美罗培南、阿维巴坦和金属-β-内酰胺酶抑制剂三联用药优化对不同β-内酰胺酶病原菌的抗菌覆盖率

工程（英文） ›› 2024, Vol. 38 ›› Issue (7) : 142 -151. DOI: 10.1016/j.eng.2024.02.010

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The Triple Combination of Meropenem, Avibactam, and a Metallo-β-Lactamase Inhibitor Optimizes Antibacterial Coverage Against Different β-Lactamase Producers

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Received	Accepted	Published
2023-08-05	2024-02-17
Issue Date
2024-06-14

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摘要

本文探讨了美罗培南（MEM）、一种新型金属-β-内酰胺酶（MBL）抑制剂[吲哚-2-羧酸盐58（InC58）]和丝氨酸-β-内酰胺酶（SBL）抑制剂[阿维巴坦（AVI）]三联用药对产碳青霉烯酶细菌的广谱抗菌活性。采用琼脂稀释法，对产MBL和SBL的各种菌株进行三联药敏试验。研究检测了细菌对MEM与InC58联合用药的自发耐药频率（FoR）。对获得的突变体进行测序并检测交叉抗药性、适应性和耐药表型的稳定性。与MEM加SBL或MBL抑制剂双联用药相比，三联用药的抗菌谱扩展至大多数携带SBL [苯唑西林酶-48（OXA-48）和肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶-2（KPC-2）]和MBL [新德里金属β-内酰胺酶（NDMs）]的分离株，但对携带Verona整合子编码金属β-内酰胺酶（VIM）的铜绿假单胞菌和携带OXA-23的鲍曼不动杆菌无效。细菌对MEM加InC58的FoR范围为2.22 × 10^-7~1.13 × 10^-6。突变体耐药性与ompC和comR基因突变相关，分别影响孔蛋白C和铜渗透性。突变体表现出适应性代价、在没有抗生素压力的传代期间耐药水平降低，以及对另一种碳青霉烯（亚胺培南）和β-内酰胺酶抑制剂（他尼硼巴坦）的交叉耐药性。总之，与双联用药相比，MEM与InC58和AVI的三联用药对不同产碳青霉烯酶细菌显示出更广谱的抗菌效果，揭示了一种针对β-内酰胺酶介导的抗生素耐药性的新策略。

Abstract

This work explores the potential of a triple combination of meropenem (MEM), a novel metallo-βlactamase (MBL) inhibitor (indole-2-carboxylate 58 (InC58)), and a serine-β-lactamase (SBL) inhibitor (avibactam (AVI)) for broad-spectrum activity against carbapenemase-producing bacteria. A diverse panel comprising MBL- and SBL-producing strains was used for susceptibility testing of the triple combination using the agar dilution method. The frequency of resistance (FoR) to MEM combined with InC58 was investigated. Mutants were sequenced and tested for cross resistance, fitness, and the stability of the resistance phenotype. Compared with the double combinations of MEM plus an SBL or MBL inhibitor, the triple combination extended the spectrum of activity to most of the isolates bearing SBLs (oxacillinase-48 (OXA-48) and Klebsiella pneumoniae carbapenemase-2 (KPC-2)) and MBLs (New Delhi metallo-β- lactamases (NDMs)), although it was not effective against Verona integron-encoded metallo-βlactamase (VIM)-carrying Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) and OXA-23-carrying Acinetobacter baumannii (A. baumannii). The FoR to MEM plus InC58 ranged from 2.22×10^-7 to 1.13×10^-6. The resistance correlated with mutations to ompC and comR, affecting porin C and copper permeability, respectively. The mutants manifested a fitness cost, a decreased level of resistance during passage without antibiotic pressure, and cross resistance to another carbapenem (imipenem) and a β-lactamase inhibitor (taniborbactam). In conclusion, compared with the dual combinations, the triple combination of MEM with InC58 and AVI showed a much wider spectrum of activity against different carbapenemase-producing bacteria, revealing a new strategy to combat β-lactamase-mediated antimicrobial resistance.

