在异源宿主中通过理性改造次级代谢途径以获得抗黑色素瘤活性增强的云雀霉素衍生物

刘向阳 , 赵菲芃 , 田添 , 王炜辰 , 刘载舟 , 周强 , 侯现锋 , 王婧 , 郭文丽 , 林双君 , Yasuhiro Igarashi , 唐功利

工程（英文） ›› 2024, Vol. 38 ›› Issue (7) : 130 -141.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 38 ›› Issue (7) : 130 -141. DOI: 10.1016/j.eng.2024.01.012
研究论文

在异源宿主中通过理性改造次级代谢途径以获得抗黑色素瘤活性增强的云雀霉素衍生物

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Rational Engineering of Secondary Metabolic Pathways in a Heterologous Host to Enable the Biosynthesis of Hibarimicin Derivatives with Enhanced Anti-Melanomic Activity

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摘要

将来源于Microbispora rosea subsp. hibaria TP-A0121、负责云雀霉素（HBM）B生物合成的一个61 kb基因簇在天蓝色链霉菌M1154中进行异源表达，重组菌株只产生了少量目标产物但积累了大量的副产物。通过对副产物相关次级代谢途径进行理性分析，我们对生物合成途径进行定向工程改造，成功实现了HBM B的高产，并且产生了抗肿瘤活性增强的新型云雀霉素衍生物。通过此研究，我们不仅建立了一个高效合成云雀霉素（一类最大、最复杂、具有独特伪二聚体结构的II型聚酮类化合物）的生物合成系统，而且为进一步工程化和深入研究这一复杂生物合成途径开辟了道路，有望用于开发潜在有效的抗癌药物。

Abstract

A 61-kb biosynthetic gene cluster (BGC), which is accountable for the biosynthesis of hibarimicin (HBM) B from Microbispora rosea subsp. hibaria TP-A0121, was heterologously expressed in Streptomyces coeli-color M1154, which generated a trace of the target products but accumulated a large amount of shunt products. Based on rational analysis of the relevant secondary metabolism, directed engineering of the biosynthetic pathways resulted in the high production of HBM B, as well as new HBM derivates with improved antitumor activity. These results not only establish a biosynthetic system to effectively synthesize HBMs-a class of the largest and most complex Type-II polyketides, with a unique pseudo-dimeric structure-but also set the stage for further engineering and deep investigation of this complex biosynthetic pathway toward potent anticancer drugs.

关键词

云雀霉素 / 生物合成 / 异源表达 / 生物合成基因簇 / 理性改造 / II 型聚酮

Key words

Hibarimicin / Biosynthesis / Heterologous expression / Biosynthetic gene cluster / Rational engineering / Type-II polyketide

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刘向阳,赵菲芃,田添,王炜辰,刘载舟,周强,侯现锋,王婧,郭文丽,林双君,Yasuhiro Igarashi,唐功利. 在异源宿主中通过理性改造次级代谢途径以获得抗黑色素瘤活性增强的云雀霉素衍生物[J]. 工程（英文）, 2024, 38(7): 130-141 DOI:10.1016/j.eng.2024.01.012

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1 引言

云雀霉素B（HBM B，1a，图1）是一种由稀有放线菌Microbispora rosea subsp. hibaria TP-A0121产生的芳香聚酮类化合物。它显示出对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10显著的抗肿瘤活性，并且能诱导人类骨髓性白血病细胞HL-60的分化[1‒2]。此外，HBM B还表现出对蛋白酪氨酸激酶的显著抑制活性。然而，抑制原癌基因酪氨酸蛋白激酶（Src）活性所需的浓度大约比抑制生长和诱导分化所需的浓度高100倍，表明HBM B的抗肿瘤活性可能还与其他的机制有关[3]。在结构上，HBM B属于分子量最大、最复杂的II型聚酮类化合物，具有独特的假二聚体结构、高度氧化的糖苷配基和丰富的糖基修饰[4]。该化合物独特的结构和显著的生物活性使其成为化学家的重要合成目标[5‒9]。迄今为止，尽管整个分子尚未被化学合成，但已经实现了hibarimicinone（2a，图1）——HBMB的核心苷元——及其类似物HMP-P1和HMP-Y1的全合成[6,9]。因此，获得足够的HBM B及其类似物以进一步开展生物和药理相关研究仍然是一项具有挑战性的任务。

