增强多发性骨髓瘤的精准治疗

齐若谷 ,  王珊珊 ,  于佳怡 ,  陆天鸣 ,  毕志强 ,  刘伟波 ,  郭园园 ,  卞勇 ,  沈建良 ,  张雪松 ,  胡文浩

工程（英文） ›› 2024, Vol. 36 ›› Issue (5) : 178 -192.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 36 ›› Issue (5) : 178 -192. DOI: 10.1016/j.eng.2024.01.001
研究论文

增强多发性骨髓瘤的精准治疗

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Enhanced Precision Therapy of Multiple Myeloma Through Engineered Biomimetic Nanoparticles with Dual Targeting

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摘要

多发性骨髓瘤（MM）是第二大常见的恶性血液肿瘤。目前，多发性骨髓瘤的治疗策略受到全身毒性大和疗效不佳等阻碍。本研究通过开发一种强效的MM靶向化疗纳米粒子T-PB@M来克服这些局限性，该策略巧妙利用阿伦膦酸盐对骨基质中羟基磷灰石的高亲和力，以及对骨髓瘤细胞膜的同源靶向作用，实现了对肿瘤细胞的精准打击。本研究突出了T-PB@M在体内外的高度骨亲和性。此外，该纳米粒子能够在低pH环境下智能触发药物释放。T-PB@M还能够通过在MM细胞中有效诱导活性氧的产生，激活聚ADP核糖聚合酶1（PARP1）-Caspase-3-B细胞淋巴瘤-2（Bcl2）通路，进而触发细胞凋亡。值得一提的是，T-PB@M能优先靶向作用涉及骨骼的部位，有效避免了全身毒性副作用的发生，显著延长了MM原位小鼠的生存期。因此这种靶标MM的纳米载体为临床上MM的精准治疗提供了一个充满前景且极具潜力的平台。

Abstract

Multiple myeloma (MM) is the second most prevalent hematological malignancy. Current MM treatment strategies are hampered by systemic toxicity and suboptimal therapeutic efficacy. This study addressed these limitations through the development of a potent MM-targeting chemotherapy strategy, which capitalized on the high binding affinity of alendronate for hydroxyapatite in the bone matrix and the homologous targeting of myeloma cell membranes, termed T-PB@M. The results from our investigations highlight the considerable bone affinity of T-PB@M, both in vitro and in vivo. Additionally, this material demonstrated a capability for drug release triggered by low pH conditions. Moreover, T-PB@M induced the generation of reactive oxygen species and triggered cell apoptosis through the poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1)-Caspase-3-B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) pathway in MM cells. Notably, T-PB@M preferentially targeted bone-involved sites, thereby circumventing systemic toxic side effects and leading to prolonged survival of MM orthotopic mice. Therefore, this designed target-MM nanocarrier presents a promising and potentially effective platform for the precise treatment of MM.

关键词

多发性骨髓瘤 / 硼替佐米 / 药物递送 / 双重靶向 / 可控释放

Key words

Multiple myeloma / Bortezomib / Drug delivery / Dual targeting / Controlled release

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齐若谷,王珊珊,于佳怡,陆天鸣,毕志强,刘伟波,郭园园,卞勇,沈建良,张雪松,胡文浩. 增强多发性骨髓瘤的精准治疗[J]. 工程（英文）, 2024, 36(5): 178-192 DOI:10.1016/j.eng.2024.01.001

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1 引言

多发性骨髓瘤（MM）是一种成年人常见的血液系统恶性肿瘤，在全球范围内是第二大常见的血液肿瘤[1‒3]。该疾病以骨髓内恶性浆细胞的异常转化和不可控的克隆增殖为特征，这些恶性浆细胞的过度增殖可能超过正常浆细胞，从而导致骨骼结构受损和造血功能抑制[4‒5]。随着疾病进展，患者常出现骨痛、贫血、肾功能障碍以及易于感染等症状[6‒7]。此外，MM还可能伴随有淀粉样变等并发症[8‒9]，使得该疾病的治愈难度大，患者死亡率高，生活质量严重下降。

目前，临床治疗MM的策略主要包括自体干细胞移植和免疫疗法[10‒11]。然而，化疗作为与新型治疗相结合的重要手段，依然具有重要意义。硼替佐米（BTZ）作为首个获得临床批准的蛋白酶体抑制剂，已成为MM的一线治疗药物[12‒13]。BTZ通过选择性结合蛋白酶体的活性位点，阻碍其功能，进而影响癌细胞内的正常代谢和蛋白降解过程，最终导致癌细胞凋亡[14‒15]。此外，BTZ还能调节多种信号通路，如核因子kappa B（NF-κB）、磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和Janus激酶（JAK）/信号转导和转录激活因子（STAT）通路，从而影响癌细胞的增殖、转移、耐药性和其他生物学行为[16‒18]。尽管BTZ能够显著缓解MM患者的症状并延长其生存期，但目前受限于无法将足够的治疗性BTZ有效递送至MM的病灶内，它仍未能根除骨髓中MM细胞，从而仍无法为MM患者提供治愈方法。此外，高毒性BTZ的临床应用还伴随着一系列毒性副作用，包括外周神经病变、白细胞减少、潜在的粒细胞缺乏以及可能的严重器官损伤等[19‒20]。因此，迫切需要创新并开发一种新型靶向药物递送系统，该系统能够促进药物向骨髓的最佳转运，选择性地靶向作用MM细胞，并减轻不良反应。

