整合素α6靶向自组装促凋亡纳米多肽对中枢神经系统急性淋巴细胞白血病的靶向治疗

叶嘉聪 ,  李琬琼 ,  陈美龄 ,  史乾坤 ,  王华 ,  李新玲 ,  李映荷 ,  杨杰 ,  王巧丽 ,  胡方 ,  高艳锋 ,  刘叔文 ,  曾木圣 ,  冯国开

工程（英文） ›› 2024, Vol. 35 ›› Issue (4) : 236 -251.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 35 ›› Issue (4) : 236 -251. DOI: 10.1016/j.eng.2023.11.012
研究论文

整合素α6靶向自组装促凋亡纳米多肽对中枢神经系统急性淋巴细胞白血病的靶向治疗

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Targeted Therapy of Central Nervous System Acute Lymphoblastic Leukemia with an Integrin α6-Targeted Self-Assembling Proapoptotic Nanopeptide

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摘要

目前，还没有用于中枢神经系统急性淋巴细胞白血病（CNS-ALL）的有效靶向治疗策略。整合素α6具有促进CNS-ALL疾病进展的作用，因此被认为是CNS-ALL诊断和治疗的潜在靶点。我们通过丙氨酸扫描、截短和D型替代等多肽优化技术，筛选并鉴定出与整合素α6具有纳摩尔亲和力的靶向肽D(RWYD)（简称RD），基于靶向肽开发了一款治疗CNS-ALL的纳米颗粒。该自组装促凋亡纳米多肽D(RWYD)-D(KLAKLAK)2-GD(FFY)（简称RD-KLA-Gffy）含有整合素α6靶向肽RD，以及被广泛认可的促凋亡肽D(KLAKLAK)2（简称KLA）和自组装四肽GD(FFY)（简称Gffy）。我们通过各种实验阐明了RD-KLA-Gffy的作用机理。研究结果表明：RD-KLA-Gffy在CNS-ALL病变中高度富集并诱导肿瘤细胞凋亡，进而减少CNS-ALL疾病负担并延长CNS-ALL模型小鼠的生存期，且无明显毒性。此外，RD-KLA-Gffy与甲氨蝶呤（MTX）联合用药时，表现出显著的抗肿瘤作用，表明RD-KLA-Gffy无论单独用药或与MTX联合用药，都在抑制CNS-ALL进展中发挥重要作用，对CNS-ALL治疗具有潜在应用价值。

Abstract

There is currently no effective targeted therapeutic strategy for the treatment of central nervous system acute lymphoblastic leukemia (CNS-ALL). Integrin α6 is considered a potential target for CNS-ALL diagnosis and therapy because of its role in promoting CNS-ALL disease progression. The targeted peptide D(RWYD) (abbreviated RD), with nanomolar affinity to integrin α6 was identified by peptide scanning techniques such as alanine scanning, truncation, and D-substitution. Herein, we developed a therapeutic nanoparticle based on the integrin α6-targeted peptide for treating CNS-ALL. The self-assembled proapoptotic nanopeptide D(RWYD)-D(KLAKLAK)2-GD(FFY) (abbreviated RD-KLA-Gffy) contains the integrin α6-targeted peptide RD, the well-known proapoptotic peptide D(KLAKLAK)2 (abbreviated KLA), and the self-assembling tetrapeptide GD(FFY) (abbreviated Gffy). The functional mechanism of RD-KLA-Gffy is clarified using different experiments. Our results demonstrate that RD-KLA-Gffy is highly enriched in CNS-ALL lesions and induces tumor cell apoptosis, thus reducing CNS-ALL disease burden and prolonging the survival of CNS-ALL mice without obvious toxicity. Moreover, the combined use of RD-KLA-Gffy and methotrexate (MTX) shows a potent antitumor effect in treating CNS-ALL, indicating that RD-KLA-Gffy plays an important role in suppressing CNS-ALL progression either as a single agent or in combination with MTX, which shows promise for application in CNS-ALL therapy.

关键词

中枢神经系统急性淋巴细胞白血病 / 整合素α6 / 靶向肽 / 促凋亡 / 纳米多肽

Key words

Central nervous system acute lymphoblastic leukemia / Integrin α6 / Targeted peptide / Proapoptotic / Nanopeptide

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叶嘉聪,李琬琼,陈美龄,史乾坤,王华,李新玲,李映荷,杨杰,王巧丽,胡方,高艳锋,刘叔文,曾木圣,冯国开. 整合素α6靶向自组装促凋亡纳米多肽对中枢神经系统急性淋巴细胞白血病的靶向治疗[J]. 工程（英文）, 2024, 35(4): 236-251 DOI:10.1016/j.eng.2023.11.012

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1 引言

以往的研究中，大约1%~5%未采用中枢神经系统（CNS）预防的急性淋巴性细胞白血病（ALL）患者会复发，形成中枢神经系统急性淋巴细胞白血病（CNS-ALL）[1‒2]。目前，CNS-ALL的主要临床治疗策略为：①口服糖皮质激素和地塞米松；②大剂量静脉注射甲氨蝶呤（MTX）联合鞘内注射；③适度的放疗[3‒5]。虽然这些方法在临床上取得了显著的短期效果，但其神经毒性对患者有长期影响[6‒7]。

