力学性能增强的聚乙烯醇/丙烯酰胺水凝胶通过旁分泌作用调节免疫和血管化过程以促进皮肤缺损的修复

工程（英文） ›› 2024, Vol. 37 ›› Issue (6) : 151 -165. DOI: 10.1016/j.eng.2024.02.005

研究论文

王鹏 ^a^,^b^,^c ,
钱丽萍 ^d ,
梁绘昕 ^a^,^b^,^c ,
黄剑浩 ^b^,^c ,
金晶 ^a ,
谢春梅 ^e ,
薛斌 ^f ,
赖建诚 ^g ,
张祎博 ^a ,
蒋利锋 ^h^,^* ,
李澜 ^a^,^b^,^c^,^* ,
蒋青 ^a^,^b^,^c^,^*

作者信息 +

A Polyvinyl Alcohol/Acrylamide Hydrogel with Enhanced Mechanical Properties Promotes Full-Thickness Skin Defect Healing by Regulating Immunomodulation and Angiogenesis Through Paracrine Secretion

Peng Wang ^a^,^b^,^c^,^# ,
Liping Qian ^d^,^# ,
Huixin Liang ^a^,^b^,^c^,^# ,
Jianhao Huang ^b^,^c^,^# ,
Jing Jin ^a ,
Chunmei Xie ^e ,
Bin Xue ^f ,
Jiancheng Lai ^g ,
Yibo Zhang ^a ,
Lifeng Jiang ^h^,^* ,
Lan Li ^a^,^b^,^c^,^* ,
Qing Jiang ^a^,^b^,^c^,^*

Author information +

^aState Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Division of Sports Medicine and Adult Reconstructive Surgery, Department of Orthopedic Surgery, Nanjing Drum Tower Hospital, The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing University, Nanjing 210008, China

^bJiangsu Engineering Research Center for 3D Bioprinting, Nanjing 210008, China

^cInstitute of Medical 3D Printing, Nanjing University, Nanjing 210093, China

^dCentre for Experimental Animals, Nanjing Drum Tower Hospital, The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing University, Nanjing 210008, China

^eCollege of Aeroplane Engineering, Nanjing University of Aeronautics and Astronautics, Nanjing 210016, China

^fNational Laboratory of Solid State Microstructures, Department of Physics, Nanjing University, Nanjing 210093, China

^gDepartment of Chemical Engineering, Stanford University, Stanford, CA 94305, USA

^hDepartment of Orthopedic Surgery, The Second Affiliated Hospital Zhejiang University School of Medicine, Orthopedic Research Institute of Zhejiang University, Key Laboratory of Motor System Disease Research and Precision Therapy of Zhejiang Province, Hangzhou 310009, China

E⁃mail addresses: jianglifeng@zju.edu.cn (L. Jiang),

E⁃mail addresses: lanl17@163.com (L. Li),

E⁃mail addresses: qingj@nju.edu.cn (Q. Jiang).

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Received	Accepted	Published
2023-09-13	2024-02-18
Issue Date
2024-06-01

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摘要

水凝胶构建的组织工程皮肤因其具备再生完整皮肤结构和功能的潜力，受到了越来越多的关注。然而，水凝胶支架的力学性能与天然皮肤存在显著差异。因此，我们开发了一种聚乙烯醇（PVA）/丙烯酰胺互穿网络（IPN）水凝胶，并使用聚多巴胺（PDA）对其进行表面修饰，命名为Dopa-gel。Dopa-gel不仅表现出与天然皮肤组织相似的力学特性，还具有出色的旁分泌调节性能。此外，该水凝胶可通过三维打印制备具有抗拉伸性能的皮肤修复支架。实验结果表明，相互渗透的PVA、海藻酸盐和聚丙烯酰胺网络显著提升了水凝胶的力学性能。经PDA表面修饰后，水凝胶能促进细胞分泌免疫调节因子和促血管生成因子。在体内模型中，Dopa-gel可加速皮肤伤口愈合，增加组织血管化，并促进伤口区域巨噬细胞从M1促炎表型向M2促愈合和抗炎表型转化。Dopa-gel可能通过黏着斑激酶（FAK）/细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路增强细胞旁分泌，促进皮肤缺损的愈合。此外，在拉伸应力条件下，Dopa-gel可通过Rho相关激酶-2（ROCK-2）/血管内皮生长因子（VEGF）信号通路旁分泌促血管生成因子。综上所述，Dopa-gel具备与天然皮肤组织相似的力学性能，同时兼具免疫调节和血管生成特性，是一种极具前景的皮肤组织再生支架。

Abstract

Hydrogel- based tissue-engineered skin has attracted increased attention due to its potential to restore the structural integrity and functionality of skin. However, the mechanical properties of hydrogel scaffolds and natural skin are substantially different. Here, we developed a polyvinyl alcohol (PVA)/acrylamide based interpenetrating network (IPN) hydrogel that was surface modified with polydopamine (PDA) and termed Dopa-gel. The Dopa-gel exhibited mechanical properties similar to native skin tissue and a superior ability to modulate paracrine functions. Furthermore, a tough scaffold with tensile resistance was fabricated using this hydrogel by three-dimensional printing. The results showed that the interpenetration of PVA, alginate, and polyacrylamide networks notably enhanced the mechanical properties of the hydrogel. Surface modification with PDA endowed the hydrogels with increased secretion of immunomodulatory and proangiogenic factors. In an in vivo model, Dopa-gel treatment accelerated wound closure, increased vascularization, and promoted a shift in macrophages from a proinflammatory M1 phenotype to a prohealing and anti-inflammatory M2 phenotype within the wound area. Mechanistically, the focal adhesion kinase (FAK)/extracellular signal-related kinase (ERK) signaling pathway may mediate the promotion of skin defect healing by increasing paracrine secretion via the Dopa-gel. Additionally, proangiogenic factors can be induced through Rho-associated kinase-2 (ROCK-2)/vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated paracrine secretion under tensile stress conditions. Taken together, these findings suggest that the multifunctional Dopa-gel, which has good mechanical properties similar to those of native skin tissue and enhanced immunomodulatory and angiogenic properties, is a promising scaffold for skin tissue regeneration.