为了充分发掘这类化合物的应用潜力并发展更具潜力的类似物，我们考虑采用生物合成的策略进行合成。前期传统13C标记的前体喂养实验和对阻断突变体中间体分析表明，一个复杂的II型聚酮合酶（PKS-II）体系可能负责了HBMs的生物合成[10‒12]。然而，对稀有放线菌Microbispora rosea subsp. hibaria TP-A0121的进一步深入研究并不成功。由于原始宿主的遗传操作比较困难，我们旨在通过建立一个异源生物合成平台来合成HBMs。近期，采用优化的底盘宿主来异源表达相关生物合成基因簇（BGC）已经成为一种很有前景的方法。这种方法可以有效地激活沉默基因簇，并建立了天然产物化学结构与其对应基因之间的联系。因此，该方法促进了对生物合成机制的研究，并便于获取结构类似物以进行深入研究[13‒17]。在本文中，我们报道了对hbm基因簇的鉴定以及在适当的底盘宿主天蓝色链霉菌（S. coelicolor）中的异源表达和功能分析。通过对次级代谢途径的理性改造，我们不仅成功异源合成了HBM B，还获得了抗肿瘤活性改善的HBM衍生物。此外，基于对几个重要基因的遗传研究和关键中间体/副产物的化学结构鉴定，我们推测出了HBM的生物合成途径。

2 材料与方法

2.1 通用方法

本研究中使用的细菌菌株、质粒和细菌人工染色体（BAC）见附录A中的表S1。聚合酶链反应（PCR）引物见附录A的表S2。通用的酶、试剂盒、培养基、化学品和分子生物学试剂均从标准商业来源购买。在大肠杆菌（E. coli）中进行的DNA操作和提取采用了标准的实验方法[18]。使用E. coli GB05-red菌株通过Redα/Redβ/Redγ（Red）/RecE/RecT（ET）重组方法进行基因敲除[19]。采用三亲本接合转移方法将BAC从大肠杆菌转移到天蓝色链霉菌中，具体操作按照标准方法进行[20]。对于天蓝色链霉菌，使用甘露醇黄豆饼粉（MS）培养基在30 °C下进行产孢和接合转移。使用含有35.0 g∙L-1麦芽提取物、30.0 g∙L-1玉米淀粉、15.0 g∙L-1玉米浆、15.0 g∙L-1棉籽粉和2.0 g∙L-1 CaCO3的#22液体培养基，添加5%的HP-20树脂和R3固体培养基平板，在30 °C下进行代谢产物的生产。M. rosea subsp. hibaria TP-A0121在28 °C下的V-22培养基中培养3 d作为种子培养物，然后将1 mL的种子培养物转移到含有麦芽提取物（MP）的100 mL发酵培养基中，进行代谢产物的生物合成[11]。

2.2 异源表达HBM生物合成基因簇

通过ET12567/pUB307介导的三亲本接合转移将BAC 3C16及其衍生质粒转到天蓝色链霉菌中[20]。ET12567/BACs和辅助菌株ET12567/pUB307在Luria-Bertani（LB）培养基中37 °C条件下培养6~8 h至光密度（OD600）为0.5~0.7。然后，收集2 mL的ET12567/BACs和1 mL的ET12567/pUB307，经离心洗涤两次去除抗生素，再用200 μL的LB培养基重悬菌体。收集新鲜的天蓝色链霉菌孢子在LB培养基中洗涤两次，重悬在400 μL的2×酵母提取物-胰蛋白胨（YT）培养基中，50 °C水浴热激10 min后与洗涤好的ET12567/BACs和ET12567/pUB307混合均匀，然后均匀涂布在MS培养基上。在30 °C培养箱中培养13~16 h后，MS平板用阿伯拉霉素（50 µg∙mL-1）和三甲氧苄啶（40 µg∙mL-1）进行抗生素覆盖，再额外培养6~7 d。通过PCR分析验证接合子正确与否。

