多聚免疫球蛋白受体通过STAT3通路调节白细胞介素-17信号通路并预防自身免疫性肝炎

工程（英文） ›› 2024, Vol. 36 ›› Issue (5) : 224 -238. DOI: 10.1016/j.eng.2024.01.006

研究论文

李婷 ^a^,^b ,
潘彤彤 ^a ,
郑楠楠 ^a ,
马雄 ^c ,
王晓东 ^a ,
方言 ^a ,
蒋卉冕 ^a ,
王雨欣 ^a ,
林宏伟 ^a ,
林静 ^a ,
张华栋 ^a ,
黄佳 ^a ,
孔令铭 ^d ,
黄安民 ^d ,
刘清秀 ^e ,
陈永平 ^a ,
陈达之 ^a^,^b

作者信息 +

STAT3-Dependent Effects of Polymeric Immunoglobulin Receptor in Regulating Interleukin-17 Signaling and Preventing Autoimmune Hepatitis

Ting Li ^a^,^b^,^- ,
Tongtong Pan ^a^,^-^,^* ,
Nannan Zheng ^a ,
Xiong Ma ^c ,
Xiaodong Wang ^a ,
Fang Yan ^a ,
Huimian Jiang ^a ,
Yuxin Wang ^a ,
Hongwei Lin ^a ,
Jing Lin ^a ,
Huadong Zhang ^a ,
Jia Huang ^a ,
Lingming Kong ^d ,
Anmin Huang ^d ,
Qingxiu Liu ^e ,
Yongping Chen ^a^,^* ,
Dazhi Chen ^* ,

Author information +

文章历史 +

Received	Accepted	Published
2023-07-14	2024-01-01
Issue Date
2024-06-14

PDF (7850K)

摘要

约有三分之一的自身免疫性肝炎（AIH）患者在诊断时已发展为肝硬化。尽管分子机制尚不明确，肠道微生态改变被认为与AIH的发病密切相关。在AIH患者和小鼠模型中，我们均观察到肠道菌群失调以及多聚免疫球蛋白受体（pIgR）表达水平的升高，且AIH患者的pIgR表达水平与血清转氨酶水平之间存在相关性。本研究通过AIH患者样本和刀豆蛋白A（ConA）诱导的AIH小鼠模型，探讨pIgR如何影响再生胰岛衍生蛋白3β（Reg3b）的分泌以及其在AIH患者肠道菌群塑造中的作用。研究发现，与野生型小鼠相比，Pirg基因敲除小鼠肠道中Reg3b表达降低，导致肠道菌群失衡。反之，外源性补充pIgR蛋白则可以增加Reg3b的表达并维持肠道菌群的稳态。通过RNA测序分析，我们发现白细胞介素（IL）-17信号通路参与了pIgR对Reg3b的调控。抑制信号转导与转录激活因子3（STAT3）的活性后，外源性补充pIgR对AIH小鼠肠道Reg3b表达的上调作用及其对菌群失衡的调控作用均丧失。在这项研究中，我们发现pIgR通过STAT3途径促进Reg3b的表达，此过程在维持AIH肠道菌群平衡中起着关键作用。总之，本研究揭示了可能对于AIH的诊断和治疗具有重要意义的新的分子靶点。

Abstract

One-third of patients with autoimmune hepatitis (AIH) have cirrhosis at the time of diagnosis. The relevance of these variables, although unknown, is believed to be critical in AIH because of suspected interactions between the gut microbiome and genetic factors. Dysbiosis of the gut flora and elevated polymeric immunoglobulin receptor (pIgR) levels have been observed in both patients and mouse models. Moreover, there is a direct relationship between pIgR expression and transaminase levels in patients with AIH. In this study, we aimed to explore how pIgR influences the secretion of regenerating islet-derived 3 beta (Reg3b) and the flora composition in AIH using in vivo experiments involving patients with AIH and a concanavalin A-induced mouse model of AIH. Reg3b expression was reduced in pIgR gene (Pigr)-knockout mice compared to that in wild-type mice, leading to increased microbiota disruption. Conversely, exogenous pIgR supplementation increased Reg3b expression and maintained microbiota homeostasis. RNA sequencing revealed the participation of the interleukin (IL)-17 signaling pathway in the regulation of Reg3b through pIgR. Furthermore, the introduction of external pIgR could not restore the imbalance in gut microbiota in AIH, and the decrease in Reg3b expression was not apparent following the inhibition of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3). In this study, pIgR facilitated the upregulation of Reg3b via the STAT3 pathway, which plays a crucial role in preserving the balance of the intestinal microbiota in AIH. Through this research, we discovered new molecular targets that can be used for the diagnosis and treatment of AIH.

