斑马鱼模型筛选揭示高效天然霉菌毒素解毒剂——缓解玉米赤霉烯酮诱导的毒性

张鸿运 ,  姜维丹 ,  吴培 ,  刘杨 ,  任红梅 ,  金小婉 ,  周小秋 ,  冯琳

工程（英文） ›› 2024, Vol. 42 ›› Issue (11) : 206 -222.

PDF (7986KB)
工程（英文） ›› 2024, Vol. 42 ›› Issue (11) : 206 -222. DOI: 10.1016/j.eng.2024.03.016
研究论文

斑马鱼模型筛选揭示高效天然霉菌毒素解毒剂——缓解玉米赤霉烯酮诱导的毒性

作者信息 +

Revealing High-Efficiency Natural Mycotoxin Antidotes in Zebrafish Model Screening Against Zearalenone-Induced Toxicity

Author information +
文章历史 +
PDF (8177K)

摘要

玉米赤霉烯酮（ZEA）作为一种霉菌毒素，严重危害全球人类和动物健康。天然产物（NP）由于其多样化的生物活性而被认为可以缓解ZEA的不利影响。然而，目前的挑战在于缺乏一种有效的策略来系统地筛选和鉴定能够有效缓解ZEA毒性的NP。本研究构建了一种基于表型的筛选策略，用于筛选NP文库，并发现高效化合物来减轻或抵消ZEA在动物体内暴露后的不良后果。利用这一策略，初步鉴定了96种NP，并基于胚胎表型和运动活性，使用评分系统和TCMacro方法评估了两种有效的候选化合物——秦皮素和羟基酪醇的效价及功效。此外，本研究进行了转录组和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，提取了两组mRNA标签，以查询连接图谱（CMap）数据库并预测NP。预测的NP展现出了能逆转与ZEA毒性相关的基因表达谱的潜力。因此，使用斑马鱼模型进一步筛选这些化合物，结果表明牛奶树碱、瑞香素和核黄素在斑马鱼中表现出良好的体内功效。值得注意的是，在整个研究过程中，秦皮素一直表现出较好的效果。生物学途径分析和功能验证表明，极低剂量的秦皮素完全逆转了ZEA的毒性作用。这是通过修复受损细胞凋亡、改变细胞周期通路和防止衰老诱导来实现的，具有良好的应用潜力。总的来说，本研究证明了这种整合策略可以成功地应用于开发潜在的解毒剂。

Abstract

Zearalenone (ZEA), a mycotoxin, poses a significant global hazard to human and animal health. Natural products (NPs) have shown promise for mitigating the adverse effects of ZEA owing to their diverse functional activities. However, the current challenge lies in the absence of an efficient strategy for systematic screening and identification of NPs that can effectively protect against ZEA-induced toxicity. This study describes a phenotype-based screening strategy for screening NP libraries and discovering more effective compounds to mitigate or counteract the adverse consequences of ZEA exposure in animals. Using this strategy, we initially identified 96 NPs and evaluated the potency and efficacy of two effective candidate compounds, fraxetin, and hydroxytyrosol, based on embryonic phenotype and locomotor activity using a scoring system and the TCMacro method. Furthermore, we performed transcriptome and protein−protein interaction (PPI) network analyses to extract two mRNA signatures to query the Connectivity Map (CMap) database and predict NPs. The predicted NPs showed the potential to reverse the gene expression profiles associated with ZEA toxicity. Consequently, we further screened these compounds using our model, which indicated that hispidin, daphnetin, and riboflavin exhibit promising in vivo efficacy in zebrafish. Notably, throughout the process, fraxetin consistently stood out as the most promising NP. Biological pathway analysis and functional verification revealed that fraxetin completely reversed the toxic effects of ZEA at very low doses. This was achieved by repairing damaged cell apoptosis, modifying the cell cycle pathway, and preventing senescence induction, indicating good application potential. Overall, we demonstrated that this integration strategy can be successfully applied to effectively discover potential antidotes.

关键词

玉米赤霉烯酮 / 天然产物 / 表型筛选 / 转录组分析 / 秦皮素

Key words

Zearalenone / Natural products / Phenotype-based screening / Transcriptome analysis / Fraxetin

引用本文

引用格式 ▾
张鸿运,姜维丹,吴培,刘杨,任红梅,金小婉,周小秋,冯琳. 斑马鱼模型筛选揭示高效天然霉菌毒素解毒剂——缓解玉米赤霉烯酮诱导的毒性[J]. 工程（英文）, 2024, 42(11): 206-222 DOI:10.1016/j.eng.2024.03.016

登录浏览全文

4963

注册一个新账户 忘记密码

1 引言

玉米赤霉烯酮（ZEA）是由多种镰刀菌属真菌产生的一种主要霉菌毒素，对人类和动物的健康构成严重威胁[1‒2]。由于其高稳定性，ZEA可在全球范围内各种植物源原料中被检测到。谷物作物（如大麦、燕麦、玉米、小麦和稻米）在干燥、加工、运输和储存阶段很容易受到ZEA污染，其污染水平从每千克几微克到几百毫克甚至更高[3‒5]。此外，ZEA也可以在香料、干果、干蔬菜、牛奶和啤酒等饮料中被检出[5]。环境样本（如河水和废水）中同样检测到ZEA的存在[6‒7]。这种广泛的污染现状凸显了动物可能通过多种途径接触ZEA。

动物通常通过食用受污染的谷物摄入ZEA。然而，ZEA已被证实与多种毒性效应相关，包括肝毒性、免疫毒性、基因毒性、生殖毒性以及潜在的致癌性[3,5,8]。小鼠摄入ZEA后，会影响肝酶活性，触发脂质过氧化和氧化应激，从而造成肝损伤[9‒10]。在免疫细胞（如T淋巴细胞）中，ZEA过度激活有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，导致细胞凋亡和免疫功能受损[11]。此外，ZEA还会抑制细胞增殖，干扰细胞周期，并影响猪肠道上皮细胞系（IPEC-J2）的转录表达谱[12]。在小鼠睾丸细胞中，ZEA触发活性氧的积累，导致内质网应激，抑制细胞增殖，诱发细胞周期阻滞和凋亡[13]。ZEA的毒性机制很复杂，涉及多种细胞过程，这些效应既可单独作用，也可协同作用，最终对动物组织和器官造成严重损害。因此，许多国家针对谷物和谷物制品中的ZEA含量设定了限制标准[3‒5]。此外，欧洲食品安全局（EFSA）指出ZEA对人类健康的影响仍需进一步研究确认。根据国际癌症研究机构（IARC）的分类标准，ZEA被列为3类致癌物[8]。

为了最大限度减少食品和原料中ZEA污染对人和动物的不良影响，目前已经开发了多种脱毒方法[5]。然而，尚缺乏能完全清除作物中ZEA的有效手段。残留毒素通过食物摄入在生物体内持续蓄积，对机体健康构成潜在威胁。天然产物（NP）具有多种生物活性，在缓解ZEA等霉菌毒素方面展现出重要应用价值。已经有许多研究探索了NP对抗ZEA毒性的潜力，以减轻其不良影响[14]。越来越多的证据表明，使用NP进行营养干预可以提供保护效果[10,14]。将这些NP添加到动物饲料中可以降低ZEA的毒性。然而，发现用于解毒目的的有效NP通常是偶然的，它们在调节动物和细胞中的作用和效价方面存在差异。此外，传统的单次尝试方法阻碍了新潜在解毒剂的确定。研究往往只集中在少量物质的测试上，这阻碍了对更广泛化合物解毒潜力的全面评估[14]。因此，建立高效、系统的筛选方法对全面评价NP的解毒特性至关重要。

