原花青素C1通过调节肠道菌群增强FOXO1信号和戊酸水平，保护炎症性肠病患者的黏膜屏障作用

工程（英文） ›› 2024, Vol. 42 ›› Issue (11) : 116 -128. DOI: 10.1016/j.eng.2023.10.016

研究论文

王希璠 ^a ,
王鹏杰 ^b ,
李依璇 ^b ,
郭慧媛 ^b ,
王然 ^b ,
刘思源 ^b ,
仇菊 ^b ,
王晓玉 ^b ,
郝彦玲 ^b ,
赵耘艺 ^b ,
廖海萍 ^b ,
Zhongju Zou ^c ,
Josephine Thinwa ^c ,
刘蓉 ^c

作者信息 +

Procyanidin C1 Modulates the Microbiome to Increase FOXO1 Signaling and Valeric Acid Levels to Protect the Mucosal Barrier in Inflammatory Bowel Disease

Xifan Wang ^a^,^# ,
Pengjie Wang ^b^,^# ,
Yixuan Li ^b^,^# ,
Huiyuan Guo ^b ,
Ran Wang ^b ,
Siyuan Liu ^b ,
Ju Qiu ^b ,
Xiaoyu Wang ^b ,
Yanling Hao ^b ,
Yunyi Zhao ^b ,
Haiping Liao ^b ,
Zhongju Zou ^c ,
Josephine Thinwa ^c ,
Rong Liu ^c^,^* ,

Author information +

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Received	Accepted	Published
2023-07-11	2023-10-25
Issue Date
2023-10-25

PDF (9564K)

摘要

炎症性肠病（IBD）是一类慢性肠道炎症疾病，主要包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。原花青素C1（PCC1）是一种从葡萄籽中提取的天然产物，具有明显的抗炎活性。本研究探讨了PCC1用于IBD治疗的潜在用途及其与宿主细胞和微生物相关的机制。利用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠IBD的经典模型，发现PCC1可以通过保护肠黏膜屏障，从而达到预防IBD的作用。PCC1预处理具有抗炎作用，并改善小鼠IBD模型的多种病理表型，其中包括减少体重减轻情况、降低疾病活动指数（DAI）和增加结肠长度，以及对黏膜屏障有明显保护（如屏障厚度和黏液溶解酶的活性）。自噬标记物微管相关蛋白1轻链3（LC3）结果显示，与非模型组小鼠相比，PCC1预处理组肠道上皮细胞中的LC3表达水平显著升高。PCC1改变了粪便菌群的组成，其中提高了Akkermansia muciniphila和Christensenella minuta的丰度。粪菌移植（FMT）实验结果表明，将PCC1处理过的动物的微生物组移植到PCC1未处理过的动物体内可提供保护作用。代谢谱分析结果表明，PCC1预处理组和FMT组的菌群衍生代谢物戊酸的水平都有所升高。同时，补充这种短链脂肪酸（SCFA）对IBD也起到很好的防治作用。最后，抑制剂实验证实了肠上皮杯状细胞中的FOXO1信号介导戊酸对黏液层的有益作用。综上，PCC1通过改变菌群产生抗炎作用和防治IBD。并且本研究证明了利用多种直接干预措施（如PCC1、FMT和补充戊酸）改善黏膜屏障损伤以治疗IBD的原理可行性。

