1 引言
光学显微镜的发明被广泛认为是科学史上的一个里程碑，极大地拓宽了人类对微观世界的认识[
1]。光学显微镜的起源可以追溯到17世纪70年代列文虎克发明的简易显微镜系统[
2]。经过长期的发展和改进，如今，光学显微镜已成为观察微观物体必不可少的强大工具，对生物学、材料科学和医学领域产生了深远影响[
3]。传统光学显微镜具有许多优点，如非侵入性成像、视野广阔、对工作环境要求低以及操作简便等。然而，由于光波的衍射效应，传统光学显微镜的成像分辨率被限制在“阿贝衍射极限”以上，该极限由Ernest Abbe于1873年提出[
4]。随后，为了适应不同的成像场景，其他的衍射极限定义，包括Rayleigh极限[
5]、Sparrow极限[
6]和Houston极限[
7]，也被纷纷提出[
8]（257~258页）。尽管这些不同的衍射极限定义存在细微差异，但它们都表明基于透镜的光学显微镜系统在成像能力上有一个下限，即无法分辨尺度小于大约光波长一半的物体。
近年来，随着对纳米尺度成像需求的不断增加，如微纳尺度生物成分的可视化、物理现象的揭示以及化学药物分析等，提升光学显微镜分辨率依然是一个备受关注的研究课题。研究人员从未停止克服光学衍射极限，以实现超分辨率光学成像的努力。迄今为止，已经有多种光学成像技术实现了超过光学衍射极限的成像分辨率[
9]。这些超分辨率光学显微成像技术大致可以分为两类：荧光超分辨显微镜和无标记超分辨显微镜[
10]。在过去的几十年中，荧光超分辨成像技术，包括光激活定位显微镜、随机光重构显微镜以及受激发射耗尽显微镜，在突破光学衍射极限方面取得了重大进展[
11‒
14]。由于在这一领域的开创性工作，三位科学家于2014年获得了诺贝尔化学奖。迄今为止，最先进的荧光超分辨显微镜技术，如MINSTED和MINFLUX，分辨率达到了大约1 nm [
15‒
17]。尽管荧光超分辨成像技术可以提供卓越的分辨率，但由于需要使用有毒的荧光染料和高功率的激光脉冲，它可能对样品产生负面影响。具体来说，荧光染料可能会改变生物样本的物理化学性质，从而导致成像结果无法准确反映样本的原始状态，而高功率激光脉冲有可能会烧灼损伤样品。此外，荧光显微镜无法应用于许多不可染色的无机样本，如硅和金属。为此，许多无标记的超分辨成像技术，例如，超透镜、超临界透镜、近场扫描显微镜、微圆柱透镜和微球透镜等也被相继开发出来[
18‒
19]。尽管这些技术的分辨率未能达到荧光超分辨显微镜的水平，但它们在许多基于荧光的技术不适用的领域中，如半导体芯片检测等，作为不可或缺的补充发挥着重要作用。
在这些无标记超分辨成像技术中，光学微球纳米显微镜因其实时成像以及经济高效的特点而受到广泛关注，是一种非常有竞争力的纳米成像方案[
20‒
21]。如
图1 [
22‒
23]所示，微球纳米显微镜利用虚像或实像放大的成像原理，可以生成样本表面纳米结构的放大图像，该图像会被位于微球上方的传统光学显微镜采集并被进一步放大。得益于双级放大机制，最终该装置可以对特征尺寸超出光学衍射极限的纳米结构进行成像。迄今，光学微球纳米成像领域已经取得了显著的进展。这些进展包括研究其纳米成像的基本原理、使用不同的浸没介质、改变微球的材料和几何形状、实现微球透镜的移动、开发等离子体增强衬底、将微球与不同的传统显微镜（如荧光显微镜、共聚焦显微镜和干涉显微镜）结合使用、组装微球复合透镜以及扩展其应用领域等。之前，也有一些优秀的综述论文对这个领域的发展进行了回顾[
24‒
27]。
考虑到微球纳米成像技术的持续提升，本文介绍了该领域的一些最新动向。此外，如
图1所示，我们将微球纳米显微镜的发展分为两个广泛的类别，即系统层面和微球透镜层面的发展，旨在从另一个角度审视该领域近些年的突破。其中，系统层面的发展涵盖了微球纳米显微镜系统中所有组件的改进，但不包括微球透镜本身。这些组件的典型例子包括照明光源、浸没介质、样本衬底、微球支架以及与微球搭配的显微镜类型。透镜层面的发展主要关注针对微球透镜本身的直接改良，例如，定制微球透镜的材料组分和几何形状，以及使用微球复合透镜而非单个微球进行成像。我们认为微球透镜是微球纳米显微镜的灵魂，因此值得更多的关注。为了突出微球透镜层面的发展，本文将微球透镜相关的改进与系统层面的发展分开讨论，这也是本文与其他综述论文的区别所在。我们希望为研究人员提供一个新的视角来审视该领域的发展，并产生不一样的启发。
本文的内容组织如下：在第二部分，我们概述了微球纳米显微镜的基本成像原理，讨论了微球纳米显微镜在系统层面的发展。系统层面的发展包括使用等离子体增强衬底、微球透镜的移动操控、使用液体/固体浸没以及将微球与不同类型的显微镜搭配使用。本节还讨论了微球纳米显微镜当前的一些应用。第三部分和第四部分介绍了微球纳米显微镜在透镜层面的发展，包括微球复合透镜和工程化微球。具体来说，第三部分总结了组装微球复合透镜的不同方法，并讨论了微球复合透镜在纳米成像中相较于单个微球的优势。在第四部分，我们介绍了多种工程化微球，详细说明了采用的工程制备方法以及这些微球透镜成像能力的提升。在第五部分，我们分析了微球纳米成像领域面临的挑战和发展前景。第六部分是对光学微球纳米成像领域的一个总结。
2 单微球纳米成像的进展
在本节中，我们首先介绍了微球的纳米成像能力的发现历程。通过一些典型的实验结果展示光学微球纳米成像的关键特性，并进一步讨论其超分辨成像机制。随后，我们对微球透镜的移动操控技术进行了介绍，并概述了改进单微球纳米成像能力的技术方法。最后，我们介绍了光学微球纳米显微镜的目标应用场景以及该技术的产业化进展。
2.1 微球纳米成像特性的发现
光与微纳尺度的颗粒之间的相互作用在很久之前就已经可以通过瑞利散射和米氏散射理论进行全面的解析。然而，直至2000年，微球对光波独特的调制能力才在实验中被发现[
28‒
30]。在那个年代，半导体产业蓬勃发展，这也带动了相关技术和产业的兴起。在硅芯片的制造过程中，晶圆清洗是一个关键步骤，研究人员开始引入新兴的激光清洗技术来完成这一任务。大量实验致力于利用强激光脉冲去除硅晶圆上的微/纳米颗粒。然而，这种技术在去除颗粒的同时往往会对晶圆造成不良影响，清洗后会留下大量微/纳米孔洞。研究人员发现一些生成的孔洞具有超出光学衍射极限的特征尺寸，这激发了广泛的研究兴趣[
31]。科学家进行了大量的理论和实验研究，以揭示这一现象的物理机制。最终，利用米氏散射理论计算出的球形微/纳米颗粒的散射光场被认为能够完美地解释这一现象[
26,
32]。研究发现，球形颗粒的散射场会随着其折射率和尺寸参数
的变化而变化，其中，
R、
和
分别是球形颗粒的半径、环境的折射率和光的波长。当
R <<
时，球形颗粒的散射光场与电偶极子辐射的光场非常相似，这与瑞利散射理论一致。随着尺寸参数的增加，散射光场的分布逐渐从前后对称的模式转变为具有极高光强度的非对称喷射状模式。当颗粒直径小至几微米时，这种光学纳米射流的半高全宽（FWHM）非常接近光学衍射极限。同时，光学纳米射流中的最大光功率密度相比入射光功率密度增强了10~100倍。这种光场增强效应，加上硅材料的烧蚀阈值效应，导致了具有超出光学衍射极限特征尺寸的孔洞的形成[
33]。
受到球形微/纳米颗粒这种异乎寻常的聚光能力的启发，基于光的互异性原理，研究人员推测这些颗粒也可以用来对纳米级物体进行放大成像。该假设于2011年得到Wang等[
21]的实验验证。在他们的实验中，研究人员将直径为2~9 μm的二氧化硅微球放置在成像样本上并且一起移动到普通的白光光学显微镜下，如
图2（a）所示[
21]。他们发现，特征尺寸超出常规光学显微镜分辨能力的图案在二氧化硅微球的帮助下可以被分辨出来。如
图2（b）所示，阳极氧化铝（AAO）样本中大约50 nm的孔洞在白光照明下也可以被该光学微球纳米显微镜成功地分辨，这证明了光学微球纳米显微镜卓越的纳米成像能力。微球纳米成像过程可以粗略地用透镜的虚像放大原理来描述。如
图2（c）所示，位于物体表面的微球能够生成纳米结构的放大虚像[
