集成乙二醇烷硫醇的CMUT谐振生物传感器用于提升DNA无标记检测选择性

, , , , , , , , , , 李支康 , 赵一鹤 , Gian Luca Barbruni , 李杰 , 李子轩 , 袁嘉玮 , 杨萍 , 赵立波 , 蒋庄德 , Sandro Carrara

工程（英文） ›› 2024, Vol. 41 ›› Issue (10) : 244 -255.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 41 ›› Issue (10) : 244 -255. DOI: 10.1016/j.eng.2023.12.015
研究论文

集成乙二醇烷硫醇的CMUT谐振生物传感器用于提升DNA无标记检测选择性

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Development of an Integrated CMUTs-Based Resonant Biosensor for Label-Free Detection of DNA with Improved Selectivity by Ethylene-Glycol Alkanethiols

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摘要

受重力谐振启发的生物传感器近年来在工业和现场检测应用中受到越来越多的关注，实现了DNA和抗体等生物标志物的无标记检测。电容式微机械超声换能器（CMUTs）在开发微型化、高性能互补金属氧化物半导体（CMOS）生物传感平台方面颇具前景。然而，其可操作性受限于功能化效率低、生物分子聚集、缓冲液中的串扰以及对外部高压（HV）电源的依赖。本研究提出一种基于CMUTs的谐振生物传感器，该传感器集成了CMOS前端接口，与乙二醇烷硫醇结合，以高特异性检测单链DNA寡核苷酸。通过能量色散X射线显微分析对功能化表面的形貌进行了表征。通过荧光成像技术对比互补与非互补的单链DNA寡核苷酸，证明了芯片表面杂交选择性显著提升。进一步使用五元件集总等效模型对传感器阵列进行表征。该专用集成电路芯片面积为4 mm2，采用0.18 μm高压双极型-CMOS-双扩散金属氧化物半导体（DMOS）集成工艺（BCD）设计和开发，能够在标准1.8 V电源下实现片上20 V高压升压，并跟踪反馈频率，连续工作模式下总功耗为3.8 mW。实测结果显示，该传感器在1~100 μmol∙L-1浓度范围内的检测灵敏度为7.943 × 10-3 μmol∙L-1∙Hz-1。综上所述，在集成内部高压源的CMOS电子器件上，利用工作效率为2 MHz的微加工CMUT阵列，可实现干燥条件下的DNA无标记生物传感。此外，乙二醇烷硫醇成功在铝电极表面自组装成单分子层，这是CMUTs研究前所未有的尝试，有效增强了生物功能化的选择性。本研究结果表明，CMUTs有望实现全片上DNA生物传感。

Abstract

Gravimetric resonant-inspired biosensors have attracted increasing attention in industrial and point-of-care applications, enabling label-free detection of biomarkers such as DNA and antibodies. Capacitive micromachined ultrasonic transducers (CMUTs) are promising tools for developing miniaturized high-performance biosensing complementary metal-oxide-silicon (CMOS) platforms. However, their operability is limited by inefficient functionalization, aggregation, crosstalk in the buffer, and the requirement for an external high-voltage (HV) power supply. In this study, we aimed to propose a CMUTs-based resonant biosensor integrated with a CMOS front-end interface coupled with ethylene-glycol alkanethiols to detect single-stranded DNA oligonucleotides with large specificity. The topography of the functionalized surface was characterized by energy-dispersive X-ray microanalysis. Improved selectivity for on-chip hybridization was demonstrated by comparing complementary and non-complementary single-stranded DNA oligonucleotides using fluorescence imaging technology. The sensor array was further characterized using a five-element lumped equivalent model. The 4 mm2 application-specific integrated circuit chip was designed and developed through 0.18 μm HV bipolar-CMOS-double diffused metal-oxide-silicon (DMOS) technology (BCD) to generate on-chip 20 V HV boosting and to track feedback frequency under a standard 1.8 V supply, with a total power consumption of 3.8 mW in a continuous mode. The measured results indicated a detection sensitivity of 7.943 × 10−3 μmol∙L−1∙Hz−1 over a concentration range of 1 to 100 μmol∙L−1. In conclusion, the label-free biosensing of DNA under dry conditions was successfully demonstrated using a microfabricated CMUT array with a 2 MHz frequency on CMOS electronics with an internal HV supplier. Moreover, ethylene-glycol alkanethiols successfully deposited self-assembled monolayers on aluminum electrodes, which has never been attempted thus far on CMUTs, to enhance the selectivity of bio-functionalization. The findings of this study indicate the possibility of full-on-chip DNA biosensing with CMUTs.