Abstract

Inflammatory bowel disease (IBD) refers to a pair of prevalent conditions (Crohn’s disease and ulcerative colitis) distinguished by persistent inflammation of the large intestine. Procyanidin C1 (PCC1) is a naturally occurring substance derived from grape seeds that has demonstrated notable anti-inflammatory properties. This study examines the potential utility of PCC1 as a treatment for IBD and subsequently examines the host-cell- and microbiome-related mechanisms underlying the detected therapeutic benefits. Working with a classic dextran sodium sulfate (DSS)-induced mouse IBD model, we show that PCC1 protects the mucosal barrier and thereby confers strong protective effects against IBD. PCC1 pretreatment resulted in anti-inflammatory effects and protection against multiple pathological phenotypes in the IBD model mice, including reduced weight loss, lower disease activity index (DAI) totals, and enhanced colon size, as well as obviously beneficial effects on the mucosal barrier (e.g., barrier thickness and activity of mucus-degrading enzymes). We also analyzed the autophagy marker microtubule- associated protein1 light chain 3 (LC3) and found that the level of LC3 was significantly elevated in the intestinal epithelial cell samples of the PCC1-pretreatment group as compared with the non-model mice samples. PCC1 altered the fecal microbiome composition, which included elevating the abundance of Akkermansia muciniphila and Christensenella minuta. Fecal microbiome transplant (FMT) experiments showed that delivering a microbiome from PCC1-treated animals into PCC1-naïve animals conferred protection. Metabolic profiling revealed that both the PCC1-pretreatment and PCC1 FMT groups had elevated levels of the microbiota-derived metabolite valeric acid, and supplementation with this short-chain fatty acid (SCFA) also conferred strong protection against IBD. Finally, inhibitor experiments confirmed that the beneficial effects of valeric acid on the mucus layer are mediated by FOXO1 signaling in the goblet cells of the intestinal epithelium. Beyond showing that PCC1 confers anti-inflammatory effects and protection against IBD by altering the microbiome, our study demonstrates proof of principle for multiple straightforward interventions (PCC1, FMT, and valeric acid supplementation) for ameliorating mucosal barrier damage to treat IBD.

关键词

炎症性肠病 / 黏膜屏障 / 自噬

Key words

Inflammatory bowel disease / Mucosal Barrier / Autophagy

引用本文

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王希璠,王鹏杰,李依璇,郭慧媛,王然,刘思源,仇菊,王晓玉,郝彦玲,赵耘艺,廖海萍,Zhongju Zou,Josephine Thinwa,刘蓉. 原花青素C1通过调节肠道菌群增强FOXO1信号和戊酸水平，保护炎症性肠病患者的黏膜屏障作用[J]. 工程（英文）, 2024, 42(11): 116-128 DOI:10.1016/j.eng.2023.10.016

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1 引言

慢性肠道炎症又称炎症性肠病（IBD），包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，主要表现为对消化道的长期刺激[1]。这些疾病的典型症状是结肠中的杯状细胞数量减少和黏液合成减少[2]。位于肠上皮的杯状细胞是一种分泌黏液的特殊细胞，起润滑和保护肠道的作用[3]。肠黏膜屏障是一层黏性凝胶，由黏蛋白、水、脂质和离子组成[4]。黏蛋白（主要是MUC2）是构成黏膜屏障基质的结构成分[5]。肠黏膜屏障可防止有害微生物的黏附和入侵，以免损伤上皮[6]。同时，也为有益的肠道菌群的相互作用提供黏附位点和营养物质[7]。这些微生物群利用黏膜屏障作为生长的生态位，促进营养物质的消化和吸收，并调节免疫反应[8]。

用于临床治疗IBD的药物主要有抗生素、皮质类固醇和免疫抑制剂。尽管种类繁多，然而有一部分患者对标准疗法无法产生适当的反应，或因为长期用药而失去疗效且出现药物副作用[9]。因此，需要探索治疗IBD的新策略。粪菌移植（FMT）是将健康人粪便中的细菌和其他微生物转移到患者体内用作治疗。目前，粪菌移植作为一种治疗难治性IBD的方法，已显示出巨大的潜力。特别是对一般药物治疗无效的慢性IBD患者而言，FMT有望成为替代疗法[10]。

已有研究表明，给啮齿动物口服多酚类物质可以提高其粪便中黏蛋白的含量，表明这些化合物可以诱导菌群（或宿主组织）调节包括抗炎作用的黏膜屏障生理机能[11]。葡萄籽原花青素是一种常见的膳食多酚化合物，被认为是具有出色抗炎活性的天然产物[12]。研究结果表明，虽然小肠可以吸收特定的β型原花青素低聚物，但大部分低聚物会进入结肠，在微生物群作用下发酵[13‒14]。已有研究探究了原花青素及其类似物（包括原花青素[15]、原花青素A1 [16]和原花青素B2 [17]）治疗实验性结肠炎的效用。观察到的治疗效果分别归因于信号转导及转录激活因子3（STAT3）和核因子κB（NF-κB）通路，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/雷帕霉素靶标（mTOR）/p70S6K信号通路以及核因子E2相关因子2（Nrf2）和Wnt/β‐连环蛋白组合的信号通路。研究表明服用原花青素可抑制消化酶并改变菌群的组成[18]。原花青素C1（PCC1）是一种存在于葡萄和其他植物中的β型原花青素，在小鼠体内具有抗炎活性[19]。

