从“铁-骨/脂”代谢稳态探索雷公藤多苷片治疗类风湿关节炎的“效/毒”关联机制

丁子禾; 王晓月; 张依; 刘健; 万磊; 李涛; 陈凛; 林娜; 张彦琼

doi:10.1016/j.eng.2024.04.003

工程（英文） ›› 2024, Vol. 39 ›› Issue (8) : 178 -192. DOI: 10.1016/j.eng.2024.04.003

研究论文

从“铁-骨/脂”代谢稳态探索雷公藤多苷片治疗类风湿关节炎的“效/毒”关联机制

丁子禾 ^a ,
王晓月 ^a ,
张依 ^a ,
刘健 ^b ,
万磊 ^b ,
李涛 ^a ,
陈凛 ^a ,
林娜 ^a^,^* ,
张彦琼 ^a^,^*

作者信息 +

Altered Iron-Mediated Metabolic Homeostasis Governs the Efficacy and Toxicity of Tripterygium Glycosides Tablets Against Rheumatoid Arthritis

Zihe Ding ^a ,
Xiaoyue Wang ^a ,
Yi Zhang ^a ,
Jian Liu ^b ,
Lei Wan ^b ,
Tao Li ^a ,
Lin Chen ^a ,
Na Lin ^a^,^* ,
Yanqiong Zhang ^a^,^*

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摘要

类风湿关节炎（RA）是一种全球范围内发病率和致残率均不断攀升的自身免疫病，它与铁代谢紊乱有关。雷公藤多苷片（TGTs）是中药雷公藤（TwHF）的代表性中成药品种，其针对RA的临床疗效确切。然而，药物性肝损伤（DILI）是限制雷公藤多苷片临床广泛应用的瓶颈问题之一。此外，雷公藤多苷片在治疗RA中的效、毒分子机制均尚未被完全阐明。为了解决这一问题，本文整合了雷公藤多苷片缓解RA和诱发DILI相关的临床转录组、蛋白质组与代谢组学数据，及其所含化学成分谱和候选靶标谱，开展了多维关联网络分析，不仅识别了其疗效与致毒候选生物标志，还系统解析了其相关分子机制；采用独立临床样本集，进一步对上述雷公藤多苷片效、毒候选生物标志的临床效能进行验证，并利用胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型验证其“效/毒”作用靶标。研究结果表明，雷公藤多苷片缓解RA所发挥的疗效和所诱发的DILI分别与其对“铁-骨”和“铁-脂”代谢稳态的调节密切相关。其中，信号转导和转录激活因子3（STAT3）-铁调素（HAMP）/脂质运载蛋白2（LCN2）-抗酒石酸酸性磷酸酶5型（ACP5）轴所介导的“铁-骨”代谢途径，和STAT3-HAMP-长链脂酰辅酶A合成酶4型（ACSL4）-卵磷脂胆碱酰基转移酶3型（LPCAT3）轴所介导的“铁-脂”代谢途径，分别是雷公藤多苷片发挥疗效和诱发毒性的关键驱动因素，即该中成药品种可通过抑制STAT3-HAMP/LCN2-ACP5轴有效逆转了CIA小鼠关节组织中的“铁-骨”紊乱，随后通过调节STAT3-HAMP-ACSL4-LPCAT3轴导致肝脏组织中的“铁-脂”紊乱。另外，本文在利用人关节炎滑膜成纤维细胞（MH7A）和AML12细胞的体外双向实验验证中，再次确认了雷公藤多苷片对上述关键靶点的双向调控作用。综上，本文证实了“铁-骨/脂”代谢稳态与雷公藤多苷片抗RA疗效和诱发DILI毒性密切关联，为具有“双刃剑”特质中成药品种的临床合理应用提供了新的思路。

Abstract

Rheumatoid arthritis (RA), a globally increasing autoimmune disorder, is associated with increased disability rates due to the disruption of iron metabolism. Tripterygium glycoside tablets (TGTs), a Tripterygium wilfordii Hook. f. (TwHF)-based therapy, exhibit satisfactory clinical efficacy for RA treatment. However, drug-induced liver injury (DILI) remains a critical issue that hinders the clinical application of TGTs, and the molecular mechanisms underlying the efficacy and toxicity of TGTs in RA have not been fully elucidated. To address this problem, we integrated clinical multi-omics data associated with the anti-RA efficacy and DILI of TGTs with the chemical and target profiling of TGTs to perform a systematic network analysis. Subsequently, we identified effective and toxic targets following experimental validation in a collagen-induced arthritis (CIA) mouse model. Significantly different transcriptome-protein-metabolite profiles distinguishing patients with favorable TGTs responses from those with poor outcomes were identified. Intriguingly, the clinical efficacy and DILI of TGTs against RA were associated with metabolic homeostasis between iron and bone and between iron and lipids, respectively. Particularly, the signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)-hepcidin (HAMP)/lipocalin 2 (LCN2)-tartrate-resis tant acid phosphatase type 5 (ACP5) and STAT3-HAMP-acyl-CoA synthetase long-chain family member 4 (ACSL4)-lysophosphatidylcholine acyltransferase 3 (LPCAT3) axes were identified as key drivers of the efficacy and toxicity of TGTs. TGTs play dual roles in ameliorating CIA-induced pathology and in inducing hepatic dysfunction, disruption of lipid metabolism, and hepatic lipid peroxidation. Notably, TGTs effectively reversed "iron-bone" disruptions in the inflamed joint tissues of CIA mice by inhibiting the STAT3-HAMP/LCN2-ACP5 axis, subsequently leading to "iron-lipid" disturbances in the liver tissues via modulation of the STAT3-HAMP-ACSL4-LPCAT3 axis. Additional bidirectional validation experiments were conducted using MH7A and AML12 cells to confirm the bidirectional regulatory effects of TGTs on key targets. Collectively, our data highlight the association between iron-mediated metabolic homeostasis and the clinical efficacy and toxicity of TGT in RA therapy, offering guidance for the rational clinical use of TwHF-based therapy with dual therapeutic and toxic potential.