斑马鱼是基于表型小分子筛选的理想模型，其研究结果可转化至哺乳动物药理学领域[15‒17]。已有证据表明，该模型在化合物筛选中具有显著优势，能够高效发现活性化合物[17‒18]。相较于传统依赖单一尝试的方法，利用斑马鱼进行高通量和小分子筛选的优势在于研究人员可以对小分子库进行系统筛选，并找到符合预期活性的化合物[18]。此外，使用同一平台进行筛选还有助于建立对效价和功效的评估标准，从而加速新物质的开发和利用。基于整体生物体的表型筛选技术已被广泛验证为一种高效策略，用来发现具有独特活性的新化合物，这些化合物可以针对意想不到的体内靶标[17,19]。

随着对新型解毒剂的需求不断增加，本研究旨在建立一个系统的NP发现策略。本研究构建了一种基于表型的筛选方法，用于识别在动物中减轻或抵消ZEA暴露的不良影响的化合物。使用这种策略，首先鉴定了96种NP，并根据胚胎表型和运动活性，利用评分系统和TCMacro方法评估了几种有效的候选化合物的效价和功效。随后，本研究进行了转录组和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，从中提取特异性mRNA标签，并利用这些分子特征在连接图谱（CMap）数据库中筛选预测化合物。这些预测的化合物可能逆转ZEA毒性相关的基因表达谱变化，进而通过斑马鱼表型二次筛选验证其有效性。最后，研究通过实验验证了最具前景的高效NP，以证明当前策略的潜力。这种整合表型评估、转录组学、PPI网络分析、CMap预测和实验验证的多维策略，增加了发现高效可靠解毒NP的成功率。

2 材料和方法

2.1 试剂

ZEA购自Sigma，使用二甲基亚砜（DMSO）溶解并制备成20 mg∙mL-1的储备溶液，保存在-20 ℃条件下。每次实验前，使用CaCl2∙2H2O（294.0 mg∙L-1）、MgSO4∙7H2O（123.3 mg∙L-1）、NaHCO3（63.0 mg∙L-1）和KCl （5.5 mg∙L-1）配置培养基，用于制备ZEA测试溶液。这些分析纯化学试剂均购自中国国药化学试剂有限公司。筛选过程包括两个阶段：随机筛选（第一次筛选）和CMap分析筛选（第二次筛选）。筛选使用市售NP库（HY-L021，MCE），包含3948个小分子，这些小分子都因其高生物活性和功能作用而被选中作为研究对象。所有NP分别用100% DMSO或去离子水配置为浓度为10 mmol∙L-1的储备溶液，并保存在-80 ℃条件下。

2.2 斑马鱼饲养

AB品系成年斑马鱼在循环水养殖系统中饲养，光照/黑暗周期为14 h/10 h，恒定温度为（28 ± 1）℃。每日投喂两次丰年虾（Artemia nauplii）。实验前下午，将亲鱼隔离在孵化盒中，并在第二天同步产卵。产卵半小时后，收集斑马鱼胚胎，清洗放置在装满培养基的培养皿中，在恒温（28 ± 1）℃培养箱中孵育。直至受精后1.25 h（hpf），使用体视显微镜（Olympus SZ61）进行胚胎质量评估。未受精或有缺陷的胚胎将被排除在研究之外。实验操作严格遵循经济合作与发展组织（OECD，2013）颁布的毒性测试指南[20]。所有实验均获得四川农业大学动物保护与使用委员会的批准。

2.3 暴露实验设计

2.3.1 梯度浓度毒性测试

本研究选择6 hpf的斑马鱼胚胎进行ZEA浓度梯度毒性测试。实验在96孔板中进行，每个孔放置一个胚胎，或者在6孔板中每个孔放置20个胚胎。每个孔中填满了不同浓度的ZEA测试溶液，浓度范围为0~2500 μg∙L-1。在96孔板中，每个孔的最终液体体积为200 μL，而在6孔板中，每个孔的体积为4 mL。所有实验组（含对照组）均添加0.025% DMSO作为溶剂对照。培养温度维持在（28 ± 1）℃，每24 h更换新鲜测试溶液，并定期观察记录胚胎/幼虫存活状态，及时移除死亡个体。

2.3.2 一级筛选

在5 hpf，将单独的胚胎转移到96孔板中的每个独立孔中。第一轮筛选将在6 hpf进行，在10、20、40或80 µmol∙L-1浓度下，将每种NP与2000 μg∙L-1的ZEA在三个重复孔中一起给药。在24 hpf和48 hpf，使用体视显微镜对毒性表型（包括尾部缩短、头部/眼睛变小和组织不透明等）进行人工评估，以评估缓解效果。斑马鱼胚胎需同时具备上述三种表型的减轻方视为有效挽救。记录各化合物处理组中表型恢复的胚胎数量，如果一种化合物能够救出至少2/3的斑马鱼免受ZEA诱导的表型影响，则被宣布命中。需要注意的是，在实验过程中，不更换测试溶液。所有命中化合物将会在第二轮筛选中进行单独测试。

2.3.3 二级筛选

一旦化合物在一级筛选测试中显示出活性，就会进行浓度-反应实验，以绘制浓度-效应曲线，并对其进行验证。具体而言，采用6孔板培养体系（每孔20个胚胎），分别加入含2000 μg∙L-1 ZEA和不同浓度的目标化合物的测试溶液。对照组和处理组分别包含0.05%的DMSO，其余设置与梯度浓度毒性测试相同。通过浓度-效应曲线分析，计算各化合物的半数有效浓度（EC50）以评估其效价。

2.4 胚胎/幼虫毒性评估

2.4.1 畸形、死亡和孵化率

每日使用体视显微镜（Olympus SZ61）检查所有处理组胚胎/幼虫的状态。记录在24、48、72、96和120 hpf的畸形和死亡率以及在72、96和120 hpf的孵化率。死亡判断依据包括胚胎凝固、心跳消失、缺乏体节形成和尾芽与卵黄囊分离失败。详细过程参考OECD（2013）提供的毒性测试指南[20]。

2.4.2 形态特征

在72和120 hpf，使用0.016%的MS-222（Sigma）对斑马鱼进行麻醉，然后利用体视显微镜（Olympus SZ61）进行成像。按照先前描述的标准[21]对斑马鱼的形态特征进行评估，并使用ImageJ软件测量身长（BL）、口到泄殖孔距离（DMA）和游泳囊面积（SBA）等。

2.4.3 毒性评分

根据之前描述的方法，稍作修改，对幼虫的畸形和孵化情况进行评估[22]。具体方法参考附录A。评分规则参考附录A中的表S1。

2.5 效价分析

根据之前描述的方法，稍作修改，采用浓度-效应曲线分析对比各化合物的EC50值[23]。具体方法参考附录A。

2.6 功效分析

本研究从二级筛选中选择了有效的化合物进行进一步分析。针对每种感兴趣的化合物，进行了基于自发运动的功效分析，以研究其在缓解ZEA诱导毒性方面的潜力。自发运动的定量分析使用了TCMacro方法和ImageJ软件，对先前的方法进行了轻微修改[24]。详细方法参考附录A。

2.7 转录组数据采集和分析

参考附录A中的工作流程分析。

2.8 RNA提取和实时荧光定量PCR

具体方法参考附录A。引物序列参考附录A中的表S2，以β-actin作为内参基因。

2.9 免疫印迹

如前所述，进行免疫印迹[25]。更多细节可参考附录A。

2.10 细胞凋亡分析

具体方法参考附录A。

2.11 细胞周期分析

使用碘化丙啶（PI）染色和流式细胞术分析细胞周期进展。染色方法同前[26]。具体方法参考附录A。

2.12 细胞衰老分析

具体方法参考附录A。

2.13 双折射分析

基于前述方法，稍作修改，对肌肉双折射进行分析[27]。具体方法参考附录A。

2.14 统计分析

本研究采用GraphPad Prism 9.5.0版本（Graph Pad Software Inc.，美国）进行统计分析。数据的正态分布由D' Agostino-Pearson和Shapiro-Wilk检验评估。图注中提供了统计方法的详细说明。显著差异用不同数量的*表示，分别为*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001和****P < 0.0001。箱线图的触须展示了各组的最小和最大值，而所有图表中的误差线代表标准偏差。