本研究报告PCC1对葡聚糖硫酸纳（DSS）诱导的小鼠IBD经典模型具有治疗作用。在DSS诱导的小鼠IBD模型中，PCC1预处理既能产生抗炎作用，又能保护小鼠免受多种IBD病理表型的影响，包括减少体重下降、降低疾病活动指数（DAI）水平、增加结肠长度及防止黏膜屏障降解。16S测序结果表明，PCC1预处理改变了结肠的菌群组成，提高了Akkermansia muciniphila和Christensenella minuta的丰度。FMT处理的小鼠黏液层再次明显增厚，对IBD有预防效果。基于气相色谱‐质谱联用仪（GC‐MS）的代谢分析表明，PCC1预处理组和FMT组的微生物群衍生代谢物戊酸（VA）水平均有所升高，说明补充VA可有效预防IBD。补充VA与FOXO1抑制剂相结合的实验表明，VA通过肠上皮杯状细胞中的FOXO1信号转导来缓解IBD。最后，研究证实了PCC1（和后续的FMT）治疗以及VA补充是通过调节黏液层以治疗IBD的有效干预措施。

2 方法

2.1 动物实验

实验使用无特定病原体（SPF）级的8周龄雄性C57BL/6J小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠饲养在SPF屏障环境中，适应后开展实验，所有动物实验均按照中国农业大学动物保护委员会制定的指导进行。实验的主要目的是评估PCC1（纯度大于98%，购自美国Sigma-Aldrich公司）对结肠炎小鼠的保护作用。将小鼠分为三组：①对照组（CON）；②给小鼠喂含有2.5% DSS的无菌水以诱发结肠炎模型组（DSS-IBD）；③PCC1预处理IBD模型组（DSS-PCC1）。收集小鼠的新鲜粪便样本于1.5 mL Ep（美国Thermo Fisher Scientific公司）管中，用干冰快速冻存。随后在-80 ℃温度下保存，以便进行FMT实验。用四种非吸收性抗生素混合物（青霉素、新霉素、万古霉素和甲硝唑）给SPF小鼠灌胃，清除原始微生物群并为FMT实验做准备。小鼠在接受FMT治疗前要先接受7 d的抗生素组合治疗。第二天，使用解冻的粪便进行FMT实验：每只经过抗生素组合预处理的小鼠口腔灌胃200 μL的悬液。此外，每只小鼠的皮毛上都涂抹了100 μL悬浮液。对于补充短链脂肪酸（SCFA）实验，按照先前描述的方案[20]，在饮用水中加入VA和乙酸（AA）各200 mmol∙L^-1。FOXO1（AS1842856）购自美国 Selleck化学有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS）和Tubulin购自Sigma-Aldrich公司。

2.2 使用DAI评估DSS诱导的结肠炎模型

SPF级C57BL/6J小鼠给予含有2.5% DSS的无菌水，饮用6 d诱导建立DSS模型，并且每48 h更换一次DSS溶液，以保持其新鲜度。在诱导结肠炎期间，每天密切监测各种指标，包括进食量、体重、精神状态、粪便稠度和出血量，以跟踪疾病的进展情况。采用DAI评价方法评估小鼠结肠炎的进展情况，包含三个客观参数：①体重减量为原体重（第一天）和最后一天体重的差值与原体重之比（0分，无变化；1分，下降1%~5%；2分，下降5%~10%；3分，下降10%~15%；4分，下降>15%）；②腹泻情况（0分，大便正常；2分，大便稀烂；4分，大便呈水样）；③便血程度（0分，无血；2分，轻微出血；4分，大量出血）。DAI通过综合体重减量、腹泻情况和便血程度三个方面进行评分。

2.3 RNA纯化和cDNA制备

取适量小鼠结肠组织，在Trizol中均质后，加入氯仿提取出总RNA。RNA提取后使用cDNA Synthesis SuperMix试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）合成互补DNA（cDNA）。该试剂盒含有反转录酶、随机引物和dNTP，可促进cDNA的合成。使用等量的总RNA进行反应，以确保cDNA产量一致。得到的cDNA可用于后续各种实验，包括定量聚合酶链反应（qPCR）和基因表达筛选。

