老药新用——洛哌丁胺对胞内病原菌感染的治疗作用

刘洪涛 ,  李思琦 ,  邓乐 ,  史真旭 ,  姜晨晓 ,  舒婧妍 ,  刘源 ,  邓旭明 ,  王建锋 ,  郭志敏 ,  邱家章

工程（英文） ›› 2024, Vol. 39 ›› Issue (8) : 180 -193.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 39 ›› Issue (8) : 180 -193. DOI: 10.1016/j.eng.2024.01.011
研究论文

老药新用——洛哌丁胺对胞内病原菌感染的治疗作用

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Repurposing Loperamide as an Anti-Infection Drug for the Treatment of Intracellular Bacterial Pathogens

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摘要

多数抗生素对细胞膜的渗透性较低，且极易在细胞内被降解，导致抗生素在细胞内难以达到有效杀菌浓度，加之耐药菌株的出现和快速传播，使得胞内菌感染的治疗面临巨大挑战。病原菌与宿主细胞相互作用机制（特别是胞内菌生存和增殖机智）的阐明促进了宿主导向疗法（HDT）的快速发展。HDT已发展成为最具潜力的抗胞内菌感染的方法之一。基于此，本研究采用庆大霉素保护试验从美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物库中筛选能够抑制鼠伤寒沙门氏菌（ST）胞内增殖的药物，发现洛哌丁胺（LPD）可显著抑制ST的胞内增殖。机制研究结果表明LPD处理可增强感染细胞溶酶体活性并促进其自噬的发生。进一步研究发现高表达的非转移性黑色素瘤糖蛋白B（GPNMB）介导了LPD诱导的细胞自噬和对胞内菌的清除。动物实验结果表明LPD治疗可显著提升ST感染的大蜡螟幼虫和小鼠模型的存活率、降低感染小鼠靶器官的菌落定殖、缓解ST感染所致的病理损伤。综上所述，本研究为基于HDT策略抗感染药物的开发提供了一种作用机制明确的先导化合物LPD。

Abstract

Infections caused by intracellular bacterial pathogens are difficult to treat since most antibiotics have low cell permeability and undergo rapid degradation within cells. The rapid development and dissemination of antimicrobial-resistant strains have exacerbated this dilemma. With the increasing knowledge of host-pathogen interactions, especially bacterial strategies for survival and proliferation within host cells, host-directed therapy (HDT) has attracted increased interest and has emerged as a promising anti-infection method for treating intracellular infection. Herein, we applied a cell-based screening approach to a US Food and Drug Administration (FDA)-approved drug library to identify compounds that can inhibit the intracellular replication of Salmonella Typhimurium (S. Typhimurium). This screening allowed us to identify the antidiarrheal agent loperamide (LPD) as a potent inhibitor of S. Typhimurium intracellular proliferation. LPD treatment of infected cells markedly promoted the host autophagic response and lysosomal activity. A mechanistic study revealed that the increase in host autophagy and elimination of intracellular bacteria were dependent on the high expression of glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B (GPNMB) induced by LPD. In addition, LPD treatment effectively protected against S. Typhimurium infection in Galleria mellonella and mouse models. Thus, our study suggested that LPD may be useful for the treatment of diseases caused by intracellular bacterial pathogens. Moreover, LPD may serve as a promising lead compound for the development of anti-infection drugs based on the HDT strategy.

关键词

胞内菌 / FDA药物 / 老药新用 / 洛哌丁胺 / 自噬 / 非转移性黑色素瘤糖蛋白B

Key words

Intracellular bacteria / US Food and Drug Administration (FDA)-approved drugs / Drug repurposing / Loperamide / Autophagy / Glycoprotein nonmetastatic melanoma / protein B

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刘洪涛,李思琦,邓乐,史真旭,姜晨晓,舒婧妍,刘源,邓旭明,王建锋,郭志敏,邱家章. 老药新用——洛哌丁胺对胞内病原菌感染的治疗作用[J]. 工程（英文）, 2024, 39(8): 180-193 DOI:10.1016/j.eng.2024.01.011

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1 引言

在全球范围内，每年由沙门氏菌（ST）、结核分枝杆菌、福氏志贺氏菌和单增李斯特菌等细胞内病原菌引起的感染可导致数百万人死亡，已成为重大公共卫生问题[1]。例如，每年约有1000万人感染结核分枝杆菌且可导致150万人死亡[2]；沙门氏菌可导致每年13亿人感染，其感染所致的沙门氏菌病已成为全球性健康问题[3]。传统抗生素治疗显著改善了患者的预后，降低细菌感染的死亡率。但细菌耐药性的增加显著降低了大多数常规抗生素的临床疗效，尤其是可移动黏菌素抗性（MCR）基因[4]、新德里金属β-内酰胺酶（NDM-1）基因[5]、替加环素耐药性基因tet(X4/5) [6‒7]等耐药基因的出现和快速传播，正威胁“最后防线抗生素”（碳青霉烯类、多黏菌素、替加环素）的临床疗效。此外，抗生素需要进入胞内才能有效清除胞内菌，这加剧了抗生素临床应用的局限性[8]。若不及时采取措施，到2050年，每年将有1000万人死于耐药菌感染[9]。因此，亟需开发新型抗感染策略或药物以应对细菌感染。