3 结果

3.1 ZEA在斑马鱼体内表现出明显的剂量毒性反应

本研究分析了不同ZEA浓度下的结果，旨在建立合适的筛选模型。评估主要关注斑马鱼胚胎或幼虫在24、48、72、96和120 hpf暴露于ZEA时的形态缺陷和最低观察效应浓度（LOEC）。结果表明，在24 hpf，暴露于1500 μg∙L-1 ZEA的胚胎中，有80%出现头部和尾部形态的变化[图1（a）、（b）和附录A中的图S1]。此外，在48~120 hpf期间，暴露于浓度≥1500 μg∙L-1 ZEA的胚胎出现卵黄囊或心包水肿。然而，暴露于≤1000 μg∙L-1 ZEA的胚胎未发现任何异常，其形态与对照组相似。综上所述，1500 μg∙L-1是导致广泛形态异常的最低浓度（附录A中的表S3）。

在进一步检查孵化率和死亡率后发现，500 μg∙L-1的ZEA浓度可导致孵化延迟[图1（c）]，这证实了即使在最低浓度下，ZEA仍具有毒性效应。当ZEA浓度≤1000 μg∙L-1时，所有胚胎在96 hpf内孵化。然而在更高浓度下，情况有所不同。暴露于≥2000 μg∙L-1 ZEA的胚胎未能孵化，并在整个实验期间表现出严重生长异常。同时，高浓度（≥2000 μg∙L-1）处理组由于更严重的发育缺陷而出现胚胎死亡[图1（d）]，而低浓度（≤1000 μg∙L-1）处理组则未观察到这一现象。需要注意的是，ZEA毒性表现出剂量依赖性。综合这些结果，可以将导致50%幼虫死亡的浓度（LC50）、导致50%幼虫畸形的浓度（MC50）和导致50%幼虫孵化受阻的浓度（IC50）进行总结（附录A中的表S4）。初始时，LC50值为2380 μg∙L-1，而MC50值为1347 μg∙L-1。随着时间的推移，这些值逐渐下降，分别约为1694 μg∙L-1和1241 μg∙L-1。IC50范围介于1143~1531 μg∙L-1之间。这些结果支持一个结论，即ZEA毒性的综合效应与浓度相关，且会随着暴露时间和测试浓度的变化而变化。

与高浓度相比，低浓度（≤1000 μg∙L-1）ZEA组展现出较少的相关细节。考虑到ZEA可以导致孵化延迟，表明即使在低浓度下，ZEA的毒性效应仍然存在。为更全面地评估ZEA的浓度梯度效应，本研究对72和120 hpf斑马鱼的DMA、眼睛面积、心脏面积、SBA、头部高度和卵黄囊面积进行了量化[图1（e）~（h）和附录A中的图S2]。与对照组相比，1000 μg∙L-1 ZEA处理组在72 hpf DMA显著减小（P < 0.05）[图1（e）]。此外，在该浓度下72 hpf时，眼睛和心脏的面积也显著减少（P < 0.05）[图1（f）和（g）]。然而，这些影响在120 hpf时基本消失。这些结果表明，与1500 μg∙L-1 ZEA组的其他畸形不同，1000 μg∙L-1 ZEA组的不良影响可能源于生长抑制，且部分效应具有可逆性。需要注意的是，1000 μg∙L-1 ZEA处理组中，有50%胚胎在120 hpf时出现SBA缩小或消失[图1（h）]，说明ZEA的毒性效应仍然存在。相比之下，1500 μg∙L-1 ZEA处理组随着时间的推移表现出持续且更严重的形态变化[图1（e）~（h）]。此外，1500 μg∙L-1 ZEA还导致斑马鱼头部高度和卵黄囊面积的显著变化[附录A中的图S2（a）和（b）]。这些结果支持了低浓度（1000 μg∙L-1）ZEA抑制斑马鱼生长的观察结果。

综合所有测试浓度下的观察结果，ZEA均表现出毒性效应，其毒性特征呈现从无效应和致死浓度之间的渐进式过渡。在致死浓度和无效应浓度之间的中间浓度会导致孵化延迟、生长抑制或明显畸形。这些结果已在附录A表S5中进行了总结。

3.2 毒性表型的描述

在≥1500 μg∙L-1浓度条件下，观察到了一种先前未被识别的毒性表型，其特征包括尾巴缩短、头部/眼睛较小和组织不透明（图S1）。这些异常的严重程度受暴露时间和ZEA剂量的影响。具体而言，在24 hpf脱膜处理下，随着ZEA浓度的增加，所有胚胎均呈现头部透明度逐渐降低、尾长逐渐缩短的特征。重要的是，根据这些表型的存在、缺失或严重程度，可以明确区分不同浓度（1000、1500、2000和2500 μg∙L-1）处理的胚胎。

观察到的表型可以大致分为轻度、中度和重度（图S1）。轻度异常（ZEA1500）表现为头部和尾部局部透明度降低，组织结构不如对照组清晰。中度异常（ZEA2000）表现为头部/眼睛、躯干和尾部大面积透明度下降，部分结构完全消失。严重异常（ZEA2500）的胚胎完全丧失活动能力，伴随头部/眼睛尺寸以及尾长明显减小。在2000 μg∙L-1浓度条件下，24 hpf胚胎出现上述异常的比例为100%（以中度异常为主）。此外，该表型检测可以按照96孔板的格式进行，无需进一步特殊脱膜处理，表明此毒性表型可适用于快速高通量筛选。

3.3 基于毒性表型的化学筛选

考虑到24 hpf胚胎的表型可作为评估毒性水平的指标，我们假设这种表型可以用于快速筛选具有解毒潜力的物质。为验证这一假设，首先测试了不同NP是否可以减轻这些异常的严重程度。总共评估了96种NP，在四个不同浓度下进行了测试。附录A的表S6中包含了所有测试NP的信息，包括CAS编号以及在浓度为10、20、40和80 μmol∙L-1下的测试结果。3%的命中（三种不同的NP）明显改善了表型并增强了胚胎活性。其中一种NP—黄芩苷—已被证明可以在动物模型中减轻ZEA的毒性[28]。同样，基于其缓解效果，黄芩苷被确定为斑马鱼表型测定中的潜在缓解分子。第二种NP—羟基酪醇—能有效减轻多种霉菌毒素（如脱氧雪腐镰刀烯醇和赭曲霉毒素A）的毒性[29‒30]，然而其对ZEA毒性的影响尚不明确。最后一种NP—秦皮素—是本研究中新发现的。需要注意的是，10 μmol∙L-1的秦皮素足以显著减缓ZEA暴露的毒性[附录A中的图S3（a）]，而黄芩苷和羟基酪醇则需要40 μmol∙L-1才能实现类似效果。这三种NP将被用于进一步的分析。