为了优化BTZ的治疗效果并最大限度地减少其全身毒性，研究者们不断探索创新策略，包括开发聚合物-化疗药物偶联物，以及利用胶束、脂质体和纳米粒子等先进的载体系统[21‒24]。在BTZ递送方面，先进的BTZ递送系统巧妙地运用了肿瘤微环境触发响应机制，特别是利用肿瘤组织与正常组织之间存在的pH差异，实现了在肿瘤部位高度精准的pH触发药物释放。此外，亚细胞区域（特别是内体）内部酸度的增加，为内吞药物pH触发释放，从而增强抗癌药物递送的疗效开辟了新的途径[25]。因此，BTZ纳米药物在实体瘤治疗中显示出了卓越的疗效和较低的副作用。然而，在恶性血液肿瘤，特别是MM的治疗中，与实体瘤相比，增强的渗透性和保留（EPR）效应的重要性显著降低[26‒27]。这主要是由于血液肿瘤独特的血管结构和肿瘤组织特性，限制了EPR效应在MM治疗领域的应用。为了提高纳米粒子对恶性血液肿瘤细胞的靶向性，研究者们近期将焦点转向了细胞膜包覆的仿生纳米粒子。这种独特的膜包覆技术，能够完美地保留原始细胞类型的靶向特性[28‒29]。通过保留癌细胞的特异性表面标记物或受体，癌细胞膜包覆的纳米粒子能够精确地识别并靶向杀灭肿瘤组织细胞。因此，这些纳米粒子能够高效聚集在肿瘤部位，显著提升药物向肿瘤细胞的递送效率[30]。在MM细胞中，其生存和增殖很大程度上依赖于它们在骨髓微环境中迁移和重建的能力，这种现象被称为“骨髓归巢”（BMH）[31‒32]。BMH贯穿于MM的整个病程中，因此，利用癌细胞膜包覆的纳米粒子的独特属性和BHM在MM细胞中的固有特性，开发包覆MM细胞膜的纳米粒子可以增强治疗药物向骨髓区域的有效递送。该方法旨在通过同源靶向来优化纳米药物与MM细胞的相互作用，从而提高治疗效果。尽管癌细胞膜包覆的生物相容性得到了显著提升，但免疫系统识别和清除方面仍令人担忧。免疫系统可能会将包覆的癌细胞膜视为外来物质，从而引发免疫反应，这有可能削弱甚至完全抵消纳米药物的治疗效果。此外，考虑到MM的骨髓定位，仅利用MM细胞膜靶向肿瘤细胞是不够的。因此，必须增强纳米粒子的骨靶向能力，以促进BTZ有效递送至骨髓，从而减轻全身毒性，进一步优化治疗效果。

具有双膦酸结构的阿伦膦酸盐（ALN），因其具备与骨骼结构中磷酸钙结合的能力，已获美国食品和药物管理局（FDA）的认可，成为治疗绝经后骨质疏松症的主要药物[33‒34]。由于其出色的骨靶向特性，ALN被研究作为向骨骼和骨髓递送药物的潜力载体，以抑制骨吸收并减缓骨质疏松症的进展。此外，ALN与BTZ的联合应用更是展现出显著的协同治疗效果，两种药物相辅相成，不仅增强了疗效，还降低了MM的发病率[35‒36]。然而，尽管在酸性条件下结合使用BTZ和ALN对骨组织靶向给药具有潜在优势，但它们在选择性靶向作用肿瘤细胞方面的能力尚显不足，这在一定程度上限制了其在MM治疗中的实际应用。

本研究旨在开发一种有效的MM靶向化疗策略，该策略结合了ALN对骨基质的高亲和力与MM细胞膜的同源靶向性。首先，我们制备了一种与儿茶酚咖啡酸（CA）共轭的可生物降解的星型聚天冬酰胺（记为P1）；其次，P1的儿茶酚可以通过酸敏感的硼酸酯键与BTZ结合形成纳米粒子（记为PB）；再次，将PB包覆含有ALN的脂质体和MM细胞膜，形成具有靶向MM细胞的复合BTZ纳米粒子（记为T-PB@M）（图1）。

据推测，由于ALN的骨结合亲和性，T-PB@M能够渗入骨腔，进而通过骨髓归巢靶向增强MM细胞的摄取。另外，骨靶向纳米粒子能够保证与载体结合的强效BTZ在体内的稳定性，从而避免药物过早释放并降低其副作用。因此，这一创新策略有望在多发性骨髓瘤的治疗中达成更佳的治疗效果。

2 材料与方法

2.1 材料和试剂

BTZ、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]-N-羟基琥珀酰亚胺（DSPE-PEG2000-NHS）、3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）、四乙烯五胺、第0代聚酰胺胺树状大分子（G0 PAMAM）、异硫氰荧光素（FITC）和IR-780碘化物购自上海麦克林生化有限公司（中国）。纳米羟基磷灰石（HAP）购自上海阿拉丁生化技术有限公司（中国）。β-苄基-L-天冬氨酸（Bzl-Asp）和三光气购自上海吉尔生化有限公司（中国）。β-苄基-L-天冬氨酸的N-羧酸酐（NCAs）按照文献描述的方法合成[37]。2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司（中国）。膜联蛋白V/碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司（中国）。聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1），Caspase-3和B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）抗体购自Cell Signaling Technology（美国），用于Western blot分析。所有其他试剂均直接使用，无需进一步纯化。胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培养基、青霉素和链霉素购自Thermo Fisher Scientific公司（美国）。血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、血尿素氮（BUN）、血清肌酐（CREA）、血红蛋白、血清钙和尿蛋白购自南京建城生物工程研究所（中国）。免疫球蛋白G购自上海酶联生物技术有限公司（中国）。

2.2 细胞系

人多发性骨髓瘤细胞系U266和MM.1S购自中国科学院细胞库（上海）。细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基，于5% CO2的孵育箱中37 °C培养。

2.3 动物

NCG（NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt）小鼠、BALB/c-nu/nu小鼠和ICR小鼠（5~6周龄）购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司（中国）。所有实验操作均符合南京中医药大学动物实验委员会批准的方案（伦理号：202307A007）。所有小鼠在南京中医药大学实验动物中心的无特定病原体（SPF）级屏障设施饲养。

2.4 T-PB@M的合成

2.4.1 星形聚天冬酰胺的合成

通过G0 PAMAM引发的苄基-L-天冬氨酸-N-羧酸酐（Bzl-Asp-NCA）在二甲基亚砜（DMSO）中的开环聚合（ROP）制备了星形聚天冬酰胺，然后通过四乙烯五胺的氨解聚合[38]。