2.3 代谢产物发酵和分析

为了生产HBMs，将100 µL天蓝色链霉菌相关衍生菌株的孢子悬液接种于50 mL液体胰蛋白胨大豆（TSB）培养基中，30 °C孵育1~2 d，获得种子培养液。然后，将2 mL的种子培养液转移至100 mL的发酵培养基（#22）中，在30 °C下再培养5 d。对于固体发酵，将30 µL孢子悬液涂布在R3固体培养基上，在30 °C培养箱中培养4 d。为了分析代谢物，将固体平板切碎，并用35 mL的99∶1（V/V）乙酸乙酯/乙酸提取3次。使用旋转蒸发仪蒸发溶剂后，将残余物溶解在1 mL的甲醇中。取20 µL样品进行高效液相色谱（HPLC）检测。液体发酵时，先将发酵液调至pH值为3~4，然后用等体积的乙酸乙酯提取。乙酸乙酯提取物采用旋转蒸发浓缩，最终提取物溶解于甲醇中。样品分析采用Agilent 1200 HPLC system（USA），使用Acclaim120 C18 column（5 µm, 4.6 mm × 250 mm）色谱柱，流动相为乙腈和含0.1%甲酸的水，流速为1.0 mL∙min-1。乙腈的梯度洗脱在20 min内由25%变为90%，然后保持10 min。HBMs相关产物的检测波长为276 nm或500 nm。

2.4 S. coelicolor M1156 的构建

为了敲除S. coelicolor M1154 [21]基因组中的剩余act相关基因，通过PCR利用引物Δact-L-HindIII-F、Δact-L-XbaI-R、Δact-R-XbaI-F和Δact-R-EcoRI-R（序列见表S2）从S. coelicolor M1154基因组DNA中扩增两个同源片段。将PCR产物纯化后，用相应的限制性内切酶进行酶切。随后，将其连接到已经酶切好的质粒pKC1139中，生成基因敲除质粒pKC1139-Δact。构建的质粒通过E. coli ET12567/pUZ8002的接合转移至S. coelicolor M1154中。接合子在37 °C下培养一代，然后在30 °C下连续培养3~4代，以实现双交换。双交换突变体利用敲除基因侧翼引物Δact-flank-F/R进行PCR验证，并通过PCR产物测序进一步证实敲除结果。

2.5 基因敲除、回补和过表达突变株的构建

采用Red/ET重组介导的基因敲除技术对3C16进行遗传改造。将含有flippase识别靶点（FRT）位点的卡那霉素抗性基因盒的线性PCR产物（来自pJTU4659 DNA片段，具有39个核苷酸的同源臂）以约0.5 µg的含量电转到50 µL GB05-red/3C16感受态细胞中。通过PCR验证正确的菌落后，将这些构建质粒转至E. coli BT340中，由flippase（FLP）重组酶介导切除卡那霉素抗性基因。在转入S. coelicolor之前，通过PCR对最终含有FLP 残留疤痕位点的敲除菌株进行验证。为了在原位过表达hbmRg2，我们合成了一个具有FRT位点的氨苄青霉素抗性基因盒，位于kasOp *启动子旁边[22]，并使用新合成的氨苄青霉素抗性盒重复上述程序。

利用整合型质粒pMS82或pMS4F（带有stnYp启动子[23]的pMS82衍生质粒）进行基因回补。将hbmD基因克隆到pMS4F质粒的stnYp启动子下游的BcuI和EcoRV限制性酶切位点中，生成pMS4F-hbmD质粒。通过将pMS4F-hbmD质粒引入到ΔhbmD/M1156突变体中，获得了回补菌株ΔhbmD/M1156::pMS4F-hbmD。同样，将actVI-ORF1克隆到pMS82中，然后引入3C16/M1156中，得到回补菌株3C16/M1156::actVI-ORF1。