34]。如果经过微球放大后的纳米结构图像的尺寸在常规显微镜的物镜分辨率范围内，则整个系统可以分辨这些纳米结构。由于微球卓越的纳米成像和放大能力，常规光学显微镜平台的成像分辨率可以提升数倍。
然而，虚像放大原理仅是一种现象学阐释，无法从根本上说明与常规光学显微镜的物镜相比，微球是如何能够放大纳米图像而引起较弱的图像模糊。为探究微球超分辨成像能力的底层物理原理，人们进行了许多实验和理论研究[
35‒
40]。实验结果表明存在两个显著影响微球成像分辨率的因素，即微球的大小和成像样品的类型。一方面，微球的成像分辨率在很大程度上依赖于其几何尺寸。根据实验观察和光学仿真，直径为4~10 μm的微球具有最佳的成像分辨率[
35,
41]。巧合的是，微球的放大倍数（可能间接影响成像分辨率）也随其直径而变化。如
图2（d）所示，直径为4~10 μm的微球的放大倍数大于直径更大的微球。
另一方面，当样本的材料或结构发生变化时，成像分辨率和放大倍数也会有所不同。Wang等[
21]证明，AAO样本上沉积一层金可以同时增强成像分辨率和增加放大倍数。同一个微球，对于光栅样品，其放大倍数约为4倍，而对于AAO样品，其放大倍数则增加至约8倍。Shi等[
42]报道称，直径为250 nm的低对比度六方密排聚苯乙烯纳米颗粒样品仅在涂覆一层30 nm银（Ag）薄膜后才能被区分。裸露的聚苯乙烯纳米颗粒阵列无法被微球纳米显微镜分辨。Cao等[
43]发现，银纳米结构的分辨率高于金和铬制成的纳米结构。金属样本中分辨率的增强可能归因于局部表面等离子体共振增强效应。由支持表面等离子体共振的材料或结构制成的样本可以增强表面倏逝波的形成，这些倏逝波可携带精细结构信息，从而提高成像分辨率[
44]。然而，在样本表面沉积金属薄膜可能会改变样品的原始特性。特别是，这种分辨率增强方法不适用于生物样品。为了避免这些限制，研究人员发现将样本放置在能够支持和增强表面等离子体共振的基底上，可以实现类似的分辨率增强效果。Yang等[
45]比较了组装在普通玻璃载体、涂覆银薄膜的玻璃载体和涂覆高反射介电薄膜的玻璃载体上的250 nm聚苯乙烯纳米颗粒阵列的成像结果。他们发现，聚苯乙烯纳米颗粒阵列只有在涂覆银薄膜的衬底上才能被30 μm钛酸钡玻璃（BTG）微球所分辨。他们将这归因于近场照明下表面等离子体极化模式的激发。随后，Pei等[
36]发现，如果将这些纳米颗粒组装在具有多层金属/介电涂层结构的蓝光光盘衬底上，如
图2（e）所示，成像对比度可以得到进一步提高。这种衬底中的纳米结构可以增强衬底和样本相邻区域的局部电场，进而提高成像对比度。Brettin等[
22]证明，使用周期为80 nm和100 nm的金纳米盘阵列作为样本衬底，微球对荧光样本的成像分辨率可以提高到
/7。这种分辨率增强现象是由荧光辐射场与等离子体超材料的局域光场模式之间的耦合形成的，而不是基于等离子体结构照明的原理。以上这些利用纳米等离子体衬底来增强成像分辨率的案例可能涉及不同的物理过程，但共通之处是它们都利用了表面等离子体共振效应来增强携带精细结构信息的倏逝波。
2.2 微球纳米成像的物理机制
根据以上这些实验观察，研究人员提出了许多假说来解释微球纳米成像的物理机制，包括表面倏逝波和传输波的转化[
46‒
47]、超越衍射极限的聚焦能力和超分辨成像的互易性[
35]、共振模增强[
48]、虚像放大的波动理论[
49]以及数值孔径（NA）的局部增强[
50]等。接下来，我们将简要概述这些理论的基本原理，并评估它们在解释光学微球纳米成像机制方面的合理性和不足之处。
微球能够将近场倏逝波转化为传输波的假说是在微球纳米成像的实验发现不久后提出的[
51‒
52]。倏逝波转换理论之前已被成功应用于阐明近场扫描光学显微镜技术的超分辨成像机制，因此也被视为微球纳米成像能力的潜在理论解释之一。Hao等[
52]根据角谱理论提出，当光照射具有亚波长结构的物体表面时，在近场区域会自然地产生倏逝波。随后，样本的粗糙表面会散射倏逝波。微球则可以和倏逝波相互作用，将其解耦并转化为传输波。为实现这种转换，他们对微球与样本表面之间的距离以及微球的视场需要满足的条件进行了理论计算。随后，Ben-Aryeh [
46,
53]等开发了一个更为定量的模型，该模型描述了倏逝波在微球边界的折射以及基于斯涅尔定律的倏逝波与传播波之间转换的条件。波动光学仿真表明，微球可以有效地折射倏逝波并将其投射到远场[
27]。此外，一些实验结果也支持这个假说[
54]。例如，利用金属样本或纳米等离子体衬底来提高微球成像分辨率的原理常被解释为由于表面等离子体共振效应增强了倏逝波进而提高了分辨率。由于倏逝波与成像分辨率之间存在着紧密的联系，因此，可以合理地假设微球能够将表面倏逝波转化为传输波，从而获得包含更多细节的图像。然而，这一理论存在三个不足之处：首先，该理论主要停留在定性分析阶段，缺乏一个全面的模型来定量地描述样本上倏逝波的激发、倏逝波的空间频率分布、不同空间频率的转换效率，以及在远场中不同空间频率的重构过程；其次，该理论无法解释微球在不支持强的倏逝波的样本上的超分辨成像能力，如对硅衬底上的纳米图案和生物样本的成像；再次，一些文献报道，微球可以在较长的工作距离上实现超分辨成像[
55]。在这样的距离下，倏逝波的强度将显著衰减，几乎可以忽略不计。因此，基于倏逝波转换理论的当前物理模型仍然不足以彻底地解释微球纳米成像能力。
另一个广泛用于解释微球纳米成像能力的理论是聚焦与成像之间的互易关系。在这一理论中，微球的成像分辨率与微球聚焦产生的光子纳米射流的束腰半径直接相关。许多实验研究通过对光子纳米射流进行模拟来解释它们的实验结果[
56‒
58]。然而，根据实验数据，微球的成像分辨率并不等同于光子纳米射流的束腰半径，前者通常远小于后者。Maslov和Astratov [
41]理论上证明，由点扩散函数定义的标准成像分辨率无法从纳米射流的聚焦特性中推导出来。因此，虚像成像特性与光子纳米射流之间仅存在一定的相关性，而不是成比例关系[
59]。此外，有人提出微球的超分辨成像可以归因于微球对光场聚焦形成的高度局域化照明[
27]。值得注意的是，大多数微球纳米成像实验是在具有低相干性的光发射二极管照明下进行的。当使用这种光源时，并不存在光子纳米射流或其他由微球聚焦产生的局域照明光斑。相反，在微球正下方的平面上存在相对均匀的光场分布，如
图2（f）左侧所示，这才是微球虚像成像的实际照明条件[
37]。事实上，如
图2（f）右侧所示的光子纳米射流是在激光照明条件下才形成的。光子纳米射流相关的理论推导也是在单色平面波入射条件下进行的。考虑到激光照明的要求，光子纳米射流的极小聚焦光斑更适合用于改进共聚焦激光扫描显微镜的性能，这一点已有文献报道[
60]。因此，微球虚像成像的卓越分辨率与微球聚焦光场的照明无关。虚像成像的分辨率与光子纳米射流的束腰半径并不相等，且没有直接的数值关系。
此外，微球中的回音壁模式或者超共振效应的激发也被认为是实现超分辨成像的可能原因之一。然而，理论计算表明，回音壁模式的激发只能略微提升成像分辨率，并且增强效果随着激发的模式不同而存在差异[
48,
61]。基于这一机制，微球在白光照明下无法实现亚100 nm分辨率。此外，大多数用于纳米成像实验的微球的表面并不光滑，而是存在许多缺陷，从而抑制了微球中回音壁模式的激发。大多数情况下，微球的尺寸也未针对特定照明波长下的回音壁模式进行特殊设计以实现纳米成像。另一种基于光学共振解释微球纳米成像能力的理论是超共振效应。这种效应是微球内部部分波的相长干涉所导致的，它能够产生巨大的光场增强[
40,
62]。理论证明，超共振效应可以提升微球将倏逝波转换为远场传输波的效率，从而提高成像分辨率[
40]。然而，超共振效应仅在特定的米氏共振
q参数下发生，对照明光的波长和微球的工作环境有严格要求[
62]。这些条件通常无法在微球纳米成像实验中满足。因此，微球中的回音壁模式或其他光学共振态的激发可能会增强成像分辨率[
63]，但它们并不是支撑微球超分辨成像能力的根本因素。
虚像成像的波动理论也被用于描述微球的成像过程[
49,