2.4 实时定量PCR

采用2×实时定量PCR扩增预混液（赛维尔生物科技公司），置于CFX Connect™荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad Laboratories公司）内进行反应。聚合酶链反应（PCR）循环条件如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s；65 ℃退火10 s；72 ℃延伸30 s；40个循环进行DNA扩增。反应体积为10μL，其中包括10 μmol∙L^-1引物和cDNA。通过CFX Manager软件（Bio-Rad Laboratories公司）收集数据。采用ΔΔCT法进行计算基因的相对表达量。该方法是将相关基因与内参基因（GAPDH）的循环阈值（CT）进行比较。通过熔融曲线分析对其进行评估以确保PCR引物的特异性。

2.5 组织病理学

取小鼠结肠浸泡在4%的多聚甲醛中固定，以保持组织的完整性。用30%、50%和70%的乙醇梯度脱水，每次30 min。将结肠包埋于2%的琼脂中，并保存在70%的乙醇中备用。随后进行石蜡包埋，并使用精密组织切片机将组织切成5 μm的切片。使用苏木精和伊红（H&E）染色后，通过显微镜观察小鼠结肠组织病理的变化。结肠组织的组织学评分是通过评估四个关键因素来确定的：炎症的规模和强度、隐窝损伤的范围以及受影响组织的比例。

2.6 阿尔辛蓝组织分析

采用改进的方法测量结肠黏液层的厚度。取结肠样本浸泡在卡诺固定液中固定3 h，随后用甲醇清洗。接着，将固定好的样品储存在甲醇中，备用。对结肠样本进行阿尔辛蓝（AB）染色观察黏液层，并使用全景相机对染色后的结肠样本进行扫描。每个样品选择两个或三个代表性区域的黏液层厚度使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）进行测量。

2.7 提取DNA和通过16S 核糖体RNA测序得到肠道微生物群落谱图

收集粪便样品并进行细菌DNA提取，评估PCC1干预对DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型肠道微生物的影响。对16S核糖体RNA（rRNA）基因的V3-V4可变区进行PCR扩增，在Illumina MiSeq平台（美国Illumina公司）上使用2 × 300 bp读数长度的双端测序对所得扩增子进行测序。在QIIME2平台（美国QIIME公司）上使用DADA2（美国GNU计划）插件对质控拼接之后的优化序列进行降噪处理，生成最小频率阈值为10的高质量扩增子序列变异（ASV），并将其保留用于下游分析。

2.8 非靶向代谢物

将采集小鼠粪便样本液氮冷冻后转移至-80 ℃条件下。测定SCFA浓度，首先将内容物与1 mL水一起加入2 mL EP管中并涡旋10 s。进一步将上清液涡旋并放置冰上超声10 min。经过4 ℃、10 000 r∙min^-1离心15 min后，将上清液移入一个新的2 mL进样小瓶中，采用GC-MS系统（GC2030‐QP2020，日本岛津科学仪器股份有限公司）HP-FFAP毛细管色谱柱（美国安捷伦科技公司）进行分析。

2.9 统计分析

研究评估alpha多样性指数和加权UniFrac距离，并研究16S rRNA基因测序数据中结构相似性的差异。采用单因素非参数差异检验分析方差的显著性。使用R语言“nlme”软件包，结合重复测量方差分析（ANOVA）对酶活性进行评估。R 4.2.0用于统计分析，所有数据以均值 ±标准误差（SEM）表示。首先采用单因素方差分析进行组间比较，如果组间差异有统计学意义，则进一步采用Tukey方法进行两两比较。统计显著性采用非配对t检验，*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001和****p < 0.0001表示显著性水平。任何低于这些界限的结果表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 PCC1预处理对IBD具有保护作用

本研究通过使用一种DSS诱导的小鼠IBD经典模型，即在2.5% DSS刺激6 d的基础上，研究了PCC1治疗IBD的潜在疗效[21]。本研究选择了预处理方法，在模型诱导前连续7 d给小鼠每天腹腔注射50 mg∙kg^-1的PCC1 [图1 （a）]。在诱导IBD模型第6天，在体重和DAI水平的表型评估中出现了预期差异，其中包括体重减轻、腹泻和便血等情况[22]。同时，实验结束后还比较了对照组和实验组小鼠的结肠长度[图1（b）~（d）]。小鼠IBD模型的体重明显降低[图1（b）；p < 0.0001]，DAI评分升高[图1（c）；p < 0.0001]，结肠长度缩短[图1（d）；p < 0.0001]。

