨水中可以降低打印过程中的温度要求，同时为细胞提供类似细胞外基质的支撑。例如，天然聚合物（如壳聚糖、明胶和海藻酸盐）已被证明在生理温度下能够进行溶胶-凝胶转化。然而，这些聚合物的机械性能较差，有时可以通过交联来提高打印结构的机械完整性。最近，有研究报道了通过盐浴凝固系统对高浓度SF溶液进行基于挤出的SF打印[图6（d）] [71]。该研究展示了出色的打印分辨率，并成功打印了高长宽比结构（如仅有一端支撑的悬臂结构）。

由于材料的多样性和原型设计方法的灵活性，ME仍存在一些显著的局限性。例如，打印分辨率通常较低，这取决于喷嘴的大小。此外，为了确保顺畅的挤出过程，需要在打印分辨率和喷嘴堵塞之间做出妥协。打印几何形状仍然局限于基本形状，因为复杂形状（尤其是带有悬垂部分的形状）对材料自支撑能力要求较高，而这对于诸如SF水凝胶等低模量材料来说难以实现。此外，由于打印层之间的黏附性较差，打印结构通常缺乏机械完整性。

6 槽式光聚合（VP）

6.1 打印机理和墨水要求

与MJ和ME不同的是，VP是一种光辅助打印技术，其中生物墨水被沉积在指定区域。大多数基于SF的VP打印研究使用DLP作为打印技术。作为一种基于投影的打印技术，DLP通过用2D像素化图案照射到可光固化树脂来打印零件。当一层树脂固化后，打印平台下降一定距离，并通过逐层固化材料重复该过程，直到生成一个固体的3D物体[104]。VP打印过程的固化动力学可能较为复杂，不过可以使用从Beer-Lambert公式改编的半经验方程来描述该固化过程 [105]：

C d = D p l n (E E c)

（6）

其中，

C d

为固化深度，

D p

为光穿透深度，E和E _c分别是照射剂量和临界能量。因此，固化深度

C d

由生物墨水的光学特性（

D p

和E _c）以及打印机设置的照射剂量E决定。生物墨水的光学特性直接受到墨水配方、聚合物浓度和光引发剂浓度的影响 [106]。要正确固化生物墨水，E必须超过E _c [107]。

对于商业树脂（如丙烯酸树脂），由于其高度交联的结构，强度通常不是显著问题。然而，对于生物树脂（如SF水凝胶），其在胶凝点的强度较低，因此提出了通过增加多余能量E _x来增强水凝胶材料的凝胶强度，并定义为：

E x = E c (D p C d) e x p C d D p - 1 - 1

（7）

多余能量E _x与E _c正相关，与C _d负相关。通常，对于VP打印，生物墨水由聚合物或单体、光引发剂以及光吸收剂/光抑制剂组成。聚合物、单体和光引发剂是光交联反应的主要成分，而光吸收剂与光引发剂竞争光子以衰减光线 [107]。光吸收剂通过减小自由基的迁移距离来降低结构渗漏效应，这在打印高纵横比的几何形状时尤其有用 [108‒109]。常见的光吸收剂包括合成或天然食用色素、无机颗粒和颜料。用于防晒霜的紫外线屏蔽剂也有可能用作光吸收剂。同时，一些紫外线吸收剂（如染料）可以赋予打印结构特定的功能特性，如可调表面润湿性和渗透性、机械性能调节、发光和力致变色特性 [110]。然而，这些因素尚未被专门研究[107]。因此，需要研究墨水配方以实现具有最佳分辨率和足够绿色部件强度的结构。

墨水黏度对VP打印过程至关重要，因为它会影响固化速度、固化深度、绿色部件强度、氧抑制效应以及单层打印后的剥离力。与ME相反，VP打印所需的黏度较低，理想范围为1~10 Pa·s [107]。这是因为较高的墨水黏度可能导致墨槽中出现气泡、剥离困难以及层间涂覆不充分。总结而言，VP打印的生物墨水需要满足以下要求：