2.6 相关菌株代谢产物的分离及结构鉴定

为了制备化合物3、4、5和6，将6 L突变株3C16/M1154的发酵液pH调整至3~4后，用等体积的乙酸乙酯萃取3次。将萃取液旋转蒸发后，溶解在适量的甲醇中。然后将溶液上载到反相C18柱上，用甲醇∶水混合物进行梯度洗脱。用半制备柱进一步纯化，最终得到纯净的目标化合物。对其余相关菌株进行5 L固体发酵，分离程序与3、4、5、6相似。最终，纯化合物1b/c、VB1/2（来自3C16/M1156突变株的发酵），1a（来自ΔhbmD突变株的发酵）、12（来自ΔhbmO6突变株的发酵）和15b（来自ΔhbmO8突变株的发酵）通过半制备HPLC获得。

2.7 细胞活力测定

采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞与不同浓度化合物孵育后的细胞活力。简而言之，将细胞以每孔2500个细胞的接种密度接种到96孔板中过夜。第二天，将原培养基丢弃，改用含有梯度浓度化合物的新鲜培养基。与化合物孵育72 h后，在每孔中加入10 µL CCK-8（K1018; APExBIO, USA），在37 °C下培养4 h。使用EnVision Multimode Plate Reader （PerkinElmer, USA）记录每个孔在450 nm处的吸光度。

2.8 RNA提取和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分析

M. rosea subsp. hibaria TP-A0121在MP培养基中30 °C生长48 h后，使用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit （Takara, Japan）从中提取总信使RNA（mRNA）。采用PCR验证没有DNA污染。然后使用互补DNA（cDNA）合成试剂盒（Takara）将分离出的RNA逆转录成cDNA。为了分析基因表达，将cDNA样本在95 °C下变性5 min，然后进行30个PCR周期扩增，方法如下：95 °C变性（30 s），最佳温度退火（30 s），72 °C延伸（15~30 s），最终72 °C补延伸（10 min）。

2.9 羟基钴胺素（OHCbl）喂养实验

在OHCbl喂养实验中，将M. rosea subsp. hibaria TP-A0121的孢子悬浮液接种于V-22培养基中，培养48 h后作为种子液。然后将1 mL种子液接种于50 mL MP培养基中。培养温度设置为30 °C，转速为220 r∙min-1。24 h后，将OHCbl以60 µmol∙L-1的终浓度加入MP培养基中。培养3 d后，收集发酵液并进行代谢物分析。在分析之前，将发酵液的pH值调整到3~4，然后用等体积的乙酸乙酯进行萃取。

3 结果与讨论

我们通过antiSMASH 6.0 [24]对M. rosea subsp. hibaria TP-A0121的基因组数据进行生物信息学分析，从中发现了一个II型聚酮相关的基因簇hbm，其中40%的基因与II型聚酮光神霉素的生物合成基因相似[25]。这个潜在的hbm基因簇约为61 kb，包含48个开放阅读框（ORFs），可能编码了HBMs的生物合成、调控和抗性相关蛋白[图2（a）]。通过对相应的氨基酸序列进行基本局部比对搜索工具（BLAST）分析来预测它们假定的功能（表1），并根据序列分析和生物合成逻辑确定了BGC的边界。考虑到该基因簇较大，我们选择BAC克隆来获得整个hbm基因簇。制备M. rosea subsp. hibaria TP-A0121基因组BAC文库，并通过PCR筛选目标BACs，从而鉴定了几个包含预期完整BGC区域的BACs（附录A中的图S1）。

随后，我们将一个阳性BAC（3C16）通过接合转移至常用的底盘菌株S. coelicolor M1154 [21]，并通过HPLC和电喷雾电离-质谱（ESI-MS）分别分析含有空载体pSET152（作为对照）和3C16的S. coelicolor M1154的发酵培养基提取物。然而，只检测到微量的HBM相关化合物（m/z 1739.12 [M‒H] -, m/z 1753.13 [M‒H] -），并在重组菌株中积累了大量的低分子量代谢物[图2（b）]。在对该菌株（3C16/M1154）进行大规模发酵后，分离出了化合物3~6，并通过核磁共振[NMR；图2（c）、附录A中表S3~S7和图S2~S24]进行了结构鉴定。然而，HBMs的产量太低，无法分离鉴定。化合物3是以前在S. coelicolor M1154或M1152 中的异源表达skt基因簇的过程中发现的一个已知化合物[26]。化合物4和5的结构与streptoketide A和UWM5相似，除了在起始单元上有一个额外的碳延伸[26]。化合物6被鉴定为HMP-M1，首次在突变株BN-Y185的发酵液中分离得到[12]，可能与HBM B的生物合成相关。这一结果表明，hbm基因簇确实负责了HBMs的生物合成。此外，终产物和前体化合物6的低产量和化合物3~5的大量积累强烈暗示了一些来自异源宿主S. coelicolor M1154的非合成途径相关酶，可能在HBM生物合成途径的早期阶段驱使生物合成中间体进入了支路合成途径。