为了验证这三种NP的潜在ZEA解毒作用，本研究在斑马鱼中进行了72 h的浓度-反应实验。通过畸形率、死亡率和孵化率来评估解毒效果。随后，根据这些结果建立了浓度-反应曲线。结果表明，秦皮素和羟基酪醇具有显著的ZEA毒性缓解作用（图2），而黄芩苷的解毒效果不稳定[伴随明显的形态异常或其他毒性；附录A中的图S3（b）]。值得注意的是，这两种有效NP的效价存在差异。秦皮素是最有效的一种[图2（e）]，其EC50值（4.57 μmol∙L-1）低于5 μmol∙L-1，而羟基酪醇的效价约为秦皮素的1/20，EC50值为92.08 μmol∙L-1 [图2（j）]。秦皮素在测试范围内能够完全逆转畸形和死亡率[图2（a）~（c）]。尽管在不同实验中比较毒性缓解效果具有一定难度，但尚未有其他NP像秦皮素一样被报道具有如此高效的解毒活性[14]。这些实例表明，结合表型分析的斑马鱼体内模型可作为识别和开发高效解毒活性物质的有效筛选工具。

3.4 基于自发运动的功效分析

本研究尝试开发新型检测方法，以更好地比较NP对ZEA等典型霉菌毒素的解毒能力。现有数据表明，不同浓度ZEA暴露可导致斑马鱼命运改变，包括孵化延迟和生长抑制，这引起了我们的关注。根据毒性表型，可以推测ZEA可能影响自发运动模式。在这种情况下，行为测定可能有助于评估ZEA引起的毒性效应。为了测试这一可能性，本研究采用TCMacro方法对19~22 hpf胚胎的自发运动参数进行了表征。已有研究表明，斑马鱼通常在17 hpf出现自发性的尾部卷曲运动，其频率呈现先升高后逐渐降低的变化趋势[31]。本研究结果表明，在所有ZEA浓度下，尾部卷曲频率分布存在显著差异。例如，在19 hpf时，对照组主要呈现50%~100%的尾部卷曲频率分布，而ZEA暴露组则主要呈现0~50%的分布[图3（a）]。这种效应的大小与浓度有关，表明ZEA以浓度依赖方式影响自发运动。值得注意的是，尾部卷曲频率的变化不仅仅是抑制性的。频率‒时间曲线表明，对照组的频率峰值出现在21 hpf，之后开始下降[图3（b）]。在500 μg∙L-1或1000 μg∙L-1浓度下观察到的频率峰值比对照组滞后约1~2 h。在19~22 hpf期间，500 μg∙L-1组的频率峰值从37%逐渐增加到77%，最终达到与对照组相当的水平（77.40% vs 77.29%）。相反，更高浓度ZEA（≥1500 μg∙L-1）进一步阻碍了自发运动功能，导致频率和运动强度降低[图3（c）]，这些浓度组难以达到最大频率峰值。此外，本研究构建了尾部卷曲频率和强度条码矩阵[图3（d）]，证实这种方法能有效区分各处理组间的差异，即使在最低浓度下也具有显著区分度。总的来说，这些发现证实了自发运动测定可提供比预期更详细的毒性效应信息。

随后进行了自发运动测定，以调查秦皮素（20和40 μmol∙L-1）或羟基酪醇（160和320 μmol∙L-1）的最佳有效剂量对ZEA毒性的缓解作用（1500 μg∙L-1）。结果表明，两种浓度的秦皮素（20和40 μmol∙L-1）均可以消除ZEA对斑马鱼的毒性效应，将尾部卷曲频率和强度恢复到接近正常水平[图3（e）]。秦皮素处理组的频率/强度‒时间曲线与对照组非常相似[图3（f）]，表明秦皮素有助于促进斑马鱼的生长。另一方面，160 μmol∙L-1的羟基酪醇部分中和了ZEA的毒性效应，其缓解效果相当于将ZEA暴露损伤降至约1000 μg∙L-1的水平[图3（e）]。虽然提高羟基酪醇浓度可略微增强缓解效果，但其尾部卷曲频率和强度仍明显低于对照组或秦皮素处理组[图3（f）和（g）]，表明羟基酪醇对ZEA的解毒能力相对有限。这一结果也得到了畸形率分析结果的支持[图2（a）、（b）、（f）和（g）]。因此，本研究成功建立了基于斑马鱼行为测定的ZEA毒性评估体系，该方法可用于比较不同NP的解毒效果，并为毒性缓解效应的可视化分析提供便捷手段。

除了基于行为测定的功效分析外，本研究还通过分别量化斑马鱼在72和120 hpf的头部、眼睛、心脏、卵黄囊和游泳囊的形态特征，验证了秦皮素和羟基酪醇对生长的作用。结果表明，两种浓度的秦皮素（20和40 μmol∙L-1）均显著逆转了ZEA引起的生长抑制和形态异常[图4（a）‒（g）]。秦皮素处理组的DMA和BL水平均高于对照组[图4（b）和附录A中的图S4（a）]，表明具有明显的缓解效果。此外，秦皮素可能促进了卵黄囊的吸收（P = 0.09），从而支持斑马鱼生长[图4（d）]。形态参数的主成分分析（PCA）/聚类分析表明三组之间没有显著的表型差异[图4（h）]。相比之下，羟基酪醇在160和320 μmol∙L-1浓度下仅部分抵消了ZEA的毒性效应[图4（i）~（l）、附录A中的图S4（b）和（c）]。在72和120 hpf，仍可以观察到头部变小和游泳囊消失[图4（i）和（k）]。PCA分析表明各组间存在明显的聚类差异[图4（j）]，且所有形态参数均弱于对照组，说明羟基酪醇对ZEA的解毒能力明显较弱。这一发现与ZEA行为测定的结果一致。

3.5 鉴定ZEA毒性测试中基因网络分析的关键节点和子网络

秦皮素显著的缓解效果促使我们进一步分析相关功能分子的作用机制。本研究首先研究了1500 μg∙L-1 ZEA处理组与DMSO对照组24 hpf斑马鱼的基因表达谱差异（详见第2节）。为了可视化这些差异表达基因（DEG）间的生物网络关系，使用STRING数据库（附录A中的图S5）和Cytoscape软件进行了基因互作网络分析。通过cytoHubba插件识别出具有差异表达的密集连接子网络，并评估了网络中可能的关键调控节点。基于MCC、DMNC、MNC、Degree和EPC算法，筛选出10个核心枢纽基因（附录A中的表S7）。使用Cytoscape重新优化网络布局并缩小分析范围后，最终确定了一个包含79个DEG的关键子网络[图5（a）]。在这个子网络中，p53表现出最高的网络连接度（degree = 56），成为斑马鱼毒性响应中最核心的节点。这一发现与既往研究一致，即p53在其他细胞系中同样对ZEA毒性起关键作用[32‒33]，证实了斑马鱼和其他生物系统对ZEA毒性存在保守的基因响应网络。为了确认整个子网络的核心特征，进一步使用MCODE聚类算法生成了三个模块：聚类1~3。

3.6 秦皮素逆转ZEA诱导的信号通路改变

接下来，本研究聚焦子网络信号通路和集群节点的功能。通过京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，评估了子网络与已知通路的关联性。功能富集分析揭示，整个子网络主要涉及细胞生长和死亡[附录A中的图S6（a）]，这与ZEA暴露导致的斑马鱼毒性表型（如组织不透明和体型缩小）高度吻合。此外，这些基因主要参与内质网中的蛋白质加工、p53信号通路、MAPK信号通路、细胞凋亡、FoxO信号通路、细胞周期和细胞衰老[图S6（b）]。需要注意的是，细胞凋亡、细胞周期和细胞衰老已知是调控网络的下游。另外，通过KEGG分析还鉴定出多个受多通路协同调控的诱导基因[图5（b）和（c）]。其中部分基因同时属于集群节点。为评估秦皮素的调控作用，本研究分析了其对上述特定基因的逆转能力。结果表明，40 μmol∙L-1秦皮素处理可使9个检测基因恢复至对照水平，而20 μmol∙L-1处理则能逆转5个测试基因表达，这可能是其减轻ZEA毒性的分子基础[图5（d）]。基于此，本研究进一步检查了关键节点蛋白p53的表达水平（附录A中的图S7），发现秦皮素显著降低了ZEA诱导的p53过表达。这些结果支持了秦皮素在逆转ZEA毒性中的作用。