2.4.2 聚天冬酰胺-CA的合成

将100 mg聚天冬酰胺，35 mg咖啡酸，50 mg 1-乙基-3-（3-二甲胺基）丙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC）和60 mg羟基丁酸酐（NHS）溶解在10 mL DMSO中，并在4 ℃下搅拌24 h。将得到的溶液放入分子量截止（MWCO）为3500 Da的透析袋中，用水透析48 h（每4 h更换一次水）以除去未反应的物质和副产物。然后将聚天冬酰胺-CA溶液冻干以备用。使用Bruker 400 Avance III仪器（德国）上的400 MHz的1H核磁共振（NMR）光谱对合成物进行表征。

2.4.3 DSPE-PEG-ALN的合成

DSPE-PEG-NHS（100.0 mg, 0.1 mmol）和ALN（32.0 mg, 0.2 mmol）溶解在40.0 mL纯净水中。然后在25 °C下搅拌一天，随后用水透析（MWCO为1 000 Da）三天，然后冻干以得到白色固体DSPE-PEG-ALN。

2.4.4 细胞膜分离

首先，收集MM细胞并悬浮在含有20 mmol∙L-1 Tris-HCl（pH = 7.4），10 mmol∙L-1 KCl、2 mmol∙L-1 MgCl2和每10 mL溶液1片无乙二胺四乙酸（EDTA）迷你蛋白酶抑制剂的低渗透裂解缓冲液中。然后通过Dounce均质器将整个细胞悬浮液均质20次。均质后，通过离心（3200 g, 5 min）收集上清液。最初离心得到的沉淀在低渗透裂解缓冲液中重悬，然后重复上述步骤两次。每轮离心得到的上清液被组合并进行进一步离心（12 000 g, 30 min）。最终的上清液用含有10 mmol∙L-1 Tris-HCl（pH = 7.4）和1 mmol∙L-1 EDTA的溶液洗涤一次。最后，收集纯化的MM细胞膜，用于后续实验。按照上述膜提取方法，将样品冻干并称重。从1×107个U266细胞中提取了850 μg细胞膜用于后续实验。

2.4.5 PB的合成

将BTZ（10.7 mg, 0.2 mL）溶解在DMSO中，将聚天冬酰胺-CA的水溶液（100 mg, 10 mL）加入上述DMSO溶液中，并在室温搅拌15 min。随后，加入20 mL磷酸盐缓冲液（PBS）（pH=7.4），轻轻搅动2 h，以充分使BTZ与含儿茶酚的聚合物相互作用。然后，将非共轭BTZ和残留溶剂用纯水透析（MWCO为3500 Da）三天并冻干得到黄色粉末。使用高效液相色谱（HPLC）分析定量PB中的BTZ含量。

2.4.6 PB@M的合成

首先，通过物理挤压过膜（200 nm聚碳酸酯膜）10次获得MM细胞膜（MMs）。然后，混合PB纳米粒子和MMs，然后依次通过孔径为200 nm的聚碳酸酯膜挤压以制备PB@M纳米粒子。

2.4.7 T-PB@M的合成

为制备T-PB@M纳米粒子，将PB@M（2 mg, 10 mL）和DSPE-PEG-ALN（2 mg, 10 mL）溶解在水中并混合。将混合物依次通过孔径为200 nm的聚碳酸酯膜的挤压，形成最终的T-PB@M纳米粒子。

2.5 FITC标记的PB的合成

将2 mg PB，0.1 mg FITC，1 mg EDC和1 mg NHS溶解在10 mL DMSO中，并在4 ℃下搅拌24 h。随后，将得到的溶液透析（MWCO为3500 Da）三天并冻干，备用。

2.6 IR780标记的PB的合成

为制备IR780标记的PB，首先合成IR780的羧基衍生物（IR780-COOH），如文献报道[39‒41]。然后，进行IR780-PB的合成，该合成与FITC-PB相似，如上所述。

2.7 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

MM细胞膜，PB@M和T-PB@M与1 × 加载缓冲液混合，100 °C金属浴加热5 min。然后将制备好的蛋白样品加入丙烯酰胺凝胶中在BIO-RAD电泳系统中进行SDS-PAGE。经过45 min，用1 × 考马斯亮蓝液染色过夜，并在脱色后放入凝胶成像系统进行成像（ChemiDoc XRS+，BIO-RAD，美国）。

2.8 体外稳定性、溶血和HAP结合能力测定

通过在PBS缓冲液中监测特定时间点的粒径，使用动态光散射（DLS）法评估BTZ-纳米粒子（NP）的体外胶体稳定性，该法在7天的周期内监测颗粒大小的变化，以作为纳米粒子在测试期间的胶体稳定性的指标。

对于溶血试验，使用小鼠和兔的新鲜全血样本。PBS溶液和纯水分别用作阴性和阳性对照。全血以3000 r∙min-1离心5 min，并用PBS洗涤5次。然后，将0.25 mL含有游离BTZ、PB、PB@M和T-PB@M的PBS溶液与0.25 mL 4%红细胞（V/V）混合。混合物在37 °C孵育2 h，然后以500 r∙min-1离心。离心后测量545 nm处上清液的吸光度值。通过以下公式计算溶血率：

溶血率 = (H－H C/H 0－H C) × 100 %

式中，H表示带有游离BTZ、PB、PB@M和T-PB@M的红细胞上清液吸光度值，H 0表示在纯水中完全溶解后红细胞吸光度值，H C代表红细胞在PBS中上清液的吸光度值。

HAP结合能力测定是通过在200 mg HAP的存在下，将FITC标记的制剂与各种含ALN的样品一起孵育来进行的。孵育过程在室温下在温和搅拌条件下进行1 h。孵育期后，通过离心分离HAP颗粒。然后通过490 nm特定波长的紫外（UV）-可见光谱测量上清液的吸光度。随后用PBS洗涤HAP三次，以去除所有未结合的颗粒，并通过荧光显微镜观察。

2.9 药物载荷含量和释放测定

使用HPLC（e2695 series；Waters，美国）和反相C-18柱（Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18，4.6 mm×150 mm；Agilent，美国）分析BTZ。对于BTZ的检测，以35%乙腈溶液为移动相，其中含有0.1%三氟乙酸（TFA），流速为1 mL∙min-1。通常，注入10 µL溶液并在保留时间为8.3 min，λ = 270 nm处进行检测。BTZ的标准曲线在0~200 µg∙mL-1范围内（y = 13.413x - 0.7409，x为BTZ浓度，单位为µg∙mL-1，y为峰面积，R 2=0.9999）。药物载荷含量（DL）的计算公式如下：