宿主细胞的内环境对细菌生长是不利的，但许多胞内病原菌已进化出不同的策略以对抗宿主细胞的固有抗菌机制，使得细菌能够在细胞内存活和增殖[10]。例如，胞内沙门氏菌可利用其三型分泌系统（T3SS）向胞浆转运SopF，并通过二磷酸腺苷（ADP）-核糖基化V型ATP酶（V-ATPase）-自噬相关蛋白16-1（ATG16L1）以抑制细胞异噬（xenophagy）的发生，实现胞内存活[11]。福氏志贺氏菌T3SS效应蛋白底物入侵质粒抗原H9.8（IpaH9.8）可靶向作用宿主人鸟苷酸结合蛋白-1（hGBP1），通过对底物hGBP1进行第48位赖氨酸（K48）多聚泛素化，使其以蛋白酶体方式被降解，以利于细菌在胞内的存活和增殖[12]。上述宿主-病原菌相互作用的研究进展，推动了基于宿主导向疗法（HDT）的抗胞内菌感染策略的发展[13]。与直接杀死或抑制细菌的生长的传统抗生素不同，HDT药物是通过调节宿主细胞防御间接达到清除胞内菌的目的[10,13]，不易诱导细菌耐药性的产生。

新的抗感染药物从头合成需要大量的时间和很高的经济成本。相比之下，基于美国食品药品监督管理局（FDA）药物库的“老药新用”策略可靠、安全，且可加快药物开发速度[14]。本研究从FDA批准的药物库中筛选ST胞内增殖的抑制剂，结果发现抗腹泻药洛哌丁胺（LPD）是一种潜在的可用于治疗ST感染的HDT类药物。LPD处理可显著增强宿主巨噬细胞的溶酶体活性和自噬。此外，LPD处理可促进非转移性黑色素瘤糖蛋白B（GPNMB）的表达，GPNMB高表达介导了LPD诱导的自噬和对胞内菌的清除。此外，根据死亡率、靶器官菌落定殖、组织病理学和细胞因子水平的分析结果，我们发现LPD可有效保护动物模型对抗ST感染。综上所述，本研究认为LPD可用于治疗胞内菌感染引起的疾病。

2 材料与方法

2.1 菌株、细胞系、培养条件和化学试剂

本研究中使用的菌株列于附录A中表S1。沙门氏菌在37 ℃条件下在含有抗生素的Luria-Bertani（LB）肉汤中培养。在培养基中添加0.3 mol∙L-1 NaCl以诱导沙门氏菌致病岛1（SPI-1）基因的表达。大肠杆菌（E. coli）、福氏志贺氏菌（S. flexneri）、鲍曼不动杆菌（A. baumannii）、单增李斯特菌（L. monocytogenes）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株在添加适当抗生素的脑心浸出液（BHI）肉汤培养基中，37 ℃条件下培养。

人宫颈癌细胞（HeLa）、乳腺腺泡细胞吞噬T抗原细胞（MAC-T）和结肠直肠腺癌细胞（Caco-2）的培养基为10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM; Sigma-Aldrich, USA）；小鼠白血病单核细胞/巨噬细胞系（RAW264.7）的培养基为10%胎牛血清的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640（Sigma-Aldrich）。所有细胞均在含5% CO2、37 ℃培养箱中培养。

FDA批准药物库（库容量2320）（货号：L1021）购自APExBIO公司（美国）。

2.2 最低抑菌浓度（MIC）和体外生长曲线的测定

参考临床实验室标准协会（CLSI）肉汤微量稀释法，评估了LPD对受试菌株的MIC。添加刃天青于96孔板中显色，使用酶标仪（Synergy H1, BioTek，美国）测定其570 nm的光密度（OD）值（OD570nm）。

体外生长曲线测定步骤如下：将过夜培养的细菌培养物用新鲜LB稀释至OD600nm值为0.1；加入梯度系列浓度的LPD后，在37 ℃、220 r∙min-1条件下活化5 h，每隔30 min测量其OD600nm，并绘制成曲线。

2.3 细菌感染筛查试验

RAW264.7细胞（浓度为每孔1 × 105个）接种于24孔板。将ST在高盐（0.3 mol∙L-1 NaCl）LB中培养至对数期（OD600nm = 1），以20的感染复数（MOI-20）感染细胞1 h。100 μg∙mL-1庆大霉素处理感染细胞1 h，以杀死胞外细菌。用温磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次，加入含有40 μg∙mL-1 FDA批准药物的新鲜培养基，在37 ℃条件下继续培养4 h，然后用0.2%皂苷裂解细胞，将裂解物涂布于LB固体平板，计算其菌落形成单位（CFUs）的数量。