3.7 秦皮素明显抑制ZEA诱导的细胞凋亡、G2期阻滞和细胞衰老

根据以上结果，ZEA毒性可能通过调控细胞凋亡、细胞周期或细胞衰老等途径直接影响细胞命运。为了确定秦皮素如何影响细胞生长和死亡，本研究使用吖啶橙（AO）染色检查了秦皮素处理或未处理的斑马鱼胚胎细胞的凋亡模式。结果表明，与对照组相比，ZEA显著促进了细胞凋亡[图6（a）~（d）]。然而，秦皮素与ZEA共同处理逆转了ZEA单独处理诱导的凋亡效应，尤其在脊索背侧区域（DSN）最为显著。Hoechst染色证实了这些结果，秦皮素处理减少了核浓缩和碎裂[图6（e）]。这些发现表明，秦皮素在斑马鱼模型中展现出显著的解毒功效，其作用机制可能通过抑制ZEA诱导的细胞死亡途径来提高细胞在毒性损伤中的存活能力。

先前研究表明，ZEA可诱导小鼠细胞发生G2期停滞[13,34‒35]。KEGG通路分析表明，与细胞周期相关的过程得到了富集。为了在斑马鱼模型中验证这一点，本研究使用流式细胞术分析细胞周期，并观察到在ZEA处理后G2期比例增加[图6（f）和（g）]。有趣的是，秦皮素处理能够逆转ZEA诱导的细胞周期阻滞，表明秦皮素可能通过调控细胞周期进程来恢复斑马鱼细胞的正常生长。

为进一步探究秦皮素对细胞衰老的影响，本研究采用衰老相关-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色法，分别在24和72 hpf斑马鱼中检测衰老细胞。结果表明，24 hpf斑马鱼的SA-β-gal染色未出现明显变化[图6（h）和（i）]。然而，在72 hpf，ZEA处理导致SA-β-gal阳性区域比例明显增加[图（j）和（k）]。与凋亡和细胞周期阻滞的结果一致，秦皮素共同处理完全逆转了ZEA诱导的细胞衰老效应。总的来说，这些发现进一步证实了筛选结果，表明秦皮素可能是ZEA毒性的清除剂。

3.8 CMap分析可用于识别更有效的NP

信号通路的改变可能在ZEA毒性中起到关键作用，因此鉴定可以逆转这些基因表达变化的化合物可能成为筛选ZEA解毒物质的有效策略。为开展这项研究，本研究使用了CMap数据库（https://clue.io/）进行分析，该数据库收录了多种生物活性小分子处理人类细胞后产生的基因表达谱数据[36]。通过特征基因标记可筛选出能够诱导目标基因表达所需变化的化合物[36‒37]。研究首先对第一组特征基因[所有DEG，图7（a）和附录A中的表S8]在CMap平台上进行了查询。有趣的是，初步结果表明，秦皮素在至少五个细胞系中诱导的基因表达与ZEA处理呈负相关[附录A中的图S8（a）]，这表明了CMap预测的可行性。基于此，本研究选择秦皮素作为阳性对照，并提取两组查询结果：①总数据集；②HA1E细胞子集。本研究将重点放在HA1E（肾细胞）子集上，因在此细胞系中秦皮素与ZEA处理呈现高度负相关性，提示该子集更可能发现具有类似于秦皮素活性的NP。基于此，鉴定出了多个能负调控ZEA毒性相关基因表达模式的化合物，其中包括秦皮素。由于本研究仅关注NP，因此对使用CMap数据库获得的化合物进行了额外的比对分析，并与现有的NP库（MCE、HY-L021）进行了名称匹配搜索。最终从两个数据库中鉴定出120个共有NP，其中73个来自总数据集，47个来自HA1E子集，且部分NP存在重叠。查询1的完整工作流程见图7（b）。

为了进一步阐明CMap分析的结果，本研究选取排名靠前的NP处理斑马鱼胚胎（查询1：总数据集和HA1E子集），并通过表型筛选评估其作用。测试涉及的物质名称、CAS编号及在10~80 μmol∙L-1浓度范围内的处理结果汇总在附录A的表S9中。从这些排名靠前的NP中，共确定出11个能显著改善胚胎表型的候选化合物[图7（c）~（e）]，其中总数据集和HA1E子集的筛选命中率分别为27.27%（3/11）和47.37%（9/19，含一个重叠化合物）。这些发现强烈表明CMap分析提高了筛选的准确性和成功率。

接下来，本研究评估了枢纽基因集是否具有相同的筛选效能[图7（b）的查询2]。为了测试这一假设，本研究通过ZEA调控的68个关键基因标记进行了CMap二次检索[附录A中的图S8（b）和表S10]，结果表明两次搜索结果高度一致。两种策略都将泼尼松龙、胃酶抑素和紫杉醇预测为潜在的解毒化合物，并预测了类似的排名靠前化合物[附录A中的图S8（c）以及图7（c）和（d）]。对其他排名靠前化合物的表型筛选另鉴定出11个新候选化合物，筛选命中率达40%（18/45，其中七个化合物重叠）[附录A中的表S11、图S8（d）和图S7（e）]。综上所述，枢纽基因集和全DEG集都可以作为有效的CMap查询标记。

3.9 核黄素用于验证斑马鱼的CMap分析结果

图7（e）和附录A中的图S8（e）展示了22种候选化合物的评估效果，其中包括多项研究中已报道的潜在解毒或拮抗化合物[38‒40]。尽管筛选获得了大量候选NP，但多数表现出相对较低的生物活性。因此，本研究选择效果最好的化合物进行深入分析，因为低活性NP可能无法完全逆转ZEA毒性，其研究价值相对有限。

根据筛选效果，候选NP被划分为两组。第一组只包括三种NP：牛奶树碱、瑞香素和核黄素。初步推测这三种NP的效果可能与羟基酪醇相近（附录A中的图S9）。其中，核黄素作为B族维生素引起了我们的关注，并被选为CMap结果的验证对象。首先评估了核黄素的效价和功效，结果表明核黄素在测试浓度范围内未能完全恢复ZEA诱导的斑马鱼缺陷[图8（a）~（d）]，其EC50值为87.83 μmol∙L-1，与羟基酪醇相当，但约是秦皮素的1/19[图8（e）]。自发运动分析发现，160 μmol∙L-1核黄素处理组的尾部卷曲频率和强度条形码矩阵与对照组模式相似，但弱于对照组[图8（f）]。有趣的是，240 μmol∙L-1核黄素的作用导致卷曲频率和强度显著下降，间接表明解毒效果降低[图8（g）]。因此，核黄素表现出一定的ZEA毒性缓解作用，但其整体效果仍不及秦皮素。

3.10 秦皮素单独促进了斑马鱼幼虫的生长

在本实验中，秦皮素是缓解ZEA毒性最有效的NP。图9（a）和（b）显示，在单独秦皮素处理72或120 h后，斑马鱼的BL和DMA均呈现剂量依赖性增长，其中在40或80 μmol∙L-1浓度下分别达到最大效应值。此外，本研究还测量了肌节间距和肌肉双折射强度[图9（c）~（h）]。结果表明，肌节间距随秦皮素浓度升高而逐渐增加，同时肌肉双折射强度也呈上升趋势。这些观察结果表明，秦皮素还具有促进斑马鱼生长的潜在功效。