关键词

电容式微机械超声换能器（CMUTs） / DNA检测 / 自组装单层（SAM） / 乙二醇烷硫醇 / 专用集成电路（ASIC）

Key words

Capacitive micromachined ultrasonic transducers (CMUTs) / DNA detection / Self-assembled monolayer (SAM) / Ethylene-glycol alkanethiols / Application-specific integrated circuit (ASIC)

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Zhikang Li,Yihe Zhao,Gian Luca Barbruni,Jie Li,Zixuan Li,Jiawei Yuan,Ping Yang,Libo Zhao,Zhuangde Jiang,Sandro Carrara,李支康,赵一鹤,Gian Luca Barbruni,李杰,李子轩,袁嘉玮,杨萍,赵立波,蒋庄德,Sandro Carrara. 集成乙二醇烷硫醇的CMUT谐振生物传感器用于提升DNA无标记检测选择性[J]. 工程（英文）, 2024, 41(10): 244-255 DOI:10.1016/j.eng.2023.12.015

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1 引言

在过去的几十年中，生物传感技术作为一种依赖于生物分子及其特异性相互作用的检测方法，已被广泛证实为各种应用中的重要分析工具，涵盖环境监测、医疗保健等领域，尤其是在传染病诊断方面备受关注[1]。目前，新型冠状病毒肺炎（COVID-19）被临床报道为一种传播速度极快的疾病，由个体无症状感染者携带严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起[2]。因此促使了结合高精度、快速病原体检测与微型化的全新生物传感平台的持续开发。靶标检测通常涉及对DNA、RNA、免疫球蛋白、酶和适配体等生物分子的识别[3]。根据构建策略，生物传感器主要分为标记型与无标记型两大类[4‒5]。传统的标记型生物传感方法，如酶联免疫分析、化学发光分析、聚合酶链反应以及质谱分析，常用于医学实验室中传染病生物标志物的检测，相比之下，无标记技术能避免烦琐的共价标记探针过程及标记物对结合位点的干扰，提供效率更高、成本更低的解决方案[6]。无标记检测方法主要包括表面等离子体共振（SPR）[7]、表面增强拉曼散射（SERS）[8‒9]、干涉型技术[10]、电化学检测[11]、电容式互补金属氧化物半导体（CMOS）芯片[12]、超表面辅助太赫兹（THz）技术[13‒14]，以及微谐振器[15‒16]。Ghayoor等[17]设计了一种基于新型斐波那契结构的SPR传感器，该结构由纳米结构薄膜和石墨烯构成，实现了高达192.19 (°)∙RIU-1（RIU：折射率单位）的超高灵敏度，用于识别基于DNA的传染性疾病，如SARS-CoV-2。然而，这种方法通常依赖精密的仪器校准和复杂的设备。Anwar等[18]利用金纳米立方体（AuNCs）增强SERS信号，以检测人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）DNA链，发现与银纳米立方体（AgNCs）相比，AuNC包覆的HIV-1 DNA分子的拉曼光谱信号强度更高。然而，由于纳米结构的差异，信号增强效果可能存在不一致性。Lomae等[19]开发了一种纸基电化学检测装置用于检测互补DNA（cDNA），其电极表面修饰有吡咯烷基肽核酸。该检测在42 min内完成，检测范围为0.1~200 nmol∙L-1，检出限为1.0 pmol∙L-1。Lai等[20]提出了一种基于0.35 μm CMOS工艺的16 × 16电容式传感器阵列，该阵列采用小型交叉指状微电极和共享的开关电容电路，在低离子强度条件下可检测浓度范围为10 amol∙L-1~100 pmol∙L-1的DNA分子，电容灵敏度为 94   f F l g   [ D N A ]（1 fF = 10-15 F），工作时钟频率为2 MHz。Li和Zhang [21]研究了THz辐射对DNA复制中振动耦合效应的影响，发现53 THz辐射可使DNA双链的解链温度降低3 °C，时间缩短20%。此外，随着材料化学的进步，用于无标记健康监测的柔性电子器件推动了诊断技术的变革。这类柔性传感器可紧密贴合人体，实现生物标志物的实时、无创监测，从而提高早期疾病检测效率[22‒25]。但柔性电子器件在实际应用中仍面临诸多挑战，包括材料耐久性、弯曲和拉伸时的性能稳定性，以及与电源系统的集成问题[26‒27]。随着微机电系统（MEMS）和CMOS技术的发展，基于微谐振器的生物传感器逐渐成为一种高灵敏度和高度微型化的生物传感平台，颇具发展潜力。