关键词

聚乙烯醇/丙烯酰胺水凝胶 / 力学性能增强 / 旁分泌效应 / 皮肤再生 / 信号通路

Key words

Polyvinyl alcohol/acrylamide hydrogel / Mechanical property enhancement / Paracrine effect / Skin regeneration / Signaling pathways

引用本文

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王鹏,钱丽萍,梁绘昕,黄剑浩,金晶,谢春梅,薛斌,赖建诚,张祎博,蒋利锋,李澜,蒋青. 力学性能增强的聚乙烯醇/丙烯酰胺水凝胶通过旁分泌作用调节免疫和血管化过程以促进皮肤缺损的修复[J]. 工程（英文）, 2024, 37(6): 151-165 DOI:10.1016/j.eng.2024.02.005

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1 引言

烧伤、慢性伤口和手术切口等因素导致的皮肤损伤后，再生完整皮肤的结构和功能是当前研究的一个主要挑战[1]。目前，标准的皮肤修复方法是自体皮肤移植，这是一种利用患者自身皮肤修复受损皮肤的方法[2]。然而这种方法存在一些局限性，例如健康供体部位有限，供体部位发病率较高，以及存在移植物失效和手术并发症等风险[3‒4]。因此，修复受损皮肤组织和恢复皮肤屏障功能的皮肤组织工程（STE）的研究变得尤为迫切。近年来，随着STE的进步，研究人员通过开发人工皮肤替代品和再生疗法来应对这些问题[5‒7]。例如，水凝胶、胶原蛋白、可生物降解聚合物、天然纤维素和脱细胞真皮基质等各种材料已被用于制造人造皮肤，以模仿天然皮肤组织的结构和功能[8‒10]。其中，具有三维（3D）亲水聚合物网络的水凝胶因其高吸水能力、优异的生物相容性和生物降解性而备受关注。这些特性使得水凝胶能够模拟天然软组织的细胞外基质（ECM）[11]。此外，水凝胶还可以有效地创造湿润环境，提供保护屏障，促进细胞迁移和增殖，并负载治疗药物，使其成为促进皮肤伤口愈合领域的一种有效材料[12]。然而，水凝胶在力学性能上与天然皮肤存在显著差异，如何解决这一问题并提高STE水凝胶的力学性能仍然是当前研究的主要挑战。

水凝胶的力学特性是影响其功能和天然皮肤组织再生效果的关键因素之一[13]。如果水凝胶支架与邻近皮肤之间的力学性能差异过大，会阻碍再生皮肤组织的整合和功能恢复，限制其运动和形变，并对再生组织的整体功能和外观形态产生不利影响。此外，水凝胶的力学特性还可能影响细胞的行为和功能。天然皮肤中的细胞处于特定的力学环境（如刚度、弹性和应力分布），如果水凝胶的力学性能与天然组织差异过大，可能会影响细胞黏附、迁移、增殖和分化，并影响水凝胶支架与周围组织的整合，最终影响再生皮肤组织的质量和功能[14]。为了应对这些挑战，研究人员深入研究了具有良好力学性能的水凝胶，使用具有适当刚度、弹性和黏弹性行为的工程水凝胶模拟天然皮肤的动态力学特征与力学性能[15]。为了提高水凝胶基皮肤支架的力学性能，研究人员广泛探索并采用了多种方法，如加入增强材料、调节交联密度或设计复合结构等[16]。通过构建互穿网络（IPN）水凝胶优化其力学性能，IPN水凝胶具有多种聚合物网络衍生的综合力学性能，通过调整聚合物的比例、分子量、交联密度和加工条件，可以调节这些材料的力学性能[17]。通过精心设计IPN的组成和结构，可以构建特定力学性能的水凝胶，以满足各种应用的需求。我们在之前的研究基础上，证明了由自组装多肽超分子网络和共价聚合物网络组成的超分子-高分子IPN水凝胶具有优异的力学性能，并被用于评估软骨再生[18]。

除了力学性能外，其他一些生物学特性（如抗炎和促血管生成特性）对于皮肤伤口愈合加速、功能恢复和长期存活也至关重要。研究人员为了获得更好的抗炎和血管生成效果，进行了多种尝试，包括：①负载抗炎药物或生长因子和细胞因子；②使用特定官能团或生物活性物质（如肽或多糖）进行表面功能化；③将生物活性物质制备成纳米颗粒并使用纳米技术将其悬浮在水凝胶中，增加其表面积和生物活性；④利用组织工程原理将细胞与水凝胶结合，制成具有生物活性的支架[19]。这些方法可以使水凝胶皮肤支架具有更好的抗炎和血管生成作用，但也存在价格高昂、预处理复杂等缺点。最近的一项研究表明，使用聚多巴胺（PDA）对支架进行表面修饰，可以方便快捷地赋予支架优异的生物相容性和黏附能力[20]。此外，PDA已被用作皮肤修复支架的表面改性剂，以增强其生物学功能[21]。例如，将间充质干细胞（MSCs）接种到PDA包被的生物材料表面时，可以观察到其旁分泌活性增加，如营养因子分泌、免疫调节以及细胞存活率与增殖率的提高[22]。Li等[23]报道，在贻贝启发的纳米结构上培养的脂肪间充质干细胞（AD-MSCs）分泌的蛋白质，在体外可增加免疫调节因子和促血管生成因子的表达和功能，并有望用于治疗糖尿病皮肤创面。