关键词

碳青霉烯酶 / 金属/丝氨酸-β-内酰胺酶抑制剂 / 阿维巴坦 / 美罗培南 / 抗生素耐药性

Key words

Carbapenemase / Metallo/serine-β-lactamase inhibitor / Avibactam / Meropenem / Antimicrobial resistance

引用本文

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凌卓人,Alistair James Macdonald Farley,Aditya Lankapalli,Yanfang Zhang,Shonnette Premchand-Branker,Kate Cook,Andrei Baran,Charlotte Gray-Hammerton,Claudia Orbegozo Rubio,Edgars Suna,Jordan Mathias,Jürgen Brem,Kirsty Sands,Maria Nieto-Rosado,Maria Mykolaivna Trush,Nadira Naznin Rakhi,Willames Martins,Yuqing Zhou,Christopher Joseph Schofield,Timothy Walsh. 美罗培南、阿维巴坦和金属-β-内酰胺酶抑制剂三联用药优化对不同β-内酰胺酶病原菌的抗菌覆盖率[J]. 工程（英文）, 2024, 38(7): 142-151 DOI:10.1016/j.eng.2024.02.010

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β-内酰胺类药物，包括青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类，是医院和社区最常用的抗感染药物之一，同时也广泛用于畜牧业[1‒2]。对β-内酰胺类药物的耐药性有多种耐药机制，其中最具治疗相关性的一种机制涉及β-内酰胺酶的产生，该酶催化β-内酰胺水解产生无活性的β-氨基酸[1]。从机制上来说，β-内酰胺酶可分为亲核丝氨酸-β-内酰胺酶（SBLs；Ambler A、C、D类）和锌离子依赖性金属-β-内酰胺酶（MBL；Ambler B类，B1~B3亚类）[3‒4]。已采用两种主要策略来缓解β-内酰胺酶耐药性：一种策略是修改β-内酰胺类抗生素以避免或抑制β-内酰胺酶催化，如单内酰胺类和碳青霉烯类抗生素；另一种策略是将β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺抗生素联合使用。临床上重要的SBL抑制剂包括克拉维酸、他唑巴坦和舒巴坦（均含β-内酰胺环）以及最近开发的阿维巴坦（AVI），AVI不含β-内酰胺环[5]，但仍能与SBL以共价可逆的方式发生反应[6‒8]。AVI对许多A、C和D类SBL具有广谱抗菌性，但与其他临床使用的SBL抑制剂一样，对MBL无效[6,9]。抑制β-内酰胺酶活性的开创性工作集中在SBL上，因为相较于MBL，SBL更具临床相关性。然而，近年来，B1-亚族MBL [如新德里金属-β-内酰胺酶（NDM）、Verona整合子编码金属-β-内酰胺酶（VIM）和亚胺培南酶（IMP）MBL]变得更加广泛传播，并在一些地区流行[3]。尤其令人担忧的是，MBL对碳青霉烯类具有耐药性，而当其他β-内酰胺类药物因耐药性失效时，医院通常使用的正是碳青霉烯类药物。此外，31个国家报道了SBL和MBL型碳青霉烯酶在同一菌株中共存[10]（附录A中图S1和表S1）。

MBL活性位点的变化，再加上需要避免抑制在人体中具有重要作用的类似MBL的酶，使得研发具有广谱活性和无毒性MBL抑制剂极具挑战性。然而，一系列有前景的化合物目前正在研发中[11‒12]。最近，吲哚羧酸盐衍生物已被证明是有效的MBL抑制剂，能够恢复碳青霉烯[美罗培南（MEM）]对产MBL菌的体内抗菌活性[13]。吲哚-2-羧酸盐（InC）的结合模式类似于双环β-内酰胺和（或）随后形成的中间体[13]。有趣的是，InC通过使水解性的二锌桥联水/氢氧化物保持稳定来部分抑制MBL [13]。然而，吲哚羧酸盐并不能有效抑制SBL。