目前已有研究提出了多种微谐振生物传感器件，这些器件在传感表面上直接固定特定探针，包括石英晶体微天平（QCMs）[15,28]、微悬臂梁[29]，以及表面声波器件（SAWs）[30‒31]、薄膜体声波谐振器（FBARs）[32]和微机械超声换能器（MUTs）[33‒37]等微声学器件。QCM由特定切割方式的石英晶体及上下电极组成，具有结构简单和高品质因数（可达104）[38]的优点。然而，它不兼容CMOS工艺，且由于石英晶体具有较高的温度系数，容易发生频率漂移，导致稳定性下降。虽然微悬臂梁结构兼容CMOS工艺，且便于信号检测，但其谐振频率一般在千赫兹范围，灵敏度受限。SAW器件由交指电极和压电基底组成，工作频率可达数百兆赫[30]，但较高的频率会放大环境因素的干扰，从而影响稳定性。此外，压电材料如氮化铝（AlN）和氧化锌（ZnO）在高性能应用中成本较高，其压电性能也易受到制造和极化特性的影响（d 33: AlN = 5.1 pm∙V-1 [39], ZnO = 9.93 pm∙V-1 [40]）。当然，材料成本也取决于数量、纯度和定制程度，因此它们在某些应用中仍因其独特性能而受到青睐。压电器件的检测性能可达纳摩尔级别，但这也带来了问题，如在频率接近数十吉赫的FBAR中也有类似的报道[32]。但MUTs可通过两种类型的器件实现：压电型MUTs（PMUTs）和电容型MUTs（CMUTs）。这两类器件在生物医学应用中均展现出良好的应用前景。然而，与机电转换效率相对较低的PMUTs器件相比，CMUTs在生物传感方面更为高效。CMUTs通常采用背腔真空结构制造，因此机电转换效率高达85% [41]。此外，CMUTs阵列通常由数百个单元组成，这种结构可降低运动能力、减少热噪声。功能材料的表面修饰也能通过这种结构实现单元间的一致性，但由于生物功能化不精确，其选择性仍然受限。

已有研究提出了多种基于CMUT生物传感器的生化检测策略，其中大多数聚焦于对环境气体的检测，如CO2 [42]、湿度[43‒44]、SO2 [45]以及挥发性有机化合物（VOCs）[46‒47]。利用CMUT检测甲基膦酸二甲酯（DMMP）的灵敏度几乎可达万亿分之一（ppt）级别[48]。近年来，研究者开始尝试将CMUTs作为潜在的免疫传感器，用来检测浓度范围为10~500 ng∙mL-1的免疫球蛋白G（IgG），其可检测的质量灵敏度为0.44 ag∙μm-2 [49]，还能检测与阿尔茨海默病相关的神经肽，检测下限低至10 pg∙mL-1~1 ng∙mL-1 [50]。然而，由于CMUTs通常需要外部设备提供高电压，限制了其在便携化和微型化方面的应用。高压（HV）电源通常用于提供直流（DC）偏置电压，同时阻抗分析仪用来测量检测过程中的频率偏移。此外，目前已有的研究表明，目前仅开发了基于硫醇（thiol）的功能化方法用于金电极或金颗粒的CMUT器件。铝（Al）电极成本效益高、电性能良好、易于封装，广泛应用于MEMS技术。此外，铝还是多种CMOS技术中常用的顶层金属，因此不需要像裸露金电极的CMOS芯片那样进行额外的后处理。然而，适用于铝电极CMUTs的生物功能化方法缺乏系统性研究，包括物理化学表面活化和生物受体固定，而这些方法对最终生物传感器的选择性和灵敏度有显著影响[51]。在液体缓冲环境中，柔性振动模式的能量损耗、生物分子间的聚集现象以及相邻单元的串扰等问题，都会增加精准监测频率偏移的难度[50]。因此，亟须开发可靠的方法，将Al的功能化处理应用于基于CMUT的DNA生物传感器中。

本研究提出了一种基于CMUTs的谐振型生物传感器，集成CMOS前端接口，用于检测单链DNA寡核苷酸。本研究设计的CMOS驱动与处理模块可在芯片上直接提供高压直流（HV‒DC）偏置，并持续监测频率偏移。图1展示了检测原理，包括利用乙二醇烷硫醇来防止非特异性结合[52]。该CMUT阵列由数百个圆形单元组成，通过低温直接键合技术制造。本研究还提出了一个集总元件模型（LEM），用于提取电气等效参数，并以此为基础，采用台积电（TSMC）0.18 μm高压双极-CMOS-DMOS（BCD）工艺，合理设计专用集成电路（ASIC）接口。通过利用乙二醇硫醇磷酸自组装单层（SAM）对CMUTs顶部的铝电极进行功能化修饰。该SAM中的乙二醇基团可调节水分子行为，而水分子的有效调控是提升传感表面选择性并成功集成单链DNA（ssDNA）探针的关键。功能化及杂交过程通过扫描电子显微镜（SEM）和荧光成像显微镜进行表征。为避免溶液中离子及邻近单元串扰带来的干扰，本研究在空气环境下开展检测，以提升测量的可靠性。与阻抗分析仪的测量结果相比，本研究提出的基于CMUTs的生物传感器能以良好的灵敏度检测1~100 μmol∙L-1范围内的DNA分子。