关键词

Key words

Autoimmune hepatitis / Polymeric immunoglobulin receptor / Regenerating islet-derived 3 beta / Intestinal microbiota / Signal transducer and activator of transcription 3

引用本文

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Ting Li,Tongtong Pan,Nannan Zheng,Xiong Ma,Xiaodong Wang,Fang Yan,Huimian Jiang,Yuxin Wang,Hongwei Lin,Jing Lin,Huadong Zhang,Jia Huang,Lingming Kong,Anmin Huang,Qingxiu Liu,Yongping Chen,Dazhi Chen,李婷,潘彤彤,郑楠楠,马雄,王晓东,方言,蒋卉冕,王雨欣,林宏伟,林静,张华栋,黄佳,孔令铭,黄安民,刘清秀,陈永平,陈达之. 多聚免疫球蛋白受体通过STAT3通路调节白细胞介素-17信号通路并预防自身免疫性肝炎[J]. 工程（英文）, 2024, 36(5): 224-238 DOI:10.1016/j.eng.2024.01.006

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ELSEVIER

1 介绍

自身免疫性肝炎（AIH）是一种多因素参与的慢性肝脏疾病，其特征是肝脏慢性炎症和肝细胞损伤，其发病机制不清，可能与遗传易感性、环境触发因素以及宿主免疫系统的相互作用有关[1]。越来越多的研究表明，肠道菌群失衡在AIH的发生发展中扮演着重要角色[2‒3]，但导致这种失衡的具体分子机制目前尚未完全明确，特别是修饰微生物群的机制及其对AIH的影响。

多聚免疫球蛋白受体（pIgR）通过共价结合稳定免疫球蛋白A（IgA），并在上皮细胞膜上转运二聚体IgA[4]。黏膜上皮组织结合天然免疫和获得性免疫，通过清除多余的细菌和主动选择有益的共生菌，在调节肠道菌群与免疫屏障中发挥关键作用[5]。在Pigr基因敲除（Pigr-KO）的小鼠中已经观察到肠道化学屏障的变化，包括溶菌酶和某些抗菌肽的改变[6]。同时，我们之前的研究表明，pIgR通过运输IgA调节S100蛋白诱导的AIH小鼠的肠道黏膜免疫和菌群稳态[7]。然而，pIgR对AIH中抗菌肽分泌的影响尚不清楚。

再生胰岛衍生蛋白3β基因（Reg3b）属于Reg家族，编码位于上皮细胞中的C型凝集素蛋白[8]。Reg3b通过抗菌作用以调节肠道菌群分布，在宿主防御中发挥重要作用[9]。具体而言，它能够附着在细菌特别是革兰阳性菌外层的碳水化合物成分上，从而有效地清除这些微生物[10]。Reg3b的抗菌活性有助于维持肠道稳态。

信号转导与转录激活因子3（STAT3）是STAT蛋白家族的一员，同时具有信号转导与转录激活的功能[11]，其Tyr705位点磷酸化后被激活，随后易位入核，从而调节基因转录。多项研究表明，STAT3在Reg家族抗菌肽释放和肠道菌群塑造中起着重要作用[12‒13]。

本研究旨在通过分析AIH患者的粪便菌群分布，并通过刀豆蛋白A（ConA）诱导的AIH小鼠模型，探讨pIgR在AIH肠道Reg3b分泌和菌群塑造中的作用。

2 材料和方法

附录A中的表S1总结了本研究使用的主要试剂、材料与设备。

2.1 AIH病人粪便样本收集

根据临床指南诊断为AIH患者[14]，并排除了在过去两个月内接受过激素、抗生素或益生菌治疗的患者[15]。共有15名AIH患者和15名健康对照参与了本研究，所有参与者均提供了知情同意书，并按照温州医科大学第一附属医院临床研究伦理委员会的批准程序（批准编号：KY-2022-155）提供了粪便样本。受试者的原始数据可以从美国国家生物技术信息中心序列读取档案（NCBI SRA）获取，项目编号为PRJNA1045518（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1045518）。患者的临床资料详见附录A中的表S2。

2.2 动物模型处理

雄性野生型（WT）和Pigr-KO小鼠（C57BL/6，6~8周龄）在无菌环境中饲养。所有动物实验均经实验动物伦理委员会（批准编号：WYYY-AEC-2021-293）批准。AIH模型小鼠先通过尾静脉注射15或20 mg∙kg^-1的ConA，随后立即腹腔注射鼠源性pIgR。对于经过广谱抗生素（Abx）治疗的小鼠，在注射ConA前，每天口服鸡尾酒抗生素（1.86 mg氨苄西林钠、0.96 mg盐酸万古霉素、1.86 mg硫酸新霉素和1.20 mg甲硝唑，剂量为0.1 mL）以消除正常肠道菌群，持续3周。每只小鼠通过尾静脉注射大约1 × 10¹¹基因组拷贝数的腺相关病毒（AAV）9-mouse-Reg3b或灌肠1 × 10¹¹ 基因组拷贝数的AAV7-mouse-Stat3来分别抑制肠道Reg3b或Stat3的表达。白细胞介素（IL）-17D治疗小鼠在ConA注射后立即腹腔注射剂量为15 μg∙kg^-1的IL-17D。小鼠被随机分为32组，具体分组情况详见附录A中的表S3。

2.3 平板粪便菌落培养

200 mg的小鼠粪便溶解于1 mL生理盐水中，在37 ℃下进行培养。滤液通过200目无菌筛网过滤去除大颗粒物质，再通过400目和800目无菌筛网去除未消化的食物残渣和较小颗粒物质，然后收集于无菌离心管中。样品悬液600 g离心5 min以清除所有不溶物后，使用Luria-Bertani培养基进行涂布，于37 ℃的厌氧培养箱中培养过夜。