基于抗体的免疫治疗是改善CNS-ALL治疗的一种新方法。有报道指出，CD19和CD3双抗原特异性抗体博纳吐（blinatumomab），可有效改善微小残留病灶（MRD）阳性患者的临床治疗结果。然而，blinatumomab可导致中枢神经系统事件和细胞因子释放综合征等毒性反应[8‒9]。其他抗体，如CD19单克隆抗体CD19-DE [10]、CD38抗体Daratumumab [11]和白细胞介素7受体（IL7R）单克隆抗体[12]等，在临床前的动物实验中也取得了良好的治疗效果。然而，这些抗体疗法的局限性在于它们向CNS的传递效率低下。另一种新治疗方法是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T）。一项CD19-CAR-T疗法的临床试验显示，此方案在化疗耐药的儿童和年轻人ALL中获得良好的治疗效果，细胞因子释放综合征的发生率较低[12]。在另一项耐药型B型ALL（B-ALL）临床试验中，两名CNS-ALL患者在CD19-CAR-T治疗后，脑脊液（CSF）中检测不到ALL细胞[13]。在另一项复发性B-ALL伴有CNS受累的国际研究中，经过CAR-T治疗后，54名患者中有51名（占比94%）达到完全缓解，但54名患者随后有22名（占比41%）出现复发[14]。这些临床试验的数据表明：CAR-T治疗可能是CNS-L的有效治疗方法。但是，目前不同临床试验中使用的CD19-CAR-T结构并不统一且疗效存在差异，且常伴有难以控制的细胞因子释放综合征等不良反应[15]。因此，迫切需要更安全、更有效的CNS靶向治疗。

整合素α6是由整合素α6基因（ITGA6）编码的跨膜蛋白[16]。自然条件下，整合素α6与β1或β4相互作用形成异二聚体，即整合素α6β1和α6β4，其在多种肿瘤中过表达[17‒18]。整合素α6β1和α6β4参与肿瘤发生、发展、免疫抑制、化疗和放疗耐受[17,19‒24]。基因表达谱互动分析（GEPIA）数据库分析显示，ITGA6基因在13种肿瘤中过表达，其中急性骨髓性白血病（AML）的肿瘤与正常组织的比值最高，为360.75（附录A中的表S1）。在一项复发性AML的临床研究中，整合素α6的表达显著上调，提示整合素α6可能是难治性AML的重要治疗靶点[21]。整合素α6在B-ALL中过表达，整合素α6基因的缺失会诱导B-ALL细胞的凋亡[25]。此外，整合素α6已被证明与层粘连蛋白相互作用，诱导ALL细胞向CSF迁移，表明整合素α6可直接促进CNS-ALL疾病进展[26]。另一项研究证实，磷酸肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂可以降低整合素α6的表达，从而减少CNS受累和延长B-ALL小鼠的存活[26]。此外，整合素α6已被证明介导B-ALL耐药[21,25]。总之，整合素α6在ALL细胞向CNS的迁移以及B-ALL耐药中具有重要作用。

前期研究中，我们通过噬菌体展示和二代测序技术鉴定了整合素α6靶向肽CRWYDENAC（简称RWY）[27]。与整合素αvβ3靶向肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）相似，RWY通过与整合素α6的结合从而表现出对肿瘤的高亲和力。RWY已被用于多种肿瘤的分子成像和靶向治疗，包括鼻咽癌[27]、肝细胞性肝癌（HCC）[28]和肠癌[29]的荷瘤小鼠以及乳腺癌患者[30]。最近，我们对整合素α6靶向肽RWY进行了丙氨酸扫描，鉴定出三个肿瘤靶向性的关键氨基酸，即精氨酸（R）、色氨酸（W）和酪氨酸（Y）[31]。此外，我们筛选出优化后的整合素α6靶向肽CRWYDANAC（简称S5），与RWY相比，其与整合素α6的结合亲和力提高了两倍[31]。基于S5，我们研发了三种分子成像探针，分别是近红外荧光（NIRF）探针Cy5-S5、磁共振（MR）探针Gd-S5以及正电子发射计算机断层扫描（PET）探针18F-S5，用于CNS-ALL模型小鼠的成像[32]。上述研究表明，整合素α6靶向肽是一种理想的载体工具，可应用于CNS-ALL的诊断和治疗。

在本项研究中，我们利用多肽优化技术筛选并鉴定了一条整合素α6靶向肽D(RWYD)（简称RD），该RD与整合素α6β1和α6β4具有纳摩尔亲和力。基于此多肽，我们开发了整合素α6靶向的自组装纳米多肽D(RWYD)-D(KLAKLAK)2-GD(FFY)（简称RD-KLA-Gffy），其由优化后的整合素α6靶向肽RD、促凋亡肽D(KLAKLAK)2（简称KLA）[33]和GD(FFY)（简称Gffy）[34]组成。RD-KLA-Gffy在体内和体外都能诱导白血病细胞凋亡，单独使用或与传统的ALL化疗药物MTX联合使用均能表现出抗白血病作用。

2 材料与方法

2.1 细胞培养

肝癌细胞HCC-LM3、Huh7和Hep3B，白血病细胞Nalm6、Jurkat和K562，以及卵巢癌细胞HeLa，均来源于美国细胞培养物收藏中心（ATCC）。HCC-LM3、Huh7、Hep3B和HeLa细胞在含有10%胎牛血清和0.5%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养；Nalm6、Jurkat和K562细胞在含有10%胎牛血清和0.5%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中培养。为了进一步验证多肽与细胞的亲和力，使用CRISPR/Cas9基因组编辑系统[和元生物技术（上海）股份有限公司]将ITGA6基因敲除，构建慢病毒稳定转染HCC-LM3和HeLa细胞株。为便于监测肿瘤，Nalm6细胞稳定转染了荧光素酶[和元生物技术（上海）股份有限公司]。所有细胞都经过定期鉴定，确保为支原体阴性。