2 材料与方法

2.1 基于CMUT的生物传感器

在设计基于CMUTs的生物传感器时，考虑了若干典型特性。例如，通过在顶部和底部电极之间施加DC偏置电压和交流电压（AC），CMUTs以谐振模式工作。该操作会产生静电力，使CMUTs顶部固定的薄膜发生振动。在本研究中，CMUTs单元被视为具有非线性响应的物理平板电容器，这种非线性特性会导致其谐振频率、阻抗和相位等电学特性在并联谐振区域内发生显著变化。

因此，单个CMUT单元的谐振频率f mem根据以下机械性质进行估算[35,45]：

f m e m = 0.83 t m e m R m e m 2 E π ρ ( 1 - ν 2 )

式中，R mem和t mem分别是顶部薄膜的半径和厚度；E是杨氏模量；ν是泊松比，ρ是密度。对于硅，E = 169 GPa, ν = 0.28, ρ = 2332 kg⋅m-3。

未施加静水压力到顶部薄膜的情况下，CMUTs单元的坍塌电压V collapse的计算公式如下[53]：

V c o l l a p s e = 5.369 R m e m 2 D d 0 ε 0
D = E t m e m 2 12 ( 1 - ν 2 )

式中，d 0是有效电极距离；ε 0是真空介电常数，D是弯曲刚度。

两种工作频率为2 MHz、由圆形单元组成的CMUT阵列通过前人研究中的低温（350  °C）直接键合工艺制备而成[54]，该技术兼容CMOS工艺。受制造工艺的限制，空腔的最小高度为400 nm。根据公式（2）和公式（3），减小空腔高度有助于降低塌陷电压。基于以上原则，最终结构的空腔高度被设计为450 nm。在下电极上方设置SiO2绝缘空腔层用于防止上下电极之间发生短路。考虑到电场击穿强度，绝缘层采用热氧化工艺制备，其设计厚度为100 nm。为确保顶层硅膜的均匀性及绝缘层的致密性，采用等离子体增强化学气相沉积（PECVD）工艺将绝缘层厚度设计为0.2 μm，并使用四乙氧基硅烷（TEOS）沉积顶层SiO2绝缘层。顶层硅膜采用绝缘层上硅（SOI）结构制备。为确保键合强度并防止在减薄过程中出现断裂，顶层硅膜的厚度设定为2 μm。

本文通过分析不同单元半径下塌陷电压与谐振频率的变化趋势，对CMUT单元的半径进行了优化设计（图2）。为兼顾人体安全电压阈值以及高工作电压下的能耗问题，将单元半径设计在60~70  μm的范围内，使得CMUT的工作电压需控制在36  V以下，同时需保持较高的谐振频率以维持较强的检测灵敏度。基于上述考虑，本文设计并制造了尺寸为4.7  mm × 4.7  mm的硅芯片，其中，半径为60  μm的CMUTs单元（A型）组成了30 × 30的圆形敏感单元阵列；半径为70  μm的CMUTs单元（B型）组成了20 × 20的圆形单元阵列。在基于CMUT的生物传感器阵列设计中，随着单元数量增加，并联结构可以增强信号读取能力并降低运动阻抗。此外，增大有效运动面积有助于减弱寄生效应（特别是寄生电容）的影响。鉴于每个CMUT芯片的制造面积限制为4.7  mm × 4.7  mm，设计时确保了足够的边缘距离（阵列最外侧单元与切割道之间至少为200   μm），以及8  μm的单元间边缘距离，从而在900个（A型）和400个（B型）单元的芯片中分别实现了顶层可动膜直径为120  μm和140   μm的结构设计。这种采用大量单元并联的阵列排布有助于抑制机械噪声和热噪声的影响。相关结构参数详见表1。

根据公式（1），CMUTs的谐振频率变化与顶部膜质量的变化呈线性关系。因此，通过在顶部膜上构建功能化探针层，基于CMUTs的器件即可检测目标生物分子。对公式（1）求导，可得出基于CMUT的生物传感器单位面积质量灵敏度S m，定义如公式（4）所示：

S m = - 2 m m e m A m e m f m e m = 4.27 R m e m 2 ρ 3 2 1 - ν 2 E

式中，m mem为CMUT顶部膜的质量，等于ρA mem t mem；A mem为CMUTs顶部膜的面积，等于 π R m e m 2。

将芯片A型和B型代入公式（4），计算检测灵敏度及抗噪性能。结果显示，较低的S m值意味着较高的质量灵敏度，且CMUTs半径越小，其质量灵敏度越高。因此，对于所设计的半径为60  μm的CMUT结构，其理论质量灵敏度估算为4.043 ag∙Hz-1∙μm-2，这一结果表明其灵敏度优异且极具应用价值。基于附录A中表S1所列参数，进一步分析了所设计CMUT单元在不同偏置电压下的电学特性，相关结果见附录A中的图S1与图S2。