对涉及AVI联合用药的耐药性已经出现——其中最重要的是头孢他啶（CAZ）-AVI。除了不受AVI抑制的MBL外，CAZ-AVI耐药性还涉及SBL关键残基的置换、肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）的突变或表达上调、外排泵活性增强、孔蛋白突变以及β-内酰胺类抗生素的转肽酶靶标突变[14‒22]。据我们所知，迄今为止，尚无对β-内酰胺和吲哚羧酸盐联合用药耐药性潜在机制的报道。

在此，我们报道了β-内酰胺类抗生素MEM、广谱SBL抑制剂（AVI）和广谱B1 MBL抑制剂（InC58）三联用药的数据，目的是最大限度地扩展杀菌谱，并研究与强效MBL抑制剂（InC58）相关的自发耐药频率（FoR）和耐药机制。

2 材料与方法

2.1 抗微生物化合物和细菌菌株

InC58是在拉脱维亚有机合成研究所根据报道的程序[13]合成的。MEM、亚胺培南（IMI）、他尼硼巴坦（TAN）和AVI分别购自Biosynth Carbosynth（瑞士）、Sigma Aldrich（美国）、MedChemExpress（美国）和Biorbyt（美国）。涵盖不同类别β-内酰胺酶的51株MEM耐药菌株获自英力士牛津抗菌药物研究所[发展中国家新生儿的抗生素耐药性负担（BARNADS）、印度、巴基斯坦、越南、塞尔维亚]和Marek Gniadkowski。

2.2 药敏试验

根据临床和实验室标准协会（CLSI，美国）的指导方针，使用琼脂稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）[23]。试验中使用Mueller Hinton琼脂（Millipore，美国）进行测定。MEM、TAN和AVI溶解在水中，IMI和InC58分别溶解在磷酸盐缓冲液和二甲基亚砜（DMSO）中。对于双联和三联用药，β-内酰胺酶抑制剂的浓度固定在4 mg∙L^-1或2 mg∙L^-1，而对MEM设置浓度梯度。使用大肠杆菌（E.coli）ATCC 25922和肺炎克雷伯菌（K. pneumonia）ATCC 700603作为质量控制菌株。MIC₅₀定义为抑制50%或更多分离株生长的MIC值[24]。

2.3 FoR试验

针对对MEM-InC58（4 mg∙L^-1的InC58）敏感的菌株组（菌株数量n = 19）进行FoR试验，该菌株组包括克雷伯氏菌属、大肠杆菌、霍米奇肠杆菌（E. hormaechei）、黏质沙雷氏菌（S. marcescen）和塞氏柠檬酸杆菌（C. sedlakii）。将细菌过夜培养物悬浮于生理盐水中，达到约每毫升10⁷菌落形成单位（CFU∙mL^-1）。将10倍梯度稀释的悬浮液接种到营养培养基上进行CFU测定。将0.1 mL等份混悬液涂布到含有MEM（4 × MIC）和InC58（4 mg∙L^-1）的营养培养基上。在37 ℃下培养24 h或48 h后统计菌落数量，并测试MIC确认其耐药表型。通过将含药培养基上生长的耐药菌落数除以初始接种物中的总CFU确定FoR。

2.4 生长曲线

为了研究自发耐药性的产生对细菌生长和适应性的影响，以约10⁶ CFU∙mL^-1的浓度，将FoR试验的亲本和突变菌株接种在Luria-Bertani（LB）液体培养基中，并在37 ℃下进行培养。为了获得生长曲线，使用分光光度计（BMG Labtech，赛默飞世尔科技公司，美国）每半小时检测一次600 nm波长处样品的光密度（OD_600nm）。