DL =W T/W NP × 100%

式中，W T是由纳米粒子携带的BTZ的总质量；W NP是纳米粒子的总质量。根据公式（2），DL计算为10%。

通过平衡透析法进行体外药物释放。将含有纳米粒子的透析袋（MWCO = 3500 Da）放入具有不同pH值（7.4、6.5、5.0）的PBS溶液中，室温下摇床速度为500 r∙min-1。在预定的时间点（包括1、3、6、12、24、48 h），收集PBS并用同等体积的新鲜PBS溶液替换，确定BTZ的浓度。

2.10 细胞毒性和细胞摄取

通过MTT法定量检测游离BTZ、PB、PB@M和T-PB@M对MM细胞（U266和MM.1S）的毒性。简而言之，将1×104个U266和MM.1S细胞种植在96孔板中，加入游离BTZ、PB、PB@M和T-PB@M，使得最终的BTZ浓度为5、50、100、200和500 nmol∙L‒1。用PBS处理的细胞作为对照。然后，在37 °C和5% CO2条件下孵育96孔板。孵育24 h和48 h后，使用MTT法测定细胞活力。

使用流式细胞仪（FCM）（Gallios； Beckman，美国）和荧光显微镜（Axio Vert A1； Zeiss，德国）检测PB、PB@M和T-PB@M的细胞摄取。通常，将U266细胞（1×105）种植在12孔板中，分别加入带有相同荧光浓度的FITC标记的PB、PB@M和T-PB@M。4 h后，用PBS三次洗涤细胞，并使用流式细胞仪分析（1）从每个样品中获取的数据为15 000个细胞；（2）进行进一步的荧光成像分析，用4%多聚甲醛溶液固定细胞，并用Hoechst染色，通过荧光显微镜成像。

2.11 细胞凋亡分析

使用膜联蛋白（Annexin）V/PI凋亡检测试剂盒，研究游离BTZ、PB、PB@M和T-PB@M对U266和MM.1S细胞诱导的细胞凋亡。将U266和MM.1S细胞接种在6孔板中，分别加入的游离BTZ、PB、PB@M和T-PB@M，并加入浓度为50 nmol∙L‒1的BTZ。12 h后，用PBS洗涤细胞三次，并按照说明使用Annexin V/PI凋亡试剂盒染色。随后，通过流式细胞仪分析细胞。

2.12 蛋白质印记

通过蛋白质印记（western blot）分析评估凋亡蛋白的表达。将U266细胞接种在6孔板中，并按照前述方法处理。培养24 h后，用PBS洗涤U266细胞两次，并以1000 r∙min-1转速离心并收集细胞沉淀。细胞裂解后，使用含有0.1%蛋白酶抑制剂的冷放射免疫沉淀分析缓冲液提取细胞总蛋白，双辛可宁酸（BCA）试剂盒测定蛋白浓度后，蛋白样品中加入缓冲液后经变形处理，然后将50 μg蛋白样品上样至SDS-PAGE胶孔中，进行电泳。电泳结束后，100 V电压于冰上转膜[聚偏二氟乙烯（PVDF）膜] 1 h。转膜结束后，以5%脱脂奶粉室温封闭2 h。4 ℃过夜孵育一抗PARP1、Caspase 3和BCL-2，室温孵育辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗后，使用化学发光试剂通过凝胶成像系统自动放射成像。蛋白条带的灰度利用Quantity One软件分析，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作内参，目的条带与其相比得到相对表达量。

2.13 活性氧物质（ROS）检测

使用流式细胞仪分析检测U266和MM.1S细胞中由游离BTZ、PB、PB@M和T-PB@M处理引起的活性氧物质的生成。首先，在6孔板中以每孔1.0×106个细胞的密度培养U266和MM.1S细胞，使用相同BTZ浓度（50 nmol∙L‒1）的游离BTZ、PB、PB@M和T-PB@M培养24 h。其次，收集U266和MM.1S细胞并用PBS洗涤三次。再次，用2',7'-二氯荧光二乙酸酯（DCFH-DA）在37 °C黑暗中染色30 min。最后，通过流式细胞仪立即分析细胞的荧光。

2.14 MM小鼠模型的建立

使用雄性BALB/c-nu/nu和NCG小鼠建立MM动物模型。骨质疏松的MM小鼠模型：对小鼠进行麻醉后，将U266细胞（5×106细胞，100 μL RPMI 1640培养基）注入右胫骨；原位MM小鼠模型：将U266细胞（1×107细胞，100 μL RPMI 1640培养基）通过尾静脉注射。

2.15 体内分布研究

MM小鼠随机分为三组，每组三只。分别静脉注射IR780标记的PB、PB@M和T-PB@M。注射后在不同时点使用小动物活体成像系统（IVIS Spectrum，PerkinElmer，美国，激发波长：745 nm，发射波长：820 nm）监测小鼠体内的荧光强度。之后，小鼠安乐死，收集心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏，以及右侧骨损伤后肢和左侧健康后肢，进行成像。

2.16 安全性评估和骨亲和性研究

使用血液生化分析评估游离BTZ、PB、PB@M和T-PB@M的安全性。ICR雄性小鼠被随机分为两组：一组小鼠用于单次给药毒性实验，另一组用于多次给药毒性实验。两组小鼠均在第1天（单剂量）或第1、3、5和7天（多剂量）分别注射PBS、游离BTZ、PB、PB@M和T-PB@M，等效BTZ剂量为0.5 mg∙kg-1。在第2天（单剂量组）和第8天（多剂量组），采集血样并离心（1500 g, 15 min, 4 °C）以获取血浆。测量血清中ALT、AST、BUN和CREA的水平。