为了获得目标终产物，我们必须优化生物合成途径以显著提高HBMs的产量。我们注意到：①化合物3和4有一个共同的吡喃环基团，这个基团也存在于放线紫红素中[ACT；图3（a）]；②与化合物4结构高度相似的S2502和S2507是通过在S. lividans TK24中异源表达诺加霉素蒽醌苷元生物合成基因获得的[27]；③S. lividans TK24的基因组中act基因簇是激活的，所以具有产生蓝色色素放线紫红素的能力。这种能力归因于rpsL K88E突变的存在，其亲本菌株S. lividans TK66由于缺少此突变而无法产生放线紫红素[28]。因此，我们推测化合物3和4是由HBM和ACT生物合成途径组合而来的杂合化合物。在ACT生物合成中，已经证明ActIV作为双功能环化-硫酯酶，产生一个不结合酰基载体蛋白（ACP）的双环中间体。该中间体随后被一个专门的还原酶（RED1）还原，以在C3处建立(S)构型，如图3（a）所示[29]。经过还原后，产物形成半缩酮，随后脱水后产生ACT的单体前体[30]。考虑到化合物3、4和ACT中均存在吡喃环基团，我们推测ActIV和RED1可能“劫持”了HBM生物合成途径合成的初期前体作为底物，产生大量的杂合产物3和4 [图3（b）和（c）]，从而导致终产物产量很低。虽然S. coelicolor M1154基因组中大部分act基因簇（该基因组序列5 515 934~5 532 918 bp，共缺失16 985 bp）被敲除了，actVI-ORF1和actIV基因被偶然保留了下来。为了消除分流产物3和4，S. coelicolor M1154中act基因簇的保留区域（6246 bp），包含完整的actVIORFB、A、1、actIV、actVB基因和部分actVI-ORF2和actVII基因被完全敲除，从而使得act基因簇从菌株S. coelicolor M1156中被完全移除[S. coelicolor A3(2)基因组序列5 511 901~5 535 131 bp，共缺失23 231 bp]，如附录A中图S25所示。

我们随后将BAC 3C16通过属间接合转移导入S. coelicolor M1156中，并通过HPLC/ESI-MS对其产物谱进行分析。与预期一致，化合物3和4被完全消除，前体6和HBMs的新成员（1b/c）的产量大幅提高[图4（a）]。我们用自身启动子控制的actVI-ORF1基因对该突变株进行基因回补，重组菌株3C16/M1156::actVI-ORF1恢复了化合物3和4的产生。这些证据支持了我们的假设，并表明仅需actVI-ORF1基因就足以将HBM的生物合成途径转移到分流产物途径[图3（b）]。通过对S. coelicolor 3C16/M1156菌株进行大量发酵，我们分离得到新化合物1b/c，并通过NMR对其进行了结构鉴定[图4（b），附录A中的表S8、表S9和图S26~S39 ]。化合物1b/c在结构上与HBM B（1a）相似，除了3′-OMe或3′,3-OMe分别被-OEt基团取代。化合物VB1/2，也从S. coelicolor 3C16/M1156的培养液中分离出来，分别由1b/c通过在D和E芳香基团之间加成-消除反应形成醚桥，同时释放出一个乙醇分子[图4（b），附录A中的表S10、表S11和图S40~S53 ]。