2.5 稳定性实验

采用菌落计数法检测自发突变体的稳定性。以约10⁶ CFU∙mL^-1的浓度接种突变体，在37 ℃（200 r∙min^-1）下培养，并在不含抗生素的LB肉汤中通过1024倍稀释连续传代12天。每四天采集一次细菌培养物，稀释并接种到不含抗生素和含抗生素（MEM-InC58的1/8和1/2 MIC值）的培养基上，以评估相应耐药表型的保留率。

2.6 全基因组测序

使用QIAamp DNA 迷你试剂盒（Qiagen，德国）和Qiacube机器（Qiagen）进行细菌DNA提取，并进行核糖核酸酶（RNase）处理。使用Qubit荧光计（Invitrogen，美国）对提取的DNA进行定量。对于长读长测序，使用Mag-Bind全纯NGS磁珠（Omega Bio-Tek，美国）纯化并浓缩提取的基因组脱氧核糖核酸（gDNA）。使用牛津纳米孔技术（英国）的SQK-RBK110.96快速条形码试剂盒制备测序文库。使用MinION装置（牛津纳米孔技术）上的R9.4.1流动槽进行测序，并使用MINknow软件中集成的Guppy 6.1.2工具包进行碱基测定。短读长测序在如前所述[25]的基础上稍作修改。简言之，使用Nextera XT V3试剂盒（Illumina，美国）和基于磁珠的标准化流程制备基因组文库。在Illumina MiSeq平台上使用V3化学进行全基因组测序（WGS），以生成多达300个碱基对（bp）的成对末端读长。

2.7 细菌菌株的遗传分析

使用Flye 2.9.1-b1780 [26]进行组装，并使用Medaka 1.7.3（英国）打磨，然后使用Pilon 1.24 [27]、Polypolish 0.5.0 [28]和Polca（MaSuRCA 4.1.0 [29]）进行短读长打磨。将经打磨的基因组提交给ResFinder 4.1，以鉴定β-内酰胺酶基因[30‒32]。使用KmerFinder 3.2 [33‒35]和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS；Bruker，美国）鉴定细菌种属。对于遗传变异分析，经打磨的基因组被视为下游分析的参考基因组。使用Snippy 4.6.0†分析参考基因组与其相应突变体（短读长）之间的变异。通过将亲代菌株的短读长数据重新映射到参考基因组，排除了参考基因组的打磨错误和与耐药性无关的变异。使用Geneious Prime 2023.2.1（新西兰）进行氨基酸序列比对。

2.8 收录号

WGS数据以BioProject ID PRJNA984017存储在序列读取档案（SRA）中。

3 结果

3.1 三联用药的效果

使用涵盖临床相关SBL和MBL碳青霉烯酶的51种革兰氏阴性菌（附录A中表S2）评估MEM联合InC58和（或）AVI的有效性（图1 [6,13,36]）。MEM-InC58联合用药对不同类型的产NDM菌株具有抗菌活性，但对VIM阳性分离株无效。当以4 mg∙L^-1的浓度添加时，InC58将NDM菌株（n = 33）的MIC₅₀降低至0.5 mg∙L^-1，与单独使用MEM相比降低至1/128（MIC₅₀ = 64 mg∙L^-1）。在MEM中加入InC58（4 mg∙L^-1或2 mg∙L^-1）后，携带VIM的肠杆菌的MIC降低至1/8~1/2（MIC: 4~8 mg∙L^-1），而携带VIM的铜绿假单胞菌对MEM-InC58保持高水平耐药（MIC > 16 mg∙L^-1）。

MEM-AVI联合用药对具有不同SBL碳青霉烯酶[苯唑西林酶（OXA）-48和KPC-2]的菌株有效，但对携带OXA-23的鲍曼不动杆菌无效。与单独使用MEM相比，MEM-AVI（4 mg∙L^-1 AVI）使OXA-48或KPC-2阳性肺炎克雷伯菌的MIC降低至不足1/16（OXA-48 MIC: 1~2 mg∙L^-1; KPC-2 MIC: 0.125~1 mg∙L^-1）。