当前，研究人员在研究生物3D打印技术方面取得了显著进展，能够精确控制水凝胶支架的结构和组成，使其具有可调的力学性能，如弹性、刚度和孔隙率，并与天然皮肤组织相匹配[24]。此外，3D打印支架在皮肤再生过程中增强了生物功能，这些多孔支架创造了一个3D微环境，研究发现孔径在20~500 μm之间的支架能够促进细胞迁移和向内生长[25]。支架的结构特征也会影响血管生成，生物支架通过加入富血小板血浆[26]、AD-MSCs [27]和多组分生物墨水[28]，可显著提高再生皮肤组织的上皮化率。此外，预先在支架内部设计血管状通道可促进血管化过程，而3D打印制备的精确微结构与天然人体皮肤的微结构非常相似[29]。将正常人表皮角质形成细胞/人真皮微血管内皮细胞[30]或内皮祖细胞/AD-MSCs [31]加入生物墨水可进一步促进血管化。毛囊样结构是真皮和皮下组织的组成部分，3D打印技术在制备毛囊样结构方面的优势在于通过在不同层面中交替打印多种细胞类型，可在支架中模拟真皮/表皮的微观结构[32]。因此，3D打印支架通过改变结构和生物墨水成分，在加速伤口愈合和调控细胞功能方面显示出良好的潜力。此外，PDA表面修饰可增加MSCs的旁分泌，使生物3D打印水凝胶皮肤修复支架具有调节免疫和促进血管生成的特性。

本研究制备了PDA改性聚乙烯醇（PVA）基IPN水凝胶（Dopa-gel），并将其作为生物墨水用于生物3D打印，以构建皮肤修复支架。我们系统地表征了Dopa-gel的形貌和力学性能，并通过分析细胞活力、细胞骨架及血管生成相关基因的表达，进一步评估其生物性能。利用大鼠皮肤创面愈合模型，分析了Dopa-gel对创面闭合、血管化和巨噬细胞极化的影响，以评估其皮肤修复效果。此外，我们还评估了PDA修饰对Dopa-gel调节旁分泌行为的影响，如促血管生成因子和抗炎因子的产生，进一步研究了Dopa-gel介导的旁分泌信号通路。我们认为，Dopa-gel具有与天然皮肤组织相似的力学特性，并且增强了旁分泌信号诱导的免疫调节和血管生成特性，有望成为一种潜在的皮肤组织再生修复支架（图1）。

2 材料和方法

2.1 材料

双丙烯酰胺、丙烯酰胺、海藻酸盐、过硫酸铵、PVA、多巴胺、CaCl₂、NaOH购自中国阿拉丁试剂（上海）有限公司。大鼠肌腱成纤维细胞系CP-R237购自武汉普诺赛生命科技有限公司。小鼠巨噬细胞系RAW264.7和AD-MSCs来源于中国科学院上海生命科学研究院。L929细胞系由南京工业大学毛宏理教授、顾忠伟教授提供。使用净水系统（UNIQUE-R10；厦门锐思捷水纯化技术有限公司）制备去离子水。

2.2 Dopa-gel的制备

双丙烯酰胺（50 mg·mL^-1）、丙烯酰胺（225 mg·mL^-1）和过硫酸铵（6 mg·mL^-1）溶解在5% w/V的PVA溶液中，然后加入海藻酸盐（6% w/V），以制备生物3D打印油墨。使用Bio-Architect^® WS 3D打印机（Regenovo Biotechnology Co. Ltd，中国）制备生物3D打印支架。在打印过程中，生物打印支架在365 nm紫外光下进行光聚合。将制备好的支架置于CaCl₂溶液（80 mmol·L^-1）中浸泡10 min。用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）洗涤三次后，用NaOH溶液（6 mol·L^-1）处理20 min，然后再用PBS洗涤三次。随后将支架冷冻（-80 ℃处理1 h）和解冻（室温6 h）进行10个循环。随后进行多巴胺表面改性，将制备好的支架在含多巴胺（2 mg·mL^-1）的2-吗啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulphonic acid, MES）缓冲液中浸泡40 min，PBS洗涤三次后，在4 ℃保存待用。对照组水凝胶（Gel）不进行PVA碱化和冻融处理。

2.3 Dopa-gel的表征

使用场发射扫描电镜（field-emission scanning electron microscope，FESEM；蔡司Supra 40 Gemini，德国）观察生物3D打印支架的微观形貌。根据光学显微镜（IMT-2；奥林巴斯，日本）观察到的图像计算打印分辨率。使用配备2 kN传感器的Instron-5944万能试验机在室温下测试Gel和Dopa-gel（长度：20 mm，宽度：8 mm，厚度：2 mm）的拉伸力学性能。拉伸裂纹和拉伸松弛循环试验的拉伸速率设为2 mm·min^-1。在应力松弛试验中，每个拉伸过程的应变设为10%，重复试验5次。以相同尺寸的大鼠皮肤为对照，进行拉伸和力学性能分析。使用HAAKE MARS流变仪系统（Thermo Fisher Scientific, USA）评估Gel和Dopa-gel（直径：8 mm，厚度：2 mm）的流变特性。对于频率扫描实验，在1%应变下，频率设置为10~50 rad·s^-1。对于应变扫描实验，应变设置为5%~30%，频率为6.28 rad·s^-1。恢复实验以0.1%应变和6.28 rad·s^-1频率持续300 s。随后以300%应变和100 Hz频率破坏凝胶60 s，然后立即切换到0.1%应变和6.28 rad·s^-1，以测量300 s的力学性能恢复情况，记录储能模量（G′）和损耗模量（G″）。所有流变学测量的温度设置为20 ℃。

2.4 细胞实验

细胞培养。将来源于大鼠肌腱的CP-R237细胞系在添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，在37 ℃、5% CO₂条件下培养。