将大肠杆菌、福氏志贺氏菌、鲍曼不动杆菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌菌株在BHI培养液中培养至对数生长期（OD600nm = 1），以MOI-20感染RAW264.7细胞1 h，随后，参考ST胞内增殖的测定方法测定LPD对上述细菌胞内增殖的影响。

2.4 β-内酰胺酶（TEM）报告系统

利用TEM报告系统对ST-T3SS-1和ST-T3SS-2效应蛋白的转运情况进行测定[15‒16]。将SipA-TEM或SopD2-TEM转入野生型SL1344。将空载体质粒转化至T3SS-1功能缺陷型（ΔinvA）和T3SS-2功能缺陷型（ΔssaN）菌株作为阴性对照菌株。过夜培养的ST以1∶30的比例稀释于含有0.3 mol∙L-1 NaCl的新鲜LB中。加入系列浓度的LPD后，在37 °C、220 r∙min-1的条件下继续培养4 h。将HeLa细胞以每孔1.2 × 104个的浓度接种于96孔板中，将ST以MOI-20感染细胞2 h。用Hank's平衡液（HBSS）洗涤细胞2次，以去除胞外细菌。每孔加入6 × CCF4/AM反应混合物（K1095, Thermo Fisher，美国）。室温（RT）避光孵育1 h后，在荧光显微镜（Olympus IX83）下观察效应蛋白的转运情况。

2.5 三氯乙酸（TCA）沉淀法

用TCA沉淀法测定T3SS-1效应蛋白的分泌情况[17]。将野生型SL1344在添加不同浓度LPD的高盐LB中培养5 h，取2 mL培养物，12 000g离心5 min。将细菌沉淀在100 µL 1 ×十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液中重悬。加入上清液1/9体积的TCA，4 ℃沉淀过夜。在12 000g离心20 min后，用20 µL 1 × SDS上样缓冲液重悬沉淀。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）结合考马斯亮蓝（CBB）染色检测效应蛋白分泌情况，或使用特异性抗体进行免疫印记（WB）分析。

2.6 RNA测序和实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）

将野生型SL1344以MOI-20感染RAW264.7细胞1 h。庆大霉素处理1 h（参考庆大霉素试验的操作方法），将16 μg∙mL-1 LPD加入到细胞中，继续培养4 h。收集细胞，使用TRIzol（货号为15596018，Thermo Fisher）裂解后提取细胞总RNA。转录组分析采用2 × 150碱基对（bp）配对端测序（PE150），在Illumina NovaSeq™ 6000（联川生物技术有限公司）进行测定。选择差异表达基因（DEGs）的阈值为倍数变化（FC）大于或等于2或者小于0.5（log2FC的绝对值≥ 1）。以错误发现率（FDR）小于0.05作为筛选差异表达基因的标准。使用OmicStudio工具在网站进行生物信息学分析。

使用RevertAid RT反转录试剂盒（货号为K1691，Thermo Fisher）将总RNA反转录为互补DNA（cDNA），以cDNA作为模板进行qRT-PCR分析。所用引物序列见附录A中表S2，采用协同结合试剂（SYBR）绿色荧光染料（货号为KTSM1401，AlpaLife，中国），使用荧光定量PCR仪器（QuantStudio 1, Thermo Fisher）进行扩增和分析。以小鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为检测的内参基因。采用2-ΔΔ循环-阈值（CT）法计算基因的相对表达量。

2.7 RNA干扰敲低糖蛋白非转移性黑色素瘤B基因（gpnmb）的表达

将RAW264.7以每孔2 × 105个的密度接种于6孔板，培养18 h。使用RNA转染试剂（AD600075; Zeta Life，美国），用50 μmol∙L-1 gpnmb小干扰RNA（siRNA，附录A中表S3）转染细胞48 h。使用GPNMB抗体对GPNMB的表达情况进行WB分析，测定gpnmb敲低的效率。

2.8 WB和免疫染色

用ST感染RAW264.7细胞1 h后，添加或不加16 μg∙mL-1 LPD继续培养4 h。收集细胞，并用辛基苯丙氧基聚乙氧基乙醇（NP）-40裂解液（150 mmol∙L-1 NaCl, 1.0% NP-40, 50 mmol∙L-1 Tris-HCl, pH 8.0）在冰上裂解细胞。通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质，然后转移到硝酸纤维膜上，在含吐温-20（TBST）缓冲液的tris缓冲盐溶液中用5%脱脂奶粉（溶于TBST）封闭1 h，室温孵育一抗1 h。所用抗体：自制的兔源SipA抗体（1∶1000），兔源异柠檬酸脱氢酶（ICDH）抗体（Sigma，货号为abs2090，1∶5000），兔源p62（sqstm1基因编码的蛋白质）抗体（Abcam，货号为ab109012，1∶3000），兔源微管相关蛋白1轻链3β（LC3B）抗体（Sigma，货号为SAB5701328，1∶3000），兔源哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗体（CST，货号为2983，1∶1000），兔源磷酸化-mTOR（CST，货号为2976，1∶1000），兔源GPNMB抗体（Abcam，货号为ab188222，1∶3000）和兔源tubulin抗体（1∶5000）。TBST洗涤膜3次后用对应的二抗（Abcam，货号为ab175775和ab175781）室温孵育1 h。使用Odyssey CLx Imaging System（LI-COR，美国）扫描成像，并用ImageJ软件定量分析蛋白丰度。