64‒
65]。该理论首先通过施加微球的表面边界条件来直接求解麦克斯韦方程，从而获得微球的散射光场。然后，虚像图片可以基于散射光场构建虚拟汇聚波来重建。这个计算过程中既可以采用基尔霍夫-亥姆霍兹定理，也可以使用等效的傅里叶变换公式。基于这个理论，Bekirov等[
49]证明宽度为
/6、间距为
/6的两条狭缝的虚像可以被微球分辨。然而，此计算中忽略了微球下方样品衬底的影响。
最近，Pahl等[
50]利用完整的仿真模型研究了微球辅助干涉显微镜的成像过程，该模型考虑了实际的三维锥形科勒照明、物镜的作用以及微球和样品中的光散射。仿真对微球在非共振和共振波长处都进行了模拟，结果显示两种情形下的成像分辨率的差异可以忽略不计。由于使用了特殊的正弦相位光栅作为成像样品，仿真中倏逝波的影响几乎可以忽略不计。在排除回音壁模式激发和倏逝波的影响后，研究人员得出结论，紧邻样品表面的微球可以增加整个系统的局部有效NA，这是支撑微球超分辨成像能力的关键因素。尽管这项研究是针对微球辅助干涉显微镜进行的，但其结果也可能扩展到常规的微球纳米显微镜[
66]。利用这一仿真方法对微球纳米显微镜的直接分析，有望进一步深化对纳米成像机制的理解。
总而言之，微球超分辨成像能力背后的物理机制至今仍然存在争议。上述所有因素，可能在特定情况下都对微球的超分辨成像能力有所贡献。也有可能这些因素的协同效应导致了微球非同寻常的成像分辨率。因此，这一领域仍然值得进一步探究。
2.3 成像分辨率的量化分析
考虑到微球纳米成像机制的复杂性，目前微球还没有被广泛接受的理论成像分辨率极限。在这种情况下，根据实验结果定量分析特定微球纳米显微镜的分辨率至关重要。在许多关于微球纳米成像领域的论文中，分辨率是通过样本中可以分辨的最小特征的尺寸来量化的。典型的例子包括AAO中的纳米孔大小、蓝光光盘的线宽、荧光纳米颗粒的直径，以及两个纳米结构的边缘间距[
21,
23,
34,
67]。然而，使用特征尺寸作为标准量化的分辨率值分布范围非常广，从
/6到
/17，这可以从Maslov和Astratov [
41]统计的以往文献报道的分辨率表格中直观地看到。这种方式评估出来的分辨率值通常都是夸大的。研究表明，当使用两个纳米结构的边缘间隔来估计分辨率时，可能出现5倍的夸大[
24]。
为了稳健地进行成像分辨率的定量分析，研究人员提出了两种方法：使用标准的分辨率校准样品和通过反卷积方法计算微球纳米显微镜的点扩散函数[
26,
68]。第一种方法非常简单，已广泛用于评估各种光学成像系统的分辨率。第二种方法基于Houston分辨率标准，它将点扩散函数（PSF）的半高全宽（FWHM）视为成像分辨率。微球纳米显微镜的点扩散函数是基于反卷积从实验结果中计算得出的。在微球纳米成像领域中进行反卷积的典型方法是函数拟合[
68]。具体来说，图像是物体函数与成像系统的点扩展函数的卷积。如果物体函数和图像函数已知，则可以通过拟合来计算点扩展函数。首先，我们可以选择一个包含未知参数的点扩展函数，比如一个具有未知半高全宽的二维高斯函数。然后，通过优化未知参数，使得物体函数和点扩展函数的卷积与图像函数最相似。需要注意的是，非相干和相干成像方法具有不同的卷积公式，应根据具体情况进行选择。一旦确定了点扩展函数，就可以通过其半高全宽来估算系统成像分辨率。过去已有一些工作利用该方法来量化微球的成像分辨率[
35,
69‒
71]。例如，Allen等[
68]利用具有15 nm间隙的领结型样品来量化成像分辨率，并得出该情况下微球纳米显微镜的分辨率为
/5.5。Darafsheh等[
69]报道，将微球与共焦显微镜搭配使用时，其量化的成像分辨率约为
/6。Wang等[
72]报道，在水中浸泡的BTG微球的成像分辨率大约为
/6.4~
/8.3。可以看出，通过反卷积方法估算的成像分辨率大多在
/6~
/8的范围内。这种方法量化的成像分辨率比通过最小特征尺寸估算的结果更合理且更可靠。关于量化评估微球成像分辨率的更多讨论，可以在文献[
24]中找到。
2.4 微球的移动
尽管微球的超分辨成像机制仍存在争议，但这并不改变微球具有卓越纳米成像能力且可用于很多实际场合的事实。在过去十多年中，研究人员为提升光学微球纳米显微镜的综合成像性能做出了大量的努力。其中，对操控微球移动的技术的开发至关重要，它显著提高了该纳米成像技术的通用性。
在光学微球纳米显微镜发展的早期阶段，微球是直接沉积在样品表面进行成像的。这种使用方法存在许多问题，例如，无法对样品上感兴趣的区域任意地成像以及可能污染或者损伤样品表面。由于微球无法在样品表面移动，此方法只适用于观察某些周期性样品，如蓝光光盘、AAO或纳米颗粒阵列，这些样品经常出现在早期报道的实验结果中。因此，这种微球成像方案并不实用，迫切需要采取额外措施使得微球可以在样品表面上进行随意的移动和成像。
为了实现微球的移动，研究人员提出了多种方法来精确地操控微球。其中最简单的方法是将微球固定在一些具有尖端的机械部件上，如原子力显微镜悬臂、移液器或手术针的尖端[
72‒
75]。如
图3（a）所示，微球通过光学胶被固定在原子力显微镜悬臂的针尖上。这种微球操控方法与原子力显微镜的扫描系统具有良好的兼容性，从而可以轻易地通过扫描获取面积很大的样品的图像。相比之下，手术针或移液器是一种经济适用的选项，然而它们需要额外的工序将机械支架连接到三轴位移台上以进行微球的运动控制。为避免使用额外的位移台，研究人员还提出了可直接安装在物镜上的特殊支架设计[
76]。例如，Huszka等[
77]设计了一种金属框架，在框架中间有一个圆形开口，并在上面黏附了一块盖玻片。该金属框架可安装在物镜适配器上，并通过四根金属杆和物镜相连接。微球由一层薄薄的光学胶固定在盖玻片的底面上。微球与物镜之间的距离可以通过移动四根金属杆上的滑块来调节。当微球的高度合适时，微球就能够对样品上任意感兴趣的位置进行聚焦和成像。Chen等[
34]设计了一种类似的适配器来连接微球和物镜，如
图3（b）所示。在他们的设计中，微球与物镜之间的相对距离通过步进电机进行精确的控制。此外，在开发介质浸没式微球显微镜时，Darafsheh等[
66,
78]发现将微球嵌入聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜中不仅可以提高成像分辨率，还可以将薄膜作为支架来操控微球在样品上的移动，如
图3（c）所示[
72]。这种方法简单且成本低，但仅限于高折射率的微球。
上述微球操控技术都依赖于专门的机械元件。光镊技术则是一种完全不同的微球移动操控方法，该技术之前曾广泛用于生物和制药领域中捕获纳米颗粒或细胞[
79]。在使用光镊操控微球方面，它曾被应用于激光纳米加工领域。例如，在2008年，Mcleod和Arnold [
80]利用被贝塞尔激光束操控的760 nm聚苯乙烯球在水中实现了亚波长纳米图案的激光直写。随着光学微球纳米成像领域的发展，光镊也被改造成与微球显微镜适配的装置。2013年，Bañas等[
81]构建了可在液体环境中操控微球移动的光镊。该光镊可以抓住一个定制的“三脚架”支撑结构，从而操控放置在“三脚架”上的聚苯乙烯微球的运动。在液体环境中，支撑结构和聚苯乙烯微球的浮力部分平衡了它们的重力，从而减轻了对光镊的捕获力的要求。后来，Michihata等[
82]设计了更强大的光镊装置，它可以直接在空气中捕获并操控二氧化硅微球用于纳米成像。如
图3（d）所示，两个光源被用于构建光镊辅助的微球纳米成像系统，其中激光源用于捕获微球，而Kohler照明光源用于纳米成像。一般来说，基于机械元件的操控方法要求将微球的一部分与机械元件黏合，因此或多或少会影响微球纳米成像过程的照明。光镊操控方案则不存在这个问题。然而，由于需要额外的组件，如激光源和高倍率物镜，光镊操控方案会比较昂贵[
83]。此外，使用光镊捕获直径大于10 μm的微球还是充满挑战的。因此，光镊操控和机械支架操控方案各自具有优缺点，可以根据具体应用需求做出选择。