MEM-InC58-AVI的结果（图1）表明，InC58和AVI的活性是互补的，使MBL和SBL联合用药的抗菌谱更为广泛。添加4 mg∙L^-1的InC58和AVI使得所有菌株的MEM MIC₅₀降低至0.5 mg∙L^-1，为MEM-AVI（4 mg∙L^-1）MIC₅₀（32 mg∙L^-1）的1/64，是MEM-InC58（InC58在4 mg∙L^-1）MIC₅₀（2 mg∙L^-1）的1/4。

与在2 mg∙L^-1时观察到的抑制作用相比，InC58和AVI在4 mg∙L^-1时在双联和三联用药中均表现出稍好的抑制作用。在双联用药时，MEM-InC58使携带NDM菌株（n = 33）的MIC₅₀从2 mg∙L^-1（InC58 2 mg∙L^-1）降低至0.5 mg∙L^-1（InC58 4 mg∙L^-1）。MEM-AVI使携带SBL菌株（n = 11）的MIC₅₀从4 mg∙L^-1（AVI为2 mg∙L^-1）降至1 mg∙L^-1（AVI为4 mg∙L^-1）。在三联组合中，当与AVI（4 mg∙L^-1）和InC58（4 mg∙L^-1）联合用药时，浓度为0.5 mg∙L^-1的MEM抑制了整个样本组中59%的分离株，而当与AVI（2 mg∙L^-1）-InC58（2 mg∙L^-1）、AVI（2 mg∙L^-1）-InC58（4 mg∙L^-1）或AVI（4 mg∙L^-1）-InC58（2 mg∙L^-1）联合用药时，相同浓度的MEM仅抑制了33%~ 51%的菌株。

3.2 自发耐药频率

对MEM-InC58联合用药（InC58浓度为4 mg∙L^-1）敏感的菌株进行FoR测试。肺炎克雷伯菌的自发突变体范围为2.88 × 10^-7~1.13 × 10^-6。鉴定出了两种大肠杆菌突变体和两种黏质沙雷氏菌突变体，FoR率分别为2.22× 10^-7和4.00 × 10^-7（表1）。敏感性试验（图2）显示，大多数肺炎克雷伯菌突变体（24/25）对MEM-InC58（InC58浓度为4 mg∙L^-1）具有高度耐药性，MIC大于或等于32 mg∙L^-1。大肠杆菌和黏质沙雷氏菌突变体对MEM-InC58（InC58浓度为4 mg∙L^-1）的MIC增加了16倍，分别达到2 mg∙L^-1和8 mg∙L^-1。

与亲代菌株相比，所有突变体的MEM MIC均升高4倍或以上，表明对MEM的耐药性增强（图2）。此外，当InC58的浓度从4 mg∙L^-1增加至16 mg∙L^-1时，约三分之二的突变体（20/29）的MEM-InC58 MIC保持不变或在两倍范围内变化（附录A中图S2）。

3.3 自发突变体的交叉耐药性

为了研究对MEM-InC58的自发耐药性是否由于对MEM和（或）InC58的特异性耐药性增加所致，我们进行了交叉耐药性试验（图2）。有趣的是，当用TAN（另一种具有抗MBL和SBL活性的β-内酰胺酶抑制剂）替代双联用药中的InC58时，双联用药仍未能有效抑制所有突变体的生长，观察到肺炎克雷伯菌突变体的MIC大于或等于32 mg∙L^-1，大肠杆菌和黏质沙雷氏菌突变体的MIC大于或等于16 mg∙L^-1。当用IMI替代MEM，与InC58双联用药时，所有突变体均表现出对IMI-InC58的耐药性。大多数肺炎克雷伯菌突变体（24/25）对IMI-InC58的MIC大于或等于32 mg∙L^-1，其余肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和黏质沙雷氏菌突变体的MIC与其亲代菌株相比增加了四倍以上。这些结果表明，突变体对不同的碳青霉烯和β-内酰胺酶抑制剂组合具有耐药性。