2.2 CMOS接口

本文中，基于CMUTs的生物传感器ASIC接口的CMOS架构采用TSMC 0.18  μm HV BCD工艺制备。该接口主要集成了两个核心电路模块：高压电荷泵和反馈振荡器，在常规1.8  V电源电压下，使用Cadence IC6.1.7（Cadence Design Systems公司，美国）进行设计[55]。HV电荷泵电路拓扑采用HV p沟道金属氧化物半导体（PMOS）晶体管设计，并在结构中引入N+埋层，以减小n型金属氧化物半导体（NMOS）晶体管的体效应，从而实现50  V的击穿电压提升。同时，该结构具有较高的集成紧凑性。一个50  MHz的环形振荡器被用作缓冲器，为不同泵浦阶段提供数字时钟信号，控制输出电压的纹波，并缩短泵浦工作周期。

本文还设计了一个自由运行的带闭环反馈的振荡器结构，用于确定CMUTs生物传感器的谐振频率。该结构由两级基于反相器的放大器与高通滤波器构成[56]。为了提高开环增益，反相器在开关过渡区工作，同时在第一级反相器中引入了电阻性推拉偏置端口。一方面，该设计实现了模拟信号下的最大跨导增益，另一方面，减少了工艺波动与晶体管失配对电路性能的影响[35]。该反相器结构的开环增益A op可由公式（5）计算得出：

A o p = - g m N + g m P g d s N + g d s P

式中，g mN和g mP分别表示NMOS和PMOS晶体管的跨导，g dsN和g dsP分别表示其输出电阻对应的跨导。

本文结合具有寄生效应的LEM，将基于CMUTs的生物传感器引入反馈振荡器中，并对闭环拓扑结构进行了优化，确保其在谐振频率附近满足巴克豪森判据，从而实现具有稳定转移函数传感器的建立。

2.3 实验过程

实验在室温和常压下进行，SAM制备过程在通风橱中完成，避免有毒溶剂的影响。首先，依次使用丙酮、无水乙醇、甲醇和异丙醇清洗CMUT膜表面，每种溶剂清洗15 min，以去除膜顶端的保护胶。之后用去离子水（DI）清洗5 min，并用氮气（N2）吹干CMUTs表面。将0.04 mmol∙L-1的(HO)2POS(CH2)11EG3OCH2COOH和1.96 mmol∙L-1的(HO)2POS(CH2)11EG3OH混合，以甲醇为溶剂，使用摇床（MS 3 basic, IKA, Staufen，德国）在1000 r∙min-1速度下振荡10 s，制备成2 mmol∙L-1的SAM溶液。这种混合配比可解决当锚定基团（—COOH）距离过近时，DNA杂交速率下降的问题。水分子能与乙二醇链形成稳定的配位键，导致包围乙二醇链的溶剂化离子之间具有高度相关性，从而形成密集的结晶性螺旋构型[57]。使用微量移液器（Eppendorf SE，德国；Joanlab，中国）和分析天平（KERN ALJ160-4NM, KERN，德国）在制备过程中精确控制溶液浓度。在暗环境中将50 μL SAM溶液滴加至CMUTs表面，并将电极在该溶液中孵育过夜（16 h）。采用0  °C的工作温度，通过动力学控制、减少热扰力和最小化分子脱附来确保SAM形成的质量。在较低温度下，分子的动能降低，有助于它们结合并形成有序结构。此外，低温能进一步减少分子的热扰动，使其趋于有序排列，并降低从SAM上脱附的可能性，确保其结构完整和稳定。孵育完成后，用甲醇和DI水清洗电极表面，去除未结合的分子，然后使用N2吹干。随后，将ssDNA探针用三羧酸乙二胺缓冲液（TE buffer，含0.3 mol∙L-1 NaCl，pH为7.0）稀释至1 mmol∙L-1，并用摇床（1000 r∙min-1, 10 s）振荡。每种溶液的pH值使用pH探针（Orion 610型，美国）测量。随后，将已形成SAM的CMUTs表面在含0.05 mol∙L-1 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和0.2 mol∙L-1 N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDAC）的水溶液中孵育30 min，以活化表面，从而有效锚定DNA分子[52]。ssDNA探针先在75  °C的水浴中处理5 min，然后固定到CMUTs表面继续孵育2 h。随后，溶液自然冷却至室温。CMUTs表面用TE buffer洗涤三次，以去除非特异性结合。之后，再用DI水清洗以去除残余盐分，并用N2吹干。将互补和非互补的30-mer（mer，源自希腊语meros，意为“部分”）ssDNA按1~100 μmol∙L-1的不同浓度系列稀释于TE buffer中，并使用摇床振荡。取8 μL的30-mer ssDNA靶标溶液，75  ℃水浴加热后滴加到CMUTs表面，自然冷却至室温（30 min）。随后，器件依前述步骤再次清洗，以去除非特异性靶标和盐分，最终用N2吹干。在干燥条件下，对生物功能化后的CMUT表面进行荧光成像和频率测量。随后使用加热的TE缓冲液（75  °C）冲洗两次，再用DI冲洗一次，再次用N2干燥。对不同浓度的ssDNA寡核苷酸样品进行多次检测和表征。所有试剂均为分析纯，见附录A中的表S2。