以上这些方案可以实现对微球移动的任意操控，这给微球纳米成像技术带来了两方面的好处。首先，微球可以移动到样品上任意感兴趣的区域进行成像，从而对样品的种类没有了限制，周期性和非周期性样品都可以用微球进行成像。
图3（e）显示的就是机械支架操控的微球对硅片上的单个纳米玫瑰花图案进行成像的结果。其次，微球纳米显微镜可以通过扫描和拼接获取大面积样品的图像。到目前为止，已经提出了许多图像拼接方案[
72,
77,
84]。最简单的图像拼接方法是记录每张图像的拍摄位置并按顺序将它们拼接。然而，由于机械振动或记录位置的微小偏差，这种简单的方法通常会导致图像错位。为了确保正确的图像拼接，在扫描过程中相邻图像之间必须存在重叠区域。这些存在交叠的图像可以通过图像对准和图像融合进行拼接。图像识别算法也可以帮助改进图像拼接的效果。例如，Zhou等[
85]应用了相位相关方法来对齐两张图像的重叠区域，并使用线性混合算法将两张图像融合在一起。
图3（f）展示了采用这种方法拼接的图像，良好的图片质量验证了这个方法的有效性。因此，结合微球的运动和有效的图像拼接方法，可以实现大面积样品的超分辨率成像，极大地满足了许多实际应用的需求。
2.5 微球工作在电介质浸没环境
在传统的光学显微镜中，采用油浸物镜是一种常用的提高成像分辨率的方法。这个方法也被证明能够增强微球的成像能力。Hao等[
52,
86]通过实验表明，将直径为3 μm的SiO₂微球部分浸没在乙醇液滴中可以显著提高其成像对比度。研究人员将成像对比度的提升归因于液体环境中微球能收集到更多的倏逝波。然而，浸没液的高度不易控制，部分浸没的微球的成像特性在不同的浸没条件下可能会有所不同。后来，Darafsheh等[
87]报道，高折射率微球（折射率
n = 1.9~2.1）在完全浸没在液体环境中时也可以实现超分辨成像。这种完全浸没的方式被认为不适用于低折射率微球。实验上实现微球完全浸没在液体中进行成像的方法非常简单，向样品表面的微球喷洒足够大的液滴即可，如
图4（a）所示[
87]。实验结果表明，直径为4.2 μm的BTG微球在异丙醇（IPA）中完全浸没时可以辨别出最小特征尺寸为
λ/7的图案。跟随这个工作，很多研究致力于分析液体和微球的不同折射率组合以及不同的浸没液高度对成像特性的影响[
54,
69,
88‒
91]。到目前为止，文献中工作在液体浸没环境中的微球所能辨别的最小特征是两个纳米圆盘之间的25 nm间隙，如
图4（b）所示[
34]。液体浸没微球已被证明在生物应用中具有显著优势，后续将详细讨论。
除了将微球浸没在液体中外，Darafsheh等[
78]还证明将高折射率微球浸没在透明固体薄膜中也可以实现超分辨成像。
图4（c）展示了将BTG微球嵌入PDMS薄膜中的制备过程[
68]。在实验中，直径为30~150 μm的BTG微球被嵌入PDMS薄膜中，这使得微球的成像分辨率提高了两倍。与液体浸没方案相比，可以在使用前预先制备PDMS薄膜，并且不会遇到类似液体蒸发的问题。Du等[
92]分析了薄膜厚度对微球成像特性的影响，发现随着薄膜厚度的减小，微球的视场（FOV）增加。此外，将高折射率微球部分浸没在SU-8光刻胶中可以显著降低成像失真[
93]。2018年，Wang等[
94]提出了一种更加复杂的浸没方案，即采用混合薄膜进行浸没。如
图4（e）所示，BTG微球的一半浸没在S1805光刻胶中，剩余部分则浸没在折射率为1.4的PDMS薄膜中。由于NA的增加，工作在这种环境中的微球可以分辨出直径为200 nm的二氧化硅纳米球阵列[
图4（f）]，而完全浸没在PDMS薄膜或液体中的BTG微球甚至无法分辨直径为250 nm的二氧化硅纳米球阵列。将微球嵌入PDMS薄膜中不仅可以提高成像分辨率，还可以控制微球的移动，这在上一节中已经提及。使用浸没在薄膜中的微球对大的样品进行扫描成像，可以获得大面积的高分辨率图像，从而大大提高成像效率[
68,
84]。
2.6 将微球和其他的显微成像技术相融合
微球透镜是一种通用的纳米成像器件，它可以与各种先进的显微镜平台相结合，利用两者的优势达到更强的纳米成像能力。由于微球的几何尺寸小并且基于虚像放大的成像原理，其本身也易于与其他显微成像技术结合。根据虚像成像原理，微球首先会生成样品的放大虚像，该虚像接着可以作为与微球搭配的显微镜的成像物进而被显微镜二次放大成像。由于微球生成的放大虚像本身包含了尺寸超出光学衍射极限的特征的信息，因此与该显微镜独立工作时相比，它搭配微球时能够表现出更优的分辨能力。
2014年，Yan等[
67]首次尝试将微球与共聚焦显微镜集成。如
图5（a）所示，研究人员将一个熔融石英微球放置在AAO样品上，并使用传统的共聚焦激光扫描显微镜捕捉微球生成的虚像。利用共聚焦激光扫描显微镜的高信噪比和微球的虚像放大能力，他们分辨出了AAO样品中小至25 nm的孔洞结构[
图5（d）]，这一成像效果显著优于传统共聚焦激光扫描显微镜独立工作时的成像性能。受到共聚焦显微镜中针孔的空间滤波功能的启发，Zhou和Hong [
95]在传统的明场微球纳米显微镜中添加了一个微小光圈[
图5（b）]，实现了比原始装置更高的成像对比度。他们将该装置称为“共聚焦光学微球成像显微镜”。由于微球固定在支架上，该装置还能够通过扫描获取样品的三维图像。
图5（e）展示了一个典型的三维成像结果。与商业化的共聚焦激光扫描显微镜相比，由于其采用了逐个图像而非逐点扫描的方式，它的三维扫描成像速度提高了大约9倍。
此外，微球还成功地与暗场显微镜、光学内窥镜和光学干涉显微镜集成[
96‒
98]。Zhou等[
99]通过实验证明，当微球与暗场显微镜结合时，成像对比度和亮度均匀性可以大大提高。目前光学内窥镜的成像分辨率通常限制在约1 µm。通过将微球固定在内窥镜探头的检测端，内窥镜可以分辨出特征尺寸大约为
λ/5的物体，这大大超过了基于梯度折射率透镜的内窥镜系统的分辨率，并且突破了光学衍射极限[
100]。
另外，许多工作通过将微球纳米成像技术与干涉显微镜结合，以提高三维成像分辨率[
97,
101]。Wang等[
102]报道了一种微球辅助白光干涉系统。该系统在Linnik型白光干涉仪的物体臂中插入了一个微球。利用白光干涉仪的高轴向层析分辨率和微球突出的横向分辨率，该系统能够分辨横向和轴向尺寸分别约为50 nm和10 nm的微小结构。该系统还可以在空气和液体环境中工作，展示了其通用性。Aakhte等[
103]则将微球与低放大倍数的Mirau干涉物镜集成到了一个共路径数字全息显微镜中，期望以相对低的成本实现高NA成像。随后，Kassamakov等[
104]利用类似的配置达到了112 nm的横向分辨率。和无微球辅助的系统相比，其成像分辨率提高了五倍。他们的仿真结果显示，纳米成像分辨率的提高主要是因为反射波的剧烈相位变化。Perrin等[
101]和Leong-Hoi等[
105]则将相移干涉显微镜与微球集成。微球将搭配低NA物镜（约0.3）的相移干涉显微镜的横向分辨率提高了4倍，同时保持轴向分辨率在几纳米。然而，这种仅在物体臂中插入单个微球的设计会导致干涉仪的不对称性，进而引起显著的球面像差。Perrin等[
106]后来在干涉仪的物体臂和参考臂中各集成了一个微球，解决了这个问题。这一简单的改进显著提高了成像的空间分辨率。
微球不仅在虚像成像中具有卓越的分辨率，它还具有强大的光场聚焦能力，即前面提及的光子纳米射流效应。因此，利用微球卓越的光场聚焦能力与各种显微技术集成也是一个重要的研究方向。Yang和Hong [
60]利用微球对一台商业共聚焦显微镜进行了改进。如
图5（c）和（f）所示，他们给显微镜增加了可调节的针孔，并将微球作为其聚焦透镜。由于微球同时减小了聚焦光斑的大小以及增加了散射光的收集效率，该微球辅助的共聚焦显微镜实现了100 nm的轴向分辨率，并将图像对比度提升了4.56倍。由于微球具有很强的光激发和信号收集能力，它在与基于荧光的显微技术和光纤探头集成方面也有很大的应用潜力[
107‒
110]。例如，Yang等[
