人类肝移植图谱揭示了一种与早期移植物功能不全发生相关的致病免疫生态位

工程（英文） ›› 2024, Vol. 36 ›› Issue (5) : 206 -223. DOI: 10.1016/j.eng.2023.12.004

研究论文

邵鑫 ^a^,^b ,
王峥 ^a^,^b ,
汪恺 ^c^,^d ,
陆晓燕 ^a^,^b ,
张萍 ^a ,
郭蓉芳 ^a ,
廖杰 ^a^,^b ,
杨鹏挥 ^a ,
郑树森 ^d^,^e ,
徐骁 ^c^,^d ,
范骁辉 ^a^,^b^,^f

作者信息 +

A Single-Cell Landscape of Human Liver Transplantation Reveals a Pathogenic Immune Niche Associated with Early Allograft Dysfunction

Xin Shao ^a^,^b^,^- ,
Zheng Wang ^a^,^b^,^- ,
Kai Wang ^c^,^d^,^- ,
Xiaoyan Lu ^a^,^b^,^- ,
Ping Zhang ^a ,
Rongfang Guo ^a ,
Jie Liao ^a^,^b ,
Penghui Yang ^a ,
Shusen Zheng ^d^,^e ,
Xiao Xu ^c^,^d^,^* ,
Xiaohui Fan ^a^,^b^,^f^,^* ,

Author information +

文章历史 +

Received	Accepted	Published
2023-08-29	2023-12-25
Issue Date
2024-06-14

PDF (11193K)

摘要

肝移植（liver transplantation, LT）是终末期肝病患者的标准治疗方法。尽管肝移植技术取得了显著进步，但术后早期移植物功能不全（early allograft dysfunction, EAD）的发生会对受者的预后产生不利影响，加剧了当前器官短缺的现状，仍然是一个严重的临床问题。然而，肝脏组织的细胞异质性阻碍了人们对EAD发生的细胞特征和分子事件进行准确表征。为此，本研究从7个患者中收集了来自冷缺血和缺血再灌注两个阶段的12个肝脏样本，构建了包含EAD发生和EAD未发生的人移植肝单细胞转录组图谱。通过分析EAD发生和EAD未发生患者的75 231个单细胞，发现了一种与 EAD发生显著相关的由黏膜相关不变T细胞（mucosal associated invariant T cell, MAIT）、颗粒酶B⁺（granzyme B⁺, GZMB ⁺）和颗粒酶K⁺（granzyme K⁺,GZMK ⁺）自然杀伤细胞以及S100钙结合蛋白A12⁺（S100 calcium binding protein A12⁺, S100A12 ⁺）中性粒细胞组成的免疫生态位。此外，在两个独立队列中也进一步验证了这种免疫生态位的存在及其与EAD发生的相关性。综上，本文研究结果在单细胞水平上揭示了移植肝的细胞特征以及一种与EAD发生相关的致病免疫生态位，为理解EAD发生发展机制提供了新的见解。

Abstract

Liver transplantation (LT) is the standard therapy for individuals afflicted with end-stage liver disease. Despite notable advancements in LT technology, the incidence of early allograft dysfunction (EAD) remains a critical concern, exacerbating the current organ shortage and detrimentally affecting the prognosis of recipients. Unfortunately, the perplexing hepatic heterogeneity has impeded characterization of the cellular traits and molecular events that contribute to EAD. Herein, we constructed a pioneering single-cell transcriptomic landscape of human transplanted livers derived from non-EAD and EAD patients, with 12 liver samples collected from 7 donors during the cold perfusion and portal reperfusion stages. Comparison of the 75 231 cells of non-EAD and EAD patients revealed an EAD-associated immune niche comprising mucosal-associated invariant T cells, granzyme B⁺ (GZMB ⁺) granzyme K⁺ (GZMK ⁺) natural killer cells, and S100 calcium binding protein A12⁺ (S100A12 ⁺) neutrophils. Moreover, we verified this immune niche and its association with EAD occurrence in two independent cohorts. Our findings elucidate the cellular characteristics of transplanted livers and the EAD-associated pathogenic immune niche at the single-cell level, thus, offering valuable insights into EAD onset.

关键词

人类肝移植 / 早期移植物功能不全 / 致病免疫生态位 / 单细胞分析 / 细胞间通讯

Key words

Human liver transplantation / Early allograft dysfunction / Pathogenic immune niche / Single-cell analysis / Cell-cell communication

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邵鑫,王峥,汪恺,陆晓燕,张萍,郭蓉芳,廖杰,杨鹏挥,郑树森,徐骁,范骁辉. 人类肝移植图谱揭示了一种与早期移植物功能不全发生相关的致病免疫生态位[J]. 工程（英文）, 2024, 36(5): 206-223 DOI:10.1016/j.eng.2023.12.004

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1 引言

肝移植是治疗终末期肝病的标准方法，该技术在过去几十年里取得了重大进步[1]。然而，目前肝移植领域形势仍然严峻，其原因除了器官短缺以外[2]，还包括术后早期移植物功能不全（early allograft dysfunction, EAD）的发生。EAD的发生率为20%~40%，会导致严重的并发症并影响异体移植受者生存率[3‒5]。EAD的发生与多种危险因素相关，包括供体风险指数、手术相关因素和终末期肝病模型评分[6‒7]。术后肝缺血再灌注损伤也是导致EAD发生的一个重要且复杂的因素，受多种细胞类型的调节，涉及免疫生态位重塑、炎症反应和细胞损伤[8‒9]。遗憾的是，肝脏复杂的细胞异质性限制了我们理解和阐明导致EAD发生的细胞特征和分子事件。

近年来，单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术凭借其极高的分辨率彻底改变了我们对复杂组织的认识，在识别生理、病理过程中的关键细胞群及分子事件等方面取得了突破性进展[10‒12]。例如，Shan等[13]和Li等[14]通过scRNA-seq分析探究了移植肝中免疫细胞的异质性，揭示了移植肝中免疫微环境的特征，为治疗肝移植排斥反应提供了潜在的治疗靶点。Yang等[15]基于大鼠正常肝和脂肪肝移植的scRNA-seq分析，定义了一种高表达集落刺激因子3（colony stimulating factor 3, Csf3）的促炎库普弗细胞亚群和高表达X-C基序趋化因子受体1（X-C motif chemokine receptor 1, Xcr1）的树突状细胞（dendritic cell, DC）亚群，并证明了它们在脂肪肝移植中介导更严重移植物损伤的作用。尽管如此，鲜见有研究聚焦在单细胞分辨下解析EAD发生和EAD未发生队列之间的肝脏异质性，进而阻碍了我们对术后EAD发生发展机制的理解。