为评估秦皮素处理的安全性，本研究对斑马鱼头部、卵黄囊和游泳囊特征进行了定量分析。结果表明，在测试浓度范围内，秦皮素未对72和120 hpf斑马鱼形态产生不良影响[图9（i）~（k）]。此外，秦皮素对孵化率也没有不良影响，反而促进了60 hpf斑马鱼胚胎的孵化进程[图9（l）]。综合这些结果，本研究未发现秦皮素在斑马鱼模型中表现出可观测的毒性效应。

4 讨论

ZEA的毒性效应在斑马鱼中已得到广泛研究[41‒42]。前期研究和我们的结果表明，ZEA可以在斑马鱼的胚胎和幼虫阶段诱发毒性相关表型。尽管本实验发现的特定毒性表型尚未见前人报道，但通过基于表型的筛选，我们成功鉴定出能够减轻ZEA毒性效应的NP。这种筛选方法可拓展应用于其他霉菌毒素的毒性研究及相应解毒化合物的发现。此外，本研究开发了一种高效的评估体系，将毒性评分系统与自动化测量脚本（TCMacro方法）结合，用于跟踪和量化斑马鱼的自发运动参数。这种方法能够在特定浓度下测试候选化合物，并提供了一种方便的方式来可视化缓解效果，促进多种化合物的比较分析，从而筛选出更具有优越的化合物。因此，这一方法将大大加速相关物质的开发与应用。同样，该方法已被用来验证和比较三种代表性候选化合物的效价和功效：秦皮素、羟基酪醇和核黄素。此外，新发现的候选化合物能以多种方式逆转毒性作用，表明基于表型的大规模筛选策略为研究小分子NP与ZEA毒性之间的关系提供了新的视角。

ZEA引起斑马鱼细胞转录谱广泛变化，影响超过500个mRNA的表达，与之前发表的研究结果一致[12,34]。然而，这些mRNA中只有少数在斑马鱼和其他动物模型中得到了深入研究。尽管目前仍不确定调节这些mRNA变化的确切机制，但利用这些数据建立了第一个CMap查询基础。此外，通过使用枢纽基因构建的PPI网络，本研究重新映射了相互作用布局，并缩小了搜索范围，直到找到一个由79个DEG组成的子网络，即第二个CMap查询基础。本研究观察到，在两个独立的CMap查询中，当预测高分化合物时，这两组查询标记之间存在显著重叠，表明该子网络能代表全局变化。另外，CMap分析还发现了数十种基于该模型预测的ZEA诱导毒性的潜在解毒剂，这表明本研究的筛选策略可以与CMap数据库结合使用，从而扩大筛选规模和命中率。总之，对差异表达mRNA及其相关生物学功能的进一步分析可能有助于揭示对ZEA的复杂响应机制，并阐明这种毒素在斑马鱼中发挥作用的特定途径。这些知识可以帮助制定用于减轻或抵消ZEA暴露的不良影响的策略。

迄今为止，对霉菌毒素解毒的研究非常有限，通常只关注少数几种小分子化合物。本研究对数百种NP进行了测试，且所有测试都在相同严格的控制条件下进行了严谨评估。这种广泛的测试允许对这些物质的效应进行全面分析，并确保可靠和一致的结果。在本研究的筛选过程中，成功鉴定和验证了几种展现缓解效应的NP。在初筛阶段，秦皮素、羟基酪醇和黄芩苷是最早发现的解毒剂。其中，羟基酪醇是一种多酚化合物，黄芩苷是一种黄酮化合物，因其抗氧化和抗炎性能而受到了广泛关注。有趣的是，羟基酪醇可以缓解肾脏和HepG2细胞中多种霉菌毒素（如脱氧雪腐镰刀烯醇和赭曲霉毒素A）引起的毒性[29‒30]。然而，它对ZEA毒性的具体缓解作用仍不清楚[38]。同样，黄芩苷可以保护小鸡免受ZEA引起的器官损伤[28]，进一步证实了其作为ZEA解毒剂的作用。此外，本研究还发现秦皮素是一种能够逆转ZEA在斑马鱼中引起的毒性效应的有效NP，这扩大了能够使用表型筛选策略鉴定的潜在解毒物质的范围。

本研究发现秦皮素具有显著的有效性，能够完全逆转ZEA引起的毒性效应。在所测试的实验中，ZEA在斑马鱼中引发了G2期细胞周期阻滞和凋亡，这些反应在各种细胞模型中一直得到一致观察[13,35,43]。秦皮素是一种存在于传统草药植物大叶白蜡树中的香豆素，以其多种生物活性（包括抗氧化、抗炎和抗癌特性）而闻名。长期以来，人们一直在研究秦皮素在癌症治疗中的潜在用途，特别是其诱导凋亡和细胞周期阻滞的能力[44‒45]。本研究结果表明，秦皮素可以逆转ZEA引起的凋亡和细胞周期阻滞。此外，细胞衰老状态是由于不可修复的亚致死损伤，如DNA损伤、氧化应激和无法进入细胞凋亡而导致的无限期细胞周期阻滞[46]。在长时间暴露于ZEA后，本研究还观察到斑马鱼中有许多衰老细胞，我们相信这是ZEA毒性中的主要细胞损伤反应之一。最近的研究表明，ZEA在体外和体内诱导心血管细胞衰老[47]，然而秦皮素却消除了这种效应。这些新发现凸显了秦皮素逆转ZEA诱导的毒性的潜力。

从机制上看，秦皮素通过调控多条ZEA激活的信号通路发挥解毒作用，包括内质网中的蛋白质加工、p53信号通路和FoxO信号通路。已证明秦皮素影响了这些信号通路中关键基因的表达，包括hsp70.1、p53、cdkn1a、rbl2、fosl1a、gadd45ab、baxa、fos、mdm2、ccng1和parp3。有趣的是，其中一些基因也是调控凋亡、细胞周期和细胞衰老的关键效应分子，如p53、cdkn1a、rbl2、gadd45ab、baxa和parp3 [48‒51]。需要注意的是，秦皮素对这些下游效应分子的调节与减缓ZEA毒性效应的结果高度吻合。KEGG通路分析表明，p53和FoxO信号通路的改变可能是引发这些效应的上游调控事件。换句话说，秦皮素的解毒作用可能通过抑制p53和FoxO两条信号通路的内在功能实现，而这两条通路最终会在下游节点交会，共同决定细胞的命运走向[52‒54]。然而，这一发现引出了一个关键科学问题，即哪些潜在介质分子和上游事件导致了p53或FoxO通路的抑制？同时，秦皮素可能调控其他信号通路，如内质网中的蛋白加工或MAPK通路，这些通路可能与p53和FoxO通路存在交互作用[55‒56]。换言之，不同信号通路之间可能存在着复杂的“串扰”（crosstalk）机制，共同产生最终的下游效应。这些问题相当复杂，需要进一步研究。然而，本研究的发现表明秦皮素是一种有效的解毒剂，可以拮抗ZEA诱导的斑马鱼基因表达变化，这为未来开发新型解毒剂提供了极具价值的研究方向。需要注意的是，尽管使用斑马鱼的表型方法来发现霉菌毒素解毒剂解决了传统方法的一些局限性，但仍然存在一些挑战，包括分辨率不足和实验复杂性。此外，尽管本研究发现许多在其他动物中具有解毒效果的NP也能缓解斑马鱼的毒性表型，但一些NP在表型筛选中未能引起任何可检测的变化。未来的研究应该解决这些问题。