2.4 小肠上皮细胞的分离

从小鼠小肠中提取脂肪组织和Peyer斑片。将小肠切成0.5 cm的小块，加入含10 mL肠上皮细胞（IEC）分离缓冲液（含90.4% Hanks平衡盐溶液、1.4% 0.5 mol∙L^-1乙二胺四乙酸、0.2%胰蛋白酶、2% 1 mol∙L^-1 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸、1% 0.1 mol∙L^-1二硫苏糖醇和5%胎牛血清）进行消化。以200 r·min^-1的速度消化15 min，然后4 ℃下600 g离心1 min，然后4 ℃下600 g离心10 min收集细胞颗粒，并用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗。加入37 ℃固有层（LP）消化缓冲液，37 ℃下200 r·min^-1在摇床中消化45 min。上清液4 ℃下600 g离心10 min收集细胞颗粒。将细胞重悬于4 mL的40% Percoll中，形成梯度并与20% Percoll混合。在20 ℃下以800 g离心20 min。离心后，界面处形成的层中含有IEC。

2.5 生化分析和组织病理学

通过在1500 r·min^-1下离心15 min从血液中获得血清。使用全自动化学分析仪（Beckman Coulter，美国）测定血清中谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）的含量。采用苏木精-伊红（H&E）染色法对石蜡包埋的组织切片进行染色。使用显微镜（Nikon，日本）捕捉图像。

2.6 实时定量聚合酶链反应测定

使用分离试剂盒从粪便或组织中提取总RNA。接下来，使用PrimeScript RT Master Mix（Takara Bio，美国）进行反转录，然后使用TB Green进行qRT-PCR。使用7500 Real-Time PCR系统（Applied Biosystems，美国）进行分析。将各基因的mRNA水平归一化为肌动蛋白β（actb）的水平并进行调整。引物序列列于附录A表S4。

2.7 蛋白免疫印迹分析

从肝脏和肠道组织中分离蛋白质，并使用二辛可宁酸（BCA）试剂盒进行定量。蛋白质样品在12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分离，随后转移到膜上。用针对性的一抗对这些膜进行孵育，然后与相应的二抗孵育。蛋白质条带通过化学发光图像分析可视化。

2.8 酶联免疫吸附试验

从粪便中分离蛋白[16]。采用BCA试剂盒定量检测总蛋白的浓度。根据生产商提供的说明书，对Reg3b、pIgR、IL-17D、IL-22和内毒素（LPS）进行定量检测。

2.9 LP免疫细胞的分离与流式细胞术

在距离幽门括约肌远端10 cm处采集小肠组织。分离Peyer斑块和脂肪组织并彻底清洗。采用小鼠LP解离试剂盒分离LP淋巴细胞。将淋巴细胞重悬于RPMI 1640培养基中[含10% 胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素]，细胞浓度约为2 × 10⁶ mL^-1。准备无菌24孔板，每孔加入1 mL细胞悬液，随后添加2 μL白细胞激活试剂（BD Biosciences，美国）以刺激细胞。将培养板在37 ℃下孵育4 h。收集细胞，离心去除上清，然后在含有2%牛血清白蛋白的PBS中重悬。加入荧光耦联抗体Allophycocyanin/Cyanine 7-CD3、CD11b、淋巴细胞抗原6家族成员G6D（LyG6D）、CD45和荧光素-5-异硫氰酸盐-自然杀伤细胞（NK）p46，于4 ℃避光条件下孵育60 min。离心去除未结合抗体，并用PBS洗涤2次。细胞使用细胞固定液固定15 min，离心后用0.1% Triton X-100渗透10 min。加入peridinin-叶绿素蛋白复合物/cyanine5.5-视黄酸受体相关孤儿受体γt（RORγt）抗体，4 ℃黑暗孵育60 min。加入浓度为0.5 μg∙mL^-1的2-（4-氨基苯基）-6-吲哚甲脒二盐酸盐（DAPI）进行细胞核染色，避光20 min。PBS洗涤2次后将细胞重悬于缓冲液中，过滤后使用BD LSRFortessa仪器（BD Biosciences）进行流式细胞术分析。

2.10 肠道微生物群测序分析

使用十六烷基三甲基溴化铵从粪便样品中提取DNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，并使用Nanodrop 2000和Qubit 3.0分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）测定基因组DNA的浓度和纯度。采用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'）和907R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）对扩增子的V4-V5区进行检测[17]。PCR产物使用AMPure XT珠（Beckman Coulter）进行纯化，并使用Qubit 3.0（Invitrogen，美国）进行定量。接着，使用文库定量试剂盒（Illumina，美国）制备扩增子文库并进行测序，使用Agilent 2100生物分析仪（Agilent Technologies，美国）评估文库大小。采用NovaSeq PE250（Illumina）进行测序。原始读取序列经过QIIME2处理，Cutadapt插件用于适配器和引物序列的修剪，fqtrim (v0.94)进行质量过滤以获得高质量的标签。随后，使用Vsearch (v2.3.4)软件进行嵌合体剔除。经过DADA2去复制后，获得了扩增子序列变异体表和代表性序列。利用预先训练过的朴素贝叶斯分类器[根据核糖体数据库项目（Ribosomal Database Project）第11版进行训练]对扩增子序列变异体代表序列进行分类赋值，置信阈值为0.8。在QIIME2中，通过QIIME2将每个样本随机选择的序列数量归一化，以确定alpha和beta多样性指标，并使用R软件包（R Core Team）进行可视化。代表性序列使用基本局部比对搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool）进行比对，并使用RDP数据库（version 11）进行功能注释。