因此，为了弥补这一空缺，本研究收集了来自3名EAD未发生患者和4名EAD发生患者肝移植前后的12个肝脏组织样本，并进行了系统的scRNA-seq分析，涉及冷缺血和门静脉灌注2 h的75 231个肝实质和非实质细胞。与EAD未发生患者相比，我们在EAD发生患者中观察到由黏膜相关不变T细胞（mucosal-associated T cell, MAIT）和颗粒酶B⁺（granzyme B⁺, GZMB ⁺）颗粒酶K⁺（granzyme K, GZMK ⁺）自然杀伤（natural killer, NK）细胞主导的T/NK细胞分支重塑以及S100钙结合蛋白A12⁺（S100 calcium binding protein, S100A12 ⁺）中性粒细胞的显著激活和改变。值得注意的是，EAD发生患者移植肝中的MAIT、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞都显著增加，组成了一种与EAD发生正相关的致病免疫生态位。通过分析两个独立队列数据，我们证实了该致病免疫生态位的存在及其与EAD发生的正相关关系。此外，通过配体-受体（ligand-receptor, LR）相互作用介导的细胞间通信分析，我们进一步揭示了肝实质细胞在促进其与该致病免疫生态位细胞间通信中的重要作用。上述研究结果增强了我们对EAD发生相关致病细胞特征和分子事件的全面理解，为寻找EAD防治策略提供了有价值的见解和启发。

2 方法

2.1 人肝脏样本收集

人肝脏样本来自中国杭州树兰医院。样本收集受机构伦理委员会（伦理批准号：2020065‒77）批准，严格按照《赫尔辛基宣言》（2013年修订版）进行，并得到了受试患者提供的书面知情同意书。分别在冷缺血和门静脉再灌注约2 h阶段从7名患者中收集了12个移植肝组织样本。在进行肝移植手术之前，移植肝保存在0~4 °C的雌二醇组氨酸-色氨酸-酮戊二酸（中国）溶液中。从移植肝中收集了大约6 mm × 6 mm × 6 mm的移植物组织块并将其保存在组织储存液（Miltenyi，中国）中，作为术前样本。通过背驮式技术为受者植入同种异体移植物，涉及下腔静脉、门静脉、肝动脉吻合和胆道重建等步骤。在关腹之前收集了术后移植组织样本，将其保存在相同的组织储存溶液中。最后，解离所有肝脏组织样本，用于后续制备单细胞悬液。

2.2 EAD发生患者分类

在肝移植手术后第1天和第7天采集受者的血样并测定丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）、总胆红素（total-bilirubin, T-Bil）和国际标准化比值（international normalized ratio, INR）等生化指标。EAD的诊断标准为移植后7天内ALT或AST > 2000 U∙L^-1，或移植后第7天T-Bil ≥ 171 μmol∙L^-1，或移植后第7天INR ≥ 1.6。满足EAD诊断标准的为EAD发生患者，不满足的则被分类为EAD未发生患者。

2.3 单细胞悬液制备

首先把肝组织切成碎片并将其放入含有解离酶混合物的gentleMACS^TM C管中，置于带有加热器的gentleMACS^TM Octo分离器中并开启合适的37C_h_TDK_1 gentleMACS^TM程序，持续1 h。其次，使用40 μm尼龙细胞滤网（Corning，中国）过滤细胞悬液，并将其转移至50 mL离心管中，500 g离心3 min。再次，加入5 mL氯化铵钾裂解缓冲液（Gibco，中国），裂解红细胞，并使用死细胞去除试剂盒（Miltenyi）去除死细胞。最后，将剩余细胞洗涤两次并加入磷酸盐缓冲盐溶液（phosphate-buffered saline, PBS），制备成单细胞悬液，置于冰上以供后续使用，并通过台盼蓝（Gibco，中国）测定细胞活力。

2.4 单细胞转录组测序

将单细胞悬浮液加入10x Genomics Chromium芯片（美国）制成乳液，利用ProFlex聚合酶链式反应系统（Thermo Fisher，美国）对乳液中的凝胶珠进行逆转录，纯化并扩增互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid, cDNA）。通过Qubit（Thermo Fisher）对cDNA浓度定量后，利用Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v3（10x Genomics）试剂盒构建文库。随后，由诺禾致源和联川生物测序公司的Illumina NovaSeq 6000测序仪对文库进行双端测序。

2.5 组织学分析

从保存液中的肝组织样本中切下一部分扁平组织，并迅速放入10%福尔马林溶液中。随后，将组织切片做成石蜡块，切成5 μm的切片后在二甲苯中脱蜡，并依次在一系列浓度梯度的酒精中复水。然后，将切片与3%过氧化氢溶液一起孵育，并用5%牛血清白蛋白进行非特异性结合封闭，持续1 h。将组织切片用苏木精和伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色，用于组织学评估，并进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxygenation uridine triphosphate nick-end labeling, TUNEL），用于评估细胞凋亡情况。最后，使用Olympus BX63显微镜（日本）以200×放大倍数拍摄图像。

2.6 免疫荧光染色

将组织切片与一级抗体（附录A中表S1）在4 °C下孵育过夜后，用含有Tween 20的PBS洗涤切片，随后将切片与合适的荧光团缀合的第二抗体在室温下孵育1.5 h。载玻片用抗褪色固定介质和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（Origene，中国）固定。使用Olympus BX63显微镜捕获MAIT和S100A12 ⁺中性粒细胞的荧光图像，并使用Olympus SLIDEVIEW VS200系统扫描GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞的荧光照片。

2.7 数据处理

通过Cell Ranger处理原始测序文件，以基因组参考联盟人类基因组构建38（genome reference consortium human genome build 38, GRCh38）为参考将原始读数数据转化为计数矩阵。采用Seurat [16]工具包对数据进一步处理，去除基因特征数小于200或大于4000的细胞以及线粒体百分比大于50%的细胞，并根据国家生物技术信息中心的基因数据校对基因名，去除不匹配和重复的基因名。

2.8 细胞类型注释

通过LogNormalize对包含12个肝组织样本的数据矩阵进行标准化，利用Seurat的典型相关分析（canonical correlation analysis, CCA）对数据进行整合及主成分分析（principal component analysis, PCA），并使用统一流形近似和投影（uniform manifold approximation and projection, UMAP）分析对数据进行降维和聚类分析。采用scDeepSort [17]和scCATCH [18]来识别每个簇的细胞类型，在手动去除表达多个已知细胞标记物的簇后，整合CellMatch中的标记物和每个簇的高表达基因确定每个簇的细类型[18]。

2.9 RNA动力学分析

通过velocyto [19]从每个样本的原始测序文件中获取包含未剪接和剪接丰度的两个矩阵，过滤得到所有T/NK细胞并利用SeuratWrappers将其转化为层次数据格式版本5注释数据（hierarchical data format version 5 annotated data, h5ad）文件后，使用默认参数下的scVelo [20]在UMAP基础上对其进行RNA速率分析。