关键词

雷公藤多苷片 / 类风湿关节炎 / 铁代谢 / 临床疗效 / 药物性肝损伤 / 临床多组学分析

Key words

Tripterygium glycosides tablets / Rheumatoid arthritis / Iron metabolism / Clinical efficacy / Drug-induced liver injury / Clinical multi-omics data analysis

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丁子禾,王晓月,张依,刘健,万磊,李涛,陈凛,林娜,张彦琼. 从“铁-骨/脂”代谢稳态探索雷公藤多苷片治疗类风湿关节炎的“效/毒”关联机制[J]. 工程（英文）, 2024, 39(8): 178-192 DOI:10.1016/j.eng.2024.04.003

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1 引言

类风湿关节炎（RA）是一种以侵蚀性关节炎为主要临床表现的世界难治性自身免疫疾病，影响约0.5%~1.0%的人口[1‒2]。尽管近年来针对RA的治疗方案已取得了一定进展，但病程超过5年的致残率仍高达61.3%，且成功治疗率仍低于10% [3]。中药雷公藤为卫矛科植物雷公藤（TwHF）的干燥根或根的木质部，具有“治筋骨疼痛、风寒湿痹、麻木不仁、瘫痪痿软、湿气流痰”等功效[4]。雷公藤多苷片（TGTs）作为中药雷公藤的表制剂，被世界卫生组织认定为治疗关节炎的“中国首创植物新药制剂”[5]。大量临床随机对照试验表明，雷公藤多苷片比RA锚定药物甲氨蝶呤和其他改善病情的抗风湿药物更安全、更有效[6‒8]。基础研究亦证实，雷公藤多苷片可通过多种途径和机制（如调节免疫和代谢、缓解局部炎症反应以及抑制血管生成），有效改善RA发生、发展中的骨破坏和滑膜等关键病理环节，这些多样化的作用机制共同促进了雷公藤多苷片在治疗RA和预防关节退行性病变中的疗效[9‒12]。

然而，由于雷公藤多苷片的有效剂量范围较窄，难以准确把握临床用药剂量，导致患者疗效参差不齐[13‒14]。越来越多的临床研究表明，雷公藤多苷片的不当使用诱发药物性肝损伤（DILI）的风险较高[15‒17]。在已报道的472例与雷公藤多苷片相关的不良反应中，有54例（11.44%）与肝功能异常有关；在45例出现严重不良反应的患者中，有11例（24.44%）出现肝损伤[18]。本项目组前期整合雷公藤多苷片所含化学成分谱鉴定及其候选靶标谱预测、生物网络挖掘及体内、外实验验证，系统阐释了雷公藤多苷片诱发DILI的分子机制[19]。此外，本项目组还组织了国内风湿免疫临床、药物监督管理、药学和循证医学研究领域的38家权威单位和48位知名专家，共同制订并发布了《雷公藤多苷/雷公藤片治疗类风湿关节炎用药指南》（编号：T/CACM 1337-2020），为临床合理使用雷公藤多苷片提供了全面而专业的建议[20‒21]。值得关注的是，雷公藤多苷片发挥抗RA疗效与其诱发DILI毒性的作用特点和关联机制均尚不明确，这为设计和优化RA患者临床治疗策略、改善治疗效果和降低不良反应带来了极大挑战。

为了解决上述瓶颈问题，本研究整合了雷公藤多苷片缓解RA疗效和诱发DILI相关的临床转录组、蛋白质组与代谢组学数据，及其所含化学成分谱和候选靶标谱，开展了多维关联网络分析，不仅识别了其疗效与致毒候选生物标志，还系统解析了其相关分子机制。进一步，采用独立临床样本集，对上述雷公藤多苷片效、毒候选生物标志的临床效能进行验证，并利用胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型及人关节炎滑膜成纤维细胞（MH7A）、AML12细胞系，从体内和体外两个层面全面验证其效、毒作用靶标（图1）。这种综合方法结合了临床见解和分子机制，加深了我们对雷公藤多苷片双重作用的见解。

2 材料与方法

2.1 临床样本收集

临床样本收集方案遵循《赫尔辛基宣言》的指导原则。本研究已获得广安门医院研究伦理委员会（批准号：BZYSY-2021KYKT8L-02）和安徽中医药大学第一附属医院研究伦理委员会（批准号：2019AH-12）的批准。在样本收集前，所有患者均提供了书面知情同意书。