2.11 肠道组织转录组测序分析

采用TRIzol试剂盒（Invitrogen）提取总RNA。通过Agilent 2100生物分析仪评估RNA的质量。使用Oligo (dT)磁珠富集真核生物的mRNA，并利用Ribo-ZeroTM Kit（Epicentre，美国）富集原核生物的mRNA。随后，使用随机引物将mRNA片段化，并将其反转录为cDNA。在此过程中，通过DNA聚合酶I、核糖核酸酶H和脱氧核糖核苷三磷酸合成第二链cDNA。对于Illumina测序，cDNA片段经过末端修复后，添加poly(A)尾，并连接Illumina测序适配器。在琼脂糖凝胶上根据连接产物的大小进行分类，并通过PCR扩增，最终使用Illumina HiSeq2500进行测序。测序数据使用FastP (version 0.18.0)进行筛选，以获得清洁读取。接着，使用Ensembl 104标记基因。通过DESeq2和EdgeR软件比较不同组别的基因表达差异。将错误发现率（FDR）小于0.05的基因或转录本判定为差异表达。

2.12 统计分析

本研究中的统计分析均采用GraphPad Prism（v9.3.1，GraphPad Software Inc.，美国）和R软件（v4.1.1；R Core Team 2021）。对于两组间的比较，采用Student t检验进行评估。多组间的比较则使用单因素方差分析（ANOVA）或双因素ANOVA，并辅以Fisher最小显著性差异检验或Bonferroni校正。Spearman秩相关检验（双尾）用于分析pIgR、临床指标与肠道微生物之间的相关性。GraphPad Prism v9.3.1用于生成直方图和生存曲线。Image J [v.1.51k，美国国立卫生研究院（NIH），美国]用于评估肝脏坏死区域、绒毛长度以及隐窝大小，并用于蛋白免疫印迹（WB）的评估。在所有分析中，数据以三个独立试验的平均值±标准差表示。统计学显著性水平定义为：^* P < 0.05，^** P < 0.01，^*** P < 0.001和^**** P < 0.0001。

3 结果

3.1 AIH患者粪便pIgR水平升高与肠道菌群紊乱相关

AIH患者肠道微生物群落失衡，微生物种类减少。如附录A中的图S1（a）和（b）Chao1和Shannon指数的检测结果所示，AIH患者肠道菌群多样性降低，这些可能与AIH的发病和病程进展有关。多变量方差分析结果显示，AIH患者与健康对照组的总体微生物组成存在显著差异（P < 0.001）[附录A，图S1（c）]。如图1（a）和图S1（d）所示，拟杆菌、普雷沃氏菌、布劳特氏菌和粪肠球菌的相对丰度升高，而阿克曼菌和乳杆菌的相对丰度降低。本研究的结果与以往研究[18‒20]相似，表明肠道微生物组可能作为一个有潜力的干预靶点。

最近的研究指出，pIgR在自身免疫性肝脏疾病（如原发性胆汁性肝硬化）中的表达上调[21]。然而，在AIH中pIgR表达的研究较少。本研究通过聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测粪便pIgR水平，发现与健康对照组相比，AIH患者的粪便pIgR浓度显著升高[图1（b）和（c）]。为了探讨AIH患者中pIgR表达与肠道菌群失衡之间的关系，我们进行了Spearman相关秩和检验[图1（d）]。在属水平上，pIgR的表达与17个分类群的丰度相关。例如，肠球菌属和拟杆菌属的丰度与pIgR表达正相关，而巴氏菌属、阿克曼菌属和粪肠球菌属的丰度与pIgR表达负相关。图1（e）所示的Pearson相关分析结果表明，pIgR与用于评估AIH损伤程度的临床指标ALT、AST和IgG呈正相关。

3.2 肠道pIgR的表达水平与AIH的病理发展呈正相关

pIgR介导IgA或IgM通过肠上皮细胞的胞吞作用处理后，与其产生的分泌片段一同释放到肠腔中[22]。肝脏pIgR水平的升高能够激活IgA转运途径，进而导致肠道pIgR水平的升高[23]。为了探究粪便中pIgR表达升高是否源于肠道或肝脏的过度表达，我们评估了ConA诱导的AIH小鼠模型肠道和肝脏中pIgR的水平。

ConA诱导的AIH小鼠肝小叶中央静脉周围的淋巴细胞浸润显著增加，伴随弥漫性水肿和肝细胞坏死的逐渐加重[图2（a）]，血清ALT、AST水平和肝坏死面积在18小时达到峰值，随后逐渐降低[图2（a）~（c）]。肝脏炎症标志物亦随时间发生变化（见附录A中的表S5）。研究结果显示，尽管肝脏中的pIgR水平未见显著变化，但随着肝损伤程度的加重，肠道组织中的pIgR水平显著上升[图2（d）~（i）]。据此，我们假设肠道pIgR的增加可能是粪便中pIgR水平升高的潜在原因，且肠道组织中pIgR的丰度与AIH的严重程度密切相关。