108]制备了介电微球阵列，并利用光子纳米射流效应检测荧光纳米颗粒。他们的实验表明，能够检测到直径小至20 nm的荧光纳米颗粒并且荧光强度大约提高了40倍。
2.7 纳米成像应用
在过去几十年中，微球纳米显微镜的成像性能取得了显著进展。尤其是，在操控微球的移动方面的进展极大地增强了这一技术的实用性，缩小了实验室原型机与工业应用要求之间的差距。2021年，新加坡初创公司Phaos Technology Pte. Ltd.成功地推出了他们的第一代微球纳米显微镜（OptoNano 200），该设备在空气环境中可以实现137 nm的成像分辨率。另一家英国公司LIG Nanowise也推出了一款名为NANORO M的微球纳米显微镜产品。NANORO M在横向能够分辨小于100 nm的微小结构，并提供使用超分辨率微球放大透镜（SMAL）的选项[
112]。苏州显纳精密仪器有限公司开发了一种微球透镜组件，能够在空气中同时实现超分辨率和超宽视场成像[
113]。毫无疑问，随着更多改进方案的应用，商业化的微球纳米显微镜将展现出更好的成像性能。
到目前为止，根据微球纳米显微镜的特性，已经探索了许多适合这个技术的应用场景。其中最具潜力和价值的应用是在半导体行业。随着半导体制造的发展，半导体芯片中金属引线和功能器件的尺寸已经远远小于普通光学显微镜的光学衍射极限。微球纳米成像技术具有无需荧光标记和性价比高的特点，是半导体芯片质量检测应用中一个颇具吸引力的选项。使用配备移动支架的微球纳米显微镜，可以检测半导体芯片上任意感兴趣的位置。此外，通过扫描和图像拼接，可以获取半导体芯片大面积的高分辨率图像。
图6（a）显示了一张由BTG微球捕捉的工业半导体产品的图像。这个样品是硬盘驱动器中的磁头，上面的结构的最小特征尺寸为77 nm [
34]。
除了能对样品表面图案进行成像外，微球纳米显微镜还能够对表面下方的纳米结构进行成像，这是相较于扫描电子显微镜和标准扫描探针显微镜的独特优势[
114]。例如，Lee等[
114]和Guo等[
115]使用微球纳米显微镜直接观察了蓝光光盘表面之下记录数据的结构（100~200 nm），这些结构的尺寸超出了传统光学显微镜的分辨率极限。此外，微球辅助的干涉显微镜可以重建纳米结构的三维图像，这已经在多种样品中得到了证明，包括硅光栅、硅上的周期性银纳米点和不锈钢中的周期性波纹[
102,
105‒
106]。值得注意的是，微球纳米显微镜在样品为金属纳米结构时表现尤为出色。表面等离子体共振效应可以增强微球纳米显微镜的成像分辨率，这一点从第2.1节中提供的许多应用实例可以看出。
生物领域是微球纳米成像技术另一个重要的应用方向，该技术在此领域展现出三个优势。首先，微球能在液体环境中工作，因此可以在液体中观察活的生物体。其次，由于微球纳米显微镜不需要使用荧光标记进行成像，因此无论生物样本是否需要荧光标记，都可以使用它进行成像。特别是，生物样本的物理化学性质有时会因荧光标记而改变，因此使用荧光显微镜获得的图像可能无法准确反映样本的原始状态，使其在后续研究中不可靠。在这种情况下，微球纳米成像技术可以作为一种替换方案，取代常用的荧光超分辨显微镜。再次，微球纳米显微镜能够实时监测生物样本的活动，且不需要进行基于后期数据处理的图像重建。
为了验证微球纳米成像技术在生物应用中的可行性，研究人员用微球显微镜对多种生物标本进行成像。Li等[
116]使用浸没式微球纳米显微镜成功地在无荧光标记的条件下观察到了75 nm的腺病毒。Yang等[
23]使用液体浸没的高折射率微球观察了多种荧光样本，包括荧光颗粒、AML12细胞中的亚细胞结构和 MTCO1蛋白。
图6（b）显示了通过传统荧光显微镜和微球纳米显微镜捕捉的 AML12细胞中线粒体的图像。在由单个微球捕捉的图像中，可以辨别出细胞更多的细节信息。实验样本里可分辨的最小结构尺寸约为
/7。Li等[
57]和Gao等[
117]报道了利用微球对人体上皮细胞和大鼠肝切片进行成像的结果。微球纳米显微镜还可用于纳米级生物结构的亚衍射极限的彩色成像。生物结构的颜色特性无法通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜等其他分析工具提取，而微球纳米显微镜能够有效地捕捉生物结构的颜色信息。例如，Jia等[
118]成功地通过微球透镜分辨了蝴蝶翅膀鳞片的纳米级特征，并保留了其真实的颜色属性。这些特征从未通过传统光学显微镜分辨出来。
量子点是用于标记生物样本的优良荧光染料。研究表明，微球纳米显微镜在增强收集量子点发射的光场方面具有良好效果。例如，Zhang等[
119]证明微球纳米显微镜即使搭配低倍率低NA的物镜也能够观察到量子点的“闪烁”现象。他们将光场的收集增强归因于三个方面：首先，微球聚焦的照明光增强了量子点的激发；其次，微球提供了更大的NA以收集光场；再次，考虑到相机像素大小的限制时，微球的虚像放大作用提升了成像分辨率。
最近，也有人尝试将微流控器件与微球纳米成像技术相结合，这可能成为生物应用的一种新范式[
120]。如
图6（c）所示，Yang等[
111]通过将高折射率微球嵌入PDMS薄膜中，观察到了水中300 nm聚苯乙烯纳米颗粒的布朗运动。Jin等[
121]成功地展示了利用微球实时成像结果来识别和分类在微流控通道中流动的纳米材料。这些尝试表明，将微球与微流控平台结合在一起用于生物学和化学领域的可行性。
3 微球复合透镜用于增强纳米成像
在第2节中，我们回顾了单微球纳米成像技术的发展。这些进展提高了微球成像系统的性能并促进了它在实际应用中的可行性。然而，这些进展尚未涉及克服微球本身在成像方面的一些固有局限性。例如，微球的成像分辨率取决于其大小。随着微球尺寸的减小，其成像分辨率会提升，但成像视野会显著减小。在单微球纳米成像系统中，很难有办法解决这种由尺寸引起的成像性能困境。正如诺贝尔物理学奖得主菲利普·W. 安德森（Philip W. Anderson）所言，“多而不同”[
122]。由多个微球和常规透镜组成的复合透镜或许能够提供一些意想不到的成像性能改进，进而解决单微球纳米成像系统中的问题。本节将介绍在构建微球复合透镜（MCL）方面的进展，并探讨其在克服单微球纳米成像系统不足之处的潜力。根据用于构建MCL的元件的不同，我们将MCL分为三种类型：①由两个微球组成的复合透镜；②包含纳米球组件的复合透镜；③由微球和常规透镜组成的复合透镜。
3.1 双微球组成的复合透镜
宏观的成像器件，如物镜，通常由多个精心设计的透镜组成，这使得这些器件能够同时满足单个透镜无法实现的多种成像性能需求[
123‒
124]。在实际应用中，复合透镜方案功能强大、可靠、灵活且成本低。宏观复合透镜的设计理念为升级微球纳米显微镜指明了可行的方向，即用MCL替代单个微球。最简单的MCL由两个垂直堆叠的微球组成，在进行纳米成像时可以实现级联的放大成像。首先，靠近样品表面的第一个微球会生成样品的放大图像，随后该图像作为上面这个微球的成像物体，会被进一步放大。最后，样品中的微小结构的放大图像可通过常规光学显微镜中的低倍率物镜进行捕捉和分辨。如
图7（a）所示，因为单个微球可在虚像或者实像成像模式下实现超分辨成像[
125]，因此，由两个微球组成的 MCL可以在四种不同的成像模式组合中工作。尽管这四种成像模式组合具有相同的级联放大率，但是不同的成像模式的成像性能存在差异。这主要是因为工作在不同成像模式下的 MCL中出射的光具有不同的出射角，这会影响物镜的光收集效率，从而影响成像效果。一般而言，“虚-实”成像模式是更好的选择，因为其具有较大的光线收集角度以及在MCL与物镜之间可提供更大的操作空间[
74]。
在MCL的定量设计中，一般采用级联的高斯成像公式来确定微球的参数，使之能够实现目标放大率和成像模式。然而，在微球中光波的传播表现出显著的波动效应，仅通过几何光学理论直接计算得出的微球或MCL的成像特性并不准确，与实验结果存在一定偏差[
126]。为了解决这个问题，Wu和Hong [