细胞毒性试验。将Gel和Dopa-gel裁剪成圆柱体（直径：8 mm，厚度：2 mm），使用PBS清洗三次并在紫外线下消毒24 h以上。随后将样品放置在24孔板中，CP-R237细胞种植于Gel表面，分别培养1天、3天和7天。将100 μL培养基移植到96孔板中，随后添加10 μL的CCK-8反应液并反应1 h，根据微孔板读取器上450 nm处的光密度（OD₄₅₀）计算细胞存活率。对于活/死染色，CP-R237细胞用PBS洗涤三次，并用钙黄素-AM和碘化丙啶（PI）染色45 min，随后使用激光扫描共聚焦显微镜（141 FV3000；奥林巴斯，日本）进行观察。

细胞黏附。按上述方法对样品进行裁剪和灭菌后，将CP-R237细胞悬液加到样品表面。培养7天后，细胞用多聚甲醛固定10 min，并用0.1% Triton X-100处理，PBS洗涤三次后，用Phalloidin和4',6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；ab104139；Abcam，美国）染色。染色后的细胞用激光扫描共聚焦显微镜观察。

定量实时聚合酶链反应（qPCR）。CPR237细胞在样品表面培养7天后，使用RNA快速纯化试剂盒提取总RNA，然后使用HiScript IIQ RT SuperMix进行反转录成互补DNA（cDNA）。随后，使用7300实时PCR系统（Applied Biosystems，美国）进行qPCR分析。纤维生成相关引物包括纤连蛋白（FN）、Decorin（DCN）、III型胶原蛋白（COL3）、I型胶原蛋白（COL1）；血管生成相关引物包括血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）、肝细胞生长因子（HGF）、血管生成素-1（ANG-1）；炎症相关引物包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素1受体拮抗剂（IL-1ra）、白细胞介素-10（IL-10），以及精氨酸酶1（ARG-1），上述引物在附录A中表S1至表S3列示。所有数据使用2^-ΔΔCT法归一化至内部参考。

Western blot分析。CP-R237细胞在样品表面培养7天后，按照前述方法收集并提取蛋白质进行Western blotting[18]。首先使用特异性一抗处理，随后使用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗进行孵育。最后，使用增强化学发光（ECL）和Western blotting检测系统检测目标蛋白质的表达水平。

旁分泌评估。使用AD-MSCs进行旁分泌评估。简要来说，将AD-MSCs接种在定制的样品表面并培养24 h。随后，用PBS洗涤细胞三次，并将其加入无血清培养基中培养24 h。使用qPCR分析AD-MSCs中血管生成相关基因的表达，包括VEGF、BFGF、HGF和ANG-1。收集上清液，根据制造商的说明使用酶联免疫吸附法（ELISAs）检测免疫调节因子，包括IL-1ra、转化生长因子β（TGF-β）和前列腺素E2（PGE-2）。用上述上清液培养RAW264.7细胞，然后提取总RNA。通过qPCR检测PGE-2、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、IL-1ra和TGF-β的信使RNA（mRNA）表达。为了进一步分析Dopa-gel处理对巨噬细胞旁分泌行为的影响，使用脂多糖（LPS, 500 μg·mL^-1）处理RAW264.7细胞1 h，然后在5种条件下培养8 h：空白组（纯培养基）、NS组（培养基+生理盐水）、非Gel组（培养基+培养皿培养的AD-MSCs上清液）、Gel组（培养基+gel表面培养的AD-MSCs上清液）、Dopa-gel组（培养基+Dopa-gel表面培养的AD-MSCs上清液）。通过qPCR检测促炎基因（TNF-α、IL-1β、IL-6）和抗炎基因（IL-1ra、IL-10、ARG-1）的表达。随后，使用诱导型一氧化氮合酶（iNOS，M1巨噬细胞标志物）和分化簇206（CD206，M2巨噬细胞标志物）对细胞进行染色，并使用半定量方法检测CD206⁺细胞和iNOS⁺细胞的强度。对α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）进行免疫荧光染色，用PBS洗涤两次后，用4%多聚甲醛固定30 min。随后，根据制造商的说明对细胞进行α-SMA免疫荧光染色，使用含DAPI的载片进行细胞核可视化，最终在荧光显微镜下观察染色后的细胞。

为进一步研究拉伸应力与旁分泌活性之间的关系，我们对L929细胞系进行了循环拉伸应变试验。L929细胞是一种源于小鼠皮下组织的成纤维细胞系。首先，将L929细胞接种到Gel和Dopa-gel表面上，培养24 h。其次，用PBS洗涤细胞三次，分为两组。第一组称为静态组（空白、Gel和Dopa-gel），在无血清培养基中在培养箱中进一步培养24 h；第二组称为循环拉伸应变组（Gel-tension和Dopa-gel-tension），在Flexcell-5000系统（Flexcell，美国）中使用无血清培养基进行循环拉伸应变，频率为1 Hz，振幅为7%，持续24 h [33]。为评估拉应力对旁分泌功能的影响，我们收集了两组的上清液，并按照制造商的说明进行ELISA检测VEGF和IL-10的水平。再次，我们使用qPCR评估了Rho相关激酶-1（ROCK-1）、ROCK-2和缺氧诱导因子-1α（Hif-1α）的表达水平（引物见附录A中的表S4）。最后，通过Western blot分析评估ROCK-1、ROCK-2、VEGF和Hif-1α的蛋白表达水平。

2.5 体内研究

雄性Sprague-Dawley大鼠18只，体重250 g，来源于南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物中心。本研究所有实验方案均已经过南京大学医学院附属鼓楼医院伦理委员会的批准。在动物背部制作10 mm × 10 mm全层皮肤缺损，用于评估皮肤再生。将18只大鼠随机分为3组（每组6只）：空白组（未植入支架的全层缺损）、Gel组（植入gel支架的全层缺损）和Dopa-gel组（植入Dopa-gel支架的全层缺损）。分别在第0、7、14天采集创面图像，并使用ImageJ软件对创面区域进行分析。治疗14天后处死大鼠，评估创面周围组织的皮肤再生情况。