**3.3 敲除Pigr加重肠道菌群失调、肠绒毛损伤，并减少Reg3b分泌以加重AIH肝损伤**

为了探讨pIgR在AIH进展中的作用，我们建立了基于Pigr基因敲除（Pigr-KO）的小鼠模型并静脉注射ConA [图3（a）]。与野生型小鼠相比，Pigr基因敲除小鼠在接受20 mg∙kg^-1剂量的ConA静脉注射后的总生存率显著降低[图3（b）]。此外，Pigr基因敲除小鼠的肝脏坏死面积更大[图3（c）]，血清ALT和AST水平更高[图3（d）和（e）]。此外，肝内炎症因子Il1β、Il10、Il-17、Tnfα、Tgfβ和Ifnγ的mRNA表达也呈现了类似的显著性差异[附录A中的S2（a）~（f）]。

本研究通过RNA测序分析了肠道组织的基因表达，并通过结合粪便样本微生物群分析，进一步探讨了差异基因与肠道微生物群之间的关系。附录A中的图S2（g）展示了ConA诱导的Pigr-KO小鼠肠道绒毛的变性和坏死现象。与WT小鼠相比，Pigr-KO小鼠的肠道微生物组存在显著差异[附录A中的图S2（h）]，Pigr基因敲除导致了肠道微生物群失衡和细菌多样性的减少。附录A中的图S2（i）揭示了特定细菌门和属的相对比例变化，如Pigr-KO小鼠中沙门氏菌、阿克曼菌和穆里巴库菌的水平升高，而拉奇诺螺杆菌_NK4A 136_组、梭状芽孢杆菌_UCG-014、拟态酵母菌、乳酸杆菌等水平降低。除了生物屏障，肠道的机械和化学防御也是维持肠道平衡的关键因素[24]。通过Abx治疗成功消除了肠道菌群，并进一步分析了菌群在Pigr-KO小鼠中的作用。附录A中的图S3（a）和（b）显示，在ConA损伤背景下，抗生素治疗减轻了Pigr-KO小鼠肝损伤，却加剧了WT小鼠的损伤。与未处理的小鼠相比，经Abx处理的Pigr-KO小鼠肝内坏死面积和炎症细胞因子（Il1β、Il17、Tnfα和Ifnr）表达有所减少，且血清ALT和AST水平降低[附录A中的图S3（c）~（l）]。这些研究结果表明，Pigr-KO小鼠对ConA的易感性增加，可能与Pigr基因敲除加重肠道微生态失调有关。

同时，通过RNA测序分析了肠道屏障相关基因的表达水平[图3（f）]，发现在Pigr-KO小鼠中，紧密连接蛋白occludins和claudins的表达未见明显变化，而某些抗菌肽的表达却发生了显著变化。在Pigr-KO的AIH小鼠中，Reg3b、Ang4和Lyz1的mRNA表达水平均降低。在各种抗菌肽中，Reg3b的表达增加最为显著[附录A中的图S3（m）]，表明其对宿主防御反应具有重要贡献。同时，AIH患者粪便样本中的Reg3b水平升高[附录A中的图S3（n）]，再次强调了其与疾病病理的潜在相关性。如图3（g）和（h）所示，Pigr基因敲除后，肠道组织中Reg3b蛋白水平的变化与Reg3b mRNA水平的变化一致。

综上所述，Pigr基因敲除进一步加剧了AIH小鼠肝脏和肠道的坏死、肠道菌群失调以及Reg3b分泌减少。这些发现共同表明，pIgR在维持组织完整性和微生物群平衡方面发挥着关键作用，这可能是通过调控Reg3b等抗菌肽的分泌来实现的。由于Pigr缺乏导致的这些功能的障碍可能是本研究中观察到的病理表型的原因。

3.4 外源性补充pIgR蛋白可改善ConA诱导的肝损伤和肠道菌群失调

在Pigr-KO小鼠中观察到的肝损伤加重，肠道菌群失调和Reg3b分泌失调表明pIgR对AIH有潜在的保护和维稳作用。为了进一步探究pIgR在AIH中的潜在保护作用，我们利用不同剂量（50、100和200 mg∙kg^-1）的外源性pIgR注射干预ConA诱导的AIH小鼠[图4（a）]。组织病理学和血生化结果表明，低剂量（50 mg∙kg^-1）的pIgR治疗对ConA诱导的肝损伤没有显著缓解效果。肝坏死面积的减少[图4（b）和（c）]和血清ALT及AST水平升高的缓解[图4（d）和（e）]也不明显。然而，随着外源性pIgR剂量的增加，对ConA诱导的肝炎的治疗效果显著提升，表现为肝脏坏死面积显著减少[图4（b）和（c）]，表明肝细胞死亡减少，炎症浸润减轻。同时指示肝损伤程度的血清ALT和AST水平也显著降低[图4（d）和（e）]。此外，促炎细胞因子如Ifnγ、Tnfα、Il-17和Il1β的产生显著减少，而抗炎物质如Il-10分泌增加，Tgfβ的表达也显著上调[附录A中的图S4（a）~（f）]。综上所述，pIgR对肝脏具有不同程度的保护作用，可以抵抗ConA引起的免疫介导损伤。这可以通过调节细胞因子环境来减少炎症反应来实现。