3 结果与讨论

3.1 CMUTs性能表征

根据实验结果，A型芯片在检测灵敏度和噪声抑制效果方面均优于B型芯片。A型芯片顶部电极的布局如图3（a）所示。CMUTs膜的塌陷变形特性及其结构形貌的统计数据分别如附录A的图S3和表S3所示。硅芯片通过导电环氧树脂与测试印刷电路板（PCB）黏接，使用线焊接机分别焊接底部和顶部电极。可以观察到，较大的CMUTs阵列提供了更平坦、更均匀的铝表面，有助于生物功能化。此外，5 μL的液滴足以覆盖敏感区域。图3（b）显示了通过扫描电子显微镜（SEM，Hitachi SU8010，日立，日本）拍摄的CMUT单元的横截面显微照片，展示了其结构分布。采用了九点测量程序来分析所制造CMUT结构的统计值。测得的顶部电极的平均厚度为412 nm，最大尺寸误差为3%。测得的平均真空腔体高度为462 nm，相对误差为2.67%。因此，直接黏接技术确保制造过程可靠。图3（c）展示了使用扫描电子显微镜（Zeiss GeminiSEM 450，蔡司，德国）得到的CMUTs在不同电子高电压（EHT）下（5~15 kV）的能谱色散X射线（EDX）分析。随着EHT的增加，EDX分析中Al、Si和钛（Ti）的强度增加，这与CMUTs在深度方向上的材料分布一致。同时，Ti和TiN有较高的EHT，因为它们是电极的附着层。相比之下，C、N和O元素的强度未见显著变化，说明这些元素大多位于表面。CMUT的电阻抗和相位响应通过阻抗分析仪（Agilent 4294A，安捷伦，美国）进行了表征，如图3（d-i）和（d-ii）所示。使用楔形和球形焊接机（HB10，TPT焊线机公司，德国）对CMUT芯片进行线焊接。CMUTs在并联谐振区域周围以串联谐振频率（f s）和并联谐振频率（f p）发生谐振。使用五元素的LEM来拟合谐振区域的测量特性[58]。如图3（e）中的模型所示，R p表示一系列寄生电阻，C 0是物理电容，包括并联的寄生电容，而谐振臂由等效的运动损耗R、刚度C和质量L组成。CMUTs在f p = 2.222 MHz的频率下谐振，品质因数为70.41，由公式（6）计算得出：

f p = 1 2 π 1 L C ( 1 + C C 0 ) = f s 1 + C C 0

与图3（d）所示的2.229 MHz实测并联谐振频率相比，本文提出的LEM的相对误差为0.314%。此外，公式（6）也表明f p作为生物传感工作频率的优势，部分原因在于其品质因数和谐振频率比f s更高，从而降低了由于单元间非均匀性引起的噪声。此外，通过对公式（6）求导，计算得出频率与质量变化之间的关系：

d f p d m m e m = ∂ f s ∂ m m e m f p f s + f s 2 C 0 1 + C C 0 - 1 2 ∂ C ∂ m m e m -                   C C 0 ∂ C 0 ∂ m m e m

公式（7）表明，当额外的质量变化不影响刚度和并联电容时，相比f s中的频率和膜质量m mem关系，f p中的频率偏移与膜质量m mem变化之间呈线性倍数关系。因此，f p被选为无标记生物传感的工作频率。