2.10 单细胞轨迹分析

在预处理T/NK细胞和中性粒细胞后，使用默认参数下的Monocle3 [21‒22]对其进行分析，进而生成单细胞轨迹并解析细胞决策。根据中性粒细胞激活评分，肽基脯氨酰异构酶F⁺（peptidylprolyl isomerase F, PPIF ⁺）中性粒细胞和分化簇8^-（cluster of differentiation 8, CD8^-）T细胞被分别定义为中性粒细胞和T/NK细胞的轨迹起点，并进一步通过Monocle3对基因进行相关性分析，从而对伪时序中影响细胞决策的基因进行识别和排序。

2.11 EAD相关免疫生态位评分

计算MAIT和GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞在所有T/NK细胞中的百分比以及S100A12 ⁺中性粒细胞在所有中性粒细胞中的百分比，将两者累加，进而计算出每个样本的EAD相关免疫生态位评分。

2.12 细胞间通信分析

通过scCrossTalk分析不同细胞群之间由信号发送细胞的高表达配体和信号接收细胞的高表达受体介导的细胞间通信。对于每个细胞群，利用CellTalkDB中记录的人类配受体互作对识别对应的配体和受体，计算出每个基因的Z值后，保留表达细胞百分比大于10%且P值小于0.05的显著高表达的配体和受体，将信号发送细胞群i的配体L平均表达和信号接收细胞群j的受体R平均表达的乘积S_(L _i _‒R _j ₎作为两者的互作评分。

2.13 通路和生物学过程富集

根据基因平均表达的倍数变化筛选出排名前100的高表达基因后，利用Metascape [23]网站对其进行通路和生物学过程富集。通过Seurat的AddModuleScore函数计算京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路和基因本体（Gene Ontology, GO）生物学过程的模块评分，其中基因特征来自msigdbr包中收录的分子特征数据库（Molecular Signatures Database, MSigDB）。通过clusterProfiler [24]进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA），底层数据为有序基因列表和MSigDB。

2.14 基于人肝移植scRNA-seq数据集的验证

从序列读取存档（Sequence Read Archive, SRA）数据库中登记号为SRP313633 [25]的库里下载原始肝移植的FASTQ测序文件，结合CellRanger和GRCh38参考基因组对其进行处理。其中，该数据集包含了三个时间节点，分别为移植前、冷缺血和再灌注2 h后。通过LogNormalize据矩阵进行对数标准化后，利用Seurat的CCA算法整合数据后进行 PCA分析，随后使用UMAP对其进行降维和聚类分析。根据该数据集对应的原始论文中记录的细胞标记物注释每个细胞簇。分别筛选出MAIT、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞排名前100的高表达基因，通过Pearson相关系数分析同种细胞类型在该数据集和本研究的scRNA-seq数据中的相关性。

2.15 基于人肝移植Bulk测序数据集的验证

从基因表达综合（Gene Expression Omnibus, GEO）数据库中登记号为GSE23649的库里下载原始肝移植的Bulk测序数据集，该数据集包含来自8个脑死亡后捐献（donation after brain death, DBD）及其肝移植后的EAD发生患者和8个DBD及其肝移植后的EAD未发生患者，其中每个移植肝都涉及两个样本：A样本来自冷缺血阶段，B样本来自门静脉再灌注2 h后。将Bulk数据矩阵中小于0的基因表达值转化为0后，通过将每个样本的中值设为1000对原始矩阵进行归一化，并将其转换为log₂矩阵。从本研究的scRNA-seq图谱中为每个细胞群随机选择1000个细胞作为SpaTalk和鲁棒细胞类型分解（robust cell type decomposition, RCTD）的参考数据，在默认参数下对Bulk数据进行解卷积，获取每个样本的细胞类型组成。根据解卷积结果中MAIT、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞的比例计算EAD相关免疫生态位评分。整合MAIT、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞的表达谱后，比较其在EAD发生患者和EAD未发生患者中的差异，从EAD发生患者中筛选出排名前100的高表达基因，进而结合Seurat中的AddModuleScore函数计算每个样本的EAD模块评分。

2.16 统计分析

采用R 4.1.3、Python 3.9和GraphPad Prism 8.0.1进行统计分析。两组之间的差异使用Welch’s t检验确定，显示为平均值和平均值标准误差（standard error of mean, SEM），其中P值小于0.05的结果被认为具有统计学意义。

3 结果

3.1 EAD发生和未发生患者移植肝概览

通过10x Genomics平台对来自从7名患者的12个肝脏组织样本进行scRNA-seq（附录A中表S2），并进一步根据受者血液样本中的ALT、AST、T-Bil和 INR等生化指标对患者进行分类，将其分为EAD发生患者和EAD未发生患者[图1（a）；附录A中表S3]。在去除死亡和低质量的细胞后，本研究从12个肝脏样本总共收集了75 231个细胞进行数据整合、降维和聚类分析，共产生46个细胞簇[附录A中图 S1（a）和（b）]。考虑到批次效应，我们使用Seurat [16]中常用的CCA算法对12个样本进行了整合[附录A中表S4和图S1（c）~（e）]，结合scDeepSort [17]预训练的结果和scCATCH [18]预测的细胞类型以及每个簇的高表达基因，我们根据CellMatch中的细胞标记基因将这45个细胞簇注释为11种主要的细胞类型，包括B细胞[分化簇 79a 分子（cluster of differentiation 79a molecule, CD79A）、膜跨4-结构域A1（membrane spanning 4-domains A1, MS4A1）]、胆管细胞[角蛋白8（keratin 8, KRT8）、角蛋白18（keratin 18, KRT18）]、DC [G 蛋白偶联受体183（G protein-coupled receptor 183, GPR183）、分化簇74分子（cluster of differentiation 74 molecule, CD74）]、内皮细胞[纤维胶凝蛋白2（ficolin 2, FCN2）、纤维胶凝蛋白3（ficolin 3, FCN3）]、肝实质细胞[白蛋白（albumin, ALB）、载脂蛋白A2（apolipoprotein A2, APOA2）]、成纤维细胞[双糖链蛋白聚糖（biglycan, BGN）、转胶蛋白（transgelin, TAGLN）]、单核吞噬细胞（mononuclear phagocyte，MP）[补体成分1，q亚组分，A 链（complement component 1, q subcomponent, A chain, C1QA）、补体组分1，q亚组分，B链（complement component 1, q subcomponent, B chain, C1QB）]、中性粒细胞[S100钙结合蛋白A8（S100 calcium binding protein A8, S100A8）、S100钙结合蛋白A9（S100 calcium binding protein A9, S100A9）]、浆细胞[免疫球蛋白kappa常数（immunoglobulin kappa constant, IGKC）、免疫球蛋白重常数α1（immunoglobulin heavy constant alpha 1, IGHA1）]、增殖细胞[增殖标记物Ki-67（marker of proliferation Ki-67, MKI67）、微管去稳定蛋白1（stathmin 1, STMN1）]和T/NK细胞[白细胞介素7受体（interleukin 7 receptor, IL7R）、自然杀伤细胞颗粒蛋白7（natural killer cell granule protein 7, NKG7）]，如图1（b）~（c）和附录A中表S5所示。