5 总结

本研究旨在建立一种高效可扩展的表型筛选过程，以发现对霉菌毒素具有解毒作用的化合物。通过在活体脊椎动物（尤其是斑马鱼）中进行毒性表型分析，本研究为筛选有潜力的NP提供了新的视角。利用斑马鱼进行筛选将加快有价值NP的发现，并帮助研究人员更深入地了解这些NP如何有效地缓解霉菌毒素引起的毒性影响。这种创新策略有望推动化合物的发现并增进对基于NP的霉菌毒素干预策略的理解。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用
[1]

Claeys L, Romano C, De Ruyck K, Wilson H, Fervers B, Korenjak M, et al. Mycotoxin exposure and human cancer risk: a systematic review of epidemiological studies. Compr Rev Food Sci Food Saf 2020;19(4):1449‒64. . 10.1111/1541-4337.12567
[2]

Bryden WL. Mycotoxin contamination of the feed supply chain: implications for animal productivity and feed security. Anim Feed Sci Technol 2012;173(1‒2):134‒58. . 10.1016/j.anifeedsci.2011.12.014
[3]

Gromadzka K, Waskiewicz A, Chelkowski J, Golinski P. Zearalenone and its metabolites: occurrence, detection, toxicity and guidelines. World Mycotoxin J 2008;1(2):209‒20. . 10.3920/wmj2008.x015
[4]

Smith MC, Madec S, Coton E, Hymery N. Natural co-occurrence of mycotoxins in foods and feeds and their in vitro combined toxicological effects. Toxins 2016;8(4):94. . 10.3390/toxins8040094
[5]

Zinedine A, Soriano JM, Moltó JC, Mañes J. Review on the toxicity, occurrence, metabolism, detoxification, regulations and intake of zearalenone: an oestrogenic mycotoxin. Food Chem Toxicol 2007;45(1):1‒18. . 10.1016/j.fct.2006.07.030
[6]

Gromadzka K, Waskiewicz A, Swietlik J, Bocianowski J, Golinski P. Possible way of zearalenone migration in the agricultural environment. Plant Soil Environ 2015;61(8):358‒63. . 10.17221/8356-pse
[7]

Gromadzka K, Was´kiewicz A, Goliń ski P, Swietlik J. Occurrence of estrogenic mycotoxin—zearalenone in aqueous environmental samples with various NOM content. Water Res 2009;43(4):1051‒9. . 10.1016/j.watres.2008.11.042
[8]

Han X, Huangfu B, Xu T, Xu W, Asakiya C, Huang K, et al. Research progress of safety of zearalenone: a review. Toxins 2022;14(6):386. . 10.3390/toxins14060386
[9]

Maaroufi K, Chekir L, Creppy EE, Ellouz F, Bacha H. Zearalenone induces modifications of haematological and biochemical parameters in rats. Toxicon 1996;34(5):535‒40. . 10.1016/0041-0101(96)00008-6
[10]

Ben Salem I, Boussabbeh M, Helali S, Abid-Essefi S, Bacha H. Protective effect of crocin against zearalenone-induced oxidative stress in liver and kidney of balb/c mice. Environ Sci Pollut Res Int 2015;22(23):19069‒76. . 10.1007/s11356-015-5086-2
[11]

Cai G, Sun K, Xia S, Feng Z, Zou H, Gu J, et al. Decrease in immune function and the role of mitogen-activated protein kinase (MAPK) overactivation in apoptosis during T lymphocytes activation induced by zearalenone, deoxynivalenol, and their combinations. Chemosphere 2020;255:126999. . 10.1016/j.chemosphere.2020.126999
[12]

Wang X, Yu H, Fang H, Zhao Y, Jin Y, Shen J, et al. Transcriptional profiling of zearalenone-induced inhibition of IPEC-J2 cell proliferation. Toxicon 2019;172:8‒14. . 10.1016/j.toxicon.2019.10.004
[13]

Zheng W, Wang B, Wang L, Shan Y, Zou H, Song R, et al. ROS-mediated cell cycle arrest and apoptosis induced by zearalenone in mouse sertoli cells via ER stress and the ATP/AMPK pathway. Toxins 2018;10(1):24. . 10.3390/toxins10010024
[14]

Jing S, Liu C, Zheng J, Dong Z, Guo N. Toxicity of zearalenone and its nutritional intervention by natural products. Food Funct 2022;13(20):10374‒400. . 10.1039/d2fo01545e
[15]

Spitsbergen JM, Kent ML. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research—advantages and current limitations. Toxicol Pathol 2003;31():62‒87. . 10.1080/01926230390174959
[16]

Lin CY, Chiang CY, Tsai HJ. Zebrafish and Medaka: new model organisms for modern biomedical research. J Biomed Sci 2016;23:19. . 10.1186/s12929-016-0236-5
[17]

Zon LI, Peterson RT. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov 2005;4(1):35‒44. . 10.1038/nrd1606
[18]

Rennekamp AJ, Peterson RT. 15 years of zebrafish chemical screening. Curr Opin Chem Biol 2015;24:58‒70. . 10.1016/j.cbpa.2014.10.025
[19]

Kwok TC, Ricker N, Fraser R, Chan AW, Burns A, Stanley EF, et al. A small-molecule screen in C . elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature 2006;441(7089):91‒5. . 10.1038/nature04657
[20]

OECD Guidelines for the testing of chemicals-fish embryo acute toxicity FET) test. Paris: OECD Publishing; 2013. . 10.1787/9789264203709-en
[21]

Ribeiro RX, da Silva BR, Pereira AC, Monteiro KBES, Gonçalves BB, Rocha TL. Ecotoxicological assessment of effluents from Brazilian wastewater treatment plants using zebrafish embryotoxicity test: a multi-biomarker approach. Sci Total Environ 2020;735:139036. . 10.1016/j.scitotenv.2020.139036
[22]

Padilla S, Hunter DL, Padnos B, Frady S, MacPhail RC. Assessing locomotor activity in larval zebrafish: influence of extrinsic and intrinsic variables. Neurotoxicol Teratol 2011;33(6):624‒30. . 10.1016/j.ntt.2011.08.005
[23]

Padilla S, Corum D, Padnos B, Hunter DL, Beam A, Houck KA, et al. Zebrafish developmental screening of the ToxCastTM Phase I chemical library. Reprod Toxicol 2012;33(2):174‒87. . 10.1016/j.reprotox.2011.10.018
[24]

Kurnia KA, Santoso F, Sampurna BP, Audira G, Huang JC, Chen KH, et al. TCMacro: a simple and robust ImageJ-based method for automated measurement of tail coiling activity in zebrafish. Biomolecules 2021;11(8):1133. . 10.3390/biom11081133
[25]

Zhang H, Wang Y, Zhou X, Jiang W, Wu P, Liu Y, et al. Zearalenone induces immuno-compromised status via TOR/NF/jB pathway and aggravates the spread of Aeromonas hydrophila to grass carp gut (Ctenopharyngodon idella). Ecotoxicol Environ Saf 2021;225:112786. . 10.1016/j.ecoenv.2021.112786
[26]

Verduzco D, Amatruda JF. Analysis of cell proliferation, senescence, and cell death in zebrafish embryos. Methods in Cell Biology 2011;101:19‒38. . 10.1016/b978-0-12-387036-0.00002-5
[27]

Smith LL, Beggs AH, Gupta VA. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp 2013;82:e50925. . 10.3791/50925
[28]

Xu J, Li S, Jiang L, Gao X, Liu W, Zhu X, et al. Baicalin protects against zearalenone-induced chicks liver and kidney injury by inhibiting expression of oxidative stress, inflammatory cytokines and caspase signaling pathway. Int Immunopharmacol 2021;100:108097. . 10.1016/j.intimp.2021.108097
[29]