2.2 多肽的合成

本研究涉及的所有多肽均由中肽生化有限公司合成，均具有完整的质量控制报告。本研究涉及的所有多肽的氨基酸序列如下：环肽CRWYDENAC（简称RWY）、CAWYDENAC、CRAYDENAC、CRWADENAC、CRWYAENAC（简称M4）、CRWYDANAC（简称S5）、CRWYDEAAC（简称M5）、RWYDENA、RWYDANA、RWYDEN、RWYDAN、RWYDE和RWYDA；线性肽RWYD、RWY和D(RWYD)（简称RD）；荧光肽CRWYDENAC-PEG4-K-FITC（简称FITC-RWY）和RWYD-PEG4-K-FITC（简称FITC-RWYD）；纳米多肽及其对照肽D(RWYD)-D(KLAKLAK)2-GD(FFY)（简称RD-KLA-Gffy）、D(CRWYAENAC)-D(KLAKLAK)2-GD(FFY)（简称M4-KLA-Gffy）、D(CRWYDEAAC)-D(KLAKLAK)2-GD(FFY)（简称M5-KLA-Gffy）、D(CRWYDENAC)-D(KLAKLAK)2-GD(FFY)（简称RWY-KLA-Gffy）、D(KLAKLAK)2-GD(FFY)（简称KLA-Gffy）、D(RWYD)-D(KLAKLAK)2（简称RD-KLA）、D(KLAKLAK)2（简称KLA）和D(RWYD)-GD(FFY)（简称RD-Gffy）。

2.3 微量热泳动分析

在微量热泳动（MST）分析中，用活性荧光染料RED-tris-NTA（#MO-L018，NanoTemper Technologies, Germany）标记整合素α6β4或α6β1重组蛋白（#CT069-H2508H或#CT013H2508H，北京义翘神州科技股份有限公司）。将不同浓度的多肽与标记好的蛋白质在25 ℃孵育5 min，然后将试管中的混合物吸入毛细管（#MO-K022, NanoTemper Technologies, Germany），用Monolith NT.115（NanoTemper Technologies, Germany）进行样品检测。

2.4 分子对接

通过SWISS-MODEL同源建模[35]获得了整合素α6的晶体结构，并通过添加排他性氢原子和缺失原子进行了优化。多肽的三维结构由PEPstrMOD软件[36‒37]生成，并通过ZDOCK软件[38]与整合素α6的最佳结构进行无偏对接。利用MOE软件分析蛋白质与多肽的对接模式，并根据结合力和相互作用位点等参数选择最佳的对接模式[39]。

2.5 流式细胞术

为了检测细胞中整合素α6的表达，细胞以1×106个∙mL-1的密度接种到6孔板中，然后在4 ℃下，用整合素α6抗体（vFAB13501P, R&D Systems, USA）和免疫球蛋白G2A（IgG2A）抗体（#IC006P, R&D Systems）以每106个细胞10 μL的浓度进行染色。孵育30 min后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次，并在CytoFLEX S流式细胞仪（Beckman Coulter, USA）上进行分析。为了研究多肽RD与细胞的结合情况，细胞以1×106个∙mL-1的密度接种到6孔板中，然后在37 ℃下用1 μmol∙L-1浓度的FITC-多肽孵育60 min，用PBS冲洗细胞3次，并在CytoFLEX S细胞分析仪上进行分析。为了验证纳米多肽对白血病细胞的杀伤效果，细胞以1×106个∙mL-1的密度接种到6孔板中，然后在37 ℃下用5 μmol∙L-1浓度的纳米多肽孵育60 min，用PBS冲洗细胞3次，然后在4 ℃下用Annexin V/PI（#BMS500FI, Invitrogen, USA）染色30 min，用PBS冲洗3次，然后在CytoFLEX S流式细胞仪上进行分析。

2.6 纳米多肽的物理表征

纳米多肽由中肽生化有限公司合成，具有高效液相色谱法（HPLC）和质谱法（MS）的质量控制报告。临界聚集浓度（CAC）值通过动态光散射（DLS）测定（Malvern, UK）。不同浓度纳米多肽溶液进行DLS检测，记录光散射强度以进行CAC计算。纳米多肽的Zeta电位和尺寸由DLS检测。使用TEM显微镜（FEI Tecnai Spirit TEM T12, USA）以100 000倍的放大率获取纳米多肽的透射电子显微镜（TEM）图像。

2.7 纳米多肽的细胞毒性

为了测定纳多米肽的细胞毒性，细胞以1×106个∙mL-1的密度接种到96孔板中，然后与不同浓度的纳米多肽及其对照肽在37 ℃下孵育。3 h后，用细胞计数试剂盒（CCK-8）（#C0039，上海碧云天生物技术有限公司）对细胞进行染色。3 h后，用紫外线（UV）光谱仪（BioTek Synergy H1, USA）检测孔板的OD450。为了实时监测纳米多肽对细胞的细胞毒性，将细胞以5×104个∙mL-1的密度接种到96孔板中。然后用5 μmol∙L-1纳米多肽及其对照肽和2.5 μmol∙L-1 SYTOX Green核酸染色剂（#S7020, Invitrogen）孵育细胞，使用实时监测系统（Essen Bioscience IncuCyte S3, USA）每隔10 min对细胞进行拍照并记录。

2.8 蛋白质提取和蛋白印迹

细胞用5 μmol∙L-1浓度的纳米多肽及其对照肽孵育3 h后，经PBS冲洗，用RIPA裂解缓冲液（#P0013B，上海碧云天生物技术有限公司）提取并溶解蛋白质。用Bradford法（#23225, Thermo Fisher, USA）测定蛋白质浓度。蛋白经过SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转移到PVDF膜上，然后在4 ℃与抗体孵育过夜，抗体包括Caspase-3（1∶2000, #ab32351, Abcam, UK）、cleaved Caspase-3（1∶500, #ab32042, Abcam）、Cspase8（1∶2000, #ab227430, Abcam）、PARP1（1∶1000, #ab191217, Abcam）、cleaved PARP1（1∶1∶1000, #ab32064, Abcam）、BCL-2（1∶1000, #15071, Cell Signaling Technology, USA）和β-tubulin（1∶1000, #2146, Cell Signaling Technology）。最后，使用山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G（IgG-HRP）抗体（1∶10000, #G-21234, Thermo Fisher）和山羊抗小鼠IgG HRP抗体（1∶10 000, #31430, Thermo Fisher）作为二抗。