与肝实质细胞相比，肝非实质细胞在肝移植前后均占据着主要的比例。具体表现为，T/NK细胞、中性粒细胞和MP数量占所有细胞的80%以上[图1（d）]，原因是肝脏缺血再灌注损伤与多种形式的炎症反应密切相关，涉及大量免疫细胞激活、迁移和浸润[26]。值得注意的是，肝移植后T/NK细胞比例明显减少，而中性粒细胞则大幅增加[图1（d）]，表明肝脏缺血再灌注过程中T/NK细胞和中性粒细胞会发生免疫重塑。

根据EAD诊断标准，我们将7名患者分为两组，分别为EAD发生组和EAD未发生组，并进一步分析了两组肝脏免疫微环境的差异[图1（a）]。其中，1、3和4号患者被列入EAD未发生组，而2、5、6和7号患者被列入EAD发生组[图1（e）；附录A中表S3]。值得注意的是，T/NK细胞和中性粒细胞在两组中的变化趋势与其在肝移植前后的变化趋势类似[图1（f）；附录A中图S1（f）]。从每个样本来观察，我们发现EAD未发生组的T/NK细胞和中性粒细胞在肝移植后变化不大，而EAD发生组的T/NK细胞和中性粒细胞在肝移植后表现出明显的变化[图1（g）和（h）；附录A中图S1（g）]，提示这些免疫细胞可能会诱导更严重的肝缺血再灌注损伤，在EAD发生中起着关键作用[图1（i）；附录A中图S1（h）]。尽管MP也是移植肝脏中重要且庞大的免疫细胞群体，但在本研究中我们没有观察到导致EAD发生的潜在MP细胞亚群（附录A中图S2）。因此，我们在后续分析中重点关注T/NK细胞和中性粒细胞亚群，探讨其与EAD发生的关系。

**3.2 EAD患者中由MAIT和GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞主导的T/NK细胞分支重塑**

我们从12个肝脏样本中过滤出了所有的T/NK细胞，累计44 799个，并对其重新整合、降维和聚类分析，共创建了32个细胞簇[附录A中图S3（a）]。根据每个簇的高表达基因，我们将所有T/NK细胞分成8个亚群，包括分化簇4⁺（cluster of differentiation 4, CD4 ⁺）幼稚T细胞、分化簇8⁺（cluster of differentiation 8, CD8 ⁺）GZMB ⁺ T细胞、CD8 ⁺ GZMB ⁺ GZMK ⁺ T细胞、CD8 ^- T细胞、MAIT细胞、GZMB ⁺ NK细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和NK T细胞[图2（a）和（b）；附录A中图S3（b）和（c）]。通过Metascape [23]对显著高表达的基因进行通路和GO生物学过程富集分析，我们发现这些T/NK细胞亚群尽管具有不同的基因表达特征，但在功能上具有一定的相似性[图2（c）和（d）；附录A中表S6]。例如，MAIT细胞显著高表达C-C基序趋化因子配体20（C-C motif chemokine ligand 20, CCL20）、波形蛋白（vimentin, VIM）、天然细胞毒性触发受体3（natural cytotoxicity triggering receptor 3, NCR3）和金属硫蛋白2A（metallothionein 2A, MT2A），与细胞因子的正向调节和白介素2的产生和调节显著相关。相反，GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞高表达白细胞介素1受体相关激酶3（interleukin 1 receptor associated kinase 3, IRAK3）、杀伤细胞凝集素样受体C1（killer cell lectin like receptor C1, KLRC1）和磷脂酶C gamma 2（phospholipase C gamma 2, PLCG2），与防御反应调节和对外部刺激反应的正向调节等显著相关。

相对于CD4 ⁺幼稚T细胞和CD8 ^- T细胞，CD8 ⁺ GZMB ⁺ T细胞、CD8 ⁺ GZMB ⁺ GZMK ⁺ T细胞、MAIT细胞、GZMB ⁺ NK细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和NK T细胞在缺血再灌注刺激下表现出更强的细胞激活、适应性免疫反应、正向调节白细胞介素-2的产生以及防御反应[图2（e）]。通过scVelo [20]和Monocle3 [21‒22]对T/NK细胞进行RNA速率和单细胞轨迹分析，我们进一步解析了T/NK细胞的细胞决策。结果显示，T/NK细胞轨迹存在两个主要分支，轨迹终点分别为MAIT细胞和GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞，表明T/NK细胞沿伪时间轴逐渐激活且毒性逐渐增强[图2（f）；附录A中图S3（d）]。利用T/NK细胞伪时间轨迹，我们分析了沿伪时间轴显著影响细胞决策的基因，发现GZMB和GZMK与伪时间存在着显著的正相关关系[图2（g）]。事实上，GZMB和GZMK编码的前蛋白原主要由NK细胞和细胞毒性T细胞分泌，并经过蛋白水解加工产生活性蛋白酶，进而诱导靶细胞凋亡[27‒29]。这些结果表明，GZMB和GZMK在肝缺血再灌注损伤期间对于T/NK细胞的激活和细胞毒性增强起着关键作用。

接着，我们对EAD发生和EAD未发生组患者肝移植前后的T/NK细胞生态位的动态变化进行了分析。尽管肝移植前后T/NK细胞亚群组成之间不存在明显差异，但对EAD发生和EAD未发生组中T/NK细胞生态位表现出了广泛的异质性[图2（h）；附录A中图S3（e）]。尽管如此，T/NK细胞中主要的细胞类型为CD8 ⁺ GZMB ⁺ GZMK ⁺ T细胞、MAIT细胞、GZMB ⁺ NK细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和NK T细胞，在EAD发生和EAD未发生组中的比例相当[附录A中图S3（f）~（h）]。值得注意的是，与EAD发生组相比，EAD未发生组中的CD8 ⁺ GZMB ⁺ T细胞、CD8 ⁺ GZMB ⁺ GZMK ⁺ T细胞、GZMB⁺ NK细胞和NK T细胞略有增加。相反，与EAD未发生组相比，EAD 发生组中具有相当大比例的MAIT细胞和GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞，在肝移植前后均显著高于EAD未发生组[图2（i）]。这些动态变化的结果说明EAD发生组患者中存在明显的由MAIT细胞和GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞主导的免疫重塑，进而加重移植肝缺血再灌注损伤。