组织学分析及免疫荧光染色方面，采集的组织用多聚甲醛固定1天，随后包埋在聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）中。将包埋的组织切成30 μm厚的切片，进行苏木精和伊红（H&E）染色、Masson染色以及α-SMA免疫组织化学染色。使用改良的Vancouver疤痕量表和伤口愈合评分来评估体内疤痕的形成（详见附录A中的表S5）[34,35]。利用CD31和α-SMA免疫荧光染色评估血管生成，使用CD68和CD206免疫荧光染色评估巨噬细胞极化。最后，使用装配有CCD相机的显微镜（Olympus）观察染色切片。

2.6 统计学分析

使用单因素方差分析（ANOVA）确定组间差异，随后使用Tukey事后分析。P < 0.05为有统计学意义。使用SPSS 19软件（IBM, USA）进行统计分析。

3 结果和讨论

3.1 Dopa-gel的设计、制备和表征

IPN水凝胶因其双网络（DN）或三网络（tTN）结构，在刚度和韧性方面表现出优异性能，广泛应用于组织再生工程中。这些水凝胶中，脆性和刚性的网络容易破裂而耗散能量；柔软且延展的网络则增强了水凝胶的拉伸性能[36]。为了制备具有力学性能类似皮肤组织的优质水凝胶，我们设计了由三个网络组成的TN水凝胶[图2（a）]：①丙烯酰胺单体和双丙烯酰胺作为共价交联剂，在过硫酸铵（APS）作为引发剂的条件下，通过自由基聚合构建交联聚合物网络[37]；②离子交联网络，CaCl₂与海藻酸盐聚合物形成离子键，构成Ca²⁺海藻酸盐离子网络，进一步提升了水凝胶的力学性能[38]；③冻融后的PVA在-80 ℃形成冰晶，然后在25 ℃下使PVA链结晶，形成交联聚合物网络，进一步增强了水凝胶的韧性[39]。先前的研究表明，通过PDA的表面修饰可以增强生物材料的表面粗糙度和亲水性，促进细胞增殖、分化以及MSCs的旁分泌功能[40,41]。我们利用PDA对制备的TN水凝胶进行表面改性，并通过扫描电镜（SEM）观察其微观结构。如图2（b）所示，Dopa-gel表面可见均匀的纳米层，而Gel表面则显示光滑和裂纹的微观结构（附录A中的图S1）。元素映射图像[附录A中的图S2（a）]和相应元素组成的半定量测定（附录A中的表S6）显示，C、O、N、Na和S均匀分布在Gel和Dopa-gel中。其中Dopa-gel中的S含量明显高于Gel，这可能归因于PDA的表面修饰[附录A中的图S2（b）]。此外，Dopa-gel可以支撑其自重75倍的重物至少10秒，然后迅速恢复到原始状态，表现出优异的变形能力和抗拉伸性能[图2（c）]。相反，普通Gel在拉伸到175%时发生断裂，显示其拉伸性能相对较差[附录A中的图S3（a）]。由于3D生物打印技术的设计特性，这种水凝胶可以作为生物墨水用于组织再生。光学显微镜下观察的Dopa-gel支架的数字模型和3D生物打印图像如附录A中的图S3（b）所示。3D打印的晶格结构其复杂细节的精度非常高。将数字模型与3D生物打印支架进行定量比较，如图A中的图S3（c）所示，显示其轮廓尺寸、大孔尺寸和小孔尺寸无显著差异，表明打印精度很高。此外，我们还制备了结构更复杂的生物3D打印支架[附录A中的图S3（d）]。

3.2 Dopa-gel的力学行为

支架应当具有与天然皮肤组织相近的力学性能，以有助于促进皮肤再生。据报道，生物材料的拉伸特性在调节生物细胞的纤维化中起关键作用[42]。机械拉伸作为一种动态刺激，影响细胞的形态和排列，与细胞的纤维化密切相关[43,44]。嵌入生物材料的细胞表现出良好的拉伸特性，可能会增加增殖、迁移和ECM重塑等行为，从而诱导细胞的纤维化。因此，我们首先使用流变仪进行了频率扫描试验[附录A中的图S4（a）]和应变扫描试验[附录A中的图S4（b）]，评估水凝胶样品的动态力学性能。我们发现制备的水凝胶的储能模量（G′）超过了它们的损耗模量（G″），表现出类似固体的行为。在恢复测试中[附录A中的图S4（c）]，Gel和Dopa-gel在高应变（300%）断裂和迅速恢复到低应变（0.1%）循环中表现出完全和快速的恢复。为了进一步评估大鼠皮肤、Gel和Dopa-gel的力学行为，我们进行了拉伸应力-应变测试和拉伸-松弛测试。与大多数快速凝胶化生物墨水不同，我们的生物墨水表现出良好的力学稳定性。应力应变曲线如图3（a）所示。大鼠皮肤组织的拉伸模量[(11.65 ± 1.61) kPa]和韧性[(376.05 ± 29.58) kJ·m^-3]显示出最大的断裂强度和断裂伸长率。然而，Dopa-gel显示出比Gel更大的拉伸模量[(2.19 ± 0.23) kPa]和韧性[(13.01 ± 1.52) kJ∙m^-3]，如图3（b）和（c）及表1所示，表明Dopa-gel作为皮肤再生支架的潜力。我们进行了不间断的拉伸-松弛循环测试（20个周期，周期间无间隔）。从图3（d）和（e）可以看出，大鼠皮肤具有最高的拉伸极限和能量耗散，而Dopa-gel的拉伸极限和能量耗散优于Gel。拉伸-松弛循环的原始曲线如图S4（d）所示，样品的能量耗散量和回收率如图3（f）所示。Dopa-gel的恢复率最高，循环20次后能量耗散量降至39.24%，恢复率保持在98.50%以上，这些数值大于大鼠皮肤和Gel的数值。此外，应力松弛曲线如图3（g）所示，显示了在Gel、Dopa-gel和大鼠皮肤中观察到的应力松弛行为[图3（g），插图]。第一至第四拉伸-松弛曲线的局部放大图如附录A中的图S4（e）所示。图3（h）显示了上述三种样品在不同应变下的特征松弛时间尺度，可以看出Dopa-gel中的松弛时间较Gel中的松弛时间有所减少。Dopa-gel的韧性和恢复能力与大鼠皮肤的韧性和恢复能力非常相似，这可能是由于其互穿聚合物网络中强大的共价和离子交联作用。