免疫染色方法简述如下：4%（w/V）多聚甲醛室温固定细胞30 min，0.02%（V/V）TritonX-100打孔5 min，4%山羊血清在37 °C条件下封闭30 min，室温孵育一抗1 h。所用抗体如下：鼠源沙门氏菌抗体（Abcam，货号为ab69238，1∶1000）、兔源溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1）抗体（Abcam，货号为ab24170，1∶1000）和兔源LC3B抗体（同上）。对应的二抗（Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 488标记）（Thermo Fisher）对细胞进行染色。通过Hoechst 33342染色观察细胞核。在Olympus IX83显微镜下观察免疫荧光信号，并采集图片。

2.9 LPD对ST感染模型的实验治疗

动物实验经吉林大学实验动物福利伦理委员会审查通过（编号：SY202306059）。

（1）大蜡螟感染模型。大蜡螟幼虫购自于天津惠裕德生物科技有限公司。将幼虫随机分为3组（每组n = 10）。使用注射器将10 μL含有1 × 105 CFUs SL1344的菌液注入大蜡螟右后腹足。LPD治疗组幼虫按照LPD 150 μg∙kg-1的剂量注射给药，药物溶剂为10% DMSO、40% PEG400、45%生理盐水、5%吐温-80。感染组幼虫注射等量的溶剂。监测12 h，随时观察和记录幼虫的存活情况。

（2）小鼠感染模型。BALB/c小鼠（雌性，6~8周龄，18~20 g）购自辽宁长生生物技术有限公司。将小鼠随机分为3组：SL1344感染组、LPD治疗组和PBS对照组（存活率测定，n = 10；靶器官菌落定殖测定，n = 5）。所有小鼠均喂食含链霉素（5 g∙L-1）的水3天。在感染第4天，感染组和LPD治疗组小鼠分别以灌胃方式感染SL1344（存活率测定试验攻菌剂量为每只小鼠1 × 107 CFUs；靶器官菌落定殖试验攻菌剂量为每只小鼠5 × 106 CFUs）。治疗组小鼠每隔12 h按照5 mg∙kg-1的剂量腹腔注射LPD。第8天解剖小鼠，无菌采集脾脏和肝脏组织，匀浆、稀释、涂布LB平板并计数，测定其CFUs。采集小鼠组织，用4%（w/V）多聚甲醛固定48 h，并用苏木精-伊红（HE）染色进行组织病理学分析。根据肝脏肝小叶的化脓灶数量、脾脏生发中心的数量和大小、肠道上皮细胞层的完整性和固有层的炎症细胞浸润情况进行炎症评分。评分标准：轻度炎症0~4分，中度炎症5~8分，重度炎症9~12分。

免疫组织化学分析使用Histostain™-SP试剂盒（Zsbio，货号为SPN-9001），并根据其说明书进行操作。使用BioLegend细胞因子检测试剂盒（TNF-α，货号为430904；IL-1β，货号为432604；IL-10，货号为431414）检测小鼠盲肠的细胞因子水平。

2.10 统计分析

所有数据使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software，美国）软件进行统分析。2组样本比较采用t检验；3组及3组以上样本的数据分析采用单因素方差分析（ANOVA）；小鼠存活率数据采用log-rank分析方法进行分析。图中P值所示如下：NS，无显著差异；*** P < 0.001；** P < 0.01；* P < 0.05。

3 结果

3.1 LPD可抑制细菌在宿主细胞内的增殖

为筛选能够清除胞内菌的HDT药物，本研究从2320种FDA药物中筛选能够抑制ST胞内增殖的化合物。RAW264.7细胞经ST感染后，加入庆大霉素以杀死胞外菌，并加入受试化合物，作用一段时间后，检测其胞内菌的增殖情况[图1（a）]。结果发现盐酸吉西他滨、依折麦布、LPD、硝唑尼特、盐酸咪达普利、布瑞哌唑和马来酸茚达特罗在40 μg∙mL-1时可抑制ST在细胞内的增殖（附录A中表S4），其中LPD的抑制作用最强[图1（b）]。剂量依赖性分析显示，4 μg∙mL-1 LPD即可显著抑制ST的胞内增殖[图1（c）]。ST胞内生长曲线的绘制结果显示，经LPD处理，巨噬细胞和HeLa细胞的胞内细菌数量逐渐减少[图1（d）~（e）]。免疫荧光结果进一步显示LPD可抑制沙门氏菌的胞内增殖[图1（f）~（g）]。LPD除可抑制ST在RAW264.7胞内增殖外，16 μg∙mL-1的LPD也可抑制大肠杆菌、福氏志贺氏菌、鲍曼不动杆菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的胞内增殖[图1（h）~（i）]。综上，LPD是一种有效的胞内菌增殖的抑制剂。