74]引入了包含波动光学效应的“有效折射率”对高斯成像公式进行修正。有效折射率的推导基于通过波动光学仿真获得的微球的焦距。把高斯成像公式中的材料折射率替换为有效折射率就可以得到更准确的MCL成像特性，这一点已被仿真和实验结果所证实。
如
图7（b）所示，第一个报道的MCL是在一个标准的倒置光学显微镜平台中实施的[
127]。在这个MCL中，底层微球固定在样品表面，而第二层微球则被安装在悬臂支架上，可以自由移动。这么构建的MCL与单一微球相同，存在移动性不足的问题。例如，整个MCL无法随意移动至感兴趣的位置进行成像并且可能会损伤成像样品。为了避免这些问题，Wu和Hong [
74]提出了一种可以在样品表面上方自由移动的MCL构造，如
图7（c）所示。用于组装该MCL的两个微球分别固定在两个金属探针的尖端上。通过将金属探针安装在两个高精度移动平台上，这两个微球可以组装成一个垂直堆叠的MCL，并且具有良好的移动性。该MCL具有对周期性和非周期性样品都适用的优势，并可以通过扫描对大面积样品进行成像。
3.2 成像性能的增强
由两个垂直堆叠的微球构成的MCL在纳米成像中比单个微球具有多重优势。首先，MCL的放大率是可定制的，并且大于单个微球的放大率。通过调整组成MCL的两个微球的尺寸，文献中实现了放大率高至10倍的MCL，而这对于单个微球而言是无法达到的[
74,
127]。
图8（a）和（b）分别展示了由单个23 μm二氧化硅微球和由23 μm（下方）和102 μm（上方）二氧化硅微球组成的MCL捕捉的蓝光光盘的图像。显然，MCL捕捉的蓝光光盘图像[
图8（b）]几乎是单个微球的成像结果的两倍。其次，通过控制微球之间的间隔，可以调节MCL的成像放大率。如
图8（c）所示，当微球之间的间隔从112 μm变为0 μm时，放大率从2.8倍增加到10.3倍，这与利用有效折射率修正的理论预测的结果相吻合，而传统的高斯成像公式通常会高估MCL的放大率。
高放大率使得MCL只需要与低倍物镜搭配使用就可以进行纳米成像。低倍物镜不仅可以降低微球纳米显微镜的成本，而且得益于它的长工作距离，它还可以给我们操控微球提供更多空间。如
图8（d）~（f）所示，Wu和Hong [
74]通过实验表明，10倍物镜（NA约为0.3）与MCL搭配使用，可以分辨出标准分辨率样品中尺寸为137 nm的图案，而单个微球无法做到这一点。此外，研究发现MCL的视场比单个微球的更大。如
图8（d）和（e）所示，MCL的视场几乎是单个微球的四倍。MCL较大的视场极大地提高了大面积样品成像时的扫描速度。
除了增大放大率和视场外，Luo等[
128]还发现与单个微球相比，设计良好的MCL可以增强成像对比度。在他们的实验中，MCL的上层使用了一个20 μm的熔融石英微球，而下层使用了一个20 μm的BTG微球。它们采用带有100~400 nm孔隙结构的AAO样品来研究该MCL的成像特性。由SEM、空气环境中工作的熔融石英微球、浸没在水中工作的BTG微球以及空气环境中工作的MCL捕捉的样品图像展示在
图9（a）~（d）中。这些结果表明，空气环境中工作的MCL在性能上与浸没在水中工作的BTG微球相当或更优。成像质量的提升归因于BTG微球在空气中比同样条件下的熔融石英微球或浸没在水中的BTG微球具有更高的折射率反差，这使得MCL能够从样品中收集到更多的散射光，从而改善了整体图像质量。与单个微球类似，具有良好移动性的MCL在实际应用中更具价值。例如，它可以通过扫描实现大面积样品的纳米成像。
图9（e）中的五环图案的面积超出了MCL的视场范围，这使得其完整图像无法通过单次拍摄得到。研究人员使用固定在可移动支架上的MCL对该图案的八个不同位置进行了扫描成像。通过拼接这些子图像，他们获得了完整图案的高分辨率图像[
图9（f）]，其中，小至76 nm的间隙特征也可分辨出来。具有移动性的MCL的实现推动了该技术的实用性。
3.3 包含纳米球组件的复合透镜
如前文所提及，微球的成像分辨率随着其尺寸的减小而提高，这引发了一个有趣的问题：纳米球是否能够提供比微球更高的成像分辨率。然而，单个纳米球的视场（FOV）很小，无法覆盖大多数图案，因此很难验证这一推测。然而，在复合透镜的范式中，可以通过将多个纳米球组装成复合透镜来实现纳米成像，从而克服这一尺寸限制。目前，已经提出了两种包含纳米球组件的复合透镜，如
图10（a）和（b）所示。第一种类型[
图10（a）]由一个位于顶部的微球和若干位于底部的纳米球组成[
129]。实验结果表明，这种MCL也可以提高成像放大倍数，其原理与由两个微球组成的复合透镜相似。目前，尚未有研究报道这种结构的MCL是否能够提高成像分辨率。
第二种类型的复合透镜[
图10（b）]不包含微球组件，而完全由纳米球组成。2015年，Zhu等[
130]采用纳米颗粒杂化悬浮聚合方法将ZrO₂和聚苯乙烯纳米球合成了高折射率MCL。通过改变ZrO₂和聚苯乙烯纳米球的体积分数，可以控制复合透镜的折射率。研究人员获得了尺寸范围从2 µm到20 µm、折射率介于1.590~1.685之间的多种MCL。这些MCL的成像分辨率和质量随着折射率的增加而提高。特别是，当MCL（
n ≈ 1.685）半浸没在浸没液（
n ≈ 1.515）中时，可以分辨样品中尺度为60 nm的间隙结构。研究认为，这种MCL的超分辨成像机制与普通微球类似。随后，Dhama等[
131]以20 nm TiO₂（
n = 2.5）纳米球作为基本组成单元，合成了这种MCL。为了直接比较BTG微球与这种复合透镜的成像性能，他们通过控制TiO₂纳米球的体积占比，将这种复合透镜的有效折射率设计成与BTG微球相同，即1.92。随后，这两种透镜均嵌入PDMS薄膜中用于纳米成像。成像结果表明，只有开发的复合透镜能够分辨晶圆上尺度为90 nm的线结构，而BTG微球无法做到。研究人员分析认为，20 nm的纳米球能够以极高的频率调制光，从而将更多的倏逝波分量转换为传播波，从而提升了成像分辨率。以上这些结果表明，由纳米球组成的复合透镜可以实现比普通微球更高的成像分辨率。
纳米球不仅能组装成球形复合透镜，它还可以被用于构建一侧为平面另一侧为球面的复合透镜。这里称这种透镜为平球面复合透镜，它的成像分辨率已被证明优于球形的复合透镜。2016年，Fan等[
132]使用直径为15 nm的TiO₂纳米球，通过一种独特的“纳米固液组装”方法制造了全介电平球面复合透镜。在实验中，浸没在有机溶剂混合物中的紧密堆积的TiO₂纳米球被喷涂到样品表面。在重力和界面张力的共同作用下，液滴会自然地变形成平球面复合透镜的轮廓。随着有机溶剂混合物的蒸发，由TiO₂纳米球制成的平球面复合透镜就形成了并可用于纳米成像。在白光照射下，该平球面复合透镜可以分辨尺度约为45 nm的纳米结构。仿真结果显示，该复合透镜中的15 nm TiO₂纳米球可以在成像区域内产生纳米尺度的照明光斑，这有助于将倏逝波转化为传输波，从而提高成像分辨率。此外，平球面复合透镜的NA相对于球面透镜更大也可能是成像分辨率提高的重要因素。考虑到由TiO₂纳米球制成的平球面复合透镜易于在水性介质中溶解，Zhu等[
133]随后组装了一种由有机-无机材料混合构成的平球面复合透镜。所选的有机和无机纳米球分别为聚合物纳米球和改性ZrO₂纳米球（
n = 2.2）。
图10（c）展示了通过该方法制备的平球面复合透镜的SEM图像。
图10（d）中高倍率SEM图像清晰地显示了构成这种平球面复合透镜的两种不同的纳米球组件。如
图10（e）和（f）所示，该平球面复合透镜在蓝光照明下能够分辨半导体芯片中尺度约为45 nm的纳米结构。
3.4 微球和普通透镜组成的复合透镜
第三种类型的复合透镜由微球和常规透镜（如物镜和微透镜）组成。如
图11（a）所示，多个研究团队开发了将单个微球与物镜集成的方法。在Stanescu等[
112]提出的设计中，BTG微球被嵌入旋涂在玻璃片上的紫外（UV）固化胶中。BTG微球、UV胶和玻璃片作为一个固定的透镜组件，进一步与物镜以可拆卸的方式集成，从而使微球可以根据需要轻松更换。整个复合透镜被命名为超分辨率微球放大透镜（SMAL），目前已被LIG Nanowise公司商业化生产。另一种由Yan等[