2.9 小鼠模型构建

小鼠实验通过了中山大学肿瘤防治中心实验动物福利伦理委员会（IACUC）的批准（IACUC批准号：L025501202204008）。为了构建皮下瘤小鼠，6周的雌性BALB/c-裸鼠（上海模式生物中心）皮下接种了1×106个Nalm6-luc-EGFP细胞。同样，为了构建CNS-ALL小鼠[26]，给6周的雌性NOD/SCID/IL-2Rγ（NSG）小鼠（上海模式生物中心）尾静脉注射1×106个Nalm6-luc-EGFP细胞。大约8天后，通过luminescence成像观察到在小鼠头部（脑膜）中Nalm6-luc-EGFP的luminescence发光时，即认为CNS-ALL小鼠模型构建成功。

2.10 近红外荧光成像

为验证纳米多肽的肿瘤靶向性，使用EZLabel蛋白Cy5标记试剂盒（#K839-5, BioVision, USA）标记RD-KLA-Gffy，使其具备红色荧光，并通过分子筛（General Electric, USA）纯化Cy5标记的RD-KLA-Gffy（简称Cy5-RD-KLA-Gffy）和Cy5标记的KLA-Gffy（简称Cy5-KLA-Gffy）。尾静脉注射0.5 mg∙kg-1的Cy5-RD-KLA-Gffy或Cy5-KLA-Gffy到皮下瘤小鼠或CNS-ALL小鼠体内，1 h、12 h、24 h和48 h后，使用体内成像系统（IVIS）（PerkinElmer, USA）进行近红外荧光成像。腹腔注射150 mg∙kg-1荧光素（#P1041, Promega, USA）5 min后开始进行luminescence成像，并在640 nm激发波长和680 nm发射波长处进行近红外荧光成像。成像结束后，采用颈椎脱臼法对小鼠实施安乐死，并立即解剖尸体，记录肿瘤和重要器官的luminescence光和近红外荧光信号强度。

2.11 免疫荧光、苏木精和伊红（HE）染色及免疫组织化学（IHC）

CNS-ALL小鼠的大脑制备成冰冻切片，用1 μg∙mL-1 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（#28718-90-3, Sigma, USA）染色，并用ProLong Gold Antifade (P26930, Invitrogen)装片。在共聚焦显微激光扫描系统（3DHISTECH Pannoramic MIDI, Hungary）下采集荧光图像。在荧光图像中，蓝色荧光代表细胞核，绿色荧光代表Nalm6-lucEGFP细胞，红色荧光代表纳米多肽Cy5-RD-KLA-Gffy。冷冻切片按照常规组织学程序进行了HE染色。此外，还使用整合素α6抗体（1∶150, #ab181551, Abcam）对冰冻切片进行IHC，IHC按照我们之前报道的常规程序进行[28]，并在显微镜（Nikon Eclipse, Japan）下观察图像。

2.12 小鼠生存实验

如2.9节所述，成功构建CNS-ALL小鼠模型后，将小鼠分成若干组，每组10只。小鼠每两天尾静脉注射一次药物，其中RD-KLA-Gffy和对照肽的浓度为5 mg∙kg-1，MTX的浓度为2 mg∙kg-1。监测CNS-ALL小鼠的体重和存活曲线，通过体内成像系统检测Nalm6-luc-EGFP细胞分布。

2.13 统计分析

所有统计数据均使用GraphPad Prism软件（版本8.3.0.538）进行分析。统计方法采用单因素方差分析（ANOVA）或双因素方差分析，结果以均数±标准差（SD）表示。存活实验的统计分析采用对数秩和检验。P值表示如下：ns，无显著性差异；P>0.05；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

3 结果

3.1 高亲和力整合素α6靶向肽的鉴定

尽管整合素α6靶向肽RWY和S5都能在肿瘤组织中高度富集[27‒28,31]，但它们与整合素α6β1和α6β4的亲和力仍然相对较低，仅微摩尔级别。为了获得与整合素α6β1和α6β4具有更强亲和力的整合素α6靶向肽，我们采用了三种多肽优化技术，即丙氨酸扫描、截短和D型替代[图1（a）]。基于已鉴定的整合素α6靶向肽RWY和S5，我们利用丙氨酸扫描和截短技术设计并合成了一系列多肽突变体。然后，利用MST法分析多肽突变体与整合素α6β4的亲和力，RWY和S5的解离常数K d值分别为(6.97 ± 1.44) μmol∙L-1和(4.34 ± 3.42) μmol∙L-1（表1）。在这些多肽突变体中，线性多肽突变体RWYD表现出最高的亲和力[K d = (21.82 ± 3.86) nmol∙L-1]，其亲和力大约是RWY的319倍[图1（b）]。此外，两个环状多肽突变体M4和M5也表现出更强的亲和力，相对于RWY分别增强了17倍和11倍（表1；附录A中的图S1）。此外，线性肽RWYD与整合素α6β1的亲和力为(23.95 ± 6.10) nmol∙L-1，比RWY [K d = (5.63 ± 1.01) μmol∙L-1]增强大约235倍[图1（b）]。总之，这些结果表明，线性肽RWYD与整合素α6β4 [K d = (21.82 ± 3.86) nmol∙L-1]和整合素α6β1 [K d = (23.95 ± 6.10) nmol∙L-1]具有纳摩尔亲和力，是一条优秀的整合素α6靶向肽。

此外，为了确定RWYD与整合素α6结合的关键氨基酸，我们进行了分子对接分析，如图1（c）所示：RWYD或RWY在整合素α6上的相互作用位点被突出显示。RWYD在整合素α6上有三个氢键（R1-S331、Y3-Y450和D4-H110）和一个芳烃疏水（W2-Y273）。相比之下，RWY只有两个氢键（R2-S331和Y4-R111）和一个芳香疏水相互作用（W3-F23）。也就是说，与RWY相比，RWYD多了一个结合相互作用位点（D4-H110），这可以解释为什么RWYD对整合素α6β4和α6β1的亲和力强于RWY。