如附录A中的图S4（g）和（h）所示，pIgR有助于修复ConA引起的肠道组织损伤，上调肠绒毛与隐窝的比例。粪便16S RNA测序结果表明，pIgR的补充对肠道微生物组产生了显著影响。主成分分析图[附录A中的图S4（i）]显示，不同剂量的pIgR处理小鼠的肠道微生物群形成了不同的簇，表明群落组成受到剂量的显著影响。所有治疗组与未治疗的ConA小鼠相比均显示出显著差异，表明pIgR对微生物群具有普遍的恢复作用。如附录A中的图S4（j）所示，pIgR处理对特定的分类群进行了精确调节，高剂量pIgR增加了阿克曼菌的数量。此外，pIgR处理后，肠道组织中Reg3b在蛋白和mRNA的表达水平都显著升高[图4（f）和（h）]。这一结果与Reg3b水平的增加相似，表明pIgR可能通过控制Reg3b的调节来促进保护作用。

通过尾静脉注射AAV9，我们成功干扰了肠内Reg3b的表达[附录A中的图S5（a）和（b）]。Reg3b敲减小鼠对ConA更不耐受，表现为肝损伤加重和转氨酶水平升高[附录A中的图S5（c）~（f）]。在此情况下，补充pIgR并不能减轻ConA引起的肝脏组织病理学损伤和炎症反应。分析六种炎症因子在肝脏中的表达[附录A中的图S5（g）~（l）]，Reg3b的主要功能是影响促炎因子，包括Il1β、Il17和Tnfα。总之，发现pIgR可能通过增加抗菌肽，特别是Reg3b，恢复肠道菌群稳态以保护肝脏免受ConA诱导的肝损伤。

3.5 pIgR通过IL-17D促进先天淋巴细胞的分化从而调控Reg3b的分泌

对Pigr-KO AIH小鼠肠黏膜进行RNA测序，如图5（a）所示，与Reg3b分泌相关的基因（Mmp9、Il17d、Stat3和Il17rd）表达显著降低，这些基因在调控免疫细胞活化、Th17反应和维持肠道屏障功能中起重要作用[25‒26]。这些因素的共同抑制可能是Pigr缺乏引起肠道菌群失调和Reg3b水平降低的基础。Huang等[27]发现，IL-17D能激活第3组先天淋巴样细胞（ILC3s），从而促进抗菌肽Reg3b和Reg3g的产生。在Pigr-KO AIH小鼠中，STAT3、IL-17D和维甲酸受体α相关孤儿受体C（Rorc）的表达显著下调[图5（b）~（f）]。相反，在200 mg∙kg^-1的pIgR处理下，AIH小鼠的STAT3、IL-17D和Rorc水平显著升高[附录A中的图S6（a）~（e）]。天然细胞毒性触发受体（NCR）和Rorc是ILC3的生物标志物[28]。流式细胞术检测IL-17D在pIgR控制Reg3b分泌的调节机制中激活ILC3s的情况[图5（g）]，结果表明，Pigr敲除后，AIH小鼠肠道中NCR⁺ILC3的比例下降[图5（h）~（k）]。定量分析显示，Pigr-KO小鼠肠道NCR⁺ILC3s的标志性细胞因子IL-22 [29]的产生明显减少[图5（l）]。这些数据表明，pIgR的缺失导致小鼠小肠中ILC3群体的损伤。然而，外源性补充pIgR蛋白则导致了完全相反的效果，ELISA证实了IL-22的产生增加[附录A中的图S6（f）]，流式细胞术结果显示NCR⁺ILC3的比例增加[附录B中的图S7（g）~（j）]。

我们对AIH小鼠补充了IL-17D蛋白[附录A中的图S7（a）]。WT和Pigr-KO小鼠在补充IL-17D后都表现出有益的效果。具体而言，在Pigr-KO小鼠中，补充IL-17D可减少肝脏坏死程度，同时降低ALT和AST水平，且肝内Il1β、Ifnγ、Il17和Tnfα的mRNA表达水平下降，而Tgfβ和Il10的mRNA表达水平上升[附录A中的图S7（b）~（j）]。我们分析了Reg3b在肠组织中的表达。与小鼠腹腔注射生理盐水相比，给予IL-17D溶液的WT小鼠肠内Reg3b表达显著上调，在Pigr-KO小鼠中也观察到这种现象[附录A中的图S7（k）和（l）]。补充IL-17D可部分缓解Pigr敲除对AIH的影响，此外，补充IL-17D显著增加NCR⁺ILC3的比例[附录A中的图S7（m）~（p）]。

简而言之，我们的研究结果表明，pIgR在控制Reg3b的分泌中起作用，部分是通过调节IL-17D水平。在小鼠体内去除Pigr导致肠道中IL-17D水平降低，同时使Reg3b的产生减少。补充pIgR可恢复IL-17D水平和Reg3b分泌。综上所述，这些结果表明，pIgR通过增加IL-17D的产生，最有可能是通过ILC3，对Reg3b发挥作用，Reg3b是一种对肠道稳态很重要的抗菌肽。因此，pIgR/IL-17D/Reg3b轴可能是维持AIH肠道和肝脏健康的重要途径。