3.2 LPD不影响沙门氏菌的体外生长和毒力

为确定LPD是否具有抗菌活性，本文检测了LPD对ST、大肠杆菌、福氏志贺氏菌、鲍曼不动杆菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的MIC，发现其MIC均大于1024 μg∙mL-1 [附录A中图S1（a）和表S5]。此外，体外生长曲线绘制结果表明，LPD浓度增加不影响ST的自然生长[附录A中图S1（b）]。上述结果表明LPD抑制细菌胞内增殖并不归因于其直接抗菌作用。

SPI-1和SPI-2编码的T3SS-1和T3SS-2是ST在宿主细胞内存活和增殖的关键系统[18‒19]。其可将效应蛋白输送到宿主细胞内，以逃避宿主细胞免疫系统的清除，实现ST胞内存活和增殖[18‒19]。为确认LPD是否通过抑制T3SS-1和（或）T3SS-2的功能实现对ST胞内增殖的抑制，本研究利用构建的TEM荧光报告系统检测LPD对T3SS-1和T3SS-2转运功能的影响[15‒16]。结果表明LPD并不影响SipA-TEM（T3SS-1效应蛋白）或SopD2-TEM（T3SS-2效应蛋白）转运到细胞内[图2（a）~（b）]。其对SipA的表达以及T3SS-1效应蛋白的分泌也无影响[图2（c）~（e）]）。上述结果表明LPD抑制ST的胞内增殖并不是通过抑制T3SS功能实现的。

3.3 LPD对沙门氏菌感染的巨噬细胞转录谱的影响

上述结果提示LPD抑制胞内菌的增殖可能是通过调节宿主防御能力实现的。为此，本研究对LPD处理前后RAW264.7细胞的转录谱变化进行分析。结果表明，与对照组（ST/Blank）相比，ST感染RAW264.7细胞后，我们在感染组中共发现1089个差异表达基因，其中515个基因表达上调，574个基因表达下调[图3（a）]。上述差异基因可能参与ST的致病过程。与感染组相比，LPD处理后（ST-LPD/ST），我们在ST-LPD组中共发现1369个差异基因，其中738个基因表达上调，631个基因表达下调[图3（a）]。这些基因可能参与LPD对胞内ST清除过程的调控。

为检测RNA测序数据的准确性，本文随机选择10个差异基因进行qRT-PCR验证。包括ST/Blank下调和ST-LPD/ST上调的6个基因[谷胱甘肽S-转移酶μ1（gstm1）、隔离体1（sqstm1）、polo样激酶3（plk3）、组织蛋白酶D（ctsd）、造血前列腺素D合成酶（hpgds）和丙氨酰氨基肽酶（anpep）]，以及ST/Blank上调和ST-LPD/ST下调的4个基因[核糖核酸还原酶M2（rrm2）、脱氧胞苷三磷酸焦磷酸酶1（dctpp1）、核糖核酸还原酶M1（rrm1）和淋巴毒素B（ltb）]（附录A中图S2）。qRT-PCR结果与RNA-测序结果一致。

通过对ST、Blank、ST-LPD 3组数据进行比较，共鉴定出219个共有的差异基因，包括ST/Blank下调和ST-LPD/ST上调的基因123个，ST/Blank上调和ST-LPD/ST下调基因96个[图3（a）]。在ST/Blank下调与ST-LPD/ST最显著的11个差异基因中，有8个基因参与巨噬细胞炎症调节，其中5个基因[Yippee样蛋白3（ypel3）、CD33分子（cd33）、C-X-C基序趋化因子受体4（cxcr4）、gpnmb和gstm1]是溶酶体活性的调节因子[图3（b）和（c）]。在ST/Blank上调和ST-LPD/ST下调最显著的12个差异基因[septin2、G蛋白信号调节因子（rgs16）、ltb、β-1,4-葡萄糖醛酸转移酶1（b4gat1）、前列腺素内过氧化物合酶（ptgs2）、ISG泛素样修饰因子15（isg15）、S100钙结合蛋白A8（s100a8）、干扰素调节因子7（irf7）、2'-5'寡腺苷酸合成酶1G（oas1g）、组织相容性复合体2-T区基因座24（h2-T24）、DEAD-box RNA解旋酶58（dhx58）和半乳糖凝集素9（lgals9）]中，有8个基因参与巨噬细胞的免疫调节，7个基因参与溶酶体活性的调节[图3（d）和（e）]。上述结果提示LPD可能通过增强宿主免疫进而抑制细菌的胞内增殖。