Zhang X, Jiang L, Geng C, Cao J, Zhong L. The role of oxidative stress in deoxynivalenol-induced DNA damage in HepG2 cells. Toxicon 2009;54(4):513‒8. . 10.1016/j.toxicon.2009.05.021
[30]

Crupi R, Palma E, Siracusa R, Fusco R, Gugliandolo E, Cordaro M, et al. Protective effect of hydroxytyrosol against oxidative stress induced by the ochratoxin in kidney cells: in vitro and in vivo study. Front Vet Sci 2020;7:136. . 10.3389/fvets.2020.00136
[31]

Zhang K, Liang J, Brun NR, Zhao Y, Werdich AA. Rapid zebrafish behavioral profiling assay accelerates the identification of environmental neurodevelopmental toxicants. Environ Sci Technol 2021;55(3):1919‒29. . 10.1021/acs.est.0c06949
[32]

Bouaziz C, Martel C, el Dein OS, Abid-Essefi S, Brenner C, Lemaire C, et al. Fusarial toxin-induced toxicity in cultured cells and in isolated mitochondria involves PTPC-dependent activation of the mitochondrial pathway of apoptosis. Toxicol Sci 2009;110(2):363‒75. . 10.1093/toxsci/kfp117
[33]

Lee HJ, Oh SY, Jo I. Zearalenone induces endothelial cell apoptosis through activation of a cytosolic Ca2+/ERK1/2/p53/Caspase 3 signaling pathway. Toxins 2021;13(3):187. . 10.3390/toxins13030187
[34]

Xie H, Hu J, Xiao C, Dai Y, Ding X, Xu Y. Exploration of ZEA cytotoxicity to mouse endometrial stromal cells and RNA-seq analysis. J Biochem Mol Toxicol 2017;31(4):e21874. . 10.1002/jbt.21874
[35]

Ji Y, Zhang K, Pan Z, Ju J, Zhang H, Liu J, et al. High-dose zearalenone exposure disturbs G2/M transition during mouse oocyte maturation. Reprod Toxicol 2022;110:172‒9. . 10.1016/j.reprotox.2022.04.009
[36]

Subramanian A, Narayan R, Corsello SM, Peck DD, Natoli TE, Lu X, et al. A next generation connectivity map: Ll 000 platform and the first 1 000 000 profiles. Cell 2017;171(6):1437‒1452.e17.
[37]

Brum AM, van de Peppel J, van der Leije CS, Schreuders-Koedam M, Eijken M, van der Eerden BC, et al. Connectivity map-based discovery of parbendazole reveals targetable human osteogenic pathway. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112(41):12711‒6. . 10.1073/pnas.1501597112
[38]

Gao F, Jiang LP, Chen M, Geng CY, Yang G, Ji F, et al. Genotoxic effects induced by zearalenone in a human embryonic kidney cell line. Mutat Res 2013;755(1):6‒10. . 10.1016/j.mrgentox.2013.04.009
[39]

Zhu W, Ge M, Li X, Wang J, Wang P, Tai T, et al. Hyperoside Attenuates Zearalenone-induced spleen injury by suppressing oxidative stress and inhibiting apoptosis in mice. Int Immunopharmacol 2022;102:108408. . 10.1016/j.intimp.2021.108408
[40]

Aichinger G, Beisl J, Marko D. The hop polyphenols xanthohumol and 8-prenyl-naringenin antagonize the estrogenic effects of Fusarium mycotoxins in human endometrial cancer cells. Front Nutr 2018;5:85. . 10.3389/fnut.2018.00085
[41]

Bakos K, Kovács R, Staszny Á, Sipos DK, Urbányi B, Müller F, et al. Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol 2013;136:13‒21. . 10.1016/j.aquatox.2013.03.004
[42]

Muthulakshmi S, Maharajan K, Habibi HR, Kadirvelu K, Venkataramana M. Zearalenone induced embryo and neurotoxicity in zebrafish model (Danio rerio): role of oxidative stress revealed by a multi biomarker study. Chemosphere 2018;198:111‒21. . 10.1016/j.chemosphere.2018.01.141
[43]

Wang B, Zheng W, Feng N, Wang T, Zou H, Gu J, et al. The effects of autophagy and PI3K/AKT/m-TOR signaling pathway on the cell-cycle arrest of rats primary sertoli cells induced by zearalenone. Toxins 2018;10(10):398. . 10.3390/toxins10100398
[44]

Lee M, Yang C, Park S, Song G, Lim W. Fraxetin induces cell death in colon cancer cells via mitochondria dysfunction and enhances therapeutic effects in 5-fluorouracil resistant cells. J Cell Biochem 2022;123(2):469‒80. . 10.1002/jcb.30187
[45]

Song J, Ham J, Hong T, Song G, Lim W. Fraxetin suppresses cell proliferation and induces apoptosis through mitochondria dysfunction in human hepatocellular carcinoma cell lines huh7 and hep3b. Pharmaceutics 2021;13(1):112. . 10.3390/pharmaceutics13010112
[46]

Ewald JA, Desotelle JA, Wilding G, Jarrard DF. Therapy-induced senescence in cancer. J Natl Cancer Inst 2010;102(20):1536‒46. . 10.1093/jnci/djq364
[47]

Wang K, Zhou M, Du Y, Li P, Huang Z. Zearalenone induces the senescence of cardiovascular cells in vitro and in vivo. Environ Sci Pollut Res Int 2023;30(19):56037‒53. . 10.1007/s11356-023-25869-x
[48]

Moujalled D, Strasser A, Liddell JR. Molecular mechanisms of cell death in neurological diseases. Cell Death Differ 2021;28(7):2029‒44. . 10.1038/s41418-021-00814-y
[49]

Wang XW, Zhan Q, Coursen JD, Khan MA, Kontny HU, Yu L, et al. GADD45induction of a G2/M cell cycle checkpoint. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96(7):3706‒11. . 10.1073/pnas.96.7.3706
[50]

Schade AE, Fischer M, DeCaprio JARB. RB, p130 and p107 differentially repressG1/S and G2/M genes after p53 activation. Nucleic Acids Res 2019;47(21):11197‒208. . 10.1093/nar/gkz961
[51]

Cheung TH, Quach NL, Charville GW, Liu L, Park L, Edalati A, et al. Maintenance of muscle stem-cell quiescence by microRNA-489. Nature 2012;482(7386):524‒8. . 10.1038/nature10834
[52]

Danilova N, Sakamoto KM, Lin S. Role of p53 family in birth defects: lessons from zebrafish. Birth Defects Res C Embryo Today 2008;84(3):215‒27. . 10.1002/bdrc.20129
[53]

Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS, et al. Akt promotes cell survival by phosphorylating and inhibiting a fork head transcription factor. Cell 1999;96(6):857‒68. . 10.1016/s0092-8674(00)80595-4
[54]

Motta MC, Divecha N, Lemieux M, Kamel C, Chen D, Gu W, et al. MammalianSIRT1 represses fork head transcription factors. Cell 2004;116(4):551‒63. . 10.1016/s0092-8674(04)00126-6
[55]

Fang L, Li G, Liu G, Lee SW, Aaronson SA. p53 induction of heparin-binding EGF-like growth factor counteracts p53 growth suppression through activation of MAPK and PI3K/Akt signaling cascades. EMBO J 2001;20(8):1931‒2199. . 10.1093/emboj/20.8.1931
[56]

Zylicz M, King FW, Wawrzynow A. Hsp70 interactions with the p53 tumour suppressor protein. EMBO J 2001;20(17):4634‒8. †10.1093/emboj/20.17.4634
AI Summary AI Mindmap
PDF (7986KB)

Supplementary files

2024-42-11-S196

3069

访问

0

被引

详细
导航
相关文章

AI思维导图

/

〈 〉