3.4 自发突变体的适应性代价

为了评估MEM-InC58的自发耐药性是否影响细菌生长和适应性，我们比较了亲代菌株和两株突变体的生长曲线[图3（a）]。与亲代菌株相比，大肠杆菌突变体表现出最显著的生长抑制，在24 h时降低了约0.5 OD_{600 nm}。黏质沙雷氏菌突变体表现出相对较低的适应性代价，在对数生长期略有生长延迟。在肺炎克雷伯菌突变体中，9/10表现出明显的生长迟缓，但K1N-M2（K1N的耐药性突变体2）是个例外，与亲代菌株相比，K1N-M2的生长曲线仅略有下降[图3（a）]。

3.5 自发突变体的稳定性

在含有1/2 MIC MEM-InC58（InC58浓度为4 mg∙L^-1）的培养基上，大多数突变体的耐药表型是不可持续的[图3（b）]。我们观察到，大多数（6/7）突变体在第4天的耐药表型平均保留率急剧下降（≥ 79%）。与其他突变体相比，黏质沙雷氏菌S4A的突变体表现出相对较高的稳定性，从第4天至第12天，平均保留率保持在约50%。在含有1/8 MIC MEM-InC58（InC58的浓度为4 mg∙L^-1）的培养基上[图3（b）]，黏质沙雷氏菌S4A和肺炎克雷伯菌K1N和K5N的突变体保持了其耐药表型，在第4天至第12天的平均保留率高于或等于86%。在不存在抗生素的情况下，其他突变体的保留率在12天的传代过程中呈下降趋势。这些结果表明，在没有抗生素选择压力的情况下，大多数突变体不能维持对MEM-InC58的耐药性。在无抗生素压力条件下传代后，我们从大肠杆菌E10N和肺炎克雷伯菌S2E、K8N和K9N的耐药突变体中获得了对MEM-InC58恢复敏感的新突变体（附录A中表S3）。

3.6 自发耐药性的遗传变异分析

为了研究对MEM-InC58的耐药机制，对FoR试验中产生的耐药突变体及其相应的敏感突变体进行测序，并与野生型参考菌株进行比较，以确定差异（图4；附录A中表S4）。在耐药突变体中，所有大肠杆菌突变体（n = 2）和40%的肺炎克雷伯菌突变体（10/25）在编码外膜孔蛋白C（OmpC，OmpC家族包括在肺炎克雷伯菌中广为人知的OmpK36 [37]）的ompC基因中出现了突变。有趣的是，与野生型参考菌株相比，两种大肠杆菌耐药突变体（n = 2）均具有精氨酸295脯氨酸（Arg295Pro）OmpC变体，而其相应的敏感突变体（n = 4）在相同位置均出现精氨酸295丝氨酸（Arg295Ser）突变（附录A中表S4和图S3）。在具有ompC突变的肺炎克雷伯菌耐药突变体中（n = 10），有两个在ompC中间产生了终止密码子；三个由于插入碱基对而发生移码；其余5个呈现错义突变，改变了OmpC序列中的一个氨基酸。我们从产生终止密码子（S2E-M, n = 2, Gln124^*）的突变体和移码突变体（K9N-M3）中获得了敏感突变体（n = 5）。然而，这些敏感突变体都保持了原有的ompC终止密码子和移码突变，唯一的例外是Gln124^*突变为谷氨酰胺124亮氨酸（Gln124Leu；错义突变）。