建模结束后结果显示，与非模型控制组相比，DSS‐PCC1和DSS‐IBD两组小鼠的体重明显减轻。DSS-PCC1组的DAI评分明显低于非模型组小鼠[图1（c）]。对DSS处理后第6天解剖获得的小鼠结肠样本进行比对后发现，与DSS-IBD组和CON组相比，DSS‐PCC1组的结肠明显变长[图1（d）]。然而，DSS‐PCC1组和CON组的结肠长度没有明显差异[图1（d）]。模型诱导后第6天的组织病理学结果显示，DSS-IBD组小鼠表现出多种严重的结肠炎特征，然而这些特征在DSS-PCC1组中并不明显，包括肠上皮隐窝消失、炎症和溃疡[图1（e）]。

基于前人对小鼠DSS模型的研究，利用qPCR评估了结肠组织中失调基因的水平。例如，巨噬细胞已证实在IBD发病过程中会产生促炎细胞因子[23]。虽然诱导IBD模型会导致细胞因子干扰素‐γ（IFN‐γ）、肿瘤坏死因子‐α（TNF‐α）和白细胞介素‐6（IL‐6）表达水平升高，但PCC1的预处理显著降低了这三种促炎细胞因子的诱导程度[图1（f）]。这些结果共同表明，PCC1预处理对DSS诱导的小鼠IBD有保护作用。

3.2 PCC1预处理可防止黏膜屏障降解

人和小鼠的消化道都有一层黏膜屏障[24]。这层屏障由杯状细胞分泌，包括低聚物黏液凝胶形成蛋白MUC2，进而组织形成网状骨架[25]。以往对IBD患者[26‒27]和对DSS小鼠的有关研究都报道了黏膜屏障变薄的病理现象。此外，缺失MUC2的小鼠会自发发展为结肠炎，并且对DSS诱导也更敏感[28]。由于AB染色法可检测硫酸化和羧酸化的酸性黏多糖以及羧酸化的唾液黏蛋白分子[29]，因此，本研究采用AB染色法评估了PCC1预处理对黏膜屏障的潜在影响。与非模型组小鼠相比，PCC1预处理组小鼠的黏液层明显更厚[图2（a）]。此外，结肠组织样本提取物中的MUC2进行免疫印迹显示，PCC1预处理组的结肠中MUC2蛋白水平显著升高[图2（b）]。值得注意的是，PCC1预处理小鼠的黏液层厚度和MUC2蛋白水平与CON组均无差异[图2（b）]。

先前的研究[30]用酶促反应证明了多种酶在动态调节黏膜屏障的组成方面所起的作用，其中包括α‐岩藻糖苷酶和β‐N‐乙酰葡萄糖胺糖苷酶，它们能通过DSS识别成熟MUC2上的O‐聚糖分子位点。由于在DSS‐PCC1组观察到的黏膜层较厚，推断非模型小鼠的黏液降解酶活性最高。随后，对粪便提取物中β‐N‐乙酰葡萄糖胺糖苷酶和α-岩藻糖苷酶活性进行定量分析。结果显示，与PCC1预处理组相比，非模型小鼠的酶活性显著升高 [图2（c）]。

由于有研究[31]报道FOXO1可调节结肠杯状细胞分泌黏蛋白，本研究利用免疫印迹法评估肠上皮细胞中的FOXO1蛋白水平。结果发现，与非模型小鼠相比，PCC1预处理组的FOXO1表达水平明显更高[图2（d）]。同时，还分析了自噬标记物LC3的蛋白水平变化，结果与之前有关FOXO1在黏液分泌中功能的报道一致。与非模型小鼠样本相比，PCC1预处理组的肠上皮细胞样本LC3水平显著升高[图2（d）]。以上结果表明，减少黏液层降解有助于PCC1对DSS诱导的IBD发挥保护作用。