PB、PB@M和T-PB@M与离体小鼠胫骨和股骨的结合实验通过IR780标记的PB、PB@M和T-PB@M与离体小鼠胫骨和股骨在6孔板中共孵育2 h完成，然后用PBS洗涤三次。小动物活体成像系统（IVIS®光谱成像系统）通过荧光强度检测骨亲和性。

2.17 体内治疗效果

MM小鼠被随机分为四组，每组五只。每组小鼠分别在第1、3、5和7天注射PBS、游离BTZ、PB@M和T-PB@M，等效BTZ剂量为0.5 mg∙kg-1。在整个实验过程中，记录了小鼠的体重和生存期。在第28天，对小鼠进行安乐死，采集血样并进行离心（1500 g, 15 min, 4 °C）以获取血浆。对骨髓瘤标志物（包括血红蛋白、血清肌酐、血清钙、免疫球蛋白G和尿蛋白）进行测定。收集小鼠骨髓进行骨髓涂片检测，收集心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和其他主要器官，用4%福尔马林固定，包埋在石蜡中，H&E染色。

2.18 统计分析

本文中的所有数据均使用GraphPad Prism 9.0软件进行处理。测试数据以均值±标准偏差（SD）表示。根据t检验进行显著性水平分析：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

3 结果与讨论

3.1 T-PB@M的制备与表征

本研究合成的双重靶向纳米粒子（T-PB@M）包括三个主要组成部分：具有BTZ共轭的聚合物核心，来源于MM细胞膜的外层壳，以及双磷酸盐功能化的骨靶向冠状物。制备T-PB@M（附录A中图S1）的具体步骤如下：首先，通过G0 PAMAM作为引发剂的开环聚合反应合成了星形可生物降解的聚天冬酰胺，并进行氨解反应[42]，将咖啡酸接枝到聚天冬酰胺的氨基上，并通过核磁共振（NMR）光谱进行验证（附录A中图S2和图S3）；其次，BTZ的硼酸与咖啡酸的儿茶酚之间形成了pH敏感的共价硼酸酯键，形成纳米的药物核心部分PB；再次，将MM细胞膜分离并包裹到PB纳米粒子上，形成具有同源靶向功能的MM细胞膜包覆的PB（PB@M）颗粒；最后，将骨靶向基元DSPE-PEG-ALN（附录A中图S4）通过疏水相互作用引入到PB@M的脂质双层中，最终得到了双重靶向纳米粒子T-PB@M。

为了优化T-PB@M与骨矿物的亲和力，将带有FITC标记的T-PB@M与不同比例的骨靶向ALN基团与模拟骨矿物组织的HAP进行共孵育。通过对HAP表面的荧光强度进行检测定量，发现荧光强度逐渐增强，表明随着ALN含量的增加，T-PB@M与HAP之间的相互作用增强（附录A中图S5）。然而，当ALN含量达到50%时，荧光强度达到平台期，随后即使增加ALN含量，也没有观察到显著的荧光增强。结果表明，含有50% ALN的T-PB@M为骨靶向纳米粒子提供了有利的结构，显著增强了与骨矿物的结合亲和力。

为了验证含药纳米粒子的成功制备，我们随后测定了PB、PB@M和T-PB@M的粒径和zeta电位。如图2（a）和（b）所示，PB的粒径约为50 nm。在PB上覆盖MM细胞膜形成PB@M后，粒径增加到约90 nm，而将DSPE-PEG-ALN引入PB@M的脂质双层形成T-PB@M后，粒径增加到120 nm。PB纳米粒子的zeta电位约为20 mV，由于MM细胞膜的负电荷性，PB@M的电位降至-17 mV；此外，由于细胞膜表面存在具有PEG包裹的骨靶向基团，T-PB@M纳米粒子的电荷略有屏蔽，表面电荷增加到-13 mV。此外，为了确定T-PB@M纳米粒子表面存在骨髓瘤细胞靶向的膜蛋白，我们进行了SDS-PAGE分析[图2（c）]。结果显示，与MM细胞膜一样，PB@M和T-PB@M均保持了大多数相关的膜蛋白，表明T-PB@M的表面性能得到了改善。此外，使用DLS评估了所制备纳米粒子在7天内的分散稳定性。如图2（d）所示，纳米粒子组成成分均表现出良好的稳定性，这归因于纳米粒子表面的电荷和疏水-亲水平衡。此外，透射电子显微镜（TEM）图像显示T-PB@M纳米粒子呈均匀的球形结构，直径约为100 nm。值得注意的是，这些纳米粒子在外层显示出明显的类似冠状的包覆层，表明纳米粒子表面成功地包覆了细胞膜，在PB@M纳米粒子的成像中也观察到了这一特征[图2（e）]。这些结果共同表明了T-PB@M纳米粒子的成功制备，其小颗粒尺寸、适当的zeta电位以及表面存在的膜蛋白为其有效进入骨髓提供了有利条件。

3.2 T-PB@M的体外溶血、药物释放和骨结合力测定

考虑到T-PB@M作为MM治疗的潜在临床药物，我们对其与小鼠血液的生物相容性进行了详细评估。为此，通过溶血实验探究了该纳米药物及其主要组成成分1 mg·mL-1的BTZ与红细胞（RBC）共孵育后的细胞毒性。如图3（a）和（b）所示，经过2 h的共孵育，与纯水阳性对照组相比，PB、PB@M以及T-PB@M的溶血率均维持在低于2%的水平，而BTZ则显示出约6%的溶血率。这一结果明确表明，与BTZ相比，PB、PB@M以及T-PB@M的安全性和生物相容性更高。为了进一步验证这些结果，我们采用兔血进行了额外的溶血实验，以更全面地评估BTZ、PB、PB@M和T-PB@M的生物相容性。如附录A中图S6所示，使用兔血进行的溶血检测结果与使用小鼠血的实验结果一致，再次验证了这些材料的安全性和生物相容性。这些结果共同证实该纳米药物的安全性和生物相容性，使其具备临床应用潜力。