3.2 SAM

图4（a）和（b）展示了SAM处理前后的显微照片，对比了CMUTs表面在使用乙二醇烷硫醇（也称硫代磷酸）功能化前后的形貌变化。洗涤和干燥后，可以观察到Al电极表面非常干净，为后续SAM层的孵育提供了必要条件，如图4（a-i）所示。放大图4（a-ii）可以看到，由于微尺度凹槽的存在，Al电极上仍有部分胶残留，但这些位于非敏感区域，因此不影响SAM过程。如图4（b-i）所示，SAM处理后实现了更好的单元均一性，表现为良好的单元间一致性。图4（b-ii）也显示了SAM分子沉积在SiO₂表面[59]上的情况，但这些区域不会参与振动或频率偏移。图4（b-iii）展示了功能化后的Al电极形貌与图4（a-iii）的对比，结果表明，SAM处理后在金属晶界处形成了均匀覆盖，这是标准的物理行为。

三块CMUT单元的能量强度显示出类似的元素分布[图4（c）]。与图3（c）的能谱图相比，这三块单元[图4（b-i）中的单元1~3]中的碳（C）元素强度明显增加，并且强度超过了氮（N）元素，这表明SAM在Al表面成功沉积，且一致性良好。图4（d）展示了硫代磷酸在CMUT表面上的化学结合机制。对于路易斯酸性表面，磷酰氧与路易斯酸性位点的配位，随后通过亲电性磷的杂缩合作用，有助于形成稳定的三齿结合状态[60‒61]，如图4（d-i）所示。对于路易斯酸性较弱的表面，主要是通过与两个表面羟基的杂缩合以及磷酰基与表面羟基之间的氢键，建立双齿结合状态[62]，如图4（d-ii）所示。尽管在自然环境中Al电极上会存在氧化铝，但在SAM沉积过程中，这两种结合方式都是有可能的。

3.3 荧光成像

对于互补ssDNA靶标，荧光强度随ssDNA浓度的增加而增强，如图5（a-i）~（a-v）所示。同时，SiO2区域的荧光强度更高，这与SAM处理后的结果一致，表明乙二醇沉积在CMUT单元之间的凹槽区域。然而，这些区域并不具备传感功能，因此不会引起与质量变化相关的频率漂移。为了研究选择性改善，本文使用半径为70 µm的CMUT单元阵列，进一步暴露于非互补ssDNA靶标中。图5（a-vi）显示了用100 µmol∙L-1非互补ssDNA获得的荧光图像，结果表明荧光完全消失，仅在环的边缘区域（尤其是在CMUT单元与底部SiO2之间的边界处）有微弱信号。这表明非互补ssDNA与固定化探针的结合效率很低，表明乙二醇烷硫醇带来了选择性的提升。

本文通过隔离细胞边缘的荧光干扰并提高有效荧光强度，定义54 µm半径、荧光图像最小色阈值为20，计算每个CMUT单元中荧光所占比例，估算出了平均荧光面积比。靠近荧光边缘的单元，其有效统计面积有所减少。对于互补ssDNA，随着浓度升高，面积比及其误差显著增加，如在1 µmol∙L-1下为6.34% ± 2.67%，而在100 µmol∙L-1下为40.40% ± 12.51%，如图5（b）所示，此外，还在高浓度下观察到ssDNA聚集的斑点。对于非互补ssDNA，最大面积比仅为0.10% ± 0.05%，相比100 µmol∙L-1互补ssDNA，减少了99.75%，如图5（c）所示。此外，在互补与非互补DNA（如100 µmol∙L-1下，分别为40.40%和0.10%）之间观察到的显著面积比差异，进一步证明了乙二醇功能基团带来的优异选择性。

3.4 CMOS测试与频率偏移

CMOS接口通过两个端口与CMUTs传感器连接：一个端口通过电阻R HV提供DC偏置电压，另一个端口则通过电容C OSC耦合到反馈振荡器，如图6（a）所示。ASIC接口键合到使用Altium Designer 2022（Altium，澳大利亚）设计的测试PCB上，如图6（b-i）和（b-ii）所示，该接口采用64引脚（9 mm × 9 mm）的无引线方形封装（QFN），见图6（a-iii）和（a-iv）。裸芯片的尺寸为1.897 mm × 1.897 mm，如图5（a-v）所示。在电气测试中，供电来自Keysight E3646A（Keysight，美国）电源，信号输出通过混合信号示波器（MSO-S 804A, Keysight，美国）实现，频率偏移通过通用频率计（53220A, Keysight，美国）检测。

图6（c）展示了所制备的基于PMOS的HV电荷泵电路的启动电压测量结果。图6（d）反映了HV输出信号在30~40 ms之间的瞬态电压波动，测得的平均输出电压为21.37 V。为了评估片上高压电荷泵的稳定性，将15~45 ms的瞬态信号分为六组，每组间隔5 ms，以计算波动水平，如图6（e）所示。测得的最大电压波动为149.96 mV。振荡器输出的启动时间少于1 ms，如图6（f）所示。稳态波形见图6（g），表明系统在2.146 MHz基频下工作，峰峰值幅度为1.891 V。采用重叠Allan偏差σ y来估算传感器噪声和短期稳定性，其计算基于多个平均时间的倍数τ 0，结合m个连续测量和总样本数N进行，如公式（8）所示[63]：