3.3 PCC1预处理改变了肠道菌群的组成

基于已有研究[32]报道原花青素会影响微生物组，我们对粪便微生物组进行了16S测序分析。PCC1预处理对各门细菌相对丰度的影响显示，与非模型小鼠样本相比，经过PCC1预处理后疣微菌（Verrucomicrobia）丰度急剧增加[图3（a）]。以往的一项临床研究[33]报道称，与健康人相比，IBD患者体内的疣微菌门数量减少了。对粪便菌群在纲水平进行分析时发现，与IBD模型小鼠和非模型小鼠相比，PCC1预处理小鼠粪便菌群中的疣微球菌纲（Verrucomicrobiae）、变形菌纲（Betaproteobacteria）和柔膜菌纲（Erysipelotrichia）的相对丰度更高[图3（b）]。在科水平上，PCC1预处理组的菌群中有较高丰度的梭菌科（Sutterellaceae）、疣微菌科（Verrucomicrobiaceae）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、韦荣球菌科（Rikenllaceae）和普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）[图3（c）]。并且，还发现PCC1预处理样本中的幽门螺杆菌数量的显著减少（已证明幽门螺杆菌会产生过量TNF‐α，从而促进结肠炎的发展[34]）和嗜黏蛋白阿克曼菌数量的显著增加[图3（d）和（e）]。

3.4 PCC1预处理小鼠的粪菌移植重现了对IBD的保护作用

FMT指把健康人粪便中的细菌和其他微生物转移到另一个人体内。这一技术在生物科学研究和临床医学中都越来越常见[35]。由此推断，如果在PCC1预处理的动物中观察到的保护作用是由菌群改变介导的，那么PCC1干预的健康供体小鼠在PCC1缺乏的受体小鼠建立DSS模型时，也能发挥一定的作用。因此，本研究将抗生素处理过的C57BL/6J小鼠作为受体，而口服PCC1（PCC1供体）或PBS（CON供体）的小鼠[图4（a）]则为供体。在FMT 7 d后，将两组受体小鼠给予2.5%的DSS无菌水，以诱导IBD模型。

与非模型组小鼠相比，FMT‐PCC1组小鼠的IBD症状明显较轻，包括体重减轻缓解[图4（b）]、DAI评分降低[图4（c）]和结肠变长[图4（d）]。H&E染色的的结肠组织病理学分析结果表明，FMT‐PCC1组小鼠的组织学评分明显下降[图4（e）]。对结肠组织的qPCR分析表明，与非模型鼠相比，FMT-PCC1组小鼠体内炎症标记物IL‐6、IL‐1β和TNF‐α的转录水平显著降低[图4（f）]。因此，可以证明早期观察到的PCC1预处理的保护作用确实是由肠道菌群介导的。

使用16S rRNA基因测序分析FMT 7 d后受体小鼠的菌群变化，发现与非模型组小鼠相比，FMT-PCC1组小鼠的微生物群组成发生了显著变化，这些变化在门、纲和科的分级水平上都可以观察到[图5（a）~（c）]。更具体地说，FMT‐PCC1组小鼠体内嗜黏蛋白-阿克曼氏菌（Akermansia maciniphila）、经黏液真杆菌（Blautia Producta）、小克里斯腾森氏菌（Christensenella minuta）、狄氏副拟杆菌（Parabacteroides distasonis）、噬糖厌氧产氢杆菌（Hydrogenoanaero blacterium）、肠杆菌（Enterorhabdus caecimuris）、多形粪球菌（Faecalicoccus pleomorphus）、肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus）和梭菌（Clostridium aldenense）相对丰度增加[图5（d）和（e）]。以上研究结果不仅证实PCC1诱导的菌群变化具有抗炎作用，还证明FMT是一种向未干预动物提供菌群保护的有效方法。

3.5 PCC1预处理小鼠的粪菌移植导致黏液层增厚

为了研究PCC1对结肠黏液层的影响，利用AB染色法评估黏膜厚度。研究结果表明，与非模型组小鼠相比，FMT-PCC1组小鼠的黏液层明显更厚[图6（a）]。与此结果相一致的是，MUC2蛋白表达水平升高[图6（b）]，以及FMT-PCC1组的α‐岩藻糖苷酶和β‐N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶活性显著降低[图6（c）]。