本研究中的纳米粒子的核心部分包含生物可降解的聚天冬酰胺和CA。CA的选择基于其儿茶酚部位能够以pH依赖的方式结合并释放BTZ [43]。我们假设，在肿瘤微环境中，BTZ与儿茶酚基团分离，触发活性药物的释放，进而发挥其蛋白酶体抑制功能。为了验证这一假设，我们在三个不同的pH条件（7.4、6.5和5.0）下进行了药物释放实验，以模拟正常组织和血液中的生理pH、肿瘤的酸性细胞外环境以及亚细胞溶酶体内的酸性环境。如图3（c）所示，我们观察到T-PB@M的pH依赖性药物释放现象。在pH = 7.4（代表生理环境）的溶液中，T-PB@M在48 h内几乎无药物释放，表明在正常生理环境下，T-PB@M能够保持稳定；当pH降至6.5（代表肿瘤细胞外环境）时，药物释放速率略有加快；而在pH = 5.0（模拟酸性溶酶体环境）下，释放速率显著增加，超过75%的药物在8 h内释放，24 h内释放量超过80%。这些结果表明T-PB@M的释放速率和释放量具有显著的pH依赖性，这主要归因于T-PB@M内部形成的pH响应动态共价键。此外，我们还比较了T-PB@M及其不同组分（PB、PB@M）在酸性条件（pH = 5.0）下的释放规律。如图3（d）所示，PB@M和T-PB@M的释放速度相比PB较慢，这可能是由于纳米粒子表面的细胞膜壳层阻碍了药物的释放。尽管如此，PB、PB@M和T-PB@M均在48 h内达到了80%的药物释放，这表明尽管它们的释放动力学有所不同，但在细胞内均能表现出较好的治疗效果。因此，双重靶向功能纳米粒子表现出良好的药物释放行为，并显示出增强靶向部位治疗效果的巨大潜力。

T-PB@M纳米粒子不仅具有pH敏感的聚合物载药核心，其表面还涂覆有聚乙二醇功能化的骨靶向ALN部分组成的细胞膜外壳。这种设计旨在提高T-PB@M对骨损伤部位的靶向能力，从而提高对MM的治疗效果，并减轻对其它器官的毒副作用。为了评估T-PB@M纳米粒子的骨组织结合能力，我们使用FITC标记的纳米粒子与模拟材料（如HAP）共孵育。如图3（e）和附录A中图S7所示，在孵育1 h后，T-PB@M与HAP的结合率分别是PB和PB@M的4.7倍和3.6倍。孵育6 h后，T-PB@M与HAP的结合率高达90%，而PB和PB@M的结合率约为20%。这些结果表明，在体外条件下，T-PB@M的骨靶向能力显著增强，这主要归因于ALN的引入，有效地增强了纳米载体的骨靶向功能。

3.3 T-PB@M的体外细胞毒性、细胞摄取和促细胞凋亡研究

在确认了T-PB@M纳米粒子对骨组织的有效靶向能力后，我们利用MTT法进一步评估了含有BTZ的纳米药物与游离BTZ相比的体外细胞毒性。实验中，我们将不同浓度的PB、PB@M和T-PB@M与MM细胞（U266和MM.1S细胞）共孵育不同时间。如图4（a）、（b）和附录A中图S8所示，PB、PB@M和T-PB@M以及游离的BTZ以剂量依赖的方式诱导细胞死亡，特别地，T-PB@M和PB@M均对MM细胞系有显著的抑制作用。在U266细胞中，T-PB@M和PB@M孵育24 h后的半数抑制浓度（IC50）值分别为177 nmol∙L-1和286 nmol∙L-1，与游离BTZ（172 nmol∙L-1）相当，但低于PB（200 nmol∙L-1）。当孵育时间延长至48 h，T-PB@M和PB@M的IC50值分别为104 nmol∙L-1和125 nmol∙L-1，而PB和游离BTZ的IC50值分别为108 nmol∙L-1和75 nmol∙L-1。这些结果表明，经细胞膜包覆的纳米粒子T-PB@M和PB@M对MM细胞的细胞毒性与临床药物BTZ相当，显示出MM细胞膜包覆策略作为治疗MM的潜在方案的有效性。

为了探究细胞膜包覆的纳米粒子递送BTZ能达到预期高毒性的原因，我们研究了纳米药物的细胞摄取行为。我们使用FITC作为荧光探针来标记纳米粒子并将标记的纳米粒子与U266细胞共孵育4 h，通过荧光显微镜和流式细胞仪观察细胞对纳米粒子的相对摄取量。如图4（c）所示，与细胞相互作用后，T-PB@M和PB@M纳米粒子处理的U266细胞的荧光强度高于PB纳米粒子处理的细胞。FCM分析进一步验证了这一结果，T-PB@M组U266细胞的平均荧光强度（78.5%）比PB组高1.8倍（42.5%），这与PB@M组相当[图4（d）和（e）]。这些结果表明，细胞膜包覆的纳米粒子表现出更强的细胞摄取和内化能力，这可能与细胞膜的流动性和膜蛋白的同源靶向性有关。这些结果与MTT实验的结果一致，进一步证明了T-PB@M和PB@M纳米粒子对MM细胞有较高的细胞毒性。

我们使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测了不同浓度的BTZ对U266和MM.1S细胞凋亡和坏死的诱导作用，并用FCM表征。如图5（a）和（b）所示，在BTZ浓度为50 nmol∙L-1时，游离BTZ处理后的U266细胞凋亡率仅为33.3%，而PB处理后的细胞凋亡率显著增加至63%，T-PB@M的凋亡率最高，达78.3%，与PB@M组（71%）相当。MM.1S细胞的凋亡趋势与U266细胞一致（如附录A中图S9所示）。这种凋亡反应的增加可归因于几个关键因素：首先，T-PB@M和PB@M的纳米粒子促进了靶细胞的内化，提高了药物的摄取和生物利用度；其次，MM细胞膜壳层提供了主动靶向能力，将药物导向MM细胞，从而最大化治疗效果；再次，纳米粒子内的药物偶联物对酸性细胞内环境敏感，这种酸敏感的结合使药物在MM细胞内更快地释放，增强了其细胞毒性和凋亡效应。这些重要发现凸显了T-PB@M因其有效诱导MM细胞凋亡并增强细胞毒性，而成为BTZ治疗方案中有前景的候选药物。