σ y ( m τ 0 , N ) = 1 2 m 2 ( N - 2 m + 1 ) ∑ j = 1 N - 2 m + 1 ∑ i = j j + m - 1 f ¯ i + m - f ¯ i 2 1 2

式中， f ¯ i是m个样本的平均频率，i和j为整数。在0.1 s的平均时间下，最小的Allan偏差（1σ）为0.27 kHz，根据200 Hz采样率的数据计算得出，如图6（h）所示。系统的功耗低于3.8 mW，其中HV增益电路和振荡器分别消耗3.6 mW和183.7 μW。

通过改变互补ssDNA的浓度，我们观察到了基于CMUTs的生物传感器中的明显频率变化。使用外部阻抗分析仪[图6（i）]和内部ASIC振荡器[图6（j）]进行了精确测量。具体来说，随着ssDNA浓度的增加，与质量加载效应相关的谐振频率下降，如在干燥条件下清洗后的测量所示。熔化并干燥后，谐振频率略微偏移并恢复[图6（i）]。基于四次测量，计算通过阻抗分析仪测量的平均频率偏移值，结果表明稳定性较好，误差较小，如图6（k）所示。尽管使用ASIC接口测量的平均频率偏移存在较大变化，但两种方法都观察到了类似的偏移趋势，这种频率噪声与系统的寄生效应有关。通过阻抗分析仪测量的频率偏移计算出检测灵敏度为9.533 nmol∙L-1，线性度为97.94%。相比之下，CMOS接口测量的灵敏度为7.943 nmol∙L-1，线性度为97.45%，相对误差为16.68%。同时，这些结果表明，使用本文提出的基于CMUT的生物传感器，实验质量检测灵敏度为0.061 fg∙Hz-1∙μm-2，适用于1~100 μmol∙L-1的浓度范围，检测限（LOD）计算为0.635 μmol∙L-1。不难理解，相对于实验室外部阻抗分析仪所需的测量，使用集成的基于CMUTs的生物传感器，灵敏度更高。然而，本文提出的集成片上振荡器和高压电源的基于CMUTs的生物传感器，在灵敏度达到0.061 fg∙Hz-1∙μm-2时，表现出极好的性能，较现有文献报道实现了重大突破。

3.5 未来改进方向

与已有文献中报道的基于CMUTs的生物传感器相比，本文首次探索了利用乙二醇烷硫醇对CMUTs阵列中Al电极进行高效功能化的新方法，从而实现了对DNA的无标记检测，并显著提高了选择性。此外，本文提出的片上HV提升和本地振荡器的CMOS/ASIC接口，在较低工作频率下为完全集成的CMOS解决方案实现了优异的检测灵敏度（表2）[35,49‒50,64‒65]。

然而，振荡器的稳定性通常受到约翰逊噪声、电路元件噪声、随机振动、散粒噪声及电源噪声等因素的影响[66‒67]。未来的研究将深入探讨这些问题，以实现更高分辨率的传感。此外，还需考虑其他几个方面。首先，可以通过提高集成度来降低电路元件噪声，例如，采用晶圆键合和硅通孔（TSV）工艺，实现CMUTs-on-ASIC器件的制备[68]。其次，对于CMUTs芯片，提高晶圆键合的可靠性并减少残余应力，有助于提升单元间振动的一致性[69]。再次，采用大规模并行阵列、增加单元数量，也能借助高品质因数和低运动阻抗进一步降低系统噪声[70‒71]。

4 结论

本文报道了一种基于2MHz CMUTs的无标记DNA生物传感器，该传感器与CMOS前端接口结合，可在空气和干燥条件下工作。研究人员采用了一种基于乙二醇烷硫醇SAM的新型功能化方法，将单链DNA固定到CMUT阵列的Al电极上。实验结果表明，形成的SAM具有良好的一致性和均匀性，并且由于乙二醇官能团的引入，显著提升了选择性。此外，本研究设计开发了一款专用集成CMOS电路，实现了片上HV电荷泵和反馈振荡器的总功耗低于3.8 mW，占用面积仅为3.6 mm2。振荡器表现出0.81 kHz（3σ）的实验Allan偏差，并成功检测了浓度范围为1~100 μmol∙L-1的ssDNA寡核苷酸。最终实现的质量检测灵敏度高达0.061 fg∙Hz-1∙μm-2，检测限达到6.243 μg∙mL-1。因此，这些结果表明，CMUT是一种在低浓度DNA检测中极具潜力的器件。未来，通过实现CMUTs-on-ASICs的直接集成，有望在微型化与可靠性方面取得更大突破。

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