由于杯状细胞在产生黏液层的各种成分中起着至关重要的作用，因此本研究观察了FMT受体小鼠的结肠组织，以分析宿主细胞是否与黏液层增厚有关。先前的一项研究[36]发现，FOXO1基因敲除小鼠的黏液层变薄，杯状细胞分泌的黏蛋白减少；因此，值得注意的是，这与我们前期的研究结果一致：与非模型组小鼠相比，FMT‐PCC1组小鼠的FOXO1表达水平明显更高[图6（d）]。此外，还发现FMT‐PCC1组小鼠结肠上皮细胞中LC3表达水平显著升高，这说明PCC1对IBD治疗有效与自噬诱导有关。

3.6 PCC1干预通过FOXO1信号传导增加VA水平以防治IBD

采用非靶向GC-MS方法测定了PCC1预处理小鼠和DSS对照小鼠粪便样本中的代谢物，结果显示PCC1导致代谢物出现明显变化[图7（a）和（b）]。值得注意的是，与DSS对照组的粪便样本相比，PCC1预处理组检测到的VA水平显著增加，后续在一项针对性的定量分析中也证实了此结果[图7（c）]。此外，对FMT小鼠的粪便样本进行类似分析。结果表明，与非模型组小鼠相比，FMT-PCC1组小鼠的VA水平也同样显著增加[图7（c）]。因此，用DSS模型小鼠进行了补充VA的实验。在诱导DSS 7 d后，给小鼠补充了VA或AA [图7（d）]。AA治疗组作为对照组，然而在代谢物谱分析中，这种SCFA的含量没有发生变化。

与补充AA组相比，补充VA可显著增加结肠长度[图7（e）和（f）]、体重[图7（h）]、DAI [图7（i）]和肠道渗透性[图7（h）和（j）]。此外，补充VA后，促炎因子TNF‐α、IFN‐γ和IL‐6的表达水平也显著降低[图7（k）~（m）]。

最后，根据FOXO1在调节杯状细胞分泌黏蛋白方面的作用[31]，使用FOXO1抑制剂来评估杯状细胞和黏液层中VA防治效果的潜力。从结肠长度[图7（e）和（f）]、体重[图7（h）]、疾病活动指数[图7（i）]和肠道通透性[图7（j）]结果来看，在补充VA的同时使用FOXO1抑制剂完全消除了VA的作用，这表明FOXO1信号传导直接介导了VA对IBD的治疗作用。

4 讨论

在本项研究中，证明了一种葡萄籽原花青素化合物可通过防止黏液层降解，对DSS诱导的IBD起到防治作用。结果发现，PCC1干预富集了阿克曼氏菌，该菌因在黏液层中的生长繁殖并且保护宿主肠道细胞而得到认可，并能为宿主肠道细胞提供保护[37]。粪菌移植实验证实，PCC1引起的粪便微菌群的变化是起到防治IBD效果的主要原因。PCC1预处理组和FMT‐PCC1组小鼠的肠道菌群代谢物VA 的含量都有所升高，并且进一步补充VA可以预防IBD。通过使用小分子抑制剂进行补充实验，验证了VA的作用是通过宿主细胞中的FOXO1信号传导来实现的。早期的研究结果表明，FOXO1在杯状细胞分泌黏液的过程中起调节作用[31]。而且研究报道，FOXO1缺失小鼠表现出（其他表型除外）杯状细胞自噬缺陷和菌群失调的现象。因此，采用FOXO1抑制剂得出的结论直接揭示了FOXO1对黏液层的调节与PCC1的抗IBD作用有关。有趣的是，先前有一项研究将FOXO1缺失导致的菌群失调与下游菌群代谢物（包括SCFA）的失调联系在一起[31]。鉴于以下两点，这一发现尤其值得注意：一是本研究发现了VA（VA补充）的作用，二是一项临床研究报告称，IBD患者的VA水平低于健康对照组。另外，一项关于辐射损伤的研究表明，VA的增加可促进肠上皮的完整性，从而将一种下游代谢物与控制黏液分泌的细胞联系起来[38]。虽然分离实验相当复杂和困难，但有必要进一步深入了解杯状细胞中FOXO1信号如何通过改变黏液层的厚度、结构和（或）组成来促进共生细菌特定类群产生特定代谢物，进而促进上消化道细胞健康（图8）。