3.4 LPD可增强ST感染的巨噬细胞溶酶体活性

溶酶体是负责消化和降解细胞内大分子的酸性细胞器，可识别和清除巨噬细胞中的微生物、碎片和死亡细胞，参与先天免疫和细胞稳态的维持[20]。此外，溶酶体作为复杂的信号转导中心还参与代谢调节和细胞应激反应[21]。上述结果提示LPD处理对宿主细胞的免疫调节（尤其对溶酶体功能的调节）可能发挥某种作用。对RNA测序数据的进一步分析发现，LPD处理的ST感染巨噬细胞中，有54个上调基因参与溶酶体活性和自噬的调节[图4（a）]。为了验证转录组学结果，我们采用LysoTracker和LysoSensor来检测巨噬细胞的溶酶体活性。结果表明ST感染的细胞中溶酶体功能没有变化[图4（b）~（c）]，但LPD处理ST感染的细胞中，LysoTracker和LysoSensor的荧光强度显著升高[图4（b）~（c）]。此外，与感染组相比，经LPD处理的感染细胞中，溶酶体标志蛋白LAMP-1与细菌共定位的比例显著上升[图4（d）~（e）]。提示LPD可能通过增强细胞的溶酶体活性进而清除胞内菌。

3.5 LPD可促进ST感染的巨噬细胞发生自噬

基于自噬发生与溶酶体之间的密切联系以及LPD对溶酶体酸化的影响，我们推测LPD可能参与宿主细胞自噬的调节。为此，本研究通过WB检测RAW264.7细胞中LC3和p62的表达水平。结果表明，虽然对照组和ST组仅呈现LC3-II的基础水平，但脂质化LC3和LPD处理将LC3-II提高到与雷帕霉素处理样品相当的水平[图5（a）~（b）]。p62在自噬诱导下被降解，常被用作自噬发生的标志。但与ST感染组相比，LPD处理的细胞中p62的表达升高[图5（a）和（c）]。其p62的表达升高可能是由于LPD处理后细胞p62的转录增强所致（附录A中图S2）。此外，在HeLa [图5（d）~（f）]、MAC-T [图5（g）~（i）]和Caco-2 [图5（j）~（l）]细胞中也观察到LPD诱导自噬的现象。

KEGG分析ST/Blank和ST-LPD/ST之间的差异基因，发现有9个基因参与磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT丝氨酸苏氨酸激酶（Akt）信号通路（附录A中图S3）。mTOR是PI3K/Akt信号通路的下游靶点[22]，在调节自噬的过程中发挥重要作用[23]。本研究对LPD处理的ST感染细胞中磷酸化mTOR（p-mTOR）水平进行检测。结果表明ST感染细胞的p-mTOR增多，而LPD处理组p-mTOR的水平降低至未感染细胞的水平[图5（m）~（p）]。因此，在ST感染的巨噬细胞中，PI3K/Akt/mTOR可能参与LPD诱导的自噬。

随后，我们探究了LPD诱导的自噬对清除胞内ST的影响。首先用ST感染RAW264.7细胞，经LPD处理后，进行免疫染色分析。免疫染色的结果显示，LC3聚集点周围的细菌明显增多[图6（a）~（b）]。此外，在ST感染细胞中添加自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3MA）可以缓解LPD对ST细胞内增殖的抑制[图6（c）]。以上数据表明LPD通过促进自噬抑制ST在细胞内增殖。

3.6 GPNMB介导LPD诱导的自噬和对胞内沙门氏菌的清除

RNA测序结果表明，gpnmb在所有差异基因中变化最显著。ST感染后，细胞gpnmb基因表达显著降低，但LPD处理组gpnmb表达显著升高[图7（a）]。gpnmb编码的GPNMB是一种高度糖基化的蛋白，可定位于细胞膜、核内体和溶酶体[24]。GPNMB参与调控宿主细胞的多种生理过程，如细胞迁移、增殖、分化和黏附等[25]。有研究表明GPNMB也可调节宿主自噬和溶酶体功能[26‒27]。

为进一步探究LPD介导的胞内菌清除机制，本研究通过qRT-PCR检测gpnmb基因的转录水平[图7（b）]。ST、福氏志贺氏菌和大肠杆菌感染RAW264.7细胞后，gpnmb转录水平降低，但LPD处理组gpnmb转录水平显著升高[图7（c）]。WB结果显示，在LPD处理后，GPNMB的表达增加[图7（d）~（e）]。上述结果提示GPNMB可能介导LPD对胞内病原菌的清除。