134]提出的设计被称为超透镜显微物镜。它由传统物镜、用3D塑料打印机打印的透镜适配器以及盖玻片超透镜组成。在盖玻片超透镜中，高折射率微球被完全浸没在透明基材中（如聚甲基丙烯酸甲酯或PDMS），其底部与盖玻片表面平齐。盖玻片超透镜被固定在适配器的底端，而整个适配器则嵌套在物镜外部。通过调节适配器和物镜的相对位置，可以改变微球与物镜之间的距离。Huszka和Gijs [
135]提出了一种类似的复合透镜构造。不同之处在于，这里的适配器采用了一个笼状金属框架。为了提高扫描成像速度，他们还将盖玻片上的微球替换成了微球阵列。
将微球与物镜集成具有许多优势。这些复合透镜无需额外的微球支架即可自由扫描样品，进行大面积成像，因此性价比极高。此外，这种微球纳米显微镜的操作复杂性显著降低。整个装置中唯一需要操作者进行精细调节的仅仅只是微球与物镜之间的距离。用户无需经过特殊培训即可使用该微球纳米显微镜，这进一步促进了其商业化应用。
研究人员除了将微球与物镜集成外，还对由微球与微透镜组成的复合透镜进行了探索。2020年，苏州显纳精密仪器有限公司发明了一种由BTG微球和平球面微透镜组成的复合透镜[
113]。如
图11（b）所示，BTG微球通过光学胶黏附在微透镜的底部平面。当BTG微球的尺寸和平球面微透镜的曲率选择得当时，该复合透镜可以在空气中同时实现超分辨率和超宽视场（FOV）成像，这优于单微球纳米成像方案。同年，Yan等[
136]提出了另一种复合透镜设计，被称为平凸-微球（PCM）物镜。如
图11（c）所示，PCM物镜由BTG微球、平凸透镜和物镜组成。BTG微球的一部分被浸没在平凸透镜曲面上的PDMS薄膜中，整个透镜组件通过定制的物镜适配器与物镜组装在一起。实验表明，PCM物镜在3.5 µm的工作距离下能够实现1/3波长的成像分辨率，这使得这种复合透镜在商业化方面极具吸引力。
综合以上文献报道中的结果，我们可以看到，将微球、纳米球和常规透镜协同组合，可以实现对光波的复杂调制，这使得复合透镜具有更加丰富以及强大的成像能力。迄今为止，各种类型的MCL在成像性能的不同方面获得了显著的提升，包括放大倍率、视场、图像对比度和成像分辨率。因此，针对MCL的研究具有重要意义，值得投入更多精力集中研究。
4 工程化微球用于增强纳米成像性能
本节概述了利用工程化微球提升微球纳米成像性能的最新进展。工程化微球，顾名思义，是指在形状、表面或材料上经过特定改造的微球。对单个微球进行改造的方法可分为三类：第一类方法是通过移除部分材料来改变微球的几何形状或在微球内创建某些微/纳米结构，这种方法可以称为“减材制造方案”；第二类方法是在微球表面添加其他材料以形成特定的形状或结构，可称为“增材制造方案”；第三类方法是利用高温高压来改变微球的几何形状，从而调控光场的传播。工程化微球具有显著不同的光场调控和光传播特性，这有助于解决普通微球在特定成像应用中的局限性。本节详细地介绍了两类具有不同性能增强的工程化微球，即用于提升成像分辨率的平球面微透镜（PSML）和用于改善成像对比度的薄膜修饰的微球。这两类工程化微球都是通过以上某一种微球工程化改造方法实现的。此外，我们还简要介绍了一些其他类型的工程化微球，尽管它们尚未应用于成像领域，但可能可以给该领域的研究人员提供一些灵感。
4.1 平球面微透镜用于提高成像分辨率
光学微球纳米显微镜的实际成像分辨率受到微球的放大倍率和NA的显著影响。当物体的尺寸超过光学衍射极限时，微球需要具有较高的放大倍率，以生成足够大的物体的像，从而使后续的常规物镜能够分辨。另一方面，正如第2.5节中提及介质浸入式微球时所证明的那样，微球的NA限制了其可以接收和转换的光的空间频率带宽，故而也对成像分辨率有重大影响。因此，提升成像分辨率的关键是提高微球的放大倍率和NA。
在第3节中，我们提及由多个纳米球组成的平球面复合透镜具有突出的成像能力。与微球不同，平球面复合透镜或者PSML的几何构造使得它们可以通过调节透镜厚度与球面直径的比率，灵活地实现所需的放大倍率和NA。因此，PSML能够有效地规避微球在放大倍率和NA上的限制，从而提升整体的成像分辨率。迄今为止，除了第3节中提出的复合透镜方法外，还有多种制造PSML的工程方法。不同的制造方法实现的PSML展示在了
图12 [
137‒
139]中。2009年，Lee等[
140]首次通过杯芳醌分子自组装的方法制备PSML并展示这种微透镜超越光学衍射极限的成像分辨率。他们制备出的PSML直径可达3 μm，且具有不同的透镜厚度与直径比。然而，由于所使用的材料的折射率（约1.5）相对较低，获得的PSML在纳米成像中的放大倍数只有大约1.6，影响了其成像分辨率的提升。随后，Vlad等[
137]通过热重塑法获得了具有更高放大倍率的PSML。他们系统地研究了退火温度、退火时间以及原始胶体聚合物微球的尺寸对最终PSML形状的影响，从而能够精确地控制PSML的厚度和放大倍率。
图12（a）和（b）分别展示了采用这种热重塑法制造的PSML的典型样貌及其采用这种PSML拍摄的六边形网格图案的像。通过该方法获得的PSML最高放大倍率约为3.2倍。近年来，激光加工方法结合各种光敏材料也被用于制造PSML [
141]。例如，Du等[
138]采用激光直写技术制造了可用于纳米成像的具有波长尺度和复杂形状的微透镜。这种制造方法的基本原理是先利用高强度激光在负光刻胶IP-Dip中引发双光子聚合，经过显影剂处理后，具有透镜形状的聚合光刻胶会被保留下来，而未聚合的光刻胶则被去除。这种3D激光打印技术具有很高的制造灵活性，如
图12（c）所示，它不仅可以制造PSML，还可以制造形状更复杂的微透镜。如
图12（d）所示，通过这种方法获得的PSML能够在波长为600 nm的照明光下分辨出尺度大约为100 nm的纳米结构。此外，还有一些文献报道了通过直接转移聚合物或者纳米颗粒液滴的方法制造形状可控的PSML [
142‒
143]。
尽管这些研究显著丰富了PSML在纳米成像领域的应用内容，但上述制造方法及其所得的PSML在成像性能方面仍存在明显的局限性。具体而言，化学生长、激光加工和热重塑方法的适用范围都局限于某些特定的聚合物材料，而这些材料通常具有较低的折射率，从而阻碍了NA的提升。此外，由于这些PSML的折射率低于2，当其用于接触式成像时，它们的放大倍数始终小于同样材质的微球的放大率。因此，通过这些方法制备的PSML通常无法显著改善透镜的NA和放大率。要充分发挥PSML的成像潜力，采用折射率大于2的材料制作PSML是至关重要的。
最近，Wu等[
139]提出了一种自上而下的PSML制造方法，即通过聚焦离子束（FIB）刻蚀高折射率微球来定制所需的高折射率PSML。在加工过程中，高折射率微球被固定在具有孔洞的金属网格中，随后FIB装置以纳米级精度逐层去除微球某一侧的材料直至该侧从球面变成平面。此方法具有广泛的适用性，可用于加工任何材料制成的微球，因此可以按需定制具有强大成像能力的PSML。
图12（e）展示了通过该方法从BTG微球（折射率约为2.34）制备得到的PSML的SEM图像，从中可以看出所获得的PSML表面非常光滑。他们通过精确控制微球的刻蚀深度，得到了放大倍率为10倍、NA约为2.34的PSML。如
图12（f）和（h）所示，将该PSML和10倍物镜搭配使用即可在空气环境中分辨出尺度小于50 nm的纳米结构。与液体浸没式BTG微球相比，PSML拍摄的样品图像具有更高的图像保真度和对比度，这从
图12（g）和（h）中两种透镜的成像结果对比中可以清楚地观察到。Wu等[
139]还证明，工程化微球与复合透镜（MCL）技术可以协同作用，以实现综合成像性能的提升。例如，将PSML和微球作为基本的构建单元来组成复合透镜，所得到的复合透镜不仅具有PSML的高分辨率，还具有复合透镜的大成像视场（FOV）。
图13展示了单个PSML与由它构成的复合透镜成像性能的直观对比。如
图13（b）和（e）所示，由于视场受限，单个PSML无法在单次成像中捕获完整的三角形图案[