原花青素的抗炎特性在人类细胞和动物模型中已有广泛的研究[15‒16]。这些研究表明，原花青素通过各种信号通路发挥其作用，如NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇‐3‐激酶（PI3K）/Akt通路。葡萄籽中的一些化合物已被证明能与细胞表面受体（如Toll样受体4和嘌呤能受体P2X7）相互作用，从而调节免疫反应。本研究发现，PCC1预处理小鼠和FMT-PCC1小鼠的炎症标志物IL‐6、IL‐1β和TNF‐α表达水平都有所降低。而且，观察到的PCC1对结肠组织和菌群的影响可能是通过与宿主细胞的相互作用和（或）与微生物细胞的相互作用来介导的。同时FMT和VA补充实验证实了以上观点，即PCC1对IBD的多方面作用可归因于PCC1对任何直接作用的下游影响。还需进一步探究这种原花青素和其他原花青素化合物的抗炎作用最终将如何塑造宿主环境，以促进黏液层特性和粪便菌群组成，从而有利于肠道健康。

在PCC1预处理样本中观察到较高水平的嗜黏蛋白阿克曼菌非常有意义，因为以前的大量研究都将该物种与改善肠道屏障功能和保护宿主免受肠道炎症影响联系起来[39‒40]。这种菌的作用正如其拉丁名所述，该物种与黏蛋白接触，并在黏膜屏障中茁壮成长[41]。尽管阿克曼菌是一种黏蛋白降解菌，但阿克曼菌丰度的增加会产生正向反馈循环，并最终加强对宿主肠道细胞的保护[42]。此外，据报道，含有阿克曼菌的粪菌移植可增加黏液层厚度，从而促进黏液层的重建[43‒44]。因此，PCC1预处理可引起包括阿克曼氏菌在内的肠道菌群的改变，通过阻止黏液层降解防止DSS引起的IBD。在人类结肠中，小克里斯滕森氏菌的研究已被广泛报道，其相对丰度与体重指数低[45]的人群呈正相关。它已作为一种益生菌干预措施用于治疗肥胖症和包括IBD在内的多种代谢性疾病。给啮齿动物口服小克里斯滕森氏菌的研究表明，这种干预措施通过诱导免疫调节，缓解了结肠炎症（在某种情况下，结肠炎症病变程度降低了36%）[45]。

肠道菌群的改变常被认为与多种IBD干预措施所带来的治疗效果有关。除了多种天然产物[15]和类药物分子[17]影响菌群改变的研究之外，对特定炎症部位的靶向纳米药物的研究也发现了肠道菌群的持续改变[46]。这对于具体跟踪PCC1分子在口服给药后的转化具有重要意义，有助于确定宿主和微生物组生理学对治疗效果的贡献。研究PCC1如何使肠道中观察到的VA含量增加也很有意义。VA已被证实会影响微生物群落的组成和行为。这可能是由于产生VA的细菌（如梭状芽孢杆菌）富集，也可能是肠道细菌之间相互作用的结果。不管PCC1是如何诱导VA增加的，值得注意的是，这种增加在PCC1预处理小鼠和FMT小鼠中都很明显，而抑制FOXO1信号传导会阻止补充VA带来的有益作用。

大量的研究和试验表明，采用FMT方法治疗IBD患者取得了有效的治疗效果，包括对正处于疾病复发期以及希望维持缓解的患者的治疗。本研究的FMT实验结果显示，PCC1诱导的粪便微生物群变化是治疗小鼠IBD模型的关键因素。此外，FMT的结果为研究最初的PCC1预处理实验提供了更多证据，包括黏液层增厚、炎症减轻、自噬激活、FOXO1信号活性提高以及VA含量增加。因此，未来的FMT研究以及以PCC1（或其他原花青素）作为干预手段治疗IBD的研究，不仅应关注粪便微生物群本身，还应监测炎症标志物，并考虑测量自噬标志物和（或）分析粪便SCFA水平。

5 结论

葡萄籽原花青素化合物PCC1通过阻止黏液层降解，对DSS诱发的IBD起到保护作用。PCC1能富集定植在黏液层中的嗜黏蛋白阿克曼菌，并促进其更新。FMT实验表明，PCC1引起的粪便微生物群改变可以解释对IBD的改善。并且PCC1预处理组和PCC1预处理组的FMT动物的微生物群衍生代谢物VA水平都有所升高。最后，我们证明补充VA可以预防IBD，并且补充VA并抑制FOXO1信号传导的实验验证了VA对IBD的改善是通过这一途径实现的。

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