细菌中不同次级代谢途径之间的交叉互通是一种常见现象。例如，hybrubins的合成涉及将截短的十一烷基灵菌红素（undecylprodigiosin）生物合成途径与异源的双吡咯四酸生物合成途径结合[31]。不同途径的组合生物合成通常是由于桥接这两条途径的关键酶具有一定的底物宽泛性。然而，关键合成酶的底物宽泛性也为组合生物合成提供了新的机会。通过利用糖基转移酶（GTs）的底物宽泛性，可以组合合成具有不同糖修饰的底物分子，从而改变分子的生物活性或水溶性。例如，通过在光神霉素生产菌S. argillaceus中异源过表达脱氧糖合成途径，可以获得具有改进活性的光神霉素类似物[32]。来自Beauveria bassiana的GT‒甲基转移酶（MT）生物合成模块表现出高底物宽容性，可以用于修饰广泛的类药物底物，包括聚酮类、蒽醌类、黄酮类和萘类化合物[33]。本研究中提到的还原酶RED1也表现出了一定的底物宽容性，因为异源表达多种II型聚酮BGC [如链酮（streptoketide）、HBM和诺加霉素（nogalamycin）]产生了结构相似的副产物。此外，化合物4结构类似于streptoketide A，只是起始单元多了一个额外的碳延伸，这表明RED1对起始单元的结构具有一定的耐受性。因此，通过异源表达不同起始单元的蒽环型II型聚酮骨架基因，有可能获得streptoketide A的类似物。

在hbm基因簇中，hbmD编码一个自由基S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）蛋白，该蛋白属于以KedN5为例的甲基钴胺素依赖的自由基SAM C-MTs家族。KedN5被认为在kedarcidin的生物合成过程中催化串联的C-甲基化反应来合成异丙氧基基团[34]。因此，我们推测3′位和3位乙基的形成是由Hbm D催化的。为了证明这一假设，我们对hbmD基因进行了同框敲除，以研究这种自由基SAM C-MT的体内功能（附录A中的图S54）。突变株S.coelicolor ΔhbmD/3C16/M1156无法生成1b/c。相反，它积累了一个红色的化合物（1a），其紫外（UV）吸收图谱与终产物相似[图5（a）]。液相色谱-质谱（LC-MS）分析结果显示其为HBM B（1a；m/z 1723 [M‒H] -；附录A中表S12和图S55~S59）。HBM B是从M. rosea subsp. hibaria TP-A0121发酵液中分离到的已知化合物。此外，在S. coelicolor 3C16/M1156菌株中也检测到少量的HBM B。我们通过属间接合转移将hbmD基因回补至ΔhbmD突变株中，恢复了化合物1b/c的产生[图5（a）]。这些体内结果支持Hbm D作为C-MT催化3′位和3位乙基的生物合成。令我们困惑的是，在原产菌株M. rosea subsp. hibaria TP-A0121的发酵液中并未检测到化合物1b/c。因此，目前尚不清楚为什么Hbm D在原产菌株中不起作用。我们检测了M. rosea subsp. hibaria TP-A0121中hbmD基因的转录，结果表明hbmD正常转录[图5（b）]。因此，我们推测Hbm D蛋白可能缺乏钴胺素辅因子，而这是B类家族自由基SAM蛋白行使功能所必需的。

为了验证这一假设，我们首先向M. rosea subsp. hibaria TP-A0121发酵液中喂养羟基钴胺素。喂养后，我们成功检测到化合物1b和HBM C和HBM D的3′-乙基取代衍生物的产生，命名为HBM C′和D′ [图5（c）和（d）]。然而，我们没有检测到3′,3-OEt取代产物1c的产生。因此，我们认为M. rosea subsp. hibaria TP-A0121菌株可通过辅因子的交叉喂养从微生物群落中获得钴胺素[35]。也就是说，在其自然培养环境下，原产菌株TP-A0121可能通过微生物群落的相互作用获得钴胺素。由于钴胺素只由某些细菌和古细菌[36]合成，而大多数基于植物的培养基中含有的钴胺素可以忽略不计。原始菌株的发酵培养基包含2%的棉籽粉和4%的甘露糖，而棉籽粉培养基中是缺乏钴胺素的。由于酵母提取物中含有较高含量的包括钴胺素在内的B族维生素，因此通过在发酵培养基中添加酵母提取物可能会促进HBM乙基衍生物的合成。这种方法值得进一步的研究尝试。