3.3 体外生物相容性及生物学功能

为了评估Gel和Dopa-gel在体外的潜在生物毒性，我们使用大鼠肌腱成纤维细胞CP-R237进行了实验。如附录A中的图S5（a）所示，细胞接种于Gel和Dopa-gel后，细胞形态未见明显变化。此外，我们对Gel组和Dopa-gel组的CP-R237细胞进行了活/死染色和CCK-8测定，培养7天后评估细胞增殖[图4（a）]和细胞活力[图4（b）]。结果表明，gel和Dopa-gel对CP-R237细胞的增殖和活力均无影响，两组之间无显著差异。对1天和3天处理的细胞进行的相关实验显示了类似的趋势[附录A中的图S5（b）、（c）]。此外，根据Phalloidin/DAPI染色观察，与其他两组相比，Dopa-gel组未观察到CP-R237细胞骨架的明显损伤[图4（c）]。我们进一步使用小鼠皮下组织的L929细胞系，进行了第1天和第3天的活/死实验和Phalloidin/DAPI染色。结果[附录A中的图S6]显示，Dopa-gel表现出令人满意的生物相容性。除了生物相容性，生物降解是组织修复支架的重要特性，可为支架中的生物细胞提供新组织生成所需的适当环境[45]。我们检测了支架的降解过程（附录A中的图S7），结果显示，Gel和Dopa-gel在7天内的降解率保持在20%，为细胞生长提供了合适的环境。越来越多的证据表明，血管生成对于促进皮肤修复至关重要，新血管的形成有助于向受损组织提供氧气和营养，促进愈合过程所必需的细胞募集[46]。因此，我们进一步研究了Dopa-gel对CP-R237细胞的纤维化作用。据报道，皮肤缺损中α-SMA的表达显示了肌成纤维细胞的激活和存在，这些细胞在伤口愈合过程中对ECM的收缩和重塑起着重要作用[47]。我们使用免疫荧光染色评估了CP-R237细胞中α-SMA的表达[图4（d）]。定量分析显示，与空白组和Gel组相比，Dopa-gel组中CP-R237细胞的α-SMA表达显著增加[图4（e）]。免疫组化染色结果显示，Dopa-gel组中角蛋白K10（K10）的表达显著上调[图4（f）]，统计分析表明，与空白组和Gel组相比，K10表达水平显著增加[图4（g）]。此外，我们还研究了成纤维细胞相关标志物FN、DCN、COL3和COL1的表达，结果显示，与其他两组相比，Dopa-gel组中这些因子的表达水平更高[图4（h）]。综上所述，这些结果表明，Dopa-gel不仅具有良好的生物相容性，还能有效上调CP-R237细胞中与成纤维细胞相关的基因表达。

3.4 体内皮肤伤口愈合评估

为了评估Dopa-gel支架在促进伤口愈合方面的效果，我们在小鼠背部创建了全层创面缺损，并在三个特定的时间点（0天、7天和14天）拍摄了各组伤口愈合进展的照片[图5（a）]。这些图像对愈合过程提供了直观观察与比较分析。在三组中均观察到伤口面积的减小，尤其是在Dopa-gel组中，在第7天时显示出更明显的促进愈合效果。此外，值得注意的是，到了第14天，空白组和Gel组仍显示出相对更大的残留伤口面积[附录A中的图S8（a）]。具体到数据上，Dopa-gel组在第7天和第14天的创面残留面积分别为(31.3±12) mm²和(16.4±1.9) mm²，明显低于Gel组[图5（b）]。我们采用了H&E染色、Masson染色和Sirius Red染色来进行创面再生的组织形态学检查。H&E染色显示，Gel组和Dopa-gel组在第14天观察到的损伤区域已完全上皮化，而空白组仍有部分伤口未愈合[附录A中的图S8（b）]。局部放大的α-SMA免疫组化染色图像如图S8（c）所示。与空白组和Gel组相比，Dopa-gel组显示更少的瘢痕形成（附录A中的图S9），伤口区域颜色更浅，更接近正常皮肤。此外，Dopa-gel组具有更高质量的肉芽组织、更广泛的ECM沉积和更好的真皮结构重建。Masson染色显示，在Dopa-gel组的真皮中有更多细网状结构的胶原纤维沉积，与健康真皮组织非常相似[图5（c）]。此外，Dopa-gel组显示出更多皮肤附属器样结构，而Gel组的这些结构较少。相反，空白组新形成的上皮长度和厚度明显较少，胶原沉积也较少，缺乏皮肤附属器样结构。Sirius Red染色也观察到了类似的结果。还使用免疫组织化学染色评估α-SMA的表达，从而可视化血管壁内平滑肌细胞的分布[48]，α-SMA的上调表明Dopa-gel能促进血管生成，而α-SMA阳性平滑肌细胞的存在对于有效的伤口愈合至关重要，因为它们有助于组织重塑、ECM成分（如胶原）的沉积和伤口的血运重建[49]。如图5（d）所示，半定量分析显示胶原沉积百分比如下：空白组[(39.6 ± 7.0)%]，gel组[(71.5 ± 8.4)%]，Dopa-gel组[(86.9 ± 10.3)%]。Masson染色和Sirius Red染色显示，Dopa-gel组比Gel组显示更多的血管样结构，而Gel组的血管数量明显多于空白组。数量上来看，Dopa-gel组有(55 ± 7)条血管，明显多于gel组(27 ± 4)条血管和空白组(11 ± 3)条血管[图5（e）]。使用CD31和α-SMA的免疫荧光染色进一步验证，Dopa-gel组显示出更多的血管样结构，这些结构包含血管平滑肌和内皮细胞[图5（f）]。综上所述，这些结果表明，Dopa-gel在促进血管生成方面的效果更为显著。它不仅为再生皮肤提供氧气和营养，还促进细胞迁移和组织重建。