3.2 优化后的整合素α6靶向肽的特异性结合力

为了检测优化后的整合素α6靶向肽RWYD与整合素α6的亲和力，我们设计并合成了两条FITC标记的多肽，即FITC-RWY和FITC-RWYD，并且检测这两条多肽对具有不同整合素α6表达水平的三种HCC细胞的结合力。我们首先用整合素α6的流式抗体确定了细胞整合素α6的表达水平，结果显示：整合素α6在HCC-LM3细胞中高表达，在Huh7细胞中中等表达，在Hep3B细胞中低表达[图2（a）]。在整合素α6高中低表达的细胞中，FITC-RWYD与HCC-LM3细胞的结合力较高，与Huh7细胞中的结合力适中，与Hep3B细胞的结合力较低[图2（b）~（d）]。在整合素α6高表达的HCC-LM3和中等表达的Huh7细胞中，FITC-RWYD与细胞结合力显著高于FITC-RWY [图2（e）]；而在整合素α6低表达的Hep3B细胞中，FITC-RWYD和FITC-RWY与细胞结合力之间没有显著差异[图2（e）]。此外，我们还比较了FITC-RWYD与Nalm6、Jurkat和K562等三种白血病细胞的结合力。与HCC细胞相似，在整合素α6高表达的Nalm6和Jurkat细胞中，FITC-RWYD比FITC-RWY具有更强的细胞结合力；而在整合素α6低表达的K562细胞中，FITC-RWYD和FITC-RWY的细胞结合力没有显著差异（附录A中的图S2）。这些结果表明，优化后的整合素α6靶向肽RWYD的细胞结合力与细胞整合素α6的表达水平相关。

为了进一步确认RWYD的特异性结合，我们使用CRISPR/Cas9基因组编辑系统，对两种高表达整合素α6的HCC-LM3肝癌细胞和HeLa卵巢癌细胞进行了ITGA6基因敲除（KO）[图2（f）]。结果符合预期，FITC-RWYD与ITGA6敲除的HCC-LM3-KOα6和HeLa-KOα6的结合力大幅下降[图2（g）~（i）]。这些结果说明，优化后的整合素α6靶向肽RWYD与细胞结合力主要取决于整合素α6的表达量，即RWYD特异性结合于整合素α6。

3.3 整合素α6靶向自组装纳米多肽RD-KLA-Gffy的特性

考虑到右旋氨基酸的体内稳定性一般比左旋氨基酸强，我们对多肽进行了D型替代。MST结果显示：右旋RWYD与整合素α6β4 [K d= (30.29.2.83) nmol∙L-1]和α6β1 [K d = (19.23 ± 3.04) nmol∙L-1]的亲和力同左旋RWYD与整合素α6β4 [K d = (21.82 ± 3.86) nmol∙L-1]和α6β1 [K d = (23.95 ± 6.10) nmol∙L-1]的亲和力相近（表2；附录A中的图S3）。因此，我们将右旋整合素α6靶向肽RWYD简称为RD，并应用于后续的研究。

前期研究中，我们基于整合素α6靶向肽S5，开发了三种整合素α6靶向肽的分子探针，并在CNS-ALL小鼠中检验了此三种分子探针的影像学效果，例如，用于NIRF成像的Cy5-S5、用于MR成像的Gd-S5以及用于PET成像的18F-S5 [32]。这些整合素α6靶向的分子探针在CNS-ALL小鼠的肿瘤处高度富集，表明整合素α6靶向肽对CNS-ALL的靶向治疗是有价值的。因此，我们设计了整合素α6靶向的自组装纳米多肽RD-KLA-Gffy，其由整合素α6靶向肽RD、促凋亡肽KLA [33]和自组装四肽Gffy [34]组成[图3（a）]。在RD-KLA-Gffy的不同成分中，RD作为肿瘤靶向肽，使纳米多肽特异性地靶向于高表达整合素α6的肿瘤，促凋亡肽KLA诱导肿瘤细胞凋亡，Gffy作为纳米多肽的骨架，使其在溶液中自主装成纳米球。纳米多肽RD-KLA-Gffy的合成过程见附录A中的图S4，其HPLC色谱和MS质谱见附录A中的图S5。RD-KLA-Gffy的基本纳米特征由DLS仪检测。RD-KLA-Gffy的CAC值为2.52 μmol∙L-1 [图3（b）]，Zeta电位为7.07 mV [图3（c）]，表明其能自组装成纳米颗粒。DLS仪测得RD-KLA-Gffy的直径为21.8 nm [图3（d）]，与TEM显微镜下观察到的结果相近[图3（e）]。此外，RD-KLA-Gffy对整合素α6β4和α6β1的亲和力分别为(70.6 ± 3.4) nmol∙L-1和(25.7 ± 4.3) nmol∙L-1，略低于单独靶向肽RD对整合素α6β4 [K d = (30.29 ± 2.83) nmol∙L-1]和α6β1 [K d = (19.23 ± 3.04) nmol∙L-1]的亲和力[图3（f）]。

3.4 整合素α6靶向自组装纳米多肽RD-KLA-Gffy的抗肿瘤作用

除了RD-KLA-Gffy外，我们还合成了其他纳米多肽作为对照肽，包括M4-KLA-Gffy、M5-KLA-Gffy和RWY-KLA-Gffy [附录A中的图S6（a）]。我们使用CCK-8细胞活力试剂盒检测纳米多肽的抗肿瘤作用。结果显示：所有纳米多肽都具有剂量依赖的细胞毒性，其中RD-KLAGffy对Nalm6细胞的毒性最大，半数最大抑制浓度（IC50）值为3.15 μmol∙L-1 [图S6（b）]。然后，我们用5 μmol∙L-1浓度的RD-KLA-Gffy或对照肽处理Nalm6细胞，并用SYTOX绿色核酸染染料和细胞实时监测系统，每隔10 min对细胞进行拍照，持续监测纳米多肽对细胞的杀伤情况。结果显示，RD-KLA-Gffy在药物处理的前40 min，细胞毒性最大，显著大于其他对照组肽[图S6（c）、（d）]。