**3.3 EAD患者中S100A12 ⁺中性粒细胞的显著激活和改变**

我们从12个肝脏样本中提取出了所有的中性粒细胞，累计11 452个，并对其重新整合、降维和聚类分析，共创建了12个细胞簇[附录A中图S4（a）]。根据每个簇的高表达基因，我们将所有中性粒细胞分成5个亚群，包括C-C基序趋化因子配体5⁺（C-C motif chemokine ligand 5, CCL5 ⁺）、防御素α3⁺（defensin alpha 3, DEFA3 ⁺）、干扰素诱导蛋白与四肽重复序列2⁺（interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 2, IFIT2 ⁺）、PPIF ⁺和S100A12 ⁺中性粒细胞[图3（a）和（b）]。根据每个亚群的高表达基因，我们发现这五种中性粒细胞亚群表现出了不同的生物学过程[图3（c）；附录A中表S7]。例如，IFIT2 ⁺中性粒细胞的标志物为干扰素刺激相关的基因，包括具有四三肽重复序列1的干扰素诱导蛋白（interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 1, IFIT1）、具有四三肽重复序列2的干扰素诱导蛋白（interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 2, IFIT2）和具有四三肽重复序列3的干扰素诱导蛋白（interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 3, IFIT3），与防御反应、核苷酸结合寡聚化结构域样受体信号通路等显著相关。PPIF ⁺中性粒细胞与白细胞迁移、白细胞介素18信号通路等显著相关，而DEFA3 ⁺和S100A12 ⁺中性粒细胞高表达DEFA3、中性粒细胞表达的弹性蛋白酶（elastase, neutrophil expressed, ELANE）、S100A12、抗菌素抗菌肽（cathelicidin antimicrobial peptide, CAMP）等基因，与细胞杀伤、中性粒细胞脱颗粒和中性粒细胞胞外陷阱形成等显著相关。

根据中性粒细胞激活模块评分的梯度分布[图3（d）]，我们对其进行了单细胞伪时间分析，进而深入研究中性粒细胞在缺血再灌注刺激下的细胞决策过程。通过伪时序轨迹重构，我们发现了轨迹的起点为PPIF ⁺中性粒细胞，并经过S100A12 ⁺中性粒细胞，最终到达DEFA3 ⁺中性粒细胞[图3（e）]，并且伪时序和模块评分之间的正相关性也进一步表明两者从PPIF ⁺中性粒细胞到S100A12 ⁺中性粒细胞的轨迹高度吻合[图3（f）]。S100A12被证明参与特定的钙依赖信号转导通路并参与调节细胞骨架成分，进而调节各种中性粒细胞的活性[30]。此外，S100A12的表达和伪时序之间表现出显著的正相关性，提示S100A12 ⁺中性粒细胞是活性极高的细胞群。

值得注意的是，我们在以DEFA3 ⁺中性粒细胞为起点、途经S100A12 ⁺中性粒细胞并到达PPIF ⁺中性粒细胞的轨迹中观察到中性粒细胞迁移、趋化性和外渗等评分逐步增强，这个过程与伪时序刚好相反，两者呈现负相关关系[图3（g）；附录A中图S4（b）]。PPIF的基因表达值与伪时序也呈负相关，且未表达PPIF基因的中性粒细胞也表现出了较低的细胞迁移评分，表明PPIF ⁺中性粒细胞是高度迁移的细胞群。与此同时，DEFA3 ⁺中性粒细胞的C-X-C基序趋化因子受体4（C-X-C motif chemokine receptor 4, CXCR4）的基因处于高表达水平，而其C-X-C基序趋化因子受体2（C-X-C motif chemokine receptor 2, CXCR2）和选择素L（selectin L, SELL）的基因表达却处于极低水平[图3（h）；附录A中图S4（c）]，说明DEFA3 ⁺中性粒细胞为衰老的细胞群体，与成熟的IFIT2 ⁺、PPIF ⁺和S100A12 ⁺中性粒细胞完全不同[31]。

尽管EAD发生和EAD未发生组患者中性粒细胞生态位存在明显的异质性，但每个样本DEFA3 ⁺、PPIF ⁺和S100A12 ⁺中性粒细胞组成了大部分的中性粒细胞群体[图3（i）；附录A中图S4（d）]。通过分析冷缺血和门脉灌注阶段的中性粒细胞亚群，我们发现CCL5 ⁺、DEFA3 ⁺中性粒细胞在肝移植后明显减少，而IFIT2 ⁺、PPIF ⁺、S100A12 ⁺均有不同程度的增加，并且在EAD未发生和EAD发生组的比较中也出现了类似的变化趋势[图3（j）；附录A中图S4（e）]。值得注意的是，无论在肝移植前还是肝移植后，EAD发生组患者中S100A12 ⁺中性粒细胞的比例均超过EAD未发生组患者，并且在中性粒细胞脱颗粒评分等方面也同样高于EAD未发生组患者[图3（k）]。事实上，中性粒细胞脱颗粒被广泛认为会加重缺血再灌注损伤。上述结果表明EAD发生组患者中S100A12 ⁺中性粒细胞会显著激活和改变，在移植肝缺血再灌注损伤中起着关键作用。

3.4 EAD发生相关致病免疫生态位识别

鉴于移植肝脏中T/NK细胞和中性粒细胞为主要的免疫细胞群体及其在肝缺血再灌注损伤中有重要作用，我们深入研究了T/NK和中性粒细胞生态位在EAD未发生组和EAD发生组之间的差异[图4（a）和（b）]。与EAD未发生组相比，EAD发生组中MAIT细胞和GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞均显著增加，其百分比分别从13%和20%增加到了21%和40% [图4（c）]，而其他T/NK细胞亚群在EAD未发生组和EAD发生组之间的区别不明显。与此同时，S100A12 ⁺中性粒细胞也表现出类似的增加趋势，其在EAD发生组中占了55%的比例，而在EAD未发生组中只有37%的比例，其他中性粒细胞亚群则未见明显变化[图4（b）和（c）]。由此表明MAIT、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞组成了与EAD发生密切相关的独特致病免疫生态位。通过对T/NK细胞和中性粒细胞进行整合分析，我们观察到从非EAD患者到EAD发生组由MAIT、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞组成的免疫生态位评分显著高于EAD未发生组[图4（d）]，提示这种致病免疫生态位在诱导EAD发生中起着重要作用。此外，我们通过已知的细胞标记物对组织样本进行了免疫荧光染色。结果显示，MAIT、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞确实在EAD发生组患者中具有更显著的聚集[图4（c）；附录A中图S5（a）]，进一步证实了我们的发现。