本研究采用RNA干扰（RNAi）技术敲低RAW264.7细胞中GPNMB的表达[图8（a）~（b）]。LC3-II和p62的表达水平不受GPNMB敲低的影响，但GPNMB敲低后可显著降低LPD诱导的LC3-II和p62表达增加[图8（c）~（e）]。此外，敲低GPNMB对ST的细胞内生长没有影响，但敲低GPNMB显著抑制了LPD多胞内ST的清除能力[图8（f）]。上述结果表明GPNMB介导了LPD诱导的细胞自噬和对胞内菌的清除作用。

3.7 LPD可有效保护动物模型对抗沙门氏菌感染

为探究LPD对细菌感染的治疗作用，本研究建立了大蜡螟幼虫和小鼠的沙门氏菌感染模型。ST感染（1 × 105 CFUs∙只-1）的大蜡螟幼虫模型在12 h内全部死亡，LPD治疗组（150 μg∙kg-1）大蜡螟幼虫的存活率为40% [图9（a）]。为检测LPD对ST感染组小鼠模型的治疗效果，每只小鼠在喂养含链霉素的水3天后感染ST（1 × 107 CFUs∙只-1），每隔12 h给予5 mg∙kg-1 LPD直至感染组小鼠全部死亡为止。结果发现感染组小鼠在第9天全部死亡，而LPD治疗组可提高ST感染小鼠的存活率50% [图9（b）]。

为确定LPD对感染小鼠靶器官菌落定殖、组织病变等的影响，采用亚致死剂量的ST（5 × 106 CFUs∙只-1）感染小鼠，并按照与小鼠死亡率测定实验相同的剂量和给药方案给予LPD进行治疗。在感染后第5天处死小鼠。剖检结果显示感染组肠道内无成型粪便，对照组和LPD治疗组小鼠肠道则可见健康成型的粪便[图9（c）]。此外，LPD治疗组其肝脏和脾脏的菌落定殖显著降低[图9（d）]。最后，通过器官的HE染色监测组织病理学变化。HE染色结果表明，感染组小鼠肠道上皮细胞脱落，而LPD治疗组上皮细胞脱落现象明显缓解。ST感染组小鼠肝脏出现广泛的炎性细胞浸润、出血和充血，而LPD治疗组该变化显著得到缓解[图9（e）]。此外，LPD治疗组脾脏炎性细胞浸润也显著弱于ST感染组[图9（e）]。肝脏、脾脏和肠道的炎症评分结果显示LPD治疗可显著降低ST感染所致的炎症损伤[图9（f）]。综上所述，LPD可有效帮助动物模型对抗沙门氏菌感染。

本研究进一步通过免疫组化检测了小鼠肠道p-mTOR和p62的表达情况，结果显示LPD治疗组小鼠肠道p-mTOR显著低于未治疗组[附录A中图S4（a）~（b）]，而p62的表达则显著高于未治疗组[附录A中图S4（c）~（d）]。因此，LPD治疗促进了感染组细胞的自噬，这与体外细胞水平上p-mTOR和p62的表达水平一致。

3.8 LPD可缓解ST感染所致的肠道炎症

转录谱分析发现包括细胞因子、趋化因子、趋化因子受体和Toll样受体在内的34个差异基因参与炎症调节[图10（a）]。这些数据表明，LPD可通过促进宿主自噬过程清除细胞内细菌外，还可调节宿主的炎症反应。为此，我们通过qRT-PCR检测RAW264.7细胞中细胞因子的转录水平。结果表明ST感染后，肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、IL-1β和干扰素（IFN）-γ的mRNA水平显著上调[图10（b）~（e）]。LPD处理可显著降低TNF-α、IL-6和IL-1β的转录水平[图10（b）~（d）]。但IFN-γ得转录水平不受影响[图10（e）]。ST感染抑制了IL-10的转录，而LPD处理显著恢复了IL-10的mRNA水平[图10（f）]。研究收集了ST感染的小鼠盲肠组织，并通过ELISA检测细胞因子水平。结果显示ST感染组TNF-α和IL-1β表达升高[图10（g）~（h）]，但IL-10表达降低[图10（i）]。重要的是，与未感染组小鼠相比，LPD治疗组小鼠TNF-α和IL-1β的表达显著降低[图10（g）~（h）]，IL-10的表达增多[图10（i）]。综上，LPD可通过抑制促炎细胞因子和提高抗炎细胞因子的表达来抑制炎症的发生。

4 讨论

胞内致病菌，如鼠伤寒沙门氏菌、结核分枝杆菌和福氏沙门氏菌能够侵入宿主上皮细胞和巨噬细胞，并在其内部存活和增殖，以逃避宿主免疫系统和抗生素的杀伤。这些胞内菌可导致急性感染或复发性慢性感染。由于大多数抗生素的低细胞渗透性和细胞内的快速降解特性，使其在临床细菌感染的治疗效果显著下降[28‒29]。提高使用剂量虽可在一定程度上提高治疗效果，但其导致治疗成本增加，且影响正常菌群状态[30]。此外，多重耐药菌株的出现和传播加剧了这一困境。因此，迫切需要开发新的抗感染药物或策略。