我们还检测了这些纳米多肽对其他高表达整合素α6的肿瘤细胞的细胞毒性，包括白血病细胞Jurkat、鼻咽癌细胞HNE1和S18、食管癌细胞KYSE30和KYSE450、结直肠癌细胞SW620和宫颈癌细胞HeLa [附录A中的图S7（a）]。结果显示，RD-KLA-Gffy在这些肿瘤细胞中的IC50值均小于10 μmol∙L-1，而M4-KLA-Gffy、M5-KLA-Gffy和RWY-KLA-Gffy的IC50值普遍高于10 μmol∙L-1，表明纳米多肽对肿瘤细胞的细胞毒性，与其所组成的靶向肽的亲和力呈正相关关系[图S7（b）]。

随后，我们又设计了几条对照肽，并测定它们对Nalm6的细胞毒性，包括KLA-Gffy、RD-KLA、KLA和RD-Gffy [图4（a）]。结果显示，RD-KLA-Gffy的IC50值最低（5.12 μmol∙L-1），约为KLA-Gffy的三分之一（14.17 μmol∙L-1）或RD-KLA的四分之一（22.09 μmol∙L-1）[图4（b）]，表明RD-KLA-Gffy具有最强的细胞毒性。在多肽处理150 min后，PBS对照组SYTOX阳性的Nalm6细胞百分比为2.39%，KLA对照组为9.09%，RD-Gffy对照组为2.54%，RD-KLA对照组为25.50%，KLA-Gffy对照组为54.61%，而RD-KLA-Gffy实验组为91.78% [图4（c）、（d）]。在Jurkat细胞中，RD-KLA-Gffy也表现出快速且强力的细胞毒活性[附录A中的图S8（a）、（b）]。

在检验了RD-KLA-Gffy对ALL细胞的杀伤作用后，我们进一步研究其对细胞的杀伤机制。考虑到纳米多肽含有促凋亡肽KLA，我们使用annexin V/PI染色的凋亡流式细胞分析以及western blotting蛋白印迹法检测凋亡标志物，来鉴定RD-KLA-Gffy对细胞的促凋亡作用。流式细胞分析结果显示，多肽处理3 h后，RD-KLA-Gffy组中98.88%的Nalm6细胞发生凋亡，KLA-Gffy组为89.23%，RD-KLA组为61.58%，而RD-Gffy组、KLA组和PBS组的细胞状态几乎维持不变[图4（e）]。此外，RD-KLA-Gffy组中99.98%的Jurkat细胞发生凋亡[图S8（c）]。随后，我们利用蛋白印迹法检测了几种主要凋亡蛋白表达的变化，发现caspase-3、caspase-8、PARP和BCL-2的表达下调，而cleaved caspase-3和cleaved PARP的表达上调[图4（f）]。这些结果表明，纳米多肽RD-KLA-Gffy对ALL的细胞毒性的主要杀伤机制是促凋亡作用。

3.5 整合素α6靶向自组装纳米多肽RD-KLA-Gffy的肿瘤靶向性

为了验证RD-KLA-Gffy纳米多肽在体内的抗白血病作用，我们使用Cy5标记试剂盒将纳米多肽标记上Cy5荧光，并使用分子筛对其产物进行纯化和验证（附录A中的图S9）。通过尾静脉将标记上荧光的Cy5-RD-KLA-Gffy注射到Nalm6-luc-EGFP皮下瘤小鼠体内。48 h后，Cy5-RD-KLAGffy在肿瘤中显著富集，而在皮肤或肠、肾和膀胱等代谢器官中的摄取较低[附录A中的图S10（a）]。Cy5-RD-KLA-Gffy的红色荧光和Nalm6-luc-EGFP细胞的luminescence光在皮下肿瘤中表现出强共定位。随后对小鼠实施安乐死，收集其主要器官和肿瘤标本进行分析，数据还显示，Cy5-RD-KLA-Gffy主要分布在肿瘤组织中，并与luminescence光的Nalm6-luc-EGFP细胞共定位[图5（a）；图S10（b）]。在Nalm6-luc-EGFP构建的CNS-ALL小鼠中，Nalm6-luc-EGFP细胞主要分布在小鼠的头部和脊柱中（附录A中的图S11），这些细胞与Cy5-RD-KLA-Gffy的红色荧光强共定位，表明Cy5-RD-KLA-Gffy可以特异性靶向CNS-ALL病灶[图5（b）]。此外，Cy5-KLA-Gffy也与Nalm6-luc-EGFP细胞有轻微的共定位（附录A中的图S12），但这种共定位效果远低于Cy5-RD-KLA-Gffy。我们剥离CNS-ALL小鼠的脑部，并进行荧光显微镜扫描，结果显示Cy5-RDKLA-Gffy的红色荧光和Nalm6-luc-EGFP的绿色荧光在脑膜中高度共定位[图5（c）]。免疫组化结果也证实了整合素α6在CNS-ALL的病灶中过表达[图5（d）]。综合Nalm6luc-EGFP皮下瘤小鼠和CNS-ALL小鼠的结果，进一步证实了自组装纳米多肽RD-KLA-Gffy对白血病细胞的特异性靶向能力，为后续的靶向治疗提供更多的依据。

3.6 纳米多肽RD-KLA-Gffy在CNS-ALL小鼠中的治疗效果

一般来说，多肽类药物具有良好的生物相容性、较低的不良反应和生物毒性[40‒41]。我们对治疗剂量的RD-KLA-Gffy开展体内毒性分析。数据表明，RD-KLA-Gffy多次给药后，小鼠体重没有显著变化[附录A中的图S13（a）]，血液生化指标也维持在正常范围内（附录A中的表S3），主要器官也没有明显的病理损害，表明在RD-KLA-Gffy治疗期间没有系统性副作用[图S13（b）]。