血清样本来自34名RA患者，其中17名患者出现DILI，17名未出现DILI。样本于2018年2月至2019年5月期间在安徽中医药大学第一附属医院风湿科收集。更多详细信息见附录A中的表S1和表S2。纳入标准、患者治疗及DILI的定义基于我们团队之前的研究[22]。外周血单核细胞（PBMCs）从12名RA患者中收集，患者分为两组：6名TGTs疗效好和6名疗效差患者。样本于2015年1月至2019年10月期间在广安门医院风湿科收集。与前一组的患者类似，纳入标准、患者治疗及TGTs疗效好和疗效差的定义基于我们团队之前的研究[23]。所有参与者的静脉血样本均在早晨空腹时采集，随后分离血清并保存在-80 ℃直至使用。

2.2 转录组学检测和数据分析

使用Affymetrix miRNA 4.0和EG1.0芯片分析TGTs反应良好和不良者的PBMCs中信使RNA（mRNA）的表达。芯片信号的检测由上海其明信息技术有限公司完成。获得的芯片数据已公开于美国国家生物技术信息中心（NCBI）的Gene Expression Omnibus数据库，登录号为GSE106893和GSE106894。

为识别TGTs疗效好和疗效差之间的差异表达基因，采用特定标准进行筛选，包括倍数变化（FC）大于1.20或小于0.83、P小于0.05以及错误发现率（FDR）小于或等于1.0。筛选使用随机方差模型t检验和FDR分析进行。层次聚类分析使用R包（v4.2.2; R Core Team，奥地利）完成。

2.3 代谢组学检测与数据分析

将50 μL解冻的血清样本加入预冷至-20 ℃的甲醇和乙腈（1∶1比例）混合物中进行去蛋白处理。样本涡旋30 s并在冰浴中超声处理10 min。为进一步增强蛋白沉淀，样本在-20 ℃下过夜保存。次日，样本在4 ℃下以12 000 r∙min^-1的转速离心15 min，仅取2 μL上清液用于代谢组学分析。非靶向代谢组学分析采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）系统（AB SCIEX，美国）。色谱分离使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.8 μm, 2.1 mm × 100 mm；美国）。进样体积为1 μL，无分流。氦气（99.9996%）作为载气，前端入口吹扫流速设置为3 mL∙min^-1，柱内气体流速设置为1 mL∙min^-1。UPLC和质谱条件根据之前的报道[24]设置。

代谢组学分析的原始数据导入Progenesis QI软件（Nonlinear Dynamics，英国）。该软件用于峰对齐，通过匹配数据中的峰获得峰面积列表和鉴定的代谢物。为将分子质量数据与代谢物匹配，使用了多个在线数据库，包括人类代谢组数据库（Human Metabolome Database, https://hmdb.ca/）、LIPIDMAPS（http://www.lipidmaps.org）、京都基因与基因组百科全书（KEGG, https://www.kegg.jp/）和METLIN（https://metlin.scripps.edu）。这些数据库提供了各种代谢物的分子质量信息，使其能够与代谢组学分析获得的数据进行匹配和鉴定。

2.4 串联质谱标记技术（TMT）定量蛋白质组学分析

TMT定量蛋白质组学分析由北京智美一诺生物技术有限公司完成。蛋白质浓度采用Bradford法测定[25]。从有和无DILI患者的PBMCs中提取总蛋白。PBMC裂解液使用二辛可丁酸（BCA）蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术，中国）按照制造商说明进行收集和定量。消化后的样本使用XBridge Peptide BEH 5μm C18柱（Waters）脱盐并真空干燥。对于TMT标记，肽段在0.5 mol∙L^-1四丁基溴化铵（TMT 10plex^TM试剂盒；Thermo Fisher Scientific，美国）中重悬，并按制造商说明进行处理。样本制备中，胰蛋白酶消化的肽段使用高pH反相高效液相色谱（HPLC）和C18柱（货号：186003581；Waters）进行分离，采用8%~32%梯度乙腈（pH 9.0）分离。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析按之前描述的方法进行[26]。

2.5 CIA小鼠模型制备与药效学评价

所有动物饲养在恒温(24 ± 1) ℃、12 h光暗循环的房间中，小鼠可自由获取水和食物。本研究已获得中国中医科学院中药研究所研究伦理委员会的批准（伦理批准号：2022B069和2022B070）。所有动物实验方案严格遵守动物伦理管理和处理的指导原则。

30只7~9周龄、平均体重(18 ± 2) g的雄性DBA-1小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司（SCXK 2021-0011；中国）。所有小鼠被分为五组，从第二次免疫后一天开始口服给药，持续五周和七周。分组如下：对照组（Con, n = 6）、CIA五周组（CIA 5W, n = 6）、CIA七周组（CIA 7W, n = 6）、TGTs治疗五周组（TGT 5W, n = 6）和TGTs治疗七周组（TGT 7W, n = 6）。CIA小鼠模型的建立方法如之前研究所述[27]。简而言之，小鼠在尾部皮下注射100 mg II型胶原蛋白（CII；货号：#20022；Chondrex，美国），乳化于完全弗氏佐剂（CFA；货号：#7001；Chondrex）中，并在三周后以相同途径加强免疫。对照组小鼠以相同剂量皮下注射生理盐水。治疗组TGTs的剂量为26 mg∙kg^-1，相当于RA患者临床每日剂量的两倍，在我们之前的研究中显示出显著疗效[19,28]。