为了进一步证实T-PB@M的促凋亡能力，我们评估了与凋亡相关蛋白的表达水平，包括PARP1、Caspase-3和Bcl-2 [44‒45]。PARP1在细胞凋亡过程中发挥重要作用，其超活化会导致细胞能量底物如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和三磷酸腺苷（ATP）的耗竭，进而在细胞损伤时导致凋亡。同样，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Caspase-3是细胞凋亡过程中的关键执行者，它在凋亡信号开始时被激活，诱导细胞内的蛋白水解并最终导致细胞死亡。而Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，通过防止内在和外在的凋亡刺激抑制凋亡过程而为细胞提供保护。Bcl-2的功能失调与促进细胞凋亡有关。PARP1和Caspase-3在细胞损伤修复和凋亡中起着互补作用。此外，Bcl-2通过调节细胞内凋亡信号通路调节Caspase-3活性。因此，本文评估了含BTZ的制剂处理后的MM细胞中PARP1、Caspase-3和Bcl-2的表达水平。如图5（c）所示，T-PB@M显著上调了PARP1和Caspase-3蛋白的表达，同时抑制了Bcl-2蛋白的表达。这些结果表明T-PB@M在增强肿瘤细胞凋亡方面的能力，其性能超过了游离BTZ和PB。

3.4 胞内ROS水平测定

当肿瘤细胞内部产生的ROS超过其固有的清除能力时，会导致氧化应激，这种现象通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用。BTZ作为一种用于MM临床治疗的蛋白酶体抑制剂，除了其抑制蛋白酶体功能外，最近的研究还发现它能够提高细胞内ROS水平[46‒47]。为了探究T-PB@M纳米粒子促使肿瘤细胞凋亡的潜在机制，我们进行了细胞内ROS水平的评估。通过使用ROS探针DCFH-DA，并结合FCM，我们检测了游离BTZ、PB、PB@M和T-PB@M处理后细胞内ROS的产生情况。如图5（d）和附录A中图S10所示，游离BTZ和PB在4 h内导致细胞内ROS水平略有上升，而PB@M和T-PB@M则显著促进了ROS的增加，特别是在U266细胞中T-PB@M显示出非凡的效果，促进高达90%的细胞产生了高水平的ROS。T-PB@M显著促进ROS生成可能由于纳米粒子的细胞膜包覆策略，它使PB@M和T-PB@M纳米粒子能够更快地被细胞摄取。这种增强的细胞摄取和内化能力使得T-PB@M纳米粒子能够在MM细胞中有效产生大量ROS，进而引发氧化应激，最终促进肿瘤细胞的凋亡。该结果与MTT实验结果一致，进一步支持了T-PB@M纳米粒子通过增强细胞摄取和内化来提高对MM细胞的细胞毒性的观点，结合其有效的细胞摄取、pH响应性药物释放和骨靶向能力，细胞膜包覆策略为实现MM治疗中的显著疗效提供了极具前景的方法。

3.5 T-PB@M的体内生物分布研究

为了更深入地探讨T-PB@M纳米粒子在生物体内的分布特性，我们构建MM骨质疏松小鼠模型，并选用IR780作为荧光探针，追踪T-PB@M在骨损伤部位的特异性聚集情况。本实验中，采用尾静脉注射的方式，将标记了IR780的纳米粒子注入MM小鼠体内，并在不同的时间点监测荧光信号的强度变化。如图6（a）所示，在实验过程中，PB和PB@M在骨损伤区域的荧光信号并不明显，而T-PB@M在注射后2 h即在骨损伤部位出现了较强的荧光信号，并且随着时间的推移，荧光强度增强。

为了验证纳米粒子在体内的分布和定位情况，在注射后12 h后对小鼠的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行了体外荧光强度评估。同时，我们还对小鼠的非病理性（左）和病理性（右）的后肢进行了荧光信号分析。如图6（b）和（c）所示，PB在肝脏内展现了最强的荧光信号，这主要是由于肝代谢中的“首过效应”所致，而由于MM细胞仿生膜的包覆，PB@M和T-PB@M在肝细胞中的清除速率得到了延缓，赋予了这些纳米粒子免疫逃逸的能力，这与文献报道结果一致[48]。特别地，在骨损伤的肢体内，T-PB@M组的荧光信号强度显著高于PB和PB@M组，分别高出4倍和1.5倍，这一趋势在所有的评估时间点均保持一致，这一发现可归因于T-PB@M所具备的ALN主动靶向能力，显著增强了纳米粒子对骨损伤部位的特异性。如图6（d）所示，对骨/肝荧光强度的定量分析表明，T-PB@M在骨与肝的荧光强度比例上，相较于PB@M和PB，分别提高了3倍和10倍，这一显著的提升由于T-PB@M的双重靶向机制：一方面，其双磷酸盐功能化的骨靶向功能使其能够精准指向骨损伤部位；另一方面，生物仿生的细胞膜包覆使其具有骨髓细胞的同源特性，进而实现了骨髓内的优先积聚。这些独特的特性使得T-PB@M纳米粒子在静脉给药后能够高效地在骨髓中积聚，同时显著减少了在肝脏的积累。这些结果不仅有力地证实了T-PB@M在骨损伤部位的选择性聚集能力，还预示了其在提高MM体内治疗效果方面的巨大潜力，为克服与免疫清除相关的挑战提供了新思路。