（1）良好的光交联特性，包括快速交联速率和较高的交联强度；

（2）良好的流动性和低黏度，与挤出打印的要求相反；

（3）适当的固化动力学。

光固化和定型必须在平台动作之前完成。因此需仔细调整固化动力学，同时选择合适的光引发剂尤为重要 [109,111]。

流变学评估是开发可打印墨水以提高打印质量的先决条件。图7展示了SF基墨水的代表性光固化流变特性。Shin等[112]研究了含有黑色素纳米颗粒（SFM）的四臂聚乙二醇丙烯酸酯（PEG4A）前体溶液的流变特性，如图7（a）所示。光照射后，含SFM生物墨水的前驱溶液的G′迅速增加并达到稳定值，表明凝胶化过程非常迅速并在1 min内完成。Kim等[113]通过改变光引发剂和Sil-MA的含量来调整流变性能，如图7（b）和（c）所示。通过向SF溶液中加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，制备了基于SF的Sil-MA生物墨水。结果表明，固化动力学随着LAP和Sil-MA含量的增加而增强。随着紫外线固化时间的延长，Sil-MA水凝胶趋于变得更加坚硬，可能是由于形成了更稳定的疏水域。Ajiteru等[114] 将rGO与甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的SF共价结合制备了一种生物墨水（SGOB1）。如图7（d）所示，该生物墨水在紫外线照射4 s后完全聚合。此外，光流变学也被用来评估凝胶强度。如图7（f）所示，不同添加剂的Sil-MA的完全凝胶化时间得到了评估 [115]。总之，VP生物墨水在光固化反应前通常表现出良好的流动性能和低黏度。经光照射后，墨水能够快速交联并快速固化成具有较高模量的固体/凝胶状态。

6.2 基于SF的VP打印墨水

本研究根据墨水配方将基于SF的VP打印策略分为四大类：纯SF、SF混合物、Sil-MA和Sil-MA混合物（表4 [112‒124]）。另一个显著特点是所使用的光引发剂。基于SF的 VP打印主要使用三种光引发剂：核黄素、曙红Y和LAP。前两者属于光氧化反应，而LAP则是基于甲基丙烯酰基的自由基照射反应。SF光交联策略的更详细解释见已发表的综述论文[125]。

与其他打印方法相比，VP技术操作简单且更易上手。更重要的是，它在SF打印材料的打印精度和可靠性再现性方面表现优异，如图8所示。因此，大量研究致力于利用VP方法进行SF打印。SF分子中含有酪氨酸，其酚羟基在可见光条件下通过引发剂进行交联，形成二酪氨酸，从而构建交联网络。Shin等[117] 利用核黄素作为光酶引发剂，通过DLP 3D打印SF溶液制造了SF微针[图8（a）]。这种SF微针具有较高的强度，在约300 mN的压应力下未出现严重结构损坏。通过在SF墨水中添加明胶，他们通过DLP 3D打印获得了具有出色结构稳定性的水凝胶[119]。

在SF墨水中加入光敏聚合物是开发VP打印墨水的另一种方法。Kwak等[121] 使用含有PEG4A的SF作为DLP 3D打印的生物墨水[图8（b）]。研究表明，加入具有生物相容性的SF颗粒可增强SF水凝胶的机械性能，并提供弹性以生成人工皮肤。嵌入成纤维细胞的SF-PEG4A水凝胶生成的角质层比纯PEG4A水凝胶更厚。他们还将SF颗粒添加到GelMA中作为DLP 3D打印的生物墨水。结构内包裹的细胞表现出较高的代谢活性，表明SF-GelMA是一种生物相容性材料[120]。

尽管VP打印技术具有打印速度快、分辨率高、能够实现高度复杂结构以及无喷嘴生物相容性打印方法的优势，但其应用仍然有限，主要原因在于可应用的光敏材料种类较少。因此，需要开发具有可生物降解性、生物相容性、可打印性和机械稳定性的创新生物墨水。2019年，Kim等[113] 为DLP 3D生物打印合成了一种基于SF的生物墨水，专用于组织工程应用[图8（c）]。通过DLP制备的Sil-MA水凝胶表现出卓越的生物相容性以及机械和流变性能，这可能成为DLP打印在生物和临床应用中的优越生物墨水。