为了研究RD-KLA-Gffy在体内的治疗效果，我们评估纳米多肽RD-KLA-Gffy或其他对照肽给药治疗后CNS-ALL小鼠的生存曲线[图6（a）]。给药20天后，生理盐水组和KLA-Gffy组小鼠的体重因疾病进展而下降。相反，RD-KLA-Gffy治疗组小鼠的体重保持正常，表明RD-KLA-Gffy抑制了疾病进展[图6（b）]。体内成像结果也显示RD-KLA-Gffy组中Nalm6-luc-EGFP的luminescence发光信号在给药第20天显著低于其他对照组[图6（c）、（d）；附录A中的图S14]。此外，生理盐水组、RD-KLA组、KLA-Gffy组和RD-KLA-Gffy组CNS-ALL小鼠的中位生存期分别为14天、17天、19天和22天，表明RD-KLA-Gffy有效地延长了CNS-ALL小鼠的生存率[图6（e）]。为了进一步验证RD-KLA-Gffy的治疗效果，我们使用RD-KLA-Gffy和MTX联合用药治疗CNS-ALL小鼠。体内成像显示，相对于其他对照组，RD-KLA-Gffy和MTX联合用药组中Nalm6-luc-EGFP的luminescence发光信号最低，即疾病进展被显著抑制[图6（f）]。生理盐水组、RD-KLA-Gffy组、MTX组和RD-KLA-Gffy和MTX联合用药组的小鼠的中位生存期分别为17天、22天、21天和30天[图6（g）]。综合两次CNS-ALL小鼠的治疗结果，RD-KLA-Gffy无论是单独给药还是与MTX联合给药，都具有良好的治疗效果。

3.7 示意图

本研究通过丙氨酸扫描、截短和D型替代等多肽优化技术，筛选并鉴定出高亲和力整合素α6靶向肽RWYD和RD。在此基础上，我们设计了一种抗白血病的自组装纳米多肽RD-KLA-Gffy，并验证了其对CNS-ALL的治疗效果。我们的结果表明，RD-KLA-Gffy通过诱导细胞凋亡，有效地抑制白血病的进展，显著地延长CNS-ALL小鼠的生存（图7）。

4 讨论

整合素α6在白血病疾病进展中起重要作用。根据B-ALL儿童患者的基因表达谱研究，整合素α6常在B-ALL中过度表达，是检测MRD免疫表型的潜在标记物[42]。临床研究表明，整合素α6，而非整合素α4，与ALL的持续性MRD有关[43]。当白血病细胞向脑侵袭时，ALL细胞首先侵袭脑边缘的脑膜和脊髓，晚期才侵入脑实质。整合素α6-层粘连蛋白相互作用介导ALL细胞向脑脊液的迁移[26]。PI3K抑制剂GS-649443或特异性整合素α6中和抗体能降低B-ALL细胞中整合素α6的表达，减少CNS的侵袭，并延长B-ALL小鼠的生存期[26]。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的pan-PI3K抑制剂copanlisib能下调B-ALL细胞中整合素α6的表达，降低CNS侵袭，抑制白血病在骨髓（BM）中的进展，改善白血病小鼠对化疗的反应[44]。目前正在开展copanlisib的I期临床试验，研究整合素α6表达和淋巴细胞增殖对难治性或复发性B-ALL成人患者（NCT04803123）的影响。其他整合素也与CNS-ALL有关联，但仍没有针对其他整合素或其下游信号通路的药物进入临床试验。

前期研究中，我们报道了整合素α6靶向肽RWY和S5，其中的S5被用于CNS-ALL小鼠的分子成像[32]。虽然RWY和S5已经具有良好的肿瘤靶向作用，但两者对整合素α6的亲和力仍然相对较低，仅微摩尔级别。为了寻找与整合素α6具有更强结合亲和力的整合素α6靶向肽，我们使用了丙氨酸扫描、截短和D型替代等多肽三种优化技术。丙氨酸扫描是指系统地将多肽中每个氨基酸替换为丙氨酸。丙氨酸扫描可以合理地优化氨基酸的序列，由于丙氨酸无活性侧链基团且体积小，将其他类型的氨基酸替换成丙氨酸，对多肽结构的影响不大。丙氨酸扫描已被广泛使用，如细胞穿透肽TAT-RasGAP317-326 [45]、肠血管活性多肽[46]和向日葵蛋白酶抑制剂-1 [47]。此外，截短可以缩短多肽的长度，保留真正有具有靶点特异性的氨基酸，降低合成成本。截短已应用于抗菌肽anoplin [48]、神经激肽受体速激肽Substance P [49]和分泌素受体类似肽[50]。此外，D型替代是指L-氨基酸被相应的D-氨基酸取代。D型替代可以提高多肽类药物的生物稳定性和药效。D型替代已应用于T细胞受体接触残基[51]、抗菌肽D-LL-37 [52]和p53MDM2/MDMX多肽抑制剂[53]。因此，使用丙氨酸扫描和截短技术，我们系统地设计了一系列基于RWY和S5的多肽突变体，并通过MST测定评估它们与整合素α6β4的亲和力（表1）。令人惊讶的是，线性肽RWYD对整合素α6具有纳摩尔亲和力，与RWY相比，亲和力增加了约319倍[(21.82 ± 3.86) nmol∙L-1 vs. (6.97 ± 1.44) μmol∙L-1]。此外，我们通过分子对接[图1（c）]和流式细胞术（图2）检测了多肽与整合素α6的亲和力。D型氨基酸通常比L型氨基酸更稳定，因此，我们利用D型多肽RD作为整合素α6的靶向肽，设计并合成了自组装纳米多肽RD-KLA-Gffy，用于后续的研究。