3.6 T-PB@M的安全性和骨亲和性评价

在深入评估纳米粒子的生物相容性时，我们系统研究了纳米药物的不同组分在单次及多次给药后对小鼠血液生化指标的影响[49‒50]。通过检测肝功能的关键指标，如ALT和AST，以及肾功能指标如BUN和CREA，探究其对小鼠机体的潜在影响。如图7（a）~（d）所示，经过多次给药后，游离BTZ显著提高了ALT和AST水平，结果表明其对小鼠肝脏的潜在损伤和毒性。然而，BUN和CREA在游离BTZ给药后均未表现出明显的变化，从而表明BTZ的肾毒性很小。特别地，与PBS对照组相比，T-PB@M纳米粒子无论是在单次还是多次给药后，其血清AST、ALT、BUN和CREA水平均保持稳定，未观察到显著变化，结果表明T-PB@M的双重靶向性，使得其能精准地将药物送达病变部位，同时有效控制和延迟药物在健康组织中的释放。因此，从生物安全性的角度，T-PB@M纳米粒子相较于游离BTZ显著降低了全身毒性，并展现出较好的生物相容性。此外，为了验证T-PB@M的骨亲和性，我们进一步在小鼠胫骨和股骨标本上进行了实验。通过IR780标记的PB、PB@M和T-PB@M与小鼠骨骼样本共孵育2 h后，利用IVIS成像系统进行评估。如图7（e）和（f）所示，T-PB@M因ALN的强大骨靶向功能而呈现出极高的荧光强度，其强度是PBS组的10.2倍。相较之下，PB和PB@M组的荧光强度则相对较弱，未显示出显著差异。这些发现不仅证实了T-PB@M纳米粒子的优越生物相容性和低全身毒性，而且凸显了其在精准骨靶向的功能，为T-PB@M纳米粒子在MM等骨相关疾病治疗中的潜在应用提供了强有力的支持。

3.7 T-PB@M的体内治疗效果评价

MM是一种侵袭性的恶性血液肿瘤，其典型的临床特征包括血钙升高、肾功能不全、贫血和骨痛等，这些指标共同构成了经典的CRAB标准。为了监测MM的病程进展，我们构建了MM原位小鼠模型，并通过血红蛋白水平、血清钙、免疫球蛋白水平、尿蛋白含量以及骨髓涂片等CRAB相关指标[51‒53]来评估T-PB@M治疗对MM小鼠模型的影响。如图8（a）所示，通过尾静脉注射U266细胞至NCG小鼠体内，成功建立了原位MM小鼠模型。14天后，MM小鼠被随机分为四组，分别给予生理盐水、游离BTZ、PB@M和T-PB@M治疗，每次给药剂量为0.5 mg∙kg-1 BTZ，共治疗四次（第1、3、5和7天）。健康NCG小鼠作为空白对照组。治疗结束后，持续观察小鼠，并在第28天对小鼠实施安乐死。整个实验过程中，严格监测了小鼠的体重和存活状况。如图8（b）~（e）所示，与生理盐水处理组相比，T-PB@M治疗显著提高了血红蛋白水平，降低了血清钙水平，减轻了蛋白尿，并减少了血清免疫球蛋白的产生。结果表明T-PB@M几乎能将MM小鼠的CRAB恢复到正常水平，显示出较好的骨髓内抗肿瘤效果。这种增强的抗肿瘤作用归因于药物的双重靶向能力，不仅包括肿瘤细胞膜壳层的骨髓归巢，还包括ALN的直接骨靶向。通过检测MM小鼠骨髓涂片，进一步证实了T-PB@M的治疗效果：患有MM的小鼠骨髓中富含代表MM进展的蓝紫色浆细胞；而经过T-PB@M治疗后，骨髓中的浆细胞数量与健康小鼠无显著差异[图8（f）]。这些结果证实了在纳米粒子内设计双重靶向特性的策略有效，解决了骨髓靶向和骨微环境归巢问题。在这种情况下，BTZ被输送到骨病变处，随后在MM部位积聚，从而增强了MM的治疗效果。

此外，我们还详细追踪了小鼠的存活率和体重变化。如图9（a）和（b）所示，接受BTZ治疗的小鼠体重显著减轻，死亡率迅速增加，这是由于BTZ较大的毒性所致。相比之下，接受T-PB@M治疗的MM小鼠体重变化较小，存活时间更长。同时，我们对小鼠主要器官进行了H&E染色评估。如图9（c）所示，MM模型组小鼠与正常对照组相比显示出明显的器官功能障碍，游离BTZ治疗组表现出明显的心肌毒性和肝毒性；然而，在接受T-PB@M和PB@M治疗后，器官功能得到有效恢复，尤其是T-PB@M组的主要器官未观察到明显的病理变化，与正常小鼠的情况相似。这些结果充分证明了T-PB@M纳米粒子在提高总体存活率、减轻全身不良反应方面的重要作用，并且未显示出组织学毒性。这些结果不仅为T-PB@M纳米粒子的安全性提供了强有力的证据，还进一步增强了其治疗MM潜力。这些发现为T-PB@M纳米粒子作为临床上的治疗策略提供了强有力的支持。

4 结论

在这项研究中，我们成功开发了一种用于治疗多发性骨髓瘤的双重靶向纳米粒子T-PB@M，该粒子系统结合了几个关键成分来提高其治疗效果。T-PB@M的核心由临床化疗药物BTZ通过pH响应性的硼酸脂键与聚合物结合而成，其外层包裹了MM细胞膜，并融合了具有骨靶向功能的双磷酸盐基团脂质体。这种创新设计不仅大大增强了纳米药物在骨髓微环境（BMH）中的亲和力，还显著提升了其骨靶向能力，从而极大地优化了治疗效果。T-PB@M的独到之处在于它能够在肿瘤细胞内部的酸性环境中精准控制释放化疗药物BTZ。更重要的是，凭借其精准的双重靶功能，T-PB@M能够精确识别MM细胞膜上的特定蛋白质，从而准确地将药物输送到MM细胞归巢的骨髓区域。除了出色的靶向能力，T-PB@M还能诱导MM细胞生成活性氧，并通过上调PARP1和Caspase3蛋白的表达，同时下调抗凋亡的Bcl-2蛋白的表达，有效促进了MM细胞的凋亡过程，显著抑制了MM细胞的生长和存活。尤为关键的是，T-PB@M的双重靶向特性显著提高了药物对骨损害的特异性传递效率，并在MM病灶处实现了高效的积聚。这使得BTZ药物能够精准地在目标区域释放，有效抑制肿瘤生长，并显著改善MM的关键临床指标（CRAB）。与PB@M相比，T-PB@M显著延长了MM小鼠的存活时间。这些发现不仅凸显了我们在双重靶向纳米粒子设计方面的创新实力，更为多发性骨髓瘤这一具有挑战性的疾病提供了精准且有效的治疗策略，为患者带来了新的希望。

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