为进一步解析导致EAD发生的分子特征，我们对EAD相关致病免疫生态位在EAD发生组和EAD未发生组之间的差异表达基因进行了全面分析[图4（f）~（h）]。结果显示，EAD发生组的免疫生态位表现出多种炎症和细胞毒性相关细胞因子及趋化因子显著上调，包括核因子κB亚基1（nuclear factor kappa B subunit 1, NFKB1）、血清淀粉样蛋白A1（serum amyloid A1, SAA1）、GZMB、GZMK、S100A8、S100A9和S100A12，并且这些基因在EAD发生组的MAIT、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞中普遍高表达[图S5（b）；附录A中表S8~S10]。其中，MAIT细胞显著高表达niban凋亡调节因子1（niban apoptosis regulator 1, NIBAN1）[图4（f）]，该基因编码的蛋白被证明可调控p53介导的细胞凋亡[32]。同样，肿瘤坏死因子受体超家族成员18（tumor necrosis factor receptor superfamily member 18, TNFRSF18）被证明在T细胞激活时会显著高表达[33]，其在EAD发生组MAIT细胞中的表达远高于EAD未发生组[附录A中图S5（c）]。值得注意的是，EAD发生组的GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞高表达花生四烯酸5-脂氧合酶激活蛋白（arachidonate 5-lipoxygenase activating protein, ALOX5AP）[图4（g）]，该蛋白对于白三烯的合成至关重要，并且与多种类型的炎症反应有关[34]。此外，EAD发生组的GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞高表达黏附G蛋白偶联受体G3（adhesion G protein-coupled receptor G3, ADGRG3）[附录A中图S5（d）]，该基因涉及G蛋白-耦合受体信号传导和细胞迁移调节，因而EAD发生组的GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞表现出更强的迁移能力。对于S100A12 ⁺中性粒细胞，我们观察到其在EAD发生组中会高表达免疫球蛋白超家族成员6（immunoglobulin superfamily member 6, IGSF6）、ADGRG3和骨髓细胞上表达的触发变体1（triggering receptor expressed on myeloid cells 1, TREM1）[图4（h）；附录A中图S5（c）]，它们可通过刺激促炎趋化因子和细胞因子的释放诱导细胞活化并放大中性粒细胞介导的炎症反应[35‒37]。上述发现揭示了导致EAD发生的复杂分子机制，凸显了由MAIT细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞组成的致病免疫生态位及其相关信号分子在EAD发生过程中的关键作用。

3.5 基于两个独立队列的EAD相关致病免疫生态位验证

为了进一步EAD相关致病免疫生态位，我们从公开平台下载了两个独立的人肝移植队列。第一个队列为人肝移植scRNA-seq数据集，下载登记号为SRP313633 [25]。结合CellRanger和Seurat对该数据集进行处理，将其分成了九种细胞类型[图5（a）；附录A中图S6（a）和（b）]，包括T/NK细胞和中性粒细胞，涉及移植前、冷缺血和再灌注两小时后收集的16 714个细胞。其中，T/NK细胞和中性粒细胞从冷缺血到再灌注两小时也表现出了与我们结果一致的变化趋势[附录A中图S6（c）]。对T/NK细胞进行重新聚类，我们总共鉴定出了11个细胞簇[图5（b）]，其中两个高表达T细胞受体分化簇3δ亚基（cluster of differentiation 3 delta subunit of T cell receptor complex, CD3D）、分化簇8亚基α（cluster of differentiation 8 subunit alpha, CD8A）、分化簇8亚基β（cluster of differentiation 8 subunit beta, CD8B）和溶质载体家族4成员10（solute carrier family 4 member 10, SLC4A10）的细胞簇为MAIT细胞[图5（c）]，另外两个高表达杀伤细胞凝集素样受体F1（killer cell lectin like receptor F1, KLRF1）、GZMB和GZMK的细胞簇为GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞[图5（c）]。同时，我们对三种条件下的中性粒细胞也进行了整合聚类分析[图5（d）]，并鉴定出了S100A12高表达的细胞簇，即S100A12 ⁺中性粒细胞[图5（e）]。我们图谱中的MAIT细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞在该独立数据集和本研究图谱中的正相关结果进一步证实该致病免疫生态位普遍存在于移植肝中[图5（f）]。此外，我们通过一套大鼠肝移植的scRNA-seq数据集进一步证明了 GZMB⁺ GZMK⁺ NK细胞和S100A12⁺中性粒细胞的存在[15]。相比之下，MAIT细胞在大鼠移植肝中分布极少[附录A中图S6（d）~（h）]，原因可能是大量研究报道MAIT细胞主要存在于人类中，而在其他物种中几乎没有。

第二个队列为人肝移植Bulk测序数据集，下载登记号为GSE23649 [38]，包含8个DBD及其肝移植后的EAD发生患者和8个DBD及其肝移植后的EAD未发生患者[图5（g）]，其中每个移植肝都涉及两个样本，一份样本来自冷缺血阶段，另一份样本来自门静脉再灌注2 h后，共计16个样本。结合本研究的scRNA-seq参考数据和SpaTalk [39]、RCTD [40]方法对Bulk测序数据进行解卷积，利用解卷积的结果分别计算了EAD发生和EAD未发生组患者的致病免疫生态位评分[图5（g）]。尽管样本内的评分存在差异，但EAD发生组患者的致病免疫生态位评分显著高于EAD未发生组患者[图5（h）；附录A中图S6（i）]。根据EAD发生组中致病免疫生态中排名前100的高表达基因（附录A中表S11），我们计算了该数据集中每个样本的EAD模块评分，并且发现EAD发生组的评分显著高于EAD未发生组[图5（i）；附录A中图S6（j）]。此外，通过差异表达基因分析，我们发现EAD发生组高表达如NIBAN1、ALOX5AP、IGSF6、TNFRSF18、ADGRG3和TREM1等多个基因[图5（j）和（k）；附录A中图S6（k）]，与本研究的结果一致[图4（f）~（h）]。其中，我们观察到SIPA1L1（一种与信号诱导增殖相关的基因）在GSE23649数据集和本研究的EAD发生组患者中均高表达[图5（k）；附录A中图S5（d）和（e）]，表明与EAD未发生组患者相比，EAD发生组患者致病免疫生态位的增殖活性显著增强，进而导致EAD发生组患者中MAIT细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞的百分比升高。上述结果进一步证实了移植肝脏中致病免疫生态位与EAD的发生之间存在显著关联。

3.6 EAD相关免疫生态位中细胞间通信揭示

鉴于肝实质细胞和内皮细胞在维持肝正常生理功能方面的重要作用，我们进一步研究了EAD发生组和EAD未发生组中肝实质细胞、内皮细胞和由MAIT细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞及S100A12 ⁺中性粒细胞组成的EAD相关免疫生态位之间的细胞间通信[图6（a）；附录A中图S7（a）]。我们利用CellTalkDB [41]数据库及scCrossTalk算法识别出了EAD发生组和EAD未发生组的配受体互作对[图6（b）]，其中EAD发生组中细胞间通信评分显著高于EAD未发生组[图6（c）和（d）；附录A中图S7（b）]，表明EAD发生组中肝实质细胞、内皮细胞、MAIT细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞及S100A12 ⁺中性粒细胞之间的互作显著增强，形成了一种缺血再灌注导致的复杂细胞间通信网络。进一步研究发现细胞间通信网络主要表现为以肝实质细胞和内皮细胞作为信号源产生的细胞间通信[图6（e）；附录A中图 S7（c）]，并且介导这些细胞间通信的配受体互作对在EAD发生组和EAD未发生组中具有高度重合[图6（f）；附录A中图S7（d）]。尽管如此，参与介导肝实质细胞和内皮细胞与其他细胞间通信的配受体互作对在EAD发生组和EAD未发生组中依然有相当大的区别，其中S100A12 ⁺中性粒细胞是肝实质细胞和内皮细胞最主要的信号接受细胞群。值得注意的是，致病免疫生态位作为信号源与肝实质细胞和内皮细胞的相互作用明显较弱[图6（g）；附录A中图S7（e）]，表明肝实质细胞和内皮细胞在缺血再灌注刺激下会优先作为信号源优先与该免疫生态位发生互作。