抗肿瘤生物活性肽（ACPs）在肿瘤治疗方面表现出较好的应用潜力[54‒55]。ACP常常与肿瘤靶向肽偶联，可以提高其特异性并降低其毒性。促凋亡肽KLA是被广泛认可的一种ACP，其最早由Ellerby [56]发现。KLA对正常细胞无毒性，然而，如果其借助细胞穿透肽（CPPs）进入肿瘤细胞，会破坏线粒体，导致细胞色素C的释放，促进Caspase 3剪切活化，进而促进细胞凋亡。在小鼠中进行了KLA毒性测试，结果表明KLA在3个月内无毒性[56]。此外，KLA与整合素αvβ3靶向肽RGD偶联形成的ACP，具备抗肿瘤和低全身毒性的特性[56‒58]。而大剂量MTX给药具有较高的毒性，容易引起不良反应，尤其是急性肾损伤（AKI），AKI可出现在2%~12%患者身上[59]。

与线性肽或环肽相比，自组装多肽具有稳定性好、靶向释放、增强免疫等优点[60]。众所周知，线性肽比环肽稳定性差，但环肽合成成本更高。多肽自组装技术可以在特定的环境中将多肽固定成特定的形状，并在一定程度上增加多肽的稳定性[61]。有报道指出，自组装多肽可以作为佐剂增强细胞和体液免疫[62]。Gffy是由L-甘氨酸、D-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和D-酪氨酸四个氨基酸组成的自组装多肽。Gffy可以与ACP偶联形成水溶性的自组装纳米颗粒，有效地增强ACP的稳定性，降低血浆清除率，并促进药物内化到肿瘤细胞中[34]。Gffy已被用于治疗肺癌和乳腺癌[34,63]。本研究中，我们将促凋亡肽KLA、自组装多肽Gffy和优化后的整合素α6靶向肽RD组装成自组装纳米多肽RD-KLA-Gffy，其通过诱导细胞凋亡表现出高效的抗白血病作用（图4）。RD-KLA-Gffy在白血病病灶中特异性富集（图5），并延长CNS-ALL小鼠的生存期。重要的是，RD-KLA-Gffy和MTX联合用药的疗效优于它们各自的疗效（图4）。因此，RD-KLA-Gffy可以在传统的临床治疗方法（MTX为主的化疗）的基础上，有效地提高CNS-ALL小鼠的生存率。

基于纳米多肽RD-KLA-Gffy与MTX联合治疗CNS-ALL的显著效果，我们可以通过接头直接将RD-KLA-Gffy与MTX结合，形成多肽偶联药物（PDC），从而简化给药过程，改善治疗效果。MTX的抗体偶联药物（ADC）已被证明对B细胞淋巴瘤有治疗效果[64]。与ADC相比，PDC具有更小的分子量、更强的肿瘤渗透性和更低的免疫原性等优点[65]，也更容易跨越血脑屏障进入中枢神经系统[66]。此外，我们还可以将RD-KLA-Gffy或RD-Gffy与1,4,7,10四氮杂环十二烷-N,N′,N″,N″′-四乙酸（DOTA）螯合剂偶联形成放射性核素偶联药物（RDC）。此RDC可以用镓-68标记，应用于CNS-ALL的PET成像，也可以用镥-177标记，应用于CNS-ALL的治疗。而我们在RDC领域已经有相当丰富的经验，例如，第二代整合素α6靶向肽S5应用于CNS-ALL小鼠PET成像[32]；纤连蛋白额外结构域B（EDB-FN）靶向肽应用于甲状腺癌的手术导航、PET成像和靶向治疗[67]。因此，纳米多肽RD-KLA-Gffy或RD-Gffy作为有效的靶向载荷系统，可应用于无创的分子影像和靶向治疗且毒性低，具有很大的应用前景。

本研究存在一些局限性。首先，模型小鼠的治疗实验仅用了一种细胞Nalm6，这是因为Nalm6来源于CNS-ALL复发的患者，用Nalm6构建的CNS-ALL小鼠模型是一个可重复且被广泛认可的模型，所以我们在最初的体内实验中仅使用了Nalm6来验证纳米多肽的治疗效果。然而，其他细胞系可能对Caspase介导的细胞凋亡不太敏感，因此，我们下一步计划用RCH-ACV和LAX7R等其他ALL细胞进行小鼠实验。其次，复发性ALL患者的淋巴细胞可以更好地反映临床治疗效果，在第一次人体试验之前，我们计划采集患者的淋巴细胞，进行更多细胞和小鼠实验。再次，研究中我们描述了RD-KLA-Gffy利用整合素α6介导的内化作用及纳米颗粒的增强渗透和滞留（EPR）效应进入细胞，但是还没有阐明RD-KLA-Gffy是如何释放和降解以及如何逃离内体/溶酶体？为了解决上述问题，我们将系统地开展更多的实验，并在后续研究中解决这些问题。

5 结论

总之，我们优化了一种高亲和力整合素α6靶向肽RD，并进一步设计了一种抗白血病的自组装纳米多肽RD-KLA-Gffy。RD-KLA-Gffy能诱导白血病细胞凋亡，在CNS-ALL病灶中特异性地富集，其单独使用或与MTX联合用药都能延长CNS-ALL小鼠的生存期。因此，整合素α6靶向的自组装纳米多肽RD-KLA-Gffy在CNS-ALL治疗中具有广阔的应用前景。

Authors’ contribution

Jia-Cong Ye, Wan-Qiong Li, Mei-Ling Chen, and Qian-Kun Shi collected, analyzed, and interpreted the data obtained from all experiments. Hua Wang, Xin-Ling Li, Ying-He Li, Jie Yang, Qiao-Li Wang, and Fang Hu provided resources and assistance. Jia-Cong Ye, Wan-Qiong Li, and Guo-Kai Feng wrote the manuscript. Yan-Feng Gao, Shu-Wen Liu, Mu-Sheng Zeng, and Guo-Kai Feng supervised the experiments and reviewed the manuscript. All the authors have read and approved the final manuscript.

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