为了利用Sil-MA通过DLP 3D打印制造3D结构，Ajiteru等[114]使用甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的SF通过共价rGO，制备了一种可用于DLP打印的生物墨水[图8（d）]。这些水凝胶具有优异的机械、导电和神经再生特性。Ajiteru等[115] 还开发了一种磁性生物反应器系统和磁性水凝胶，通过单阶段DLP 3D打印技术用于肌肉祖细胞的分化。3D打印的磁性生物反应器系统为肌肉祖细胞进一步分化为丝磁性复合水凝胶提供了合适的3D环境。

7. 3 D打印SF的有前途的策略

7.1 技术方面

7.1.1 新兴的光聚合技术

尽管大多数基于蚕丝的打印研究依赖于挤出式打印方法，VP打印技术凭借其卓越的打印质量和速度，在生物医学领域展现了巨大的潜力。近年来，双光子/多光子聚合（2PP）和体积增材制造（VAM）等新兴的VP技术为这一领域带来了新的机遇。在各种VP技术中，立体光刻（SLA）技术最早是在20世纪80年代被开发出来[126]。如图9（a）所示，激光束从激光源发射，在构建平台上以点状方式固化一层光敏树脂。通过平台的移动，逐层固化后，整个对象从液态树脂中成型。根据打印机的配置，可以调整光源和树脂槽的相对位置 [127]。基于与SLA相似的机制，DLP通过投影机将紫外光投射到树脂表面，使整个树脂层同时固化[图9（b）]。与SLA的点状打印相比，DLP的层状打印特性具有更高的效率。在此基础上，最近开发了一种快速连续的打印方法——连续液态界面生产（CLIP）[128]。在传统的VP方法中，氧气抑制效应可能导致聚合不完全和表面黏性问题。通过在投影窗口和打印表面之间引入一层薄薄的液态树脂“死亡区”，解决了表面光洁度和打印速度的问题。

尽管VP打印技术不断发展，并且成为最精确的打印方法之一，前述VP技术的横向分辨率约为10~50 μm [129]。相比之下，2PP可以实现纳米级特征打印，具有大约100 nm的高横向分辨率 [130‒131]。由于波长为λ的光的双光子吸收仅在一个体积为λ³的紧聚焦体素区域内发生，2PP的聚合区域比传统光聚合更小[图9（c）] [132‒133]。此外，最近的一项研究开发了一种基于体积的打印方法，通过旋转照明系统同时打印对象内部的所有点[图9（d）]，实现了打印速度和表面光洁度的进一步飞跃。

3D打印是一个快速发展的领域，目标是在分辨率和速度方面实现最大化。近年来，VP技术从最早的SLA、2PP到DLP、CLIP，以及最新的VAM，各种技术不断涌现。然而，从打印材料的角度来看，VP打印技术对材料性能并没有显著影响。目前，DLP是打印SF基墨水的主流技术，如第6节所总结的。当更先进的技术应用于SF打印时，将有可能实现具有更高复杂性和功能性的SF基打印结构。

7.1.2 四维打印

四维（4D）打印是打印技术、设计方法和多学科智能材料快速发展的产物，自2013年概念化以来引起了各领域的广泛关注[134]。相比于3D打印，4D打印多了一个“时间”的维度，即3D打印的部件能够在暴露于外部刺激（如热、光、水、pH等）时随时间改变其形状、性能或功能[135]。因此，4D打印可以用于创造具有自愈、自折叠特性或可按需从一种形状转变为另一种形状的材料[136]。这些特性在自愈电池（用于事故恢复）以及具有形状记忆功能的生物支架等领域中具有重要意义[137]。目前，4D打印可以通过最常用的3D打印技术（如ME和VP）实现。其材料体系包括形状记忆聚合物、液晶弹性体和复合水凝胶等[135]。

然而，基于SF的4D打印研究仍处于起步阶段。在一项研究中，通过DLP打印制备了一种具有形状变化能力的Sil-MA水凝胶[138]。通过改变Sil-MA水凝胶的外部或内部属性，在生理条件下实现了形状变化。利用该技术还制备了一个仿气管组织结构，并通过体内实验验证了这种4D生物打印系统在生物医学应用中的潜在价值（如图10所示）。另一项研究则打印了一种卷须状结构，采用石墨烯纳米片改性的SF作为核心材料，聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯（PHBV）作为壳材料。通过两种材料的不同热膨胀系数以及热能向机械驱动的转换，实现了第四维度的运动[138]。随着这一初步研究的推进，SF材料独特的性能有望转化为“智能”或“活化”的4D打印对象，可用于多个领域的应用。除了上述形状变化结构之外，基于刺激响应的药物释放系统是4D打印SF材料的一个具有前景的应用方向。