图13（a）]或“NUS”字母[
图13（d）]图案的像。然而，如
图13（c）和（f）所示，当使用由PSML和95 μm硼硅酸盐玻璃微球组成的复合透镜对这两个图案进行成像时，这两个图案均可完整地呈现在单次拍摄的图像中，并且所有小于50 nm的特征都能被清晰地分辨出来。这些结果展示了结合这两种技术以增强纳米成像的巨大潜力。
4.2 薄膜修饰的微球用于改善成像对比度
在传统光学成像系统中，透镜、反射镜和棱镜等光学元件的表面通常涂覆有介质薄膜，以提高光学元件的色差、透射率和反射率等性能。微球作为一种微尺度光学透镜同样不是完美的，它在成像方面存在一些固有的缺陷，这些缺陷也可以通过介质薄膜的修饰来克服。微球纳米成像系统中一个广为人知的问题是微球的成像对比度较差。迄今为止，已有许多方法被提出以改善微球纳米成像的对比度。早期研究主要致力于通过系统层面的优化来降低环境噪声。一系列措施包括采用液体浸没环境、优化照明光源、合理设置聚光器/视场光阑等已被证明能够有效地减少环境噪声，从而提高成像对比度。近年，从器件层面的改良出发，研究人员提出了另一类工程化微球，即薄膜修饰的微球，来提高成像对比度。
图14（a）和（b）展示的是两种不同类型的薄膜修饰的微球。第一种薄膜修饰的微球[
图14（a）]的下表面覆盖了双层介电薄膜。介电薄膜作为抗反射涂层可以减少微球界面的反射，这种反射通常会在虚像成像过程中导致牛顿环的出现，从而降低成像对比度[
37,
45,
125]。研究人员在建立虚像中牛顿环形成的物理模型时发现，微球靠近样品的那半个球面的反射会导致牛顿环的产生，而上半个球面的反射可以忽略不计。为了确保微球的薄膜修饰区域朝向样品表面，在实验中，研究人员将BTG微球的一部分嵌入在PDMS薄膜中，而未嵌入PDMS薄膜的部分则通过电子束蒸镀技术沉积介质薄膜。成像实验证明，用70 nm Al₂O₃和92 nm SiO₂组成的双层薄膜来修饰微球的底部就可以显著减弱虚像成像中的牛顿环。利用普通微球和双层介电薄膜修饰的微球拍摄的蓝光光盘的图像展示在
图14（c）和（e）中。
图14（e）中的牛顿环明显消失，其图像对比度更高，这一点也可以通过
图14（d）和（f）中的强度分布图直观地观察到。
另一种薄膜修饰的微球[
图14（b）]的侧面涂覆有补丁状的反射薄层，以形成钩状的照明光场，从而提高成像对比度[
144]。在实验中，研究人员利用物理气相沉积法以恒定角度在微球表面部分沉积了100 nm的Ag薄膜。当沉积的Ag薄膜位于微球的侧面时，部分入射光被Ag薄膜阻挡就可以形成斜向的钩状照明光场。实验结果表明，侧面具有Ag薄膜修饰的BTG微球的成像对比度约为普通微球的6.5倍。然而，该工作提出的方案里Ag薄膜与样品表面的相对位置不可控。当Ag薄膜位于微球的不同位置时，生成的照明光场分布会发生变化。并非所有调制后的照明光场都有利于提高成像对比度。因此，还需要进一步探索新的制造工艺，以确保所获得的薄膜修饰的微球在实际应用中始终能够以优化状态运行。
4.3 其他类型的工程化微球
其他类型的工程化微球也已在文献中提出[
145‒
149]。尽管这些工程化微球并非为实现超分辨率虚像/实像成像而设计，但是它们采用的光场调制方法可能为设计旨在提升成像性能的工程化微球提供一些灵感。下面简要介绍其中的三个典型代表。
图15（a）[
150]显示了一个具有同心环结构的工程化微球的扫描电子显微镜图像。这些同心环结构是通过聚焦离子束（FIB）刻蚀技术在微球表面上加工而成。通过优化微球表面上的环形设计，可以从微球中输出想要的光场波前分布。
图15（b）[
151]展示了一种通过增材制造方法制作的中心有非透明涂层的微球。这种设计可以选择性地过滤光波的空间频率，从而实现光场调制。
图15（c）[
152]展示了一个具有负锥形表面的微球的SEM图像。这个工程化微球也是通过FIB刻蚀技术制造的。它的负锥形表面能够为不同位置出射的光引入光程差，从而使得从微球中出射的光场的发散性变得适中。与常见的具有球对称性的微球透镜不同，这些工程化微球不具有球对称性。如果设计类似的工程化微球用于成像，则需要制造一种特殊的支架，能够移动并旋转这些工程化微球，以确保它们在正确的方向上工作。
5 挑战和展望
尽管近年来微球纳米成像领域取得了显著进展，但这一领域仍然面临一些严峻的挑战。其中，微球纳米显微镜的工作距离短是该领域最亟待解决的问题。在第2.4节中，我们介绍了多种用于操控微球移动的支架。通过这些支架，使用者可以操控微球在三维空间内自由地运动。然而，由于只有在较短的工作距离下微球才能够达到突破衍射极限的分辨率，微球与样品表面之间的间隙必须控制在几百纳米或更小的范围内，这在实际应用中会引发许多问题从而限制了微球显微镜适用的成像场景。首先，它无法在细胞内部结构成像或芯片内部电路检测等应用中发挥作用，而只能对物体表面形貌进行成像。其次，短工作距离要求样品表面必须光滑。如果样品表面过于粗糙，微球则无法以足够小的距离接近目标位置进行纳米成像。再次，短工作距离需要精密的运动平台和控制系统，以在成像过程中保持微球与样品表面之间的微小间隙。否则，微球可能接触到样品，从而导致微球或样品被污染甚至损坏。因此，为了推动微球纳米显微镜的广泛应用，必须做出努力来增加微球的工作距离。
除了工作距离短这一基础性的问题之外，微球纳米成像领域还有其他一些尚未解决的问题。作为球透镜的微球实际上存在严重的球差和色差。这些问题可能可以通过MCL技术和工程化微球技术来解决。除了硬件方面的升级外，该领域目前鲜有与计算成像技术相结合的研究报道，而计算成像的方法可能在克服微球纳米成像中的挑战时发挥重要作用。尤其是随着机器学习的快速发展[
153‒
154]，最先进的计算成像算法可能赋予微球纳米显微镜前所未有的性能提升。
展望未来，充分发挥微球透镜的微小尺度优势，开发小型化和集成化的光学纳米显微镜系统将是一个重要的研究方向。当前的微球纳米显微镜装置体积庞大，这主要是因为微球在纳米成像中必须与传统台式光学显微镜搭配使用。装置中的传统光学显微镜的作用是放大由微球产生的虚像或实像，并将其投射到相机上。随着MCL技术的发展，微球纳米显微镜装置中的传统光学显微镜不再是必需的，它完全可以由精心设计的复合透镜所取代。微球复合透镜不仅能够提供足够的放大倍数，还可以在实像成像模式下工作，将生成的图像直接投射到相机上进行采集。因此，基于微球纳米成像技术构建紧凑且高度集成的光学纳米显微镜是可能的。集成化的微球纳米显微镜不仅因其紧凑设计而具备更高的性价比，还可能在性能上优于传统的体块装置。例如，在当前的体块装置中，成像视场受限于微球和物镜，相机上的像素无法被全面地利用。而在集成化的成像系统中，这一限制将不复存在。如果将复合透镜阵列直接集成到相机前方，不仅可以最大限度地利用相机的像素，还可以提高成像通量。总的来说，微球透镜卓越的成像能力和其紧凑的几何结构为构建高度集成化的新型纳米显微镜范式提供了良好前景。
6 结论
如何突破光学衍射极限是光学显微成像中的一个基础性难题。在过去的十多年中，光学微球纳米成像技术作为克服这一挑战的有效技术路径逐渐兴起。在本文中，我们首先总结了单微球纳米成像的研究进展，详细介绍并对比了当前用于解释微球超分辨率成像机制的各类物理模型，同时，还概述了从系统层面对微球纳米显微镜性能进行优化的重要技术进展，包括微球的运动控制、工作环境介质的优化，以及微球与其他显微镜技术的有机集成。随后，我们重点讨论了两种通过对微球透镜本身的改进来提升成像性能的技术方案，即微球复合透镜和工程化微球技术。文中介绍了构建微球复合透镜和制造工程化微球的多种方法，并展示了这些透镜在成像放大倍率、分辨率、对比度和视场等方面的性能提升。最后，我们总结了当前微球纳米成像技术面临的挑战及潜在的解决方案。展望未来，我们认为微球纳米显微镜可以朝着小型化、高度集成化和良好便携性的方向发展，从而有可能彻底变革光学纳米显微镜领域，并对相关应用产生深远影响。
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