黏质沙雷氏菌的两个耐药突变体在comR基因上具有相同的移码。据报道，comR基因的破坏（转座子插入）会降低铜在细菌外膜上的渗透性[38]。

此外，大部分（10/12）来自K8N的突变体具有编码核酮糖激酶和钼辅因子生物合成蛋白B的araB和moaB基因突变。相应的敏感突变体在araB和moaB中呈现相同的突变。目前，尚未发现上述两个基因与抗生素耐药性之间存在直接关系。

4 讨论

全球范围内SBL和MBL碳青霉烯酶的流行增加，对β-内酰胺类药物联合单一β-内酰胺酶抑制剂的广泛疗效构成威胁[3]。既往的研究已经揭示了某些三联用药对耐碳青霉烯类革兰氏阴性菌的效果，例如，两种单环β-内酰胺与克拉维酸的联用[39]、β-内酰胺类药物联合AVI和妥布霉素-四氮杂环十四烷结合物[40]、β-内酰胺类药物联合两种SBL抑制剂（舒巴坦和AVI）[41]，或亚胺培南联合瑞来巴坦（SBL抑制剂）及西司他丁（一种肾脱氢肽酶抑制剂）[42]。据我们所知，本研究首次测试了MBL和SBL选择性抑制剂与碳青霉烯类药物三联使用，旨在优化对各种产碳青霉烯酶细菌的抗菌覆盖率。

我们的研究结果揭示了三联用药具有临床潜力，对多种携带SBL和MBL的革兰氏阴性菌株具有扩大的广谱抗菌活性。在我们的三联用药中，两种β-内酰胺酶抑制剂以互补的方式发挥作用：AVI可减轻SBL的酰化作用[6,8]，InC58可抑制MBL的水解作用[13]。结果表明，SBL和MBL抑制剂联合用药可以扩展碳青霉烯类抗生素（如MEM）的疗效，也可能扩展其他β-内酰胺类抗生素的疗效。

与AVI和InC58对不同β-内酰胺酶的pIC₅₀一致[pIC₅₀ = -log(IC₅₀)；IC₅₀：半数抑制浓度]（附录A中表S5）[13]，MEM-AVI和MEM-InC58双联用药分别对SBL和MBL型碳青霉烯酶具有抗菌活性，但OXA-23阳性鲍曼不动杆菌和VIM阳性铜绿假单胞菌除外。MEM-AVI可抑制产OXA-48菌株和产KPC-2菌株，与先前研究[9]的结果一致，但该联合用药对OXA-23阳性鲍曼不动杆菌无效。MEM-InC58双联用药对NDM阳性菌株具有良好的抗菌活性，与既往研究[13]一致，但对VIM阳性肠杆菌属的抗菌活性较低，对产VIM铜绿假单胞菌的抗菌活性更低。这些例外情况可能与抗菌化合物的渗透性差有关，如先前研究所述[43‒45]。Brem等[13]还报道了InC49（InC58的类似物质）与MEM或亚胺培南联合使用时对产VIM铜绿假单胞菌和产NDM鲍曼不动杆菌的抗菌活性有限。类似地，铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对CAZ-AVI的耐药程度高于肠杆菌科[15]。另一个原因是InC58抑制VIM，AVI抑制OXA-23的效果不足。先前的研究表明，InC58对VIM的pIC₅₀低于NDM [13]，AVI抑制OXA-23的效率也很低[46]。因此，在治疗携带VIM的铜绿假单胞菌和携带OXA-23的鲍曼不动杆菌引起的感染时，应避免使用MEM-InC58-AVI；然而，也许可以通过使用替代的抗菌药物来克服这一限制。

由于选择压力，新抗生素的应用极有可能伴随着细菌耐药性的出现。早期的研究揭示了CAZ-AVI的耐药机制（MBL表达除外），发现这与不同SBL的关键位点（如Ω环）的突变、外排泵活性的升高、青霉素结合蛋白（PBP）或孔蛋白的突变以及KPC表达的增强有关[14‒22]。然而，对新型MBL抑制剂（如InC58）的耐药性尚无详细研究。