在获得了几种新的HBM同系物后，我们对其抑制肿瘤细胞的潜力进行了测试。为了评估糖基对抗肿瘤活性的影响，我们通过在1.5 N HCl-MeOH（100 μg∙mL-1）中进行酸催化的甲醇水解[11]，水解1a/b的糖基基团后得到其糖基配苷部分2a/b（附录A中表S12~S15和图S60~ S69）。化合物对多种癌细胞系的抗肿瘤活性总结在表2中。在这些化合物中，1c在大多数情况下表现出最佳的抗肿瘤活性，但对SKMel-28细胞除外。VB2在SKMel-28细胞中的抑制活性略高于1c，但1c可以在pH 7.5或加热条件下迅速转化为VB2。值得注意的是，糖基似乎对A375细胞的生物活性非常重要，而1-OH和3′-OMe基团似乎对B16-F10细胞的生物活性至关重要。

考虑到异源生物合成体系中独特的二乙基衍生物1c具有更好的活性，我们希望提高最终产物1b/c的产量。hbm基因簇包含一个转录调控基因hbmRg2，其编码一个AfsR/链霉菌抗生素调控蛋白（SARP）家族转录激活因子。它通常作为一种途径特异性激活因子，直接影响抗生素合成的特定的BGC的转录[37]。因此，我们通过Red/ET重组方法将一个强启动子kasOp * [22]直接放置在BAC 3C16中hbmRg2的上游，构建OERg2-3C16，然后将其导入S. coelicolor M1156中，得到OERg2-3C16/M1156突变株。最近，在thioangucycline生物合成中，编码丙二酰辅酶A（CoA）脱羧酶同源物的单一tacP基因的缺失导致最终产物的产量提高[38]。在hbm基因簇中，hbmRg2基因位于最小PKS基因hbmA1-A3的上游和hbmP1的下游，而hbmP1编码一个丙酰辅酶羧化酶β亚基。然而，敲除hbmP1并不能提高HBMs的产量（附录A中的图S70）。接下来，我们用Red/ET重组方法将hbmP1替换为位于hbmRg2上游约973 bp的kasOp *启动子，构建了另一个过表达hbmRg2的质粒，命名为OERg2 *-3C16。然后将OERg2 *- 3C16导入S. coelicolor M1156中，得到OERg2 *-3C16/M1156突变株。这两种过表达hbmRg2的突变株的1b/c产量均高于S. coelicolor 3C16/M1156（图6），1b在摇瓶中的产量提高了约2倍，达到约30 mg∙L-1。

在建立了优化的异源表达体系后，我们发现编码黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖的单加氧酶的两个基因hbmO6和hbmO8，这两个基因编码的单加氧酶在光神霉素生物合成中没有同源蛋白，所以将其同框敲除来初步探索HBM的后期氧化修饰步骤。ΔhbmO6突变株积累了一个新的化合物12 [图7（a）]，具有与HBM B相同的2,2′-偶联位置的同源二聚体结构[图7（b），附录A中的表S16和图S71~S77 ]。这一发现表明，苯酚偶联转化发生在先前已知的中间体HMP-Y1 [14a，图3（c）]的生成之前。ΔhbmO8突变体积累化合物15b，15b与HMP-Y6（15a）相似，除了在C3′-OH处是乙基基团（图7，附录A中的表S17和图S78~S84）。依赖于FAD的单加氧酶HBM O8可能催化从HMP-Y1（14a）到hibarimicinone（2）的第一次氧化反应[图3（c）]。化合物1b/c具有独特的3′-乙基或3′,3-二乙基结构，使其比HBM B具有更好的抗肿瘤活性（表2）。然而，目前尚不清楚HBM D的真实底物是什么，因为在ΔhbmO8突变株的发酵液中积累了丰富的化合物15b，它也具有C3′-乙基结构[图7（a）]。HBM D可能能够催化HMP-Y1形成14b，然后糖基化生成化合物15b，也有可能HBM D在C3′-OMe基团形成后立即催化乙基的形成[图3（c）]。我们后续需要对HBM D进行进一步的体外酶反应或生物转化研究来解决这个问题。