2.6 体外细胞培养与模型构建

MH7A细胞来源于人类RA滑膜（RIKEN，日本），在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中于37 ℃、5% CO₂条件下培养。AML12细胞代表正常小鼠肝细胞，购自广州汇元医药科技有限公司，在含10%胎牛血清、1%胰岛素-转铁蛋白-硒和40 ng∙mL^-1地塞米松的DMEM-F12培养基中于37 ℃、5% CO₂条件下培养。

实验处理中，MH7A细胞先用50 ng∙mL^-1肿瘤坏死因子α（TNFα）诱导48 h，随后分别用Stattic [信号转到和转录激活因子3（STAT3）磷酸化抑制剂；货号：HY-13818；MCE，美国]、colivelin TFA（STAT3磷酸化激活剂；货号：HY-P1061A；MCE）和5 μg∙mL^-1 TGTs处理18 h。AML12细胞用5 μg∙mL^-1 TGTs刺激，随后用不同浓度的Stattic和colivelin TFA处理18 h。收集细胞上清和沉淀用于分子生物学实验，以研究两种细胞系中的关键蛋白和基因。

2.7 关节炎和肝损伤严重程度评估

本文根据关节炎发生率、关节炎评分和后爪厚度来评估关节炎的严重程度，与前期研究[29]一致。肝损伤的严重程度通过测量肝脑指数和血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）及天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平来评估。肝脏ALT和AST水平使用相应试剂盒（C009-2-1和C010-2-1；南京建成生物工程研究所，中国）测定。此外，通过测量总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平评估肝组织脂质代谢紊乱的严重程度。肝脏TC、TG、LDL-C和HDL-C水平使用相应试剂盒（BC1985、BC0625、BC5335和BC5325；北京索莱宝科技有限公司）定量。为测量炎症关节和肝组织中的铁含量，使用相应试剂盒（BC4355和BC5415；北京索莱宝科技有限公司）定量。此外，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）按照制造商说明测定丙二醛（MDA, ml094962）、4-羟基壬烯醛（4-HNE, ml023341）、铁调素（HAMP, ml025039）、脂质运载蛋白2（LCN2, ml022573）和卵磷脂胆碱酰基转移酶3型（LPCAT3, ml023384）的表达水平。吸光度使用Multiskan^TM GO微孔板分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测定。

2.8 组织病理学观察和评分

采用组织病理学分析方法考察CIA小鼠受累关节软骨、滑膜和肝脏组织中的病理改变。组织切片分别开展苏木精&伊红（H&E）染色和Masson染色，并邀请两名病理学专家在双盲情况下进行评分[19]。此外，根据我们之前研究的方案[30]，使用Masson染色评估膝关节组织的病理学变化。

2.9 免疫组织化学（IHC）染色

通过IHC染色法研究转铁蛋白受体蛋白1（TFR1）和酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）蛋白在不同组小鼠受累关节和肝脏组织中的表达水平和亚细胞定位。用于IHC分析的抗体包括TFR1（ET1702-06，1∶100稀释）和ACSL4（ET7111-43，1∶100稀释）。染色方案如前所述[31]。使用ImageJ软件（Bethesda，美国）对免疫反应进行量化，检测视野中三个不同的代表性区域。

2.10 透射电子显微镜（TEM）检测

根据之前的研究[32‒33]中描述的方案，使用TEM观察受累肝脏组织中线粒体和脂滴的变化情况。

2.11 定量聚合酶链反应（qPCR）分析

对各组受累关节和肝脏组织样本进行三重的qPCR分析，以评估不同效率和毒性相关基因的表达水平，包括HAMP、LPCAT和抗酒石酸酸性磷酸酶5型（ACP5）基因。实验过程如前所述[34]。

2.12 Western 印迹分析

开展Western印迹分析，客观评估雷公藤多苷片对受累关节和肝脏组织样本中STAT3和磷酸化信号转导及转录激活因子3（p-STAT3）蛋白质表达水平的调控作用[22]。用于分析的抗体包括STAT3和p-STAT抗体（1∶1000稀释，兔多克隆抗体；杭州华安生物技术有限公司）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体（GAPDH）（1∶1000稀释，兔多克隆抗体；杭州华安生物技术有限公司）和β-肌动蛋白抗体（1∶10 000稀释，兔多克隆抗体；Cell Signaling Technology，美国）。所有实验均进行三次重复。

2.13 统计分析

数据以平均值和标准差（SD）表示。组间比较采用单因素方差分析，配对比较采用Student t检验，P < 0.05为显著。使用GraphPad Prism 8.0软件进行可视化。各种组学差异标记的筛选标准包括FC大于1.20或小于0.83、P小于0.05 和 FDR大于或等于1.0。生物分子间相互作用网络分析阈值为0.60。

StatTarget软件包用于主成分分析和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。ggcor R软件包用于计算两个变量之间的皮尔逊秩相关性。P < 0.05时，有统计学意义。