自2000年以来，尽管只有12种新的抗生素被批准使用，但通过药物手段寻找新的抗生素或提高现有抗生素的治疗效果，仍然是控制细菌感染的首选策略[31]。近年来，随着基因组学和培养组学技术的发展[32]，一些有前景的抗菌化合物（如teixobactin [33]和darobactin [34]）被发现并应用于抗感染。尽管取得了一些进展，但仍无法满足临床细菌感染的治疗需求。与传统抗生素不同，以促进宿主抗感染机制的HDT药物不具有直接的杀菌或抑菌活性，因此对细菌的选择性压力较小[10]。不易诱导细菌耐药性和影响肠道菌群[30]。胞内细菌可通过利用细胞内的营养物质和对抗宿主免疫防御，实现其胞内存活和增殖。因此，HDT策略适用于胞内菌的清除。宿主-病原菌相互作用机制的阐明也可为HDT药物的设计或筛选提供重要靶标[35]。CRISPR/Cas基因编辑技术的发展和应用使得影响胞内菌存活和增殖的宿主因子筛选成为现实[36‒37]。目前，HDT策略可以通过阻断细菌生存所必需的宿主途径或激活病原体拮抗机制实现对胞内菌的清除。

自噬不仅通过提供能量来源在维持细胞稳态中发挥重要作用，也是一种重要的先天防御机制（异噬）以清除入侵的微生物[38]。但多种胞内病原可通过特有的毒力因子逃避异噬的清除。ST的T3SS-2效应蛋白SopF可通过ADP核糖基化异噬的必需因子，进而抑制异噬[11]。因此，通过调节自噬以实现治疗胞内菌感染的HDT类药物开发是一种很有前景的抗感染策略[13]。前期已有多种该类HDT药物的报道，尤其是通过调节自噬实现抗结核分枝杆菌感染类药物的发现[39]。例如，表皮生长因子抑制剂吉非替尼可通过诱导自噬，进而抑制结核分枝杆菌的增殖[40]；二甲双胍是治疗2型糖尿病的一线药物，其可通过触发自噬来有效消除细胞内结核分枝杆菌[41]。考虑到二甲双胍可接受的毒性和广泛应用，该药物已成为一种有前景的抗结核药物，并即将进入临床试验阶段[42]。此外，Chiu等[43]发现的一种新型小分子药物AR-12能够通过促进感染巨噬细胞的自噬体形成清除胞内ST。AR-12对ST感染小鼠表现出显著的抑制作用，能够减少肝脏和脾脏的菌落定殖，并延长动物存活时间，表明其在控制沙门氏菌感染方面具有潜在的应用前景[43]。

本文通过筛选发现LPD是一种沙门氏菌胞内增殖的抑制剂。LPD可通过增强宿主细胞的溶酶体活性和自噬来清除胞内病原菌。此外，LPD对沙门氏菌感染的动物模型具有良好的保护效果。其可降低沙门氏菌感染小鼠模型的死亡率，降低其靶器官菌落定殖，缓解病理损伤。抑制宿主自噬是多种细菌在宿主细胞内得以存活和复制的共同机制之一[44]。LPD处理可显著抑制大肠杆菌、福氏志贺氏菌、鲍曼不动杆菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的胞内增殖。此外，有研究发现LPD也可抑制中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒和人冠状病毒229E的复制[45]。因此，本研究提示LPD是一种广谱的抗胞内病原体的HDT类药物。此外，前期研究表明LPD可增强米诺环素[46]和黏菌素[47]的抗菌活性，表明LPD也具有作为潜在的胞内感染标准化疗辅助治疗方案的应用前景。LPD是一种非处方的μ阿片受体激动剂，被广泛用于临床止泻[48]。由于LPD对中枢神经系统（CNS）的渗透能力较弱，一般认为其治疗剂量是安全的[49]，但高剂量LPD可能会引起心脏毒性[50]和中枢神经系统紊乱[51]。此外，服药后偶发其他不良反应，如便秘和腹痛[49]。因此，在将LPD重新应用于其他疾病的治疗之前，需要对其安全性进行重新评估。

GPNMB是一种参与多种宿主过程的跨膜糖蛋白[25]。GPNMB可通过抑制mTOR信号通路增强细胞自噬[27]，也是巨噬细胞溶酶体功能紊乱的生物标志[24]。最近的一项研究表明，GPNMB可通过抑制自噬体和溶酶体的融合，进而抑制呼吸综合征病毒（PRRSV）的复制[52]。本文的机制研究结果表明LPD对胞内菌的清除主要依赖于LPD诱导的GPNMB表达的增强。综上，GPNMB可能是促进细胞自噬类的HDT药物筛选的理想靶标。

数据可用性：转录组数据保存于NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），登录号：GSE236340。数据未公开时，获取数据的安全密码：itwtqaqenfsjzil。

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