3.6 STAT3在介导pIgR调控IL-17信号和促进ILC3活化的过程中发挥着不可或缺的作用

我们分离了原代小肠上皮细胞，并观察到ConA诱导的Pigr-KO小鼠中，总STAT3蛋白和磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白的表达均显著降低[附录A中的图S7（q）~（s）]。在ConA模型中，Pigr-KO诱导的总STAT3和p-STAT3蛋白水平的降低也很明显。为了更深入地了解STAT3在介导pIgRs对AIH保护作用中的功能，我们利用AAV7特异性敲减了小鼠肠道的Stat3 [图6（a）]。如图6（b）和（c）所示，干扰Stat3可以消除pIgR对AIH的保护作用。STAT3信号的阻断会导致pIgR对肠绒毛损伤的改善作用丧失[图6（d）和（e）]。阻断STAT3后，肝脏坏死加剧，血清ALT和AST水平持续升高[图6（f）和（g）]，肠道Reg3b表达显著降低[图6（h）和（i）]，而补充pIgR无法逆转此过程。此外，抑制STAT3可以消除pIgR对IL-17信号传导和ILC3s活化的影响。AAV7给药后，Rorc和IL-17D水平显著降低，外源性pIgR补充不能恢复其水平[图6（h）、（j）、（k）]。与此一致的是，在STAT3信号被阻断的小鼠肠道LP细胞中，NCR⁺和RORγt⁺细胞的比例下降，IL-22的产生也减少[图6（l）~（p）]。

总之，我们的研究结果表明，pIgR对AIH炎症和免疫的调控作用至少部分依赖于STAT3活化，对STAT3的药理学阻断消除了pIgR刺激ILC3反应的能力并减轻了AIH，表明STAT3是连接pIgR和IL-17信号通路的关键节点。

3.7 pIgR保护肝脏免受内毒素诱导的损伤

内毒素（LPS）是一种存在于革兰氏阴性菌外膜中的物质，是“肠-肝轴”中连接肠道和肝脏的主要桥梁[30]，随血流进入肝脏后LPS附着在LPS结合蛋白和CD14上，这会激活肝脏免疫细胞和肝细胞中的Toll样受体4（TLR4），启动炎症信号通路，诱发促炎细胞因子的产生，是引起肝损伤的关键因素[31‒32]。与野生型（WT）小鼠相比，Pigr-KO小鼠血清中的LPS水平显著升高[图7（a）]，而pIgR以剂量依赖的方式显著降低LPS水平[图7（b）]，表明Pigr负调控LPS。同时，AAV注射对STAT3的抑制消除了pIgR的作用[图7（c）]。

在Pigr-KO小鼠中，TLR4和髓样分化因子88（MyD88）的表达水平更高[图7（d）~（f）]，这两者对LPS信号传导至关重要[33]。在AIH肝脏中，pIgR治疗导致TLR4和MyD88的表达呈剂量依赖性降低[图7（g）~（i）]。STAT3的抑制阻止了pIgR与LPS之间的相互作用，可能导致TLR4和MyD88降解的中断[图7（j）~（l）]。

通过调节IL-17途径、扩增ILC3、诱导抗菌肽和调节肠道微生物群组成，肠道pIgR可防止LPS从肠道转运到肝脏，从而预防AIH。因此，pIgR通过多管齐下的机制发挥重要的保护作用，这些机制涉及以STAT3依赖的方式通过TLR4/MyD88轴抑制LPS信号。

4 讨论

AIH是一种由免疫系统对肝组织错误攻击导致的慢性炎症性肝病[34]，当免疫系统错误地靶向肝细胞时，就会发生炎症和损伤。确切原因尚不清楚，然而，遗传和环境因素可能在破坏免疫耐受和启动自身免疫反应中发挥作用[35]。越来越多的研究表明，肠道微生物组的改变以及肠壁屏障破坏与宿主免疫应答有关[36]。然而，这些变化是否具有疾病特异性仍有争议[37]。在本研究中，我们分析了AIH患者肠道微生物群的变化。拟杆菌和普雷沃氏菌能产生LPS [20,38]，后者的升高可能会激活炎症和免疫应答，从而加剧AIH进展。蓝杆菌和粪杆菌通过发酵产生短链脂肪酸（SCFAs）[39,40]，此成分可能会改变肠道屏障功能和肠道通透性，导致细菌抗原和LPS泄漏到血液中，引发自身免疫反应。阿克曼菌和乳杆菌是常见的益生菌，有助于维持肠道屏障完整性和调节免疫功能[41]。这些微生物群引起的紊乱可能导致AIH的发生或恶化。此外，Abx治疗后肝损伤加重。这可能是由于野生型小鼠肠道微生物平衡的破坏，使肝脏更容易受到ConA刺激[36]。接受抗生素治疗的Pigr-KO小鼠的肝损伤程度减轻，这表明Pigr基因敲除导致的肠道菌群紊乱是导致AIH易感性增加的重要因素。