在我们的FoR试验中，产生了对MEM-InC58联合用药的自发耐药突变体。与亲代菌株相比，所有受试突变体均表现为生长速度减缓，这表明获得对MEM-InC58的耐药性给菌株带来了适应性代价。稳定性试验的结果表明，在没有抗生素选择压力的情况下，突变体不能保持对MEM-InC58的原始耐药水平，尽管在本研究中黏质沙雷氏菌突变体的耐药表型的稳定性相对高于其他种属的突变体。此外，这些突变体不仅对MEM-InC58或MEM本身不敏感，而且对IMI-InC58和MEM-TAN产生了交叉耐药性，这表明耐药机制非特异性靶向不同的碳青霉烯类和β-内酰胺酶抑制剂。

WGS数据分析表明，对MEM-InC58有三种潜在耐药机制。值得注意的是，在对MEM-InC58耐药突变体中，未发现β-内酰胺酶的氨基酸残基突变。从化合物结构的角度看，InC58不含反应性羰基，因此，β-内酰胺酶对其介导耐药性似乎不太可能。相比之下，虽然AVI不含β-内酰胺，但其作用机制（即其环脲与SBL的亲核丝氨酸反应）表明可能出现SBL介导的耐药性。例如，有报道显示，暴露在CAZ-AVI后，细菌耐药性与KPC中出现与Ω环突变相关 [14,20‒21]。

对于两个黏质沙雷氏菌突变体，序列分析显示两者在comR中都有移码突变。ComR是调节ComC表达的阻遏物，其中ComC是外膜上的一种蛋白质，可降低外膜对铜的渗透性[38]。因此，破坏comR可能会间接降低铜对细菌的渗透性[38]。因为铜离子抑制NDM-1的活性[47]，所以破坏comR可能增强黏质沙雷氏菌突变体中的NDM-1活性。然而，鉴于InC58与MBL的活性位点锌离子结合，comR和金属离子在针对InC58的耐药性中可能有其他作用。

所有大肠杆菌突变体和40%肺炎克雷伯菌突变体在编码OmpC的ompC基因中存在突变。先前研究观察到，在碳青霉烯类药物压力下，细菌中ompC的表达下调，表明ompC与碳青霉烯类耐药性之间存在关联[48]。孔蛋白是细菌外膜上的蛋白质通道，它们参与多种化合物（包括抗生素）进入细菌的过程[37]。包括ompC在内的孔蛋白突变与β-内酰胺的摄取有限有关[37,49]，并可能阻碍β-内酰胺酶抑制剂进入细菌。将耐药突变体在无抗生素压力下传代后，我们获得了对MEM-InC58恢复敏感性的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌敏感突变体。所有大肠杆菌敏感突变株（n = 4）在OmpC上都有Arg295Ser突变，有别于耐药突变株（n = 2, Arg295Pro）。这一发现表明，Arg295可能是对MEM-InC58产生耐药性的重要位点。然而，对于肺炎克雷伯菌的敏感突变体，与耐药突变体相比，大多数（4/5）在ompC上含有相同的终止密码子和移码突变。这一现象表明，在这些肺炎克雷伯菌耐药突变体中，孔蛋白C的破坏并不是促进对MEM-InC58耐药的唯一因素。除核苷酸水平上的突变外，还可能存在其他耐药机制。

在临床环境中，与单一药物相比，双联用药和三联用药产生耐药性的程度值得监测。然而，一些β-内酰胺加SBL抑制剂的联合用药仍然是重要的治疗手段，如力百汀（阿莫西林和克拉维酸），这表明新的联合用药具有很大临床潜力。

5 结论

与双联用药相比，MEM与InC58（一种新型MBL抑制剂）和AVI（一种SBL抑制剂）三联用药对不同产β-内酰胺酶细菌显示出更广谱的抗菌活性。这些结果揭示了一种对抗β-内酰胺酶介导的抗生素耐药性的新策略。

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