我们分析了介导肝实质细胞和内皮细胞与免疫生态位之间排名前10的配受体互作对来评估EAD发生组和EAD未发生组中多样化的细胞间通信[图6（h）]。值得注意的是，EAD发生组中介导肝实质细胞与S100A12 ⁺中性粒细胞间通信的SAA1-甲酰肽受体1（formyl peptide receptor 1, FPR1）互作评分最高。大量文献证明SAA1是一种主要的急性期蛋白，在炎症和组织损伤反应中高表达[42]，而FPR1作为SAA1的受体，可介导吞噬细胞对入侵宿主的微生物的反应，在宿主防御和炎症中发挥作用[43]。相对于EAD未发生组患者，EAD发生组患者中肝实质细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞内的SAA1和FPR1基因表达水平显著升高[图6（i）]。此外，SAA1-FPR1相互作用是肝实质细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞间特有的，未在其他细胞间通信中观察到[图6（j）]，这与在人肝移植Bulk测序数据集的发现一致[附录A中图S7（f）]，表明其在缺血再灌注过程中介导肝实质细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞间通信发挥重要作用。相对于EAD未发生组，尽管EAD发生组中内皮与免疫细胞间通信的配受体互作对更多，但是重合的配受体互作对评分明显要低于EAD未发生组[图6（h）]，表明肝实质细胞在与该致病免疫生态位通信中发挥着至关重要的作用。

因此，我们对EAD发生组和EAD未发生组之间的差异表达基因进行了系统分析[图6（k）]。结果显示，EAD发生组中的肝实质细胞高表达多种趋化因子，包括S100A8、S100A9、巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）、C-C 基序趋化因子配体3（C-C motif chemokine ligand 3, CCL3）和CXCL8，与急性炎症反应、中性粒细胞趋化性和细胞因子产生的正向调节等信号通路及生物学过程显著相关，使肝实质细胞成为诱导趋化性的关键角色。同时，我们发现肝实质会分泌大量配体，如纤维蛋白原α链（fibrinogen alpha chain, FGA）、纤维蛋白原β链（fibrinogen beta chain, FGB）和纤维蛋白原γ链（fibrinogen gamma chain, FGG），这些配体与MAIT细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞上的整合素亚基β2（integrin subunit beta 2，ITGB2）受体结合[图6（h）；附录A中图S7（g）]，进而促进白细胞黏附并诱导免疫反应[44]。相比之下，EAD未发生组中的肝实质细胞会高表达线粒体编码细胞色素C氧化酶II假基因12（mitochondrially encoded cytochrome c oxidase II pseudogene 12, MTCO2P12）、谷胱甘肽S-转移酶α1（glutathione S-transferase alpha 1, GSTA1）、细胞色素P450家族3亚家族A成员4（cytochrome P450 family 3 subfamily A member 4, CYP3A4），细胞色素P450家族2亚家族A成员7（cytochrome P450 family 2 subfamily A member 7，CYP2A7），C-X-C基序趋化因子配体10（C-X-C motif chemokine ligand 10, CXCL10）和载脂蛋白A1（apolipoprotein A1, APOA1），尽管伴有微弱的急性炎症反应，肝实质细胞却能继续执行正常的代谢功能[图6（k）]。此外，GSEA的验证结果也进一步表明EAD发生组的肝实质细胞与核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）介导的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNFα）信号传导和胆管代谢抑制显著相关[图6（l）]，表明EAD发生组中肝脏代谢功能受损，并且MAIT细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞在受到损伤肝实质细胞招募后，会通过β2-微球蛋白（beta-2-microglobulin, B2M）、转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1, TGFB1）、S100A8、S100A9、MIF、钙调蛋白1（calmodulin 1, CALM1）和膜联蛋白A1（annexin A1, ANXA1）与其建立细胞间通信网络，形成一种致病免疫生态位。其中，这些配体对应的受体为CD69、ITGB2、CXCR4和分化簇44分子（cluster of differentiation 44，CD44）[附录A中图S7（h）~（j）]，它们对于增强白细胞活化、黏附、增殖以及细胞毒性至关重要[45‒46]。

4 讨论

在本项研究中，我们对EAD未发生患者和EAD发生患者中12个移植肝的scRNA-seq数据进行了全面分析，发现了一个与EAD相关的由MAIT细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞组成的免疫生态位。与EAD未发生患者相比，EAD发生患者中在肝脏缺血再灌注过程中显著富集MAIT细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞，形成一种致病免疫生态位，进而引发EAD。通过深入分析两个独立的肝移植队列数据，我们进一步证实了这种致病免疫生态位的普遍存在及其与EAD发生的密切相关性，揭示了这种致病性免疫生态位在发现导致EAD发生的关键细胞和分子事件中的重要作用。

尽管门静脉灌注仅持续2 h，但我们依然观察到肝移植前后肝脏的细胞组成和分子表达存在显著差异。一方面，我们发现肝移植后中性粒细胞和MP显著增加，与肝脏缺血再灌注过程中存在明显免疫浸润这一认识吻合[附录A中图S1（g）]。另一方面，作为肝小叶中主要的细胞群，内皮细胞和肝细胞的比例在肝移植后有所下降，与缺血再灌注损伤过程中内皮细胞和肝细胞会显著受损这一认识吻合[附录A中图S1（g）]。此外，通过分析肝移植前后肝实质细胞之间的差异表达基因，我们发现肝移植后比肝移植前存在更显著的炎症、细胞死亡等反应[附录A中图S8（a）]。值得注意的是，肝移植后肝实质细胞的差异表达基因数量要少于EAD发生患者[附录A中图S8（b）]，且EAD未发生和EAD发生患者之间肝实质细胞表达谱的相关系数最低，存在显著的差异[附录A中图S8（c）]。对于免疫生态位，本研究和Bulk测序数据均未发现其在EAD未发生患者的肝移植前后以及在EAD发生患者的肝移植前后存在显著差异，其只在肝移植后的肝脏中略微增加[附录A中图S9（a）和（b）]，表明整合分析肝移植前后样本的合理性。这些结果表明EAD未发生和EAD发生患者之间肝实质细胞和致病免疫生态位的差异远比肝移植前后的差异更大。