增加的pIgR水平对肠道产生多层次的有益作用，有助于减少AIH患者的肝损伤。pIgR的细胞外结构域促进聚合IgA和IgM的结合，允许它们运输到肠道并限制细菌易位[42‒44]。Pigr基因敲除会导致更严重的肠道损伤，而给予不同剂量的pIgR可以显著改善肠道形态，这表明pIgR在保持肠道屏障完整性方面发挥作用。pIgR还会增加抗菌肽的表达，尤其是Reg3b [45]。Reg3b可以抑制细菌定植，并调节微生物群与免疫系统的相互作用[9]。pIgR的保护作用归因于其抗菌活性。

IL-17信号通路通过刺激上皮细胞黏液分泌和抗菌肽产生，对维持肠道屏障的完整性至关重要[46‒47]。在肠道中，IL-17与其他细胞因子（如IL-22）一起调节免疫反应[48]。IL-17D结合CD93后调节LC3s的功能[27]。然而，IL-17也可能通过诱导紧密连接蛋白的失调和上皮细胞凋亡来损害肠道屏障[49]，从而使细菌抗原和内毒素泄漏到血流中，触发自身免疫反应。IL-17信号已被证明可以影响肠道微生物群的组成[50]。IL-17水平升高可能部分介导与AIH相关的生态失调。pIgR在通过IL-17D调节ILC3s中的作用已在该AIH模型中得到证实，这表明通过调节pIgR操纵IL-17途径可能控制与肠道相关的难治性AIH的严重程度，并有助于维持肠道稳态。

STAT3被激活后，易位至细胞核并控制与免疫细胞分化相关的多种基因的表达[51]。在细胞因子或生长因子激活后，STAT3迁移到细胞核并附着在Il17基因启动子上[52,53]以增强IL17的转录，导致IL-17表达的增加。另一方面，IL-17可以附着于细胞上的受体，激活Janus激酶（JAK）-STAT3通路[54]，促进STAT3形成二聚体并入核，即形成了一个正反馈回路，放大了Th17的分化和效应器功能。研究表明，STAT3和IL-17信号会影响风湿关节炎和炎症性肠病等自身免疫性疾病[55‒57]。它们似乎在驱动慢性炎症和组织损伤方面相互配合。Huang等[27]发现，消除Il17d并没有显著改变Stat3水平，这表明IL-17D可能不是主要通过激活STAT3来调节ILC3s。我们的研究结果表明，抑制STAT3激活可以有效地消除pIgR对IL-17途径和ILC3s增殖的上调作用，这表明pIgR至少在一定程度上通过STAT3通路发挥作用。pIgR或STAT3的过表达增加了IL-17D的分泌。

各种营养干预，如维生素、益生菌、益生元和特定的膳食成分，都有可能增加肠道pIgR的表达。壳聚糖低聚糖或龙眼果肉多糖已被证明可以刺激小鼠分泌IgA并增强pIgR转录[58‒59]。热量限制是改善宿主生理机能的一种有效策略，也启动了pIgR的生物合成[60]。维生素A是一种不可或缺的微量营养素，在pIgR的转录调控中起着关键作用[61]。益生菌菌株酿酒酵母布拉氏酵母CNCM I-1079已被证实可以有效调节pIgR表达和肠道菌群结构[62]。

本研究存在一定的局限性。我们在AIH患者样本和小鼠粪便中观察到阿克曼杆菌丰度降低，而在Pigr-KO AIH模型中观察到阿克曼杆菌丰度增加。这种差异可能归因于人类样本和动物模型之间微生态环境的差异。此外，Pigr基因敲除导致肠道屏障受损，从而促进阿克曼杆菌的增殖。未来的研究应采用更全面的动物模型来研究pIgR与多种肠道细菌之间的具体联系。这将增强该领域科学知识的整体一致性和深度。需要进一步的研究来探讨pIgR/STAT3/IL-17通路与其他免疫通路之间的相互作用，并阐明pIgR作为AIH的诊治靶点的潜力。克服现有的制约因素对于有效利用至关重要。需要进一步的纵向研究来验证特定的微生物群特征和基因表达水平作为疾病活动的生物标志物的合理性。我们的研究仅关注pIgR/STAT3/IL-17通路，没有研究AIH中可能失调的其他信号通路。pIgR/STAT3/IL-17通路与其他免疫通路之间的相互作用和串扰尚不清楚，需要进一步研究。在开发高效、精确和理想的长效安全性的阻断剂方面仍然存在困难。

5 结论

本研究表明，肠道pIgR通过限制LPS从肠道的转运和改变肠道免疫系统的平衡，在预防AIH方面发挥着至关重要的作用。基本过程包括通过激活STAT3信号通路上调IL-17D表达，STAT3信号途径依赖于pIgR并部分调节IL-17信号。这一过程激活ILC3，增加抗菌肽分泌，从而恢复肠道菌群稳态，减少LPS易位至肝脏，最终通过下调LPS/TLR4/MyD88信号级联负调控AIH肝脏炎症。总的来说，我们的研究结果表明，肠道pIgR通过限制肠道来源的LPS在预防AIH方面起着关键作用。因此，调节pIgR功能可能成为AIH的一种有前景的创新治疗方法。

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