7.2 材料方面

7.2.1 有前途的SF凝胶化方法

尽管基于SF的水凝胶取得了显著进展，但现有的SF凝胶化方法（包括超声处理、pH调节和有机溶剂的使用）仍存在明显局限性，如非生理条件、缺乏可逆交联及力学性能较弱等[139]。尤其是，网络中缺乏动态牺牲键用于在分子水平上高效耗散能量，这限制了体外实现高韧性的能力，大多数现有SF水凝胶表现出脆性行为。将动态能量耗散机制引入物理交联网络可能是增强再生SF水凝胶机械性能的有效策略。Shi等[14] 提出了一种基于动态金属-配体配位化学的策略，通过SF微纤维与多糖粘合剂在生理条件下组装形成SF水凝胶。所得SF水凝胶表现出优异的剪切稀化性和自愈合性能，从而能够填充不规则形状的组织缺陷而不会发生凝胶破裂。另一项研究中，Huang等[140] 通过将胆固醇或β-环糊精接枝到羧基化的SF上，利用主体-客体相互作用组装形成SF基水凝胶。与传统的SF水凝胶相比，该水凝胶在无需外部刺激的情况下表现出更高的机械强度、韧性及适宜的自愈合性能。这些研究结果表明，动态交联的SF水凝胶为新一代3D打印SF材料提供了巨大的潜力，有望实现更优异的力学性能及功能表现，为复杂组织修复和再生医学应用提供更理想的解决方案。

7.2.2 化学改性方法

近年来，SF化学的研究主要集中在理解天然SF的分子结构及其结构-性能关系，并开发将SF加工成功能材料的先进技术[141]。然而，关于SF化学修饰的研究仍较为有限，主要在于获得理性设计的物理化学和生物学特性。为了推动SF研究并扩展其在3D打印中的应用，开发能够精确修饰SF分子结构的化学工具以满足特定应用需求显得尤为重要。此外，制备具有精确结构、特定功能和高附加值的丝基精细化学品已在生物医学和化妆品领域引起了广泛兴趣并展现了巨大的潜力。从化学角度来看，SF是一种由氨基酸组成的生物聚合物，包括丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和精氨酸，含有多个反应性基团（羟基、羧基和氨基）。其中，丝氨酸（12.1%）和酪氨酸（5.3%）是最丰富的反应性基团，其余基团的含量则少于1% [142]。通过SF的反应性基团与其他分子的反应，可开发具有良好可打印性和机械性能的丝基材料，为3D打印提供新的可能性。近期，一项研究引入了酯化方法，通过在离子液体/二甲基甲酰胺均相溶液中使用琥珀酸酐对SF进行改性，成功实现了可控的SF羧基化，同时显著减少了蛋白质的降解 [143]。这一策略展现了将SF改造成用于3D打印的新型材料的潜力，为SF的高附加值功能化开发提供了新的方向。

8 结论与展望

蚕丝因其加工灵活性、机械完整性、细胞相容性、可控的生物降解性和免疫耐受性，在3D打印生物墨水的制备中引起了广泛关注。本文从ISO/ASTM 52900标准定义的主流3D打印技术出发，结合SF材料的化学和结构特性，讨论了其在各类打印技术中的适应性。重点分析了MJ、ME和VP这三种最常用的打印技术。通过对比三种技术的打印机制、墨水要求及SF打印结构的特点，可以发现以下结论：MJ打印技术可以实现高精度的2D结构，但打印结果通常需要附着于基底上。ME技术因其材料灵活性成为最广泛采用的方法，但其打印分辨率和形状保真度相对较低。VP技术则展示了制造高分辨率和复杂结构的潜力，但目前缺乏适用于VP工艺的蚕丝基打印材料。为了扩大基于蚕丝材料的应用范围，本文从技术和材料两个方面提出了原型设计的潜在策略，旨在实现高度精确和功能化的组织工程支架或设备。这些策略有望在仿生组织结构（如血管组织）、高精度生物医学设备（如微针）以及个性化医疗等领域中展现广泛的应用前景。

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