尽管肝移植前EAD未发生和EAD发生患者之间以及肝移植前EAD未发生和EAD发生患者之间免疫生态位评分存在差异，但它们的P值高于整合肝移植前后EAD未发生和EAD发生患者之间的P值，该P值由单侧Welch检验计算得到[附录A中图S9（c）]，并且这一现象也存在于Bulk测序队列数据以及整合本研究和Bulk测序数据后的融合队列数据中[附录A中图S9（d）~（f）]，进一步证明由MAIT细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞组成的免疫生态位在EAD发生患者移植肝中更显著富集。事实上，在Bulk测序队列数据肝移植前的样本中，EAD发生组免疫生态位评分也高于EAD未发生组，表明这种免疫生态位的差异不是由灌注引起的，而是由EAD未发生和EAD发生患者的供体或移植物之间不同的状态引起的。与此同时，免疫生态位评分与供体年龄、移植物重量、受体年龄、移植物与受体重量比、手术时间、失血量和输注等条件没有显著相关性[附录A中图S9（g）]，而免疫生态位评分与冷缺血时间之间存在显著正相关，两者的Pearson相关系数（r）达到了0.94，原因是大量研究表明长时间的冷缺血会肝移植后移植物失功的独立危险因素，而本研究中的EAD发生组移植物的冷缺血时间比EAD未发生组移植物的更长[47]。

EAD发生的因素很多，包括排斥反应、缺血再灌注损伤和小肝移植综合征。值得注意的是，本研究中大多数受者的移植类型是整肝原位肝移植，除了EAD未发生组有一位是右肝原位肝移植（附录A中表S12）。具体来说，所有受者的移植物与受体重量比均大于0.8%，因而可以排除小肝移植综合征[48]。对于术后排斥反应，本研究队列中的所有患者均接受了常规抗排斥药物，治疗方案没有进行重大调整，所有患者（包括ABO血型不兼容的3号患者）均未观察到T细胞介导的排斥反应和抗体介导的排斥反应（附录A中表S13）。Mazilescu等[49]通过对包含1068名肝移植患者的队列研究发现，与DBD组相比，循环死亡后捐献（donation after circulatory death, DCD）组EAD的发生率更高，表明EAD的发生率及受者生存率可能与供体死亡类型有关。然后，本研究的队列中DBD或DCD受者有一半伴有EAD发生，而DBD组和DCD组之间EAD 的发生没有显著差异（附录A中表S2），原因可能是我们队列中患者数量有限。尽管如此，我们在本研究队列中观察到大多数捐赠者为DBD，这与Mazilescu等[49]统计的结果一致。

虽然缺血再灌注损伤是肝移植中的主要事件，但也会存在肝再生过程。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）-甲氧普林耐受（methoprene-tolerant，MET）相互作用是肝再生的关键配受体互作对。与之前的研究结果一致[50]，成纤维细胞是HGF的主要来源，且HGF的表达在肝移植前后没有显著差异。然而，HGF的表达在EAD未发生和EAD发生患者之间肝脏成纤维细胞中存在显著差异[附录A中图S10（a）]。值得注意的是，移植肝脏中MET的平均表达水平（log1p）低至0.1左右，并且与肝移植前和EAD未发生组患者的肝脏相比，肝移植后和EAD发生组患者肝实质细胞中MET的基因表达量均有所下降[附录A中图 S10（b）]，表明肝实质细胞的再生能力在缺血、缺血再灌注损伤中显著受损，在EAD发生患者中尤为明显。

GZMB和GZMK编码的前蛋白原由NK细胞和细胞毒性T细胞分泌，随后经过蛋白水解加工生成活性蛋白酶，并通过caspase激活诱导靶细胞凋亡[27‒29]。尽管GZMB和GZMK都是颗粒酶亚家族的成员，执行相似的功能，但我们发现GZMB主要在NK细胞中表达，GZMK主要在T细胞中表达。尽管如此，我们还是发现了一个独特的NK细胞群，它们同时高表达GZMB和GZMK，并且两者均与伪时间轴上的细胞激活评分呈显著正相关。这一发现意味着与GZMB ⁺ NK细胞相比，GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞的细胞毒性和防御反应更强。此外，MAIT细胞是T淋巴细胞中一个独特的细胞亚群，作为先天性免疫和适应性免疫之间的桥梁，MAIT细胞也高表达GZMB和GZMK，与先前研究结果中报道MAIT细胞高度激活的特征吻合。这些结果揭示了MAIT细胞和GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞在感知和选择炎症信号、T/NK分支重塑中的重要作用。

与S100A8和S100A9相比，我们发现中性粒细胞中S100A12表达的异质性更加明显，并存在一个独特的中性粒细胞亚群，即S100A12 ⁺中性粒细胞。S100A12被普遍认为主要由活化的中性粒细胞表达和分泌，同时在炎症位点显著富集，这与本研究观察到的S100A12 ⁺中性粒细胞活性增强和脱颗粒现象相吻合。作为中性粒细胞的标记物，S100A8和S100A9蛋白确实几乎在所有中性粒细胞群体中普遍表达。尽管如此，S100A12 ⁺中性粒细胞中的S100A8和S100A9水平远远超过了其他中性粒细胞亚群中的水平，这也解释了每个组织样本中存在大量的S100A12 ⁺中性粒细胞的原因是S100蛋白参与各种细胞过程的调节，如细胞周期和细胞分化[30]。

T/NK细胞和中性粒细胞的细胞组成在肝移植前后差异不明显，原因是肝移植前后样本之间的时间间隔较短，只有两个小时。尽管T/NK细胞和中性粒细胞生态位在肝移植前后差异不明显，但我们在T/NK和中性粒细胞亚群中发现EAD发生和EAD未发生患者之间存在显著差异。对于MAIT细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞，与EAD未发生患者相比，肝移植前后EAD发生患者的细胞数量显著增加。尽管EAD发生患者中MAIT细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞各自并不普遍高于EAD未发生患者，如7号患者中的MAIT细胞、5号患者中的GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞以及2号患者中的S100A12 ⁺中性粒细胞，但是在三者的总比例上，EAD发生患者始终高于EAD未发生患者，说明这些免疫细胞群之间存在复杂且协同的相互作用，它们共同形成了一个导致EAD发生的致病免疫生态位。此外，配受体互作介导的细胞间通信网络也证实了MAIT细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞之间的密切关系，该网络有效维持了白细胞活化、黏附、增殖和细胞毒性的增强，进一步证实了上述发现。

EAD是移植肝内发生严重缺血再灌注损伤的表现，其特征是移植后7天内ALT或AST > 2000 U∙L^-1，或移植后第7天T-Bil ≥ 171 μmol∙L^-1，或移植后第7天INR ≥ 1.6 [4]。血清ALT和AST水平是肝实质细胞损伤的可靠生物标志物，而T-Bil和INR则用于确定移植物的代谢功能[51]。这些指标可以深入了解肝实质细胞损伤和合成功能障碍的程度，因此有必要为每个参数建立明确的阈值。值得注意的是，由MAIT细胞、GZMB ⁺ GZMK ⁺ NK细胞和S100A12 ⁺中性粒细胞组成的致病免疫生态位在诱导EAD发生也表现出了类似的累积效应。因此，未来的发展应致力于明确EAD相关致病免疫生态位评分的阈值，以在冷缺血期间对EAD发生进行预测，提高同种异体移植物及其受体的存活率，获得良好的预后结果。

参考文献

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