基于对hbm基因簇的生物信息学分析和对突变体中积累的中间体的结构阐明，我们推测了该II型聚酮化合物在异源底盘宿主中的生物合成途径[图3（c）]。化合物1a/b/c的生物合成始于9个丙二酸盐的缩合以及C4起始单元的引入，形成22碳的β-聚酮链。接下来，HBM C5区域选择性地还原骨架上的C9，然后进行连续的环化。环化可能是由HBM C4起始，HBM C4与推测负责SF2575生物合成中第一环环化的SsfY1高度相似[39]。HBM C4催化第一环环化后生成7。化合物7中间体可以进行自发的非酶环化，或被一种未知的蛋白催化形成不与ACP连接的化合物8，化合物8可以被RED1还原C3位的羰基形成9。9中的半缩醛形成后生成中间体10，10通过氧化C-C键断裂产生streptoketide C（3）。另外，10也可以通过脱水加环化/脱水产生4。HBM C2与环化酶MtmY有71%的相似性，被预测为第二环和第三环环化酶。HBM P是ATP依赖的酰基辅酶A连接酶家族的成员，我们推测与环化酶HBM C6一起负责第四个环的形成。线性的四环芳香族化合物11经过多个氧化还原步骤形成HMP-M1（6）。根据ΔhbmO6突变体积累的化合物12的结构，我们推测HMP-M1（6）需要经历复杂的重排和苯酚偶联步骤来形成化合物12。hbmO6基因编码一个FAD依赖的单加氧酶HBM O6，它可能与另一个MT一起，催化芳香环C3和C3′的羟基化和O-甲基化从而形成13。此外，HBM O7和另一个O-MT催化D和E环在C4和C-4′处的羟基化和O-甲基化，形成已证明的中间体HMP-Y1（14a）。hbm基因簇编码三个MTs。HBM M1与CmmMII的相似度为66%，CmmMII与C-MT MtmMII更相似。Hbm M2和Hbm M3与O-MTs有很强的相似性，可能负责C-3,3′和C-4,4′羟基的甲基化。HBM D可能催化HMP-Y1或化合物13在C-3′O-Me基团处进一步的C-甲基化。氧化酶HBM O8和其他未知蛋白催化接下来的氧化反应生成化合物2a/b/c。最后，对化合物2a/b/c进行糖基化修饰，得到最终产物1a/b/c。

4 结论

综上所述，通过M. rosea subsp. hibaria TP-A0121基因组文库中阳性BAC克隆的异源表达，我们鉴定了HBMs的完整生物合成基因簇。此外，我们通过敲除残余的ACT生物合成基因，构建了一个背景优化的宿主S. coelicolor M1156，S. coelicolor M1156可作为II型聚酮异源生物合成的宿主。此外，我们发现自由基SAM蛋白HBM D负责3位和3′位的乙基衍生化，形成具有增强抗肿瘤活性的化合物1b/c。总的来说，这项工作为进一步研究HBMs的生物合成铺平了道路，包括研究伪二聚反应和苷元氧化的酶促反应，同样也为组合生物合成更多有效的类似物用于药物发现和开发提供借鉴。

Authors’ contribution

Xiangyang Liu: conducted the majority of the experiments, analyzed the majority of the data, and wrote the manuscript; Fei-Peng Zhao: constructed some of the mutants; Tian Tian: conducted the biochemical experiment; Wei-Chen Wang and Xian-Feng Hou: isolated some of the compounds; Zaizhou Liu and Jing Wang: performed the biological activity assay; Qiang Zhou: conducted the genetic assay; Wenli Guo and Shuangjun Lin: provided the promoter and plasmid; Yasuhiro Igarashi: provided the strain and sequenced the genome; Gong-Li Tang: designed the project, analyzed the data, and wrote the manuscript.

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