2.14 伦理审批和参与者同意书

本研究获得了中国中医科学院广安门医院和安徽中医药大学第一附属医院医学伦理委员会的批准。所有研究对象均已获得书面知情同意。动物实验由中国中医科学院中医基础理论研究所批准。

3 结果

3.1 “铁-骨”代谢稳态调节与雷公藤多苷片治疗RA的临床疗效密切相关

在之前的研究中，我们分析了对TGTs治疗反应良好或不良的RA患者外周血单核细胞的转录组谱，并鉴定了212个与其临床疗效相关的差异表达基因（DEGs），其中包括102个上调基因和110个下调基因。所有DEGs均通过相应数据库映射到基因本体论（Gene Ontology）术语、KEGG和Reactome通路（附录A中表S3和表S4）。功能富集分析显示，与TGTs疗效相关的DEGs与骨吸收、铁调节和破骨细胞分化等通路存在显著关联[图2（a）]。在构建和分析这些功能性DEGs的相互作用网络后，我们发现TGTs疗效相关基因显著参与铁代谢相关通路，如铁离子结合、铁离子通道激活和铁储存。上述基因也与骨代谢相关通路密切相关，如破骨细胞分化和骨保护素（OPG）/核因子κB受体活化因子配体（RANKL）/核因子κB受体活化因子（RANK）信号通路[图2（b）]。

3.2 “铁-脂”代谢紊乱与雷公藤多苷片诱发DILI密切相关

为探究雷公藤多苷片诱发DILI的分子机制，本研究招募了17名服用雷公藤多苷片后发生DILI的RA患者（DILI组）、17名未发生DILI的RA患者（非DILI组）和17名健康志愿者（NC组），并对其血清样本进行代谢组学和蛋白质组学检测和分析。针对两种组学数据的PLS-DA分析结果显示，NC组、DILI组和非DILI组的代谢表征各不相同[图2（c）和（d）]，三组之间存在24种差异代谢物（附录A中表S5），多为脂质或脂质衍生物，其中甘油磷脂代谢与雷公藤多苷片诱发的DILI密切相关[图2（e）]。

考虑到大多数已鉴定的差异代谢物是脂质或脂质衍生物，在现有数据库中暂无分类，我们整合了蛋白质组学数据进行进一步研究。临床蛋白质组学共鉴定出49个差异表达蛋白质，其中，分别有13个和36个在DILI组中下调和上调表达[图2（f）和附录A中的表S6]。Mantel相关分析表明上述DILI相关差异表达蛋白质与9种不同DILI相关差异代谢物类型关联[图2（g）]，这些蛋白质和代谢物不仅参与了甘油磷脂、鞘磷脂和花生四烯酸代谢等脂质代谢途径，还显著富集于半胱氨酸、谷氨酰胺和谷胱甘肽等代谢途径[图2（h）]，其均在维持铁稳态中发挥重要作用，即“脂质过氧化”和“谷氨酰胺-半胱氨酸途径”[35]，提示“铁-脂”代谢紊乱与雷公藤多苷片诱发DILI密切相关。

3.3 STAT-HAMP 信号轴介导的骨代谢和脂代谢分别与雷公藤多苷片的药效和致毒密切相关

根据上述临床多组学整合挖掘结果，结合文献调研，进一步确定了与雷公藤多苷片临床疗效相关的铁和骨代谢核心靶点[图3（a）和（b）]，以及与雷公藤多苷片诱发DILI相关的铁和脂质代谢核心靶点[图3（c）和（d）]。结合雷公藤多苷片所含化学成分的候选靶标谱及其相互作用网络特征计算，并用STRING在线工具进行了聚类分析，使用Cytoscape 3.9.1计算的结果如图3（e）和（f）所示，结果提示，参与铁稳态调控的STAT3和HAMP均为雷公藤多苷片药效和致毒关键靶点。此外，参与调节骨代谢的LCN2和ACP5为雷公藤多苷片“效”的关键靶点，而与脂质代谢密切相关ACSL4和LPCAT3为雷公藤多苷片“毒”的关键靶点。值得注意的是，STAT3/HAMP可能是LCN2-ACP5和ACSL4-LPCAT3信号轴的共同上游调节因子。鉴于此，本文提出如下科学假说：STAT3-HAMP/LCN2-ICP5和STAT3-HAMP-ACSL4-LPCAT3信号轴分别是与雷公藤多苷片“效”和“毒”相关的关键靶点[图3（g）]。

3.4 雷公藤多苷片通过抑制STAT3-HAMP/LCN2-ACP5信号轴而改善CIA小鼠受累关节“铁-骨”代谢紊乱

如图4（a）所示，在第二次免疫后，每三天对小鼠进行一次行为测定，并在给药后5周和7周将动物处死。与Con组小鼠相比，CIA组小鼠体重显著下降（给药后6~12 d，P < 0.01），随后逐渐恢复。雷公藤多苷片组小鼠给药后体重也有所下降，在给药后第12天达到最低值；但总体而言，在第24天之前，雷公藤多苷片组小鼠的体重值明显高于CIA模型组（P < 0.01）。此外，雷公藤多苷片还能显著改善CIA小鼠的关节炎评分、爪肿和痛阈值[图4（b）~（f）]。值得注意的是，器官/脑指数显示，雷公藤多苷片加剧了CIA小鼠肝脏/脑指数的升高，但却逆转了脾脏/脑指数和胸腺/脑指数[图4（g）~（j）]，且呈时间依赖性，表明雷公藤多苷片对肝脏和免疫系统均有显著影响。

在铁稳态方面，CIA小鼠受累关节组织中Fe²⁺和Fe³⁺的含量均显著低于正常对照组小鼠，而雷公藤多苷片能有效地逆转这一异常改变[P < 0.05，图5（a）]，这表明CIA导致受累关节组织中铁水平过低。各组关节组织Fe²⁺/Fe³⁺比值显示[图5（b）]，雷公藤多苷片增加了受累关节组织中的铁含量，尤其是Fe³⁺含量。如图5（c）所示，IHC结果表明雷公藤多苷片能有效抑制受累软骨组织中TFR1蛋白的表达量（P < 0.05）。值得注意的是，TFR1蛋白在 TGT 5W组软骨组织为阴性表达，但在滑膜组织为阳性表达，这表明该蛋白在软骨滑膜组织中的异质性分布具有时间依赖性特征[图5（d）]。

在骨代谢方面，与Con组相比，CIA组受累踝关节和膝关节的组织病理学评分显示炎性细胞浸润、骨质破坏和滑膜增生明显增加。使用雷公藤多苷片治疗后，组织病理学评分的变化显示药物依赖性明显下降[P < 0.01，图5（e）~（g）]。此外，对Con小鼠发炎的膝关节组织进行Masson染色显示[图5（h）和（i）]，关节软骨基质和纤维呈蓝色，而软骨细胞质和胶质呈红色，着色均匀，潮线清晰，软骨和软骨下骨边界的梯度一致。相比之下，CIA 5W组小鼠的关节软骨表面粗糙、受损，表层软骨变性和脱落。在CIA 7W组中，纤维化明显，潮线附近有许多火焰状突起的红色斑点，软骨下骨之间的界限不清。值得注意的是，雷公藤多苷片组CIA大鼠关节软骨的形态有不同程度的改善，软骨表面无粗糙状改变或受损，浅层软骨无变性或变色，骨潮汐线处无胶原纤维。这些结果表明，雷公藤多苷片能有效缓解CIA引起的关节炎浸润、骨破坏、滑膜增生和胶原纤维化。

从机制上看，CIA模型组的STAT3和p-STAT3蛋白表达量比例比Con组有所增加，而治疗后STAT3和p-STAT3蛋白表达量比例明显降低[P < 0.001，图5（j）]。相应地，雷公藤多苷片干预组的HAMP、LCN2和ACP5蛋白含量和转录水平也明显低于Con组[P < 0.01，图5（k）~（n）]。这些研究结果表明，雷公藤多苷片可通过抑制 STAT3-HAMP/LCN2-ACP5轴，改善CIA小鼠受累关节组织的铁和骨代谢紊乱。

3.5 雷公藤多苷片调节 STAT3-HAMP-ACSL4-LPCAT3信号轴而导致CIA小鼠肝脏组织的“铁-脂”代谢紊乱

如图6（a）和（b）所示，正常对照组小鼠的肝脏组织形态和肝窦无明显异常。CIA组肝脏组织的整体形态正常，部分区域的肝索有轻微炎症浸润。值得注意的是，雷公藤多苷片干预组的肝脏组织显示肝细胞增大且形状不规则，并伴有炎性细胞浸润，这在TGT 7W干预组更为明显，表明随着干预时间的延长，雷公藤多苷片可加重肝损伤。评估不同组间肝脏血脂（TC、TG、HDL-C和LDL-C）、肝功能（AST和ALT）和过氧化脂质指标（MDA和4-HNE）变化的结果[图6（c）~（j）]表明，与Con组和CIA组相比，雷公藤多苷片组的ALT和AST水平在给药后呈时间依赖性升高（P < 0.01）。同样，服用雷公藤多苷片后，TC、TG、LDL-C、MDA和4-HNE水平呈时间依赖性显著升高（P < 0.05），而HDL-C水平则显著降低（P < 0.05）。此外，与雷公藤多苷片5W干预组相比，TGT 7W干预组的这些指标变化更为显著，表明雷公藤多苷片可诱发肝功能和脂质代谢异常，导致肝脏组织脂质过氧化。

为探索铁代谢紊乱与雷公藤多苷片诱发DILI之间的关联性，本研究检测了各组小鼠肝脏组织中的铁离子含量，结果表明，雷公藤多苷片干预后Fe²⁺含量显著增加[P < 0.01，图7（a）和（b）]，随后由于Fe²⁺含量不稳定导致肝损伤。图7（c）和（d）所示的TEM结果显示，Con组、CIA 5W组和CIA 7W组的细胞核呈现出规则和光滑的特征，内部染色质清晰可见。细胞质脂滴数量适中，形状规则。在20 000倍放大镜下，线粒体边界清晰，质地均匀。相比之下，TGT 5W和TGT 7W组的细胞核缩小，脂滴聚集增多，染色体上出现大量空泡，质地不均匀，脊线消失，表明雷公藤多苷片加剧了铁紊乱。参与“铁-脂”代谢的关键上游蛋白TFR1和ACSL4的IHC染色结果进一步证实了这一点[图7（e）和（f）]。通过Western印记检测获得了相似的TFR1和ACSL4蛋白质表达结果[附录A中图S1（b）和（c）]。

从机制层面来看，与CIA组相比，雷公藤多苷片干预组对肝脏组织中p-STAT3和STAT3蛋白的表达量比值有明显的降低作用[P < 0.001，图7（g）]。相应地，雷公藤多苷片干预组中HMAP和LPCAT3的含量和转录水平也明显下降（P < 0.001）。这些结果表明，雷公藤多苷片通过调节 STAT3-HAMP-ACSL4-LPCAT3交联信号轴而导致CIA小鼠肝脏组织中铁和脂质代谢紊乱[图7（h）~（k）]。

3.6 雷公藤多苷片对MH7A和AML12细胞干预效果与毒性的体外实验验证

为了阐明雷公藤多苷片“效/毒”的潜在机制，我们使用MH7A和AML12细胞进行了体外实验。在体外实验验证中，根据前期实验研究确定雷公藤多苷片和TNFα的剂量[19,27]（附录A中图S2）。在MH7A细胞中，采用TNFα诱导条件，用不同浓度的Stattic、colivelin TFA和5 µg∙mL^-1雷公藤多苷片处理细胞18 h。结果显示，Stattic在5.0 μmol∙L^-1和10.0 μmol∙L^-1浓度时能显著抑制p-STAT3蛋白的表达，其中10.0 μmol∙L^-1浓度时效果最明显。相反，20.0 μmol∙L^-1的多不饱和反式脂肪酸（PUFAs）具有最显著的激活效果[P < 0.001，图 8（a）]。在雷公藤多苷片的干预下，观察到p-STAT3表达与Stattic之间的协同效应（P < 0.05），而与colivelin TFA之间呈拮抗效应[P < 0.001，图 8（b）]。STAT3-HAMP/LCN2-ACP5信号轴的其他成分也有类似的结果[P < 0.05，图8（c）~（g）]。

在抑制/激活STAT3磷酸化的条件下，依次用不同浓度Stattic、colivelin TFA和雷公藤多苷片处理AML12细胞。浓度为2.5 μmol∙L^-1、5.0 μmol∙L^-1和10.0 μmol∙L^-1的Stattic对p-STAT3蛋白表达有不同程度的抑制作用，其中，5.0 μmol∙L^-1的Stattic抑制作用最明显，而20.0 μmol∙L^-1的colivelin TFA激活作用最明显[P < 0.01，图8（h）]。雷公藤多苷片干预后，观察到Stattic对p-STAT3表达的协同作用和colivelin TFA对p-STAT3表达的拮抗作用[P < 0.05，图8（i）]，同时对STAT3-HAMP-ACSL4-LPCAT3信号轴的其他成员分子也有类似干预影响[P < 0.05，图8（j）~（n）]。上述结果表明，雷公藤多苷片所诱发的DILI与AML12细胞的“铁-脂”代谢紊乱密切关联。

4 讨论

阐明雷公藤多苷片发挥临床疗效和诱发DILI的分子机制可提供有关治疗的更完备的知识，并有助于指导该中成药品种的临床合理用药。主要活性成分通过调控Toll样受体（TLR）、JAK/STAT通路、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体及环鸟嘌呤-磷酸腺苷合酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）通路等炎症信号网络发挥作用，但其治疗RA的关键靶点仍不明确[36‒39]。现有分子水平研究多聚焦于雷公藤甲素和雷公藤红素，难以全面反映中药复方的整体效应。值得注意的是，TGTs“效/毒”双重特性提示其活性靶点可能同时介导不良反应。明确雷公藤多苷片的作用靶点，将同时揭示其治疗与毒性机制，为临床联合用药提供理论依据。与既往仅单独探讨雷公藤多苷片“效/毒”机制的研究不同，本研究通过整合临床来源的转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据挖掘，首次发现雷公藤多苷片疗效好和疗效差的RA患者存在显著差异的分子特征，揭示了雷公藤多苷片缓解RA药效和致毒作用分别与其调控铁-骨之间和铁-脂之间的代谢稳态密切相关。具体地，STAT3-HAMP/LCN2-ACP5和STAT3-HAMP-ACSL4-LPCAT3轴分别是雷公藤多苷片的功效和毒性的关键驱动因素。进一步的动物层面实验表明，雷公藤多苷片在改善CIA小鼠软骨损伤和滑膜增生以及诱导肝功能异常、脂质代谢紊乱和肝脏脂质过氧化方面发挥着双重作用，更有趣的是，正反向的机制验证实验证实了该中成药品种通过抑制STAT3-HAMP/LCN2-ACP5轴，而有效逆转CIA小鼠受累关节组织中的“铁-骨”紊乱，随后又通过调节STAT3-HAMP-ACSL4-LPCAT3轴，而导致肝脏组织中的“铁-脂”紊乱。本研究首次全面揭示了雷公藤多苷片效、毒关联特征及其相关作用机制，不同于以往仅探讨该中成药品种效或毒的单一性研究。

铁是一种重要的微量元素，对人体的正常功能起着至关重要的作用。在正常生理条件下，人体通过精确的调节机制维持铁稳态平衡，铁稳态紊乱可诱发多种疾病的发生发展[40]。铁稳态与骨代谢密切相关，铁过载和铁缺失都会对骨代谢产生不利影响[41‒42]。临床数据显示，约60%的RA患者铁缺失导致贫血，这不仅会加重关节破坏，也是评估RA患者预后的一个独立因素[43]。近期研究发现，铁缺失不仅会增加破骨细胞标志基因ACP5、组织蛋白酶K和基质金属蛋白酶9的表达，促进破骨细胞活化，还会通过减少骨形态发生蛋白（BMPs）等骨形成相关基因的表达而破坏骨形成[44‒45]。这些发现凸显了铁稳态异常在破骨细胞活化和骨破坏过程中的重要作用。扭转铁代谢紊乱已被证明是预防和治疗RA骨质破坏的有效方法[46‒47]。相应地，本研究的临床转录组学数据挖掘亦证实，雷公藤多苷片疗效相关基因显著参与了铁和骨代谢途径，如铁离子结合、铁离子通道活性、铁储存、骨吸收、铁调节和破骨细胞分化等。HAMP是铁稳态的主要调节因子，也是STAT3信号通路的上游调节靶标[48]。炎症会激活STAT3蛋白的磷酸化，进而增加HAMP的转录，导致体内循环铁缺失[49]。雷公藤多苷片所含的雷公藤红素和雷公藤甲素均可阻断破骨细胞中STAT3蛋白的磷酸化[50‒52]。STAT3既是雷公藤多苷片所含多种活性成分的候选靶标之一，又是该中成药品种临床疗效相关差异基因之一。LCN2是一种急性期蛋白，在炎症条件下调节铁转运[53‒54]。LCN2和JAK2/STAT3相互促进，导致炎症损伤加重[55]。值得注意的是，本研究实验数据显示，在CIA小鼠的受累关节组织中，HAMP和LCN2的表达量明显增加，而雷公藤多苷片干预，可有效降低HAMP和LCN2的表达量。此外，雷公藤多苷片还能抑制STAT3蛋白的磷酸化，减少HAMP的转录，抑制与LCN2的串联激活，调节受累关节组织中铁的摄取和吸收过程，控制细胞内储存铁的释放，从而提高对Fe²⁺和Fe³⁺的利用率，减轻铁缺失症状，恢复受累关节组织中的铁含量，进而改善骨代谢标志物ACP5的过度表达，纠正“铁-骨”代谢紊乱。

肝脏不仅在体内铁吸收、储存和运输中起着至关重要的作用[56]，也是受药物毒性影响的主要器官[57]。维持铁稳态对肝细胞功能和各种肝病预防至关重要[58]。近期研究表明，在铁超载情况下，肝细胞可能会出现过量的Fe²⁺积累，进而通过Fenton反应产生过多的活性氧，破坏细胞内氧化系统和抗氧化系统之间的平衡[59‒60]，这与本研究结果一致，即使用雷公藤多苷片治疗后，CIA小鼠体内的Fe²⁺、MDA和4-HNE含量显著增加。此外，Fenton反应会产生羟自由基（OH∙），作为ACSL4的合成底物。这些自由基与LPCAT3共同催化多不饱和脂肪酸的过氧化反应，导致脂质代谢异常，最终诱发DILI [61]。根据临床来源的代谢组学和蛋白质组学数据挖掘提示，雷公藤多苷片所诱发的DILI受铁和脂质代谢紊乱影响。其中，HAMP蛋白是一种肝脏产生的激素，是铁吸收和分布的主要循环调节剂[62]。在炎症状态下，雷公藤红素可降低肝细胞中的HAMP水平，从而导致机体对铁的吸收增加，铁离子浓度升高，最终诱发肝毒性[63]。给予雷公藤多苷片干预后，CIA小鼠肝脏组织中的HAMP表达量显著降低，且与ALT和AST水平升高呈时间依赖型的相关性。最新研究显示，外源性磷脂酸可通过抑制IL-6/STAT3通路减轻对乙酰氨基酚诱导的损伤[64]，这雷公藤多苷片诱发DILI的分子机制相辅相成，即该中成药品种可抑制STAT3-HAMP信号轴，随后导致肝脏组织中Fe²⁺浓度明显升高，肝脏组织超负荷后，Fenton反应激活ACSL4-LPCAT3信号轴，从而导致与肝损伤发生相关的PUFAs脂质过氧化和“铁-脂”代谢紊乱。

综上所述，本研究结果证实了“铁-骨/脂”代谢稳态与雷公藤多苷片的抗RA疗效和诱发DILI毒性密切关联，为具有“双刃剑”特质中成药品种的临床合理应用提供了新的思路。在后续研究中，本团队将进一步引入类器官芯片和单细胞组学等前沿技术和方法，从细胞、时间和空间异质性等多个层面解析雷公藤多苷片“效/毒”双向动态调控的分子机制，深层次阐释其“效/毒”关联的科学内涵。

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