此外，巨噬细胞在细胞间通信中发挥关键作用，调节炎症和再生过程[50]。我们进一步验证了Gel和Dopa-gel治疗后皮肤缺损区域的巨噬细胞极化情况，使用双标记免疫荧光染色方法，对CD68（泛巨噬细胞标记）和CD206（M2标记）进行双染。如图6（a）所示，三组均显示不同程度的CD68（红色荧光）和CD206（绿色荧光）阳性染色。空白组CD68的表达明显高于其他两组，表明更多的巨噬细胞浸润到创面缺损中。此外，Gel组和Dopa-gel组的CD206水平显著高于空白组。尤其是Dopa-gel组表现出最高水平的CD206表达，表明存在大量M2型巨噬细胞。在数量上，空白组的总CD68⁺细胞数为(962.3 ± 105.8)，而Dopa-gel组和Gel组的CD68⁺细胞数则相对较少，分别为(499.7 ± 87.7)和(645.3 ± 109.2) [图6（b）]。相反，M2型巨噬细胞（CD206⁺）的总数在三组中表现出相反的趋势[图6（c）]。此外，Dopa-gel组的M1型/总巨噬细胞比率显著低于空白组和Gel组[图6（d）]。相比之下，Dopa-gel组的M2型/总巨噬细胞比率为(33.1 ± 5.2)%，显著高于空白组(15.3 ± 2.9)%和Gel组(24.6 ± 4.3)% [图6（e）]。这些结果表明，Dopa-gel在调节巨噬细胞表型、促进抗炎环境以及促进受损组织修复和再生方面具有显著作用。

3.5 Dopa-gel诱导皮肤缺损修复的作用机制

当皮肤受损时，中性粒细胞是最早募集到伤口的免疫细胞之一，其次是促炎的M1型巨噬细胞。在伤口愈合过程中，M1型巨噬细胞逐渐转变为M2型巨噬细胞，这有助于促进组织的再生[51,52]。此外，中性粒细胞首先极化成促炎的M1表型并释放细胞因子。激活的血小板表达CD40配体，与巨噬细胞表面的受体相互作用，从而刺激巨噬细胞分泌血管内皮生长因子，进而促进血管生成[53,54]。为了研究Dopa-gel在皮肤再生中的生物学功能，我们使用ELISA检测了Dopa-gel培养的AD-MSCs中与炎症相关的旁分泌因子，包括IL-1ra、TGF-β和PGE-2的表达。AD-MSCs条件培养基的ELISA结果显示，与Gel组和空白组相比，Dopa-gel组IL-1ra、TGF-β和PGE-2的mRNA表达显著上调[图7（a）]。除此之外，我们检测了血管生成因子如VEGF、BFGF、HGF和ANG-1的表达情况，并发现在Dopa-gel组中，它们的表达显著高于Gel组和空白组[图7（b）]。这些结果表明，由Dopa-gel培养的AD-MSCs能够调节炎症相关细胞因子并释放血管生成因子，这对于皮肤组织再生至关重要。为了进一步探究AD-MSCs分泌的因子在抗炎和促血管生成中的功能，我们将ADMSCs衍生的条件培养基添加到Gel和Dopa-gel中，孵育14天后，利用收集的条件培养基培养RAW264.7巨噬细胞。通过免疫荧光染色分析[附录A中的图S10（a）]，发现Dopa-gel组中存在的分泌因子显著促进了巨噬细胞向M2型极化，其CD206表达增加。相比之下，Gel组虽然也调节了CD206的表达，但影响不显著；而空白组的CD206表达水平最低，表明其M2型巨噬细胞极化程度较低。此外，巨噬细胞的M1型标记物iNOS在三组中表现出相反的变化趋势，其中Dopa-gel组的iNOS表达水平最低，Gel组次之，空白组最高。免疫荧光强度分析进一步支持了CD206和iNOS表达的这一趋势。Dopa-gel组中iNOS水平显著降低，约为空白组的0.69 [附录A中的图S10（b）]，而CD206表达则显著增加，约为空白组的1.75倍[附录A中的图S10（c）]。此外，我们发现Dopa-gel组的M1/M2表型比例为(20.8 ± 3.2)%，明显低于Gel组[(43.3 ± 6.6)%]和空白组[(53.7 ± 7.8)%] [附录A中的图S10（d）]。进一步研究AD-MSCs的活性因子是否具有抗炎功能显示，Dopa-gel组中促炎因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6）的mRNA水平显著降低，而抗炎因子（如IL-1ra、IL-10、ARG-1）的表达则相反[图7（c）]。这些结果表明，Dopa-gel培养的AD-MSCs分泌的活性因子有助于促使M1型巨噬细胞转化为M2型，并降低炎症水平。

调控血管生成涉及多种信号通路。例如，血管生成素特异性结合受体酪氨酸激酶信号通路（TIE2/Tek-RTK）[55,56]。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）途径或Ras途径的激活，主要调控细胞活性。在这些细胞因子中，血管紧张素1（Ang1）通过激活PI3K通路促进内皮细胞增殖，而血管紧张素2（Ang2）在Ang1不足时作为TIE2受体的激动剂，激活PI3K-AKT通路。Ang1以PI3K依赖的方式刺激内皮细胞TIE2、AKT和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的磷酸化[57,58]。因此，我们对黏着斑激酶（FAK）信号通路进行了研究。之前的研究表明，该通路的激活可促进肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化，调控整合素的表达，从而促进整合素介导的细胞聚集[59]。FAK信号通路参与整合素介导的下游信号传导，调节血管形态、细胞迁移和血管床形成。此外，细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）通路通过调节促血管生成因子、内皮细胞迁移和基质重塑，在促进血管生成过程中也发挥关键作用[60]。我们的研究结果显示，Dopa-gel通过激活FAK信号通路，诱导了ERK1/2的磷酸化，进而促进血管生成并调节免疫反应。报道称，与机械力传导相关的FAK在Tyr397位点通过整合素介导的磷酸化，与Src家族蛋白相互作用。Src与FAK结合，进而导致FAK上Tyr925的磷酸化。FAK/Src复合体可以激活多种信号通路，其中包括Ras依赖的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。MAPK的激活可磷酸化并激活转录因子，进一步调控细胞功能。为进一步研究Dopa-gel促进AD-MSCs中炎症因子释放的潜在机制，我们评估了FAK及其Tyr397自磷酸化位点的蛋白表达水平。结果显示，与其他组相比，Dopa-gel组中这两种蛋白表达显著上调[图7（d）]。这种上调导致了FAK/Src复合物的形成，进而增加了下游蛋白Tyr925的磷酸化，这与蛋白质分析结果一致。磷酸化的Tyr925能结合到连接蛋白生长受体结合蛋白2（Grb2），其中含有Tyr925的肽基序YYNN位另一个接头蛋白提供结合位点，Grb2的SH3结构域与Ras的交换因子Son of Sevenless（SOS）结合。FAK通过Grb2激活Ras和MAPK通路。ERK1/2是MAPK家族成员，参与调节细胞生长、发育和分裂。因此，我们检测了Dopa-gel组中ERK1/2的蛋白水平及Thr202/Tyr204磷酸化位点的ERK2水平[图7（d）]，结果显示它们显著增加[图7（e）]。这些发现表明FAK-ERK信号通路可能介导了PDA修饰的机制，从而增强了AD-MSCs的免疫调节功能。

3.6 拉伸应力调节旁分泌功能的机制

由于大鼠背部皮肤在不同体位下存在较大的形变，支架必须具备优异的力学性能，并能够与周围皮肤协调产生应变，才能确保有效的伤口再生（附录A中的图S11）。因此，我们进一步探讨了支架拉伸应力与旁分泌功能之间的关系。已有研究报道，拉伸应力可以通过增加血管紧张素2和血小板衍生生长因子（PDGF）的分泌来介导内皮细胞的信号传导[33,61]。此外，拉伸应力可触发血管重构过程中PI3K、P21和Ras同源基因家族成员A（RhoA）信号的激活[62‒64]。为了研究拉伸应力是否会影响炎症反应，我们评估了IL-10（抗炎因子）和VEGF（血管生成相关因子）的旁分泌作用。如图8（a）所示，静态组和循环拉伸应变组的IL-10分泌均有所增加，两组间无明显差异。然而，循环拉伸应变组的VEGF水平显著高于静态组和空白组。在循环拉伸应变组中，Gel组和Dopa-gel组之间也存在显著差异，说明更好的力学性能导致了更高的VEGF分泌水平。因此，我们认为拉伸应力主要通过影响血管化过程来调节旁分泌作用，而非抗炎作用。ROCK信号通路已被证明在机械应力介导的血管生成中起关键作用[64]。为了验证这一推断，我们评估了血管生成相关基因的表达[图8（b）]。结果显示，与VEGF分泌的结果相似，Dopa-gel循环拉伸应变组的表达水平最高。循环拉伸应变组的ROCK-2表达量显著增加，而ROCK-1表达量在各组间无显著差异。这些结果与之前的研究一致，即拉伸应力诱导了ROCK-2的表达，而不是ROCK-1的表达，且ROCK抑制剂以剂量依赖的方式阻止了拉伸应力诱导的VEGF表达[65]。Hif-1α是另一种已被证明可以调节VEGF的经典因子，我们也评估了其表达，发现其趋势与ROCK-1一致，说明机械应力和多巴胺表面修饰不能激活该信号通路。Western blot及相关半定量分析结果更清楚地证明了这一现象[图8（c）和（d）]。具体来说，循环拉伸应变组的ROCK-2和VEGF表达水平显著升高，尤其是Dopa-gel组的两种蛋白表达量最高。而ROCK-1或Hif-1α的表达在各组间无显著差异。因此，在伤口再生过程中，拉伸应力可以通过ROCK-2介导的VEGF血管生成来调节旁分泌功能。

4 总结

总之，PDA修饰的3D生物打印支架表现出与天然皮肤组织相匹配的力学性能。此外，通过PDA表面修饰的Dopa-gel不仅能促进免疫调节因子和促血管生成因子的分泌，还可通过调节拉伸应力触发旁分泌。在体内实验中，Dopa-gel加速了皮肤创面的愈合，增强了组织血管化，并促进创面内巨噬细胞从M1型向M2型转变。机制研究表明，FAK信号通路可能通过增加免疫调节因子和促血管生成因子的旁分泌作用，在Dopa-gel介导的皮肤缺损愈合中发挥关键作用。在拉伸应力下，力学性能通过ROCK-2/VEGF介导的血管生成，协同调节旁分泌行为。综上所述，多功能Dopa-gel具有类似天然皮肤组织的力学特性，并且具有增强的免疫调节和血管生成特性，显示出作为皮肤组织再